DE2026687A1 - Novenamin und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

»ECHTSANWALTE <1O U ·

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER SEIl Z9. Mai ALFRED HOEPPENER . ■ DR. JUR. DiPL-CHEM. R-J. WOLFP , DR. JUR. HANS CHR. BEIL

I 623FRANKFURTAMMAIn-BOCHST

Unsere Kr. 16 303

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ii Codpanj
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Verfahren zu issses. -Gier

Die Erfindung betrifft die neue Verbindimg 3-Aiaino-4-liydrox3i·-

jrl-4-0-ia3 bhyl-5—laoxy-5, 5-d.iaethyl-p-L-lyxolciHsariB. mit dem Trivialnaaieii liovenaaiin und ein Verfahren sur Ilerstellunt; derselben duroh. enzymati— sehe Spaltung der Ainidbindung' im Antibiotikum NovobioGin, Hovenaniin kann auch durch enzymatische Spaltung von Dihydro— no-yobiocin hergestellt v/erden. -

Novobiocin ist ein Antibiotikum, dass als- Stoffwechaelprodukt eines Novobiocin produzierenden Streptomyceten erhalten 'vierden kann. Verfahren zur Herstellung, Aufarbeitung und Reinigung /on Novobiocin sind in der US-Patentschrift 3 049 534 beschrieben. Hovobiocia ist ein bekanntes Antibio bikuni, das zur üehaudlung rou durch Staphylokokken hervorgerufenen Infek tiot-on und von durch bestimmte Stämme von Proteus hervorgerufenen Infektionen der Harnwege verwendet wsr&en kann, Sa 'ivrLo'j keine Kreua-Fieslirtena mit Penicillin und ist gegenüber

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Penicillin-resistenten Stämmen von Staphylococcus aiireus wirksam. Dihydronovobiocin ist ein Antibioticum, das durch Hydrierung von Jovobiocin nach dem Verfahren der US-Patentschrift 3 175 944 err alten wird. Ms-ior wer es nicht raö^lio; , daa liovobiocin-i-iülekül 30 zu spalten, dass die al3 ilovenatdln bezeichnete Verbindung erhalten wird«. Durch das srflndungsgemäsae Verfahren der ensymatiachen Spaltung wird iaher IToven amin als neue Verbindung bereit gestellt,

ITovenamin (U-33 918), wird durch ensymatlache Spaltung von. Novobiocin oder Dihydronovobiocin rit einem neuen Mikroorganismua, der ale Arthrobacter 3p. identifiziert wurde, hergestellt _t -^3 wurde gefunden, dass .dieses --janteriuia sin Br^ym abgondert, vielones ilovobiocin in 1-.Ό"7βη?\ηί:ι ur.d 4~-*iydroxy-"i-(3-uiethyl-2-butenyl)-benzoeBäure spaltet. Bisse enaymati^c-\n hydrolytische Spaltung erfolgt mit31· anaerobes Bedin^imge.^ bei diesor Spalttm^ erhält man die Spaltungsprodukte in q-jaä-Ausbeuten.

A. üer I-Ukroorganiainua

Das erf indungsgemäss aur enzyraatisehen Spaltung von verwendete Baktarium wurde als eine Spezies von Arthrobacter· identifiziert, der in der vorliegenden Beschreibung die ^eaelearning 11-18 gegeben sei. ΙΓ—13 ist eil. neues Piuiteriurn, June seiner Eigenschaften besteht in der Früxi-jkeit zur Bereitstellung eines Bnsyms, das novobiocin spaltet. Eine Subkiil+ur Acζ lebenden Organigmua. vmrde ohne beschränkende Auflagen hii/.srlegt bei Northern litilissation and Research Divißivn,. Asrici-lfcural Research, U.S. Department of Agriculture, Peori-a, Illinois, U,S.A_ffi untjr der Hinterlegungsnumraer MIlIi 3-3^52, und -Proben körm-m v:n dort'besogen werden.

Das Baktet'ium iI-IO ist ein nichb-mobiles, pleomorphes, i}r?·;;-negatives Bakberiuni variabler Länge, gelegentlich von i

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Aussehen. £ε wusnrt gui, a'Jf verschiedenen Laboratoriumsmedien, die v^r^iiedene Kohlenstoff- und Stickstoff quellen enthalten, lei;;pielsv'eise Pepton, Oasein-Verdaunungsprodukte, Lac^alburdn-Yerlauuiigsprodukte, Trypton, Trypticase und dgl. AbfOsenen von !lethionin und Valin, verwertet 11-18 sämtliche föbräuchlicl.er. Aminosäuren als Kohlenstoff- und Stickstof loucller:, Veisi-ielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure, !lysin, Argi-.i;._f 'listidin. Frei In, Hydroxyprolin, Asparagin, Gluta-.ii:, Glyoir., Alanin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Tyrcai;., Pher rl: -lanin ur.d Tryptophan, Auf gleiche Weise wird auch Krv-:1)f ooii. verv/ertet. /*na Wachstum können ferner folgende ^vereil,auii£;ei; ßl- Kohlenstoffquelle dienen: Riboee, Xylose, Fructose,--Galactose, GltiGonat, 2-Ketogluconat, p-

oat, Oitrat und Glycerin, nicht jedoch AraMnose, Sorbose, Kaltoie, Sucrose, Iiactose, Dextrin, Stärke, Rhamnose, Raffinoi?e, Inosit, Sorbit, ilannit oder p-Aminol»en«oat, Für das ^&chstum geeignete Stickstoff quellen sind Amruoniumsalze · Das Bakteriun ii-18 wächst aerob gut bei 20,28, 32 und 37⁰Cf jedoch nicht bei 42° oder bei 5⁰C. Ee 1st tatalase-poeitiv, hingegen sind die Tests init Oytochrom-Oatldaee, Indol, nach Voges-Proskauer und der Urease-Test negativ. Das Bakterium reduziert Kitrat nicht sura Hitrit, verflüeeigt Gelatine nicht und bildet keinen Schwefelwasserstoff, Tests auf Arginin-, Lysin- und Ornithin-Becarboxylagen verlaufen negatir· ³³^s Bakterium bildet ohne Gasentwicklung aus Zuckern Säuren, Aufgrund der obigen Daten wurde das Bakterium der Sattung Arthrobacter zugeordnet,-

