DE2150375A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung rhamnosehaltiger Glycolipide - Google Patents

Verfahren zur biotechnischen Herstellung rhamnosehaltiger