Das Bakterium wird auf Schrägnährböden aus Agar*-Mediuia, das 0,5 g £ryptöB.$ 1 g Brer Rabbit-Molasse, I g Glycerin, O_f25 g ^vHefee3fe?akt und 1,5 g Agar {pH 6,8} enthält, bei 5⁰O gehalten und in Abständen von 2-4 Wochen umgtfüllt* 3?as lakteritua kann auch auf Medien vergleichsweise einfacher Zusammensetzung gehalten Worden, beispielsweise O,2f6 Difco oasitone-'Agar oder auf Ö_# 1$ Glucose, O₉ ©5$ Ämraoniumchlorid und anorganischen

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Salzen, oder Q,1# Glucose und 0,05$ Hefeextrakt, Komplexe . liedien, beispielsweise Hirn,-Herz-Infusionsbrühe, begünstigen die Produktion deß Novobiocin-spaltenden Enzyms, das nachstehend als Hovöbiocin-Acylaee bezeichnet wird, nicht.

Die Wpchetumsbedingungen sind wie folgt! Zellen von Bakterium N-18 können in vereehiedenen Medien mit verschiedenen Kohlenstoff- und Stickeloffquellen gezüchtet werden, solange ein gutes Wachstum de» StlEteriums erzielt wird. Geeignete Kohlenstoff- und Stickat^fftuellen sind Hefeextrakt, "NZ-. Amine B" (Sheffield¹« eilEymatisch abgebautes Casein), "Oaeitone" (Dico), Glucoee, HH^Ol und dgl. Die Medien werden Eweckmäasig durch anorganische Salze, beispielsweise KHpPO^, MgSO^, NaOl, yeGlj, VeiU^« lind dgl· ergänzt. Ein bevorzugtes Medium beeteht aiie Q_§®£ ⁿW&<>*A&tne B^M ₉ 0,5$ Glucose, 0,05?δ KH₂K)₄, 0,05Jt NaCl, 0,02Ji MgBO^.7H_g0 und 0,001$ FeSO₄ (pH 7,6),

B, Pie »ngymatlache Spaltbuia,,yon l>oyobiooin

Die enzymatieche Spaltung yon Hovoblocin verläuft wie folgtί

ΪΪΗ-Ο

HOTOBIOdJH

H-18

H₂O

HOOO

(Teil O und B) (Teil Δ) ■

. UOVENAMIIT 4-Hydroxy-3-(3- .

me thyl-2-but enyl) benzoesäure

Die obige Spaltung wird bewirkt, indem man Novobiocin oder Dihydronovobiocin in Form der freien Säure oder eines Salzes mit einer Base mit dem oben beschriebenen Bakterium N-18 in Berührung bringt· Die Spaltung erfolgt aweckmässig unter anaeroben Bedingungen, wobei die Spaltungsprodukte in quanti tativen Ausbeuten erhalten v/erden.

Die Zellen ^von Bakterium 11-18 werden etwa 1-3 Tage lang bei einer Incubationstemperatur von ca» 25-37⁰C gezüchtet. Die bevorKU^te achstumszeit beträgt etwa einen Tag bei einer Incubationstemperatur von oa 28 C# Zweekmässig v/erden die Zellen während der Wachstumsperiode bewegt und im Medium belüftet.

Dann werden die Bakterienzellen aus dem Medium gewonneii, vorteilhafterweise durch Abzentrifugieren, Die Zellen werden sodann mit V/asser gewaschen und erneut suspendiert, zweekmässig in einer minimalen Wassermenge, Dieses Gemisch kann dann in einer wässrigen Lösung von Novobiocin, beispielsweise ^atriumnovobiocin, suspendiert werden, wobei die Spaltung erfolgt, Wie bereits erwähnt, wird die Spaltung zweckmäsßig unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Anaerobe Bedingungen können im Laboratorium auf verschiedene, an sich bekannte Weise hergestellt werden, beispielsweise indem man das Heaktionsgemiach mit einer luftabgohliessenden Substanz, z.B₉ Toluol, überlagert, oder indem man das Reaktionsgemisch mit Stickstoff durchspült, ^ei gröasaren Anlagen werden die , anaeroben Bedingungen ebenfalls in an sich bekannter Weise herbeigeführt«

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Im allgemeinen ist die Spaltung von novobiocin durch das vom Bakterium H-18 produzierte Enzym in etwa 18-42 Stunden bei Raumtemperatur beendet« Bei höheren l'emperaturon, "beispielsweise 34 "bis etwa 37 Ö, wird die Reaktionszeit verkürst, während "bei niedrigeren Temperaturen von "beispielsv/eise 15 bis etwa 24⁰G die Reaktionszeit länger wird, Vorzugswelse wird die Spaltung bei Raumtemperatur durchgeführt. Durch höhere Konzentrationen an das gewünschte Enzym erti&ltenden Zellen wird dl» Reatetionsze.it ebenfalls verkürzte

iaoh Beendigung der. Spaltung werden die Bakterienzellen aus dem Reaktionsgemlsoil abgesondert» Die Zellen von ί·ί-18 sind stabil und werden während der Spaltung nicht leicht inaktiviert» öleiohe Zellen können "daher 4-6 aal in Sp&ltungsprozeaaen der oben beschriebenen Art eingesetzt werden. I>ie -allen können auch lyophiliaiert und während längerer Seiträuue bei niedrigen $emperaturen (vorzugsweise unterhalb Gefi'ierpunkt) gelagert werden» ohne dass ein lasasbarer Verlust der Fähigkeit zur Spaltung von iiovobioein eintritt«, Die Seilen werden durch 2entr-ifugiereri oder Filtrieren, Torz-u^sv-'siriS durch Zentrifugieren _f -warn Reak^iorxSöeirii^ch abgetrennt» T>ie Wengo an l.^rovenariin in der zellfreien, überstehenden i'lüssigkeit kann naoh folgender Methode ermittelt werden: Ki^e Probe (0,1-0,4 ml) die3er flüssigkeit, wird verdünnt, mit 3n-Salzsäure auf pH 1,8eingestellt und mit Butylacetat extrahiert, ö_er Extrakt wird mit der zweifachen Volumeniaenfce an angesäuertem (3n-Salasäure) Ifehanol (pH 2_Pü) verdünnt Uiid die liovenaminmenge v;ird quantitativ durch dia Absorption bei im bestimmt. Die Novenaminmenge berechnet eich naoxi icl^aricLer Jf'orwelt

^ΟΡ295Γ ^{X yeJ?dlh}™g , mg iiovenamin/ml 35,4 ⁺

35,4 entspricht der 0I)_Oqcrau von 1 mg Hovenamin/ml, (=a) OD--* opfeiiJoiie Dichte

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Heei. dem obigen Spaltungsverfahren werden .Eevebloeinkon2entrat ionen Ton etwa 1 bis 2,5jt In Ausbeuten von 91-100# inntrhslb etwa eines Tages 2U ]\övenamln (und Teil A) aufgespalten.

Das Ausganganiaterial novobiocin kann i» oben beschriebenen Vi-r.f?.:.?en iich durch Düiyaronovoblocin ersotst werden·

liovoronin iat in wasser relativ löslich! te 1st ferner relativ unlöelicl 5κ Lösungsmitteln, in «eichen Hovobiocin imä Dih^clronovobiccin bei sai^ram pH~Wert •xtTehlerbaie.flindi.Bßis; -f3sveiEe int Hovena^iu in chlorifcrt«n niedrigen Alkenen_t 3.-. He-lhyler.3¹ 3orid_t Ciiiorcforra, Ithylindiehlorid und dßl., in reit Vaeeor* nicbt-mlschbarei: Estern %it· IthylftCfttat, Butyli.c^t"*t_t Aßij'laaetttt und dgl» un-5 in mit Keßaer nicht-miBchburei. höheren Alkoholen relativ unlöslich. In Gegenwart \-on Sauer toff ist Kovenamin unter alkalis.chen Bediwguiif;.-n in

Kovenamin kai;n nach der eneymatischcn Spaltung auf verechiedener. Wegen aufgearbeitet i^eräen, beispielsweise unter Vervtiidu^s von Adsorbentien und durch Kristallisation aus Lbsuiiganitteln· Die erste Stufe des Aufarteitungsverfahrens umfasst die Entfernung der -öakteriejiEellen» VoraiigevJeiee werden die Zellen entfernt durch Zentrifugieren Oder Filtrieren einer angesäuerten Suspension» ®emäes einem bevorzugten Verfahren werden die überstehende 3?ilissigk»it oder das Piltrat, die lovenamin zusaiaraen. mit verschiedenen Verunreinigungen wie ungespaltenem Ausgangsmaterial_# enthalten, auf einen sauren pH-Wert von etv.'a 2-6 eingestellt und dann mir einem Lösungsmittel extrahiert, in welchem Itovenamin nicht löslich ist, Hiersu kann rnan sämtliche der oben genannter* Lösungsmittel verwenden, wobei jedoch.Butylaeetat bevorzugt wird* Bei der Extraktion der angesäuerten IiSsungen «erden Verunreinigungen, beispielsweise lovobiocin oder Dihydroiiovobiocin, entfernt,- und es bleibt eine Lösung zurück, die

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bei der Gefriertrocknung ein relativ reines Präparat eines . Novenamin-Säureadditionssaleee ergibt. Dieses Präparat kann dort verwendet werden, wo höhere Reinheit nicht erforderlich ist. Das so erhaltene relativ reine Präparat kann ' ferner acyliert werden unter Bildung von antibakteriell wirksamen Novenamin-Aoylaten. Die Acylierung und die dabei erhältlichen Produkte werden nachstehend näher beschrieben,

Noyenamin-Präparate höherer Reinheit können erhalten werden, indem man ein wie oben besohriebsn erhaltenes, relativ reines Präpara-fc auB Lösungsmittel kristalliBiert. Beispielsweise kann man ein relativ reines Präparat von Novenamin-Hydrochlorid durch azeotrope Destillation, beispielsv/eiae unter Verwendung von absolutem Äthanol, vorn Wasser befreien und das Hovenamin dann aus absolutem Äthanol und Äther kristallisieren, wobei man ein gereinigtes Novenamin-Präparat erhält.

Zur Einstellung des pH-$erte der überstehenden Flüssigkeit im Spaltungsverfa-bren eignen eich starke Mineralsäuren oder organische Säuren, beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoff-· säure, Phosphorsäure_f Schwefelsäure, Ameisensäure, Oxalsäure und dgl· Bei der Gefriertrocknung wird das Hovenarain als Sale der verwendeten Säure isoliert. Wurde im Spaltungsverfahren der pH-Wert mit Salzsäure eingestellt, so wird das Hovenamin entsprechend ala Hydrochlorid isoliert« Dieses Salz kann in die freie*Saue Übergeführt werden, indem man es in Tetrahydrofuran iuipendlert und etwa 1 Äquivalent Triäthylamin zugibt, oder indem man das Salz in Spuren Wasser enthaltendem Aceton löst, oder indem man läng ?re ²eit bei rermindertem Druck trocknet* Aus der freien Base können dann andere Hovenaminealze htrgeetellt werden» .Die Hovenaminsalze können für die gleicliift ^wetke eingesetzt werden wie die freie Base,

liovenamin kann auch aus der bei der Spaltung überstehenden ^ζ'

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■ Flüssigkeit gewonnen werden, indem man es in ein iT-48 ' Acylat überführt. Dies kann beispielsweise wie folgt geschehen: (1) Die überstehende Flüssigkeit wird mit einer Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure, auf etwa pH 2,5 ange-' säuert j (2) dann wird mit einem lösungsmittel für Novobiocin, . · beispielsweise mit Butylacetat extrahiert; (3) danach wird der pH-Wert mit einer ^ase, beispielsweise 6n-Natriumhydroxydlösung, auf etwa 8,0 eingestellt, und danach wird (4) ein Halogenid oder Anhydrid einer Carbonsäure zugesetzt, wobei sich das Novenamin-N-Acylat bildet,

Sobald das Reaktionsgemisch einen alkalischen pH-Wert besitztö, sollte im obigen Verfahren eine Stickstoffatroosphäre aufrecht erhalten werden.

Bei dem genannten Veri'eihren können selbstverständlich auch vbn der Salzsäure verschiedene Hineralsäuren verwendet werden. Ferner kann man mit anderen !lösungsmitteln für Novobiocin anstelle des Butylacetats arbeiten.. Anstelle von Natrrumhydroxyd eignen sich ferner andere Basen wie beispielsweise -tfatriumbicarbonat oder Natriumcarbonat, Lithium- odar Kaliumhydroxyd, -bicarbonat oder -carbonat oder basische Metallsalze, ferner wasserlösliche tertiäre Amine wie Trialkylamine (Triäthylamin) oder Pyridin, Chinolin und dgl,

liovenamin kann aus wässrigen Lösungen, beispielsweise der bei der Spaltung überstehenden Flüssigkeit, ferner durch Adsorption an Kationen-Austauacherharzen gewonnen werden· Bei dieser Arbeitsweise können sowohl Carbonsäure-wie Sulfonsäureharze verwendet werden. Geeignete Carbonsäureharze sind ,-PoIyacrylharse, die durch Mischpolymerisation von Acrylsäure und üivinylbenzol erhalten werden (Herstellung siehe Kunin, Ion Exchange Resins, 2,Aufl. (1958)^ John Wiley and Sons, r Inc., Seite 07)» Carbonsäure-Kationtnauatauscherharze dieser • Art sind unter de» Handelsnamen «Amiitrlite IHO-50" und

;■! oo085o/2in

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^M2eokarb 226" #rhältlich· 2u den geeigneten Sulfonsäureharsen gehören die am Kern sulfonierten und mit Dlvinylbenzol vernetzten PolystyrolharKO« (Herstellung siehe Kunin, Loc. cit., S, 84) Sulfonierte Kationenaustauscherharze dieser Art sind unter den Handelsnamen "Dowex 50", "Aaberlite IR-12C", "Halcite HÖR», »Chempro 0-20», »Permutit Q" und "Zeokarb 225" erhältlich.

Das protonierte Antibiotikum wird aus dem Harz mit V/aas er bei saurem pH-Wert, zWeokmässi-g bei einem pH-Wert, dor niedriger ist als der pKa-Wert des verwendeten Kationex.austausoherharzes, eluiert. Befriedigende Ergebnisse werden bei pH-V/erten von etwa 2-6 erzielt» überschüssige Säure im Eluat wird mit einer Base, beispielsweise ifatriumhydroxyd oder einen» stark basi3ohen Anionen-Austauscherharz bis zutü pH-Wert etwa 6-7 neutralisiert_f so dass ein Überschuss an Säure über die zur Protonierung der basischen Gruppen erforderliche l.ci.ge entfernt wird. Geeignete Anionen-Austauscher für obigen Zweck werden durch Chlormethylierung von gegebenenfalls .mit Divirr/lbenzol vernetztem Polystyrol und Quatemisierung -nit 'i'ri:.iethylainin odtr Dimethylalkanolanin ernalben (zur herstellung 3iei..» Kunin, loc. oit», S. 88 und 97; Seite 84; Seite 97). Anionenaustauscherharze dieser Art sind unter den Handelsr.&men "Dowex 2», "Bowex 20», "Araberlite ·ΙΗΑ-400^{·, »Buolite A-102" und »Parmutit S«1» erhältlich.

Nofenamin kann aus wässrigen Lösungen auch durch Adsorption an oberflächenaktiven Absorbenaien, beispiels"eise Entfärbungskohle oder entfärbenden Harzen, und Eluierux^ des adsorbierten Materials mit einer_v,I»ösung aus ^v'asser und Aceton erhalten werden»

Hovenamin kann acyliert warden unter Bildung neuer Verbindungen mifc antiraikrobieller Wirkung. Biese Verbindungen weisen folgende Formel auf J

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II

Η.ΊΓ-σ-0 CH C

O η

In der RC- den Acylrest einer substituierten Benzoesäure der

Formel

XIa

darstellt« In Formel XIa stellt Rg Qitmn Alkaneyltxyreet mit 2-18 Kohlenstoffatomen! η eine ganee Zahl von 1 biß 3» &| Wasserstoff, einen Alkylrest mit 1-18 Kohlenetoffatomen, Alkoxyrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder Alkenylrest rait 2-18 Kohlenstoffatomen dar, AlkanoyloxyWite «it 2-18 Kohlenstoffatomen sind »»Β* der Aoitoxy-, Propionoyloxy-, Butanoyloxy-, Pentanoyloxy-j Hexanoyloxy-, Hiptanoyloxy-, Octanoyloxy-, ITonanoyloxy-, Decanoyloxy-, tJndecanoyloxy-, 33odecanoyloxy-, TridecanOyloxy-, Tetradecanoyloxy-, Pentadecanoyloxy-, Hexadeoanoyloxy-, Heptadecanoyloxy- und Octadeeanoyloxyrest und deren isomere Formen*

Alkylreste mit 1—18 Kohlenstoffatomen Bind z.B. der Methyl-, ithyl-, Propyl-, Butyl-,, ientyl-, Hexyl-, Gepty-, Octyl-, Sonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, ■ xridecyl·-, Tetredecyl-,

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Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-, üctadecylrest und deren isomere Formen,

Alkoxyreste mit 1-6 Kohlenstoffatomen oind z.B. der Methoxy*-, Äthoxy-, l'ropyloxy-, Butyloxy-, Pentyloxy-, Hexyloxyrest und deren leomere Formen.

Alkenylreste mit 2-18 Kohlenstoffatomen sind z.B. der Vinyl-, Propenyl-, Allyl-, Isopropenyl-i Butenyl-, Pentenyl-, Hexenyl-, Heptenyl-, Octenyl-, Nonenyl-, Decenyl-, Dodecenyl-, Tridecenyl-, Tetradecenyl-f Pentadecenyl-, Hexadecenyl-, Heptadeceriyl-, Octadecenylrest und deren isomere Formen.

Dan Verfahren zur Herstellung der Hovenamin-Acylate hängt weitgehend vom Reinheitegrad des Ausgangsmaterials ab. Liegt das Hovenamin als relativ reine, freie Base vor, so wird weniger Acylierungsmittel "benötigt. Bei Verwendung von Rohprodukten als Auegangsmatβrial hingegen wird eine grösaere Menge an Acylierungsmittel verbraucht« .

Genäse einer bevorzugten Ausführungsform werden Novenaminacylate der Formel II durch selektive Ιί-Acylierung der freien Base mit einem Acylhalogeiiid einer Carbonsäure hergestellt. Die Acylierung erfolgt in Gegenwart von V/asser. Beispielsweise erhält man bei der Umsetzung von Kovenamin in wässriger Lösung, die durch kontrollierte Zugabe von Base oder Puffer beim pH ca 8,0 gehalten wird,· mit Benzoylchlorid das N-Bensscyl-Kovenamin, Während dar Umsetzung- freigesetzter Chlor- . wasserstoff wird durch die Baee oder den Puffer neutralisiert, Acyliert man die freie Base Novenamin auf vorstehende Weise, so wird eine Acylierung freier Hydroxylgruppen veraieden. '^{V:: ; :}-/· ' ' ' ¹^'

Da Kovenejnin eine achWche %aa* ist, wird^: durchJBiäiiteilen dee pH-Werts einer wässrigen trdvehaniinlösung auf etwa 7»5 - 8,5 .._; sichergestellt, das» «ine ausriiohende Menge an Nortnaiiin .J in der cur erfeinreichen N-Aoylierung erforderlichen Form der/

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_ ₁₃ _ ί 2026697

' freien Base vorliegt.

Novenainin-Aeylate der Formel II können auch durch Acylierung der freien Base in aproti3chen Lösungen, beispielsweise in Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines aäurebindenden Mittels wie beispielsweise Pyridin, hergestellt werden. Das Reaktionsprodukt wird dann mit flüssigem Ammoniak behandelt, um o-Acylgruppen zu entfernen, ohne die M-Acylgruppe anzugreifen. Wegen der zusätzlichen Stufe der Entfernung der O-Acylgruppen ist dieses Verfahren weniger bevorzugt. Das Verfahren erweist sich jedoch als geeignet bei Acylierungsmitteln, die in Wasser relativ unlöslich sind»

Die zur Herstellung der ^erbindungen der Formel II verwendbaren Säurehalogenide können ein einem zweistufigen Verfahren hergestellt werden. Zunächst wird die substituierte Benzoesäure mit dem Halogenid oder Anhydrid der entsprechenden Carbonsäure in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, beispielsweise Pyridiiiy O-acyliert, Die resultierende Alkanoyloxybenzoesäure wird dann mit Thionylchlorid oder Oxalylchlorid in an sich bekannter ^eise umgesetzt, wobei man das Säure-r halogenid der acylierten Benzoesäure erhält» beispielsweise wird 4-Acetoxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-benzoylchlorid hergestellt, indem man zunächst 4-Hydroxy-3-(3~meth3/l-2-butenyl)-benzoesäure in Gegenwart von Pyridin aoyliert unter Bildung der 4-Acetoxy„3..( 3-methyl-2~butenyl)-benzoesäur8» Diese Verbindung wird dann mit !Thionylchlorid umgesetzt zum gewünschten BenzoylchlorXd. Andere Alkanoyloxyverbindungen der Formel Ha können erhalten werden durch Acylierung der entsprechend substi tuiertou ISanzoesäure mit· einem Säurehalogenid oder 3äure£irihydrid der gewünschten Carbonsäure.

iiovenamin kann auch zum novobiocin oder Dihydronovobiocin acyliert werden. V/ird Wovenamin in Wasser bei basischen pH-• V/ecb gelitet und mit 4-O-Aoetyl-3-^3-mebliyl-a-butenylj'-benzoyl-

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chlorid behandelt, so bildet sich day entsprechende Acylat. Bei Behandlung ait verdünnter Base e:it3teht daraus ein -I-3-tnicch aus novobiocin und I3onovobiocin, das durch öe^e .:;tromverteilung in die Komponenten zerlegt v/erdeu !:ann.

Novenamin Inhibiert 'las »'achstum vemoh ie liner Bakterien, beispielsweise von Staphylococcus aureuo, Bacillus ενbtills, · Diplococcus pneuaoniae, Saroina lutea ur.·' Pseudononas fluorescens. Dementsprechend kann liovenamin beispielo eisü verwendet werden aur Behandlung der [iv.chtplp b^e vuu 3tί ler.vnir-Esrn, um Infekt Lanen durch Bacillus subtilis zu yerae Leier; oder zu "bekämpfen. Die '/erbindurir kar_'i auch al.-j üä£:i..:?ökti-i.sraittel für zahiLMsdizinische und medizinische Geräte verwendet verlen, die durcii Staphylococau3 aureua verunreinigt s ind.

lJovenamir.-Acylate, ceispiel3 eise 'J-ier.zoyl-nzvev/.mLn und

ebenfalls antibakteriell wirksrme '/"erl.ii:lunker-, die g\-iiⁿ. maaaen v/ie Hovenainin eingesetzt v/erden l'.öria

In den fnl^jirler. Beispielen 3ind "/L;li:!S Bv- znr.tcin^u^e:, auf das Cre-jicht besagen, v/ährenl Iligcvangsverhäl-nisse von Löaimgamitteln sich auf 7olu.Tien beziehen.

Beispiel 1

Enzymatische Spaltung von Novobiocin

Eine Öse volljZelien von einem Schrägnährboden 70η ^akteriit" Ii-1 a 2IREL Ü-365I Jird in 25o al-ErlenmeyerKolten ii.okuliar^, iie 100 ml eines Mediums aus folgenden Komponenten enthielten: 0,8?b '»WZ-Arnine B", O_f5f5 Glucose, 0,055^ KH₂PC₄, 0,05 $ WaCl, 0,024 MgSL ^. 7H_O0 und G,. j 19» FeSO₄, pH 6,8-7,3, Die Kolben werten t-ί 28 C auf einer- Schütcelmaschine inkubiert. Nach 18-at:iadiger Inkubation, sobald die Bakterienpopulation ihre maximale Dichte weit&e>i«u-l err^ioht hat, werisn die

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absentrifugiert, einmal mit destilliertem Wasser gewnccvier. u.id i:i Waseer nieder cuspendiert bei einem Endvolu-' ,t:2ii vcj; 5 ml. Ein ral-Fraktionen, werden dann in 5 Ttßtröhrcnan pipettie-t, danach"wird Novobiocin als Katriumsalz zugebe ".,·.-<: und das Endvolumen wird in jedem Röhrchen auf 5 ml eiii^esi eilt. Die Heagensgläser werden mit Stickstoff durchspült, dicht verschlossen und auf einer ßchUttelmasehine inkuMurt. KaJh 20-etündi^er Inkubation bei Eaumteicperatur i. -lie -eilen abzentrifugiert und die zellfreie über-Ji.io Flüssigkeit wird nach der vorstehend beschriebenen ri« auf. die Anwescnlieit von Hovenanin untersucht. Dabei •.;c.i\},_;- lOl^-ende Ergebnisse erhalten!

Novobiocin

(Anfcuirskon^eritration) Novenarain

m^'/ral £ Ausbeute

10 100

25 91,7

50 44,4 75 4,9

100 0

Beispiel 2

Isolierung von liovenamin-Hydrochlorid

4,5 1 zellfreier Flüssigkeit, einem grösseren Ansatz einer enzymatischen. Spaltung gemäss Beispiel 1 entstammend, die das Spaltprodukt von 12 g Novobiocin enthalten, werden mit 15 ml 6n-Salzsäure angesäuert und 1 χ mit 1 1 Methylenchlorid, dann 1 χ mit 800 ml Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird verworfen, dase wässrige Material wird gefriergetrocknet, Ausbeute 10 g rohes Novenamin-Pulver, das mit Ninhydrin in Pyridin sofort eine Purpurfärbmig ergibt.

800 mg des obigen Novenamin-^räparats werden aus absoluten Äthanol und Äther umkristallisiert, nachdem Wasser durch Destillation aus absolutem Äthanol entfernt worden war. Die

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Ausbeute der Umkristallißierung beträgt 4-00 mg, das Produkt , ßChmtlBt oberhalb 300°Ö unter Zersetzung,

Ein gereinigtes Novenomin-Präparat ergibt bei der Elementar- ' analyse folgende Werte«

Anal» Ber. für O₁₉H₂₅Ii₂O₉OIi ·

0 49»49ϊ Η 5,47.1 N 6,08; Cl 7*69 gefunden» 0 49»26| H 6,61 j N 5»81.

Kovenamtn-HydroChlorid »©igt In Mineralöl folgende siarlce (cm*¹)!

3420 (Sch * Schulter)

3350 1606

3190 1575

2920 (öl) 154Ö

2Θ60 1485

2650 i.W

1707 1435

(Öl)

Bei» Kristallisieren dee obigfen Materials aus schwach feuchten Methanol erhält man iiotenamin ale amphdtere freie Base, die eich lsi«lachen 220 und 240⁰O versetzt.

H-BeniBoylnovenara in

1 1 de· zentrifugierte^ auß der enzymatischem Spaltung resultierenden Gemische, erhalten naeh dem Verfahre ton Beispiel 1, mit ilnein »ovenamingehait t&& etwa 1,0 g, wird mit Salzsäure auf pH 0,5 *nge*äuteB# Uas Angesäuerte Öemisoh Kird 2 3t mit 350 Al IthflHfcetftt ittiÄ £ ic mit 250 ml UethflMmhlvrlU, extra- ^: hlert, um n|%fct ikgeöit^tei Novobiocin und |*ißopentenyl-4-hydroxybenisoeiitire zu entfernen* Die wässrige Schicht wird dann mit 30 g »«itrlumbKiarbonat behandelt und der pH**He£t ^ ■/.

«309860/2174

wird duroh ""Zugabe von en-KatriiimhydroxydlÖsung auf 8,0 alngestellt. Eine Stickstoffatraosphäre wird aufrechterhalten. Die Lösung wird kräftig gerührt und dann mit 5 ml'Benaoylchlorid versetzt» Ea wird noch 1 Stunde lang gerührt, wobei der pH-Wert zwischen 7 und 9 gehalten wird» Eine zweite Portion von 5 ml Benzoylchlorid wird zugegeben, dann wird nochmals eine Stunde lang gerührt_t immer noch unter Stickstoff atmosphäre und bei einem pH-Wert von 7-9· Sedann wird -_; die lösung mit Salzsäure auf pH 2 angesäuert und 2 je Hit 200 ml Ithylacetat extrahiert» Nach dem Binengen dea äxtrmjfl· auf 100 ml wird das doppelte Volumen an Äther augtgeben, und man erhält einen Niederschlag (450 mg) aus N-Benaoyl-iioven*· amin. Das Filtrat wird eingedampft und der Rückstand wird «it Äther ausgelaugt, um Benzoesäure zu entfernen» Man erhält einen Rückstand (300 mg) aus weiterem N-Benzoyl-Novenamini OY-Absorption bei 323 mu, a - 34,0, B_eim Umkriatalllaieren die ses Materials aus Äthanol und Wasser erhält man N-Benzοyl-Novenamin in kristalliner fom voa Schmelzpunkt 245°Ö (Zersetzung)» .

Anal. Ber. für ö₂6^H28^Ii2°i0^l

0 59,08} H 5,34} W 5,30 ge fund en ί Ο 50,24! ·Η' 5,49.1 N 5,29.

Beispiel 4

Zu 2 g ier freien Base liovenaniin, in 20 ml Wasaer suspendiert, das 1,1 g iJatrimiaojfcab (pH 8,o) enbhält» werden 2,4 {1 |~A09box-y--3-(3—mebhyl~2-but.enyl)-benisoylchlor.id por— tionav/eine zugesetzt. Dabei wird eine Sticks to ff atmosphäre aufreohfeerhaiten. tfaoh 3-3tündigem Rühren bebmgb der pH-Wert 4,2» ßin Eiieder^ohlag von 2 g'wird isoliert, dieser wird In CJr 1θΓ.;ίΌπα sudpo-i'liert iui-1 dte in Ohio ro form lösliche Prak~ Ϊλ,οϊι wird ifjuLterb, Aufhaute 0,76 g. Das" Material wird einer '*■■-·.,..'.■ -/'^hW : I ^!.Lu/i:· Li. _Λ thy iac ; - xfc { 0*roLuhax:-ui ί Afci-'-.ήθΙ :' Wuiiii-ii' t'--' ϊ 5 ί -^J, '52",...' au t-irwo.cf en· l>ie Pt-.'.-^;': ->\'.:. ui<; .i-.^ri ■

000850/2174

Höhrchtn 210*260 und 270-300 werden vereinigt und eingedampf» wobei ein Rückstand verbleibt. Beim Kristallisieren des Rückstands aus Äthylacetat und 3kelly3olve B (isomere Heptane) arhMlt man 70 mg kristallines ll~/1-(3-Hethyl-2-butenyl)-4-aoeto3iyben2ioyl7^-iiovenainin (Jtcetoxy-novobiocin) vora Schmelapunkt 155-16O⁰O. .

Anal» Bar. für

gefunden?

O 59,091 H 5,71| N 4, N 4(31·

Daa 4-Aoetoxy-3-(3-möthyl«2-butenyl)-ben3oylchlorid im Verfahren von üaispiöl 4 kann durch Halogenide der folgenden substituierten Benzoeoäuren ersetzt werden, wobei raan die entsprechenden Novenaiain-Aoylata erhalt (wie orwähnt, werden die iubatifcuierten Benjjoeaäuren zuerst O-aoetyliert unter Bil4u^i ^^er Acetoxyverbindung, und letztere v/ird IaHi₁ mit Thionylohlortd oder Oxalylchlorid umgg^etzt unter 3äurehalogtnlda)i

e-HyclrcixybensoQBäure

m-Hjrdroxybenaoesäure
2-Hydroxy-3-niethylbsn3oe3äure
2-Hydroxy-3-proi. y Lbenzoesäure
2-Hydroxy-3-iaopropyLbenzoes:iure
«i-Hydroxy- |.-ri3 trhylbenaoesäure
.'-Hydro■xy-.l-^i.aoi;: ropy !benzoesäure
-'-Hydroxy--}--Lsohexylbenaoesauru
^.-Hydroxy- J, 5—<lIi .e thylbenaoesäure
2-HydiT):j:y- >-aL L;^τ 1L on icesUuro

:: ■'-3-r

(O-Thynr ,iäsäurs }■■

(Anacardlnsäure) 2-Hydroxy-6-pentadecylbeni:oe8äure 2-3iydroxy-6-(8-pcntaöecenyl )-beiieoeBäure (Oinkgolinsäure) 2-liydroxy-6-heptedecadienylbenEoesäure (Pelandjanineäure) 3-Hydroxy-2-nethylbenßoeBfture 3-Hydrc.xy-2-ti-t hylbenzoeeäure 3-iij^r'lroxy-4-inopropylbenzo-e säure 3-Hydroxy-4—ÜihylbenzoesUure 3-Hydroxy-2_iiethyl-4-ieopropylbeiiBoesfiure 3-lIyirDxy-2~methyl-4-tert,-butylbens5Oesäure 3-Hyd3⁴oxy-4-methoxyberiEoesäure 3~Hydroxy-i|-athoxybenzoeBäure ■

3-Hydroxy-2_f 4-dimethoxybenzoesötire 4-Hydroxy-2-methylbenzoeßä¹ui?t

4-Hydroxy-3-methyXbeiiEoeBäur6

4-Hydroxy-3-lsopentylben2oesäure 4-Hydroxy-2-(1-methylbuty1)-bensoeöMure 4-Hydroxy~2-pentadecylbensoesäure 4-Hydroxy-3,5-dimethylbenzoesäure 4-Hydroxy-3_t5-aipropylbenisoesäure 4-%droxy-3,5-diiiop3Copylben2oesäure

4--Hydroxy-3,5-Gli-eec.-butylbenzoesäure 4-Hydroxy-5-methyl-2-isopropylbenzoesäure 4-%droxy-5-propyl-3-allylbenzoe säure 4-%droxy-2-ätJiox:ybtiiaoe säure

008850/2174

4-Hydroxy-3-isopentoxybenzoesäure 4-%droxy-2,6-dimethoxybenzoe säure 4-Kydroxy-3,5-dimethoxybenzoesäure 5-Hydroxy-2-methylbenzoesäure 5-HycLroxy-3-niethylbenzoe säure 5-Hydroxy-2-äthylbenzoesäure 5-Hydroxy-2-isoaraylbenzoesäure 5-Hydroxy-2,3-dimethylbenzoesäure

5-Iiyiiroxy-2-meth3'l-4-isopropylbeni2oe säure 5-iiydrpxy-2-butoxybenzoe säure 5-Hydroxy-3»4-diraethox3'benzoe säure 6-Hydroxy-2-methylbensoesäure 6-Hydroxy-3-methylbenzoesäure 6-Kydroxy-3-äthylbenzoesäure 6-Hydroxy-3-prop3'lbenzoe säure 6-Hydroxy-3-isopropylbenzoesäure ö-Hyüroxy-S-tert.-butylbenzoesäure 6-Hydroxy-2,3-dimethylbenzoesäure 6-Hydroxy-2,4-dimethy!benzoesäure 6-Hydroxy-2-methyl-3-isopropylbenzoesäure 6-Hydroxy-4-raethyl-3-isopropylbenzoesäure 6-liydroxy-5-rnethyl~2-iEopropylbenzoesäure 6-Hydroxy-3-iaethyl-5-äthy !benzoesäure 6-Hydroxy-2-methyl-5-ißopropylbenzoesäure 6-Hydroxy-2, 3,5-trifnethylbenzoesäure 6-%droxy-2,4» 5-trimethylbenzoesäure 2,4-3)ihydroxybenzoeBäure (ß-Resorcinsäure) 2_f5-Dihydroxybenzoesäure (Gentisinsäure) 2,6-Dihydroxybenzoesäure (^"Resorcineäure) 3,4-Dihydroxybenzoe8äure (Protpcatechusäure) 3»5-Dihydroxybenzoesäure (a-Resorcinsäure) 2,3|4-Trihydroxybenzoesäure 2,3t6-Trihydroxybenzoesäure • 2,4,6-TrilrydroxybenzoeBäure 2,3»5-Trihydroxybenzoesäure

009850/2174

ι. t I * t

3,4,5~Irihydraxy"benzoesäure (Gallussäure)

\3,4-Dihydroxy-5--methoxybeiizoesäure 3, 5-Dihydroxy-4--inöthoxybenzoesäure 3, 5ⁱ-Dihydroxy-2-metliylbeni3oesäure

3, 5-Dih.ydroxy-4-methylTDenzoesäure 2,4-Diliydroxy-3-methylbenzoesäure 2,4-Dih.ydroxy-3» o-diraethoxybenaoeaaure (Squainatsäure) 2,4-Dihydroxy-5-methyrbenzoesäure 2,4-Dihydroxy-6-methyrbenzoesäure 2,4-Difflhydroxy-5-äthyllDeiizoesäure 2,4-Dihydroxy-6-pentylbenroesäure 2,4-DULy droxy-ö-heptylbenzoe säure 2,6-Dihydroxy-3-isopentyl-4-methoxyberLZQesäure 2,6-Dihydroxy-4-methoxybenzoesäur© 2,6-Dihydroxy-4-methoxy-3-( 3-metliyl-2-butenyl )-b9nzoesäure •2,6-Diliydroxy-4-niethylbenzoesäur9 2 y 6-Diliydroxy-3-methylbenzoesäure 2,6-Diliydroxy-4-pentadecylbenzoesäur6 2,5-Dihydroxy-3-methoxybenzoesäure 2,5-Dihydroxy-4-met}ioxyben!3oesäure 2,5-I>ilxyd-roxy-4-nietliQxy-6-^ethy !benzoesäure 2,5-Bihy&roxy-3-methyrben2oesäure 2,5-DUiydroxy-4-methylbenzoes.äure ■ 4,^-Dihydroxy-2-methy!benzoesäure

4, -5-Dihydroxy-2~methy!benzoesäure 5»6-Ditiydroxy-2-ine1;liylbenzoesäure 5,6-Dlhydroxy-3-]»ethylbenzoesäure 3» 5-Dihydroxy-2,4~dimetiiylbenzoesäur0 3,5-Diiiydroxy-2,6~dimetiiylbenzoe saure 2,6-Dihydroxy-3| 5-dImet3a'yroenzoesäure 3f 6-Bihydroxy-2,4» 5»trimetliyibenzoesäure 3-Hydroxy-4-S.llyl"be2izoe säure ,

3-Hydroxy-2-allylbenzoeaäure ■ _Λ ■

4-Hydroxy«3-allyl-5-propylbenzio0aäure »-3f 5-cLiallylbenzoeaäur·

009850/21^4

* * ti

tB
ι · > I ■

· 1

t)

t · ti

- 22 -

Dia obigen Benzoesäuren können in anderen Qr-Ac-ylcte. überfuhrt werden durch Acylierung mit den entsprechenden Säurehalo^enid oder -anhydrid, einer Alkancarbonaäure, beispielsv/eise der Propionsäure, Buttersäure, Pentancarbonsäure, Hexancarbonsäure, Heptan-, Octan*·, Nonan-, Deoan-, Undecan-, Dodecan-, Tridücan-, Tetradecan-_r Pentadeoan-, Hexadecan-, Heptadeean-, Octadecancarbonsäure oder isomeren formen davon» Diese Äcylate kennen dann mit Thionylchlorid oder Oxalylchlorid umgebe tat v/erden unter Bildung des SäurehalogenidSi das dann anstelle von 4-Aoetoxy-"-3-(3-methyl-2-butenyl)-benzoylchlorid im Verfahren von Beispiel 4 eingesetzt werden kann zwecks Bildung des entsprechenden liovenamin-Acylats«

ooftso/tm

Claims (7)

1. ■β und dessen Säureadditionssalze,
2. 2, IJcvonamiiiliyc.r3Chlorid der Formel

   OH-O

   nach Anspruoh 1#
3. 3. Verfahren zur Herstellung des Novenamins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man HoYobiocin oder Dihydronovo-"biocin mit dem Bacterium Arthrobacter sp., N-18, HRRL J652 unter anaeroben Bedingungen inlcubiert.
4. 4. Verbindung der allgemeinen Formel

   003850/2174

   H₉W-C-O OH

   *- Il

   Il

   «HÖR

   OH'

   worin RC- den Acylrest einer substituierten Benzoesäure der Formel

   bedeutet, in der Rp einen Alkanoyloxyrest mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen, η eine ganze Zahl von 1 bis 3» Rh sin Wasaerstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, einen Alkoxyrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Alkeiiylrest mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeuten,
5. 5. H^3-(3-Methyl-2-butenyl)4-acetoxybenzoyl7-novenamin nach Anspruch A·
6. 6· Verfahren zur Herstellung der llovenarainaoylate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Hovenamin in Form der freien Ease mit einem Acylhalogenid der gewünschten Carbonsäure unter einer Stickstoffatmosphäre bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis 8,5 umsetzt«

   009850/217/»

   71 -V-erf ahren zur J iorstellung von Ιί-Benzoylnovenamin nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daa_s man das Movenamin in einer wässrigen lösung mit Benzoylchlorid unter einer ; S ticka.t off atmosphäre bei einem pH-Wert von etwa 8,0 umsetzt«

   8. YerfaJiren zur Herstellung von IT-£5-(3-Methyl-2-biite-nyl)-' 4-acetoxyTDen3oyl7-novenamin nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass i'ian eine wässrige Lösung des Movenamins in I'orm der freien Base mit 4-Acetoxy-3-^3-£ietliyl-2-"bu^:tenyl7-benzoylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre umsetzt.

   Für The Upjohn Company

   Kalamazoo (Michigan,.
7. 7.St-.A..)

   Re ent aanwalt

   009850/21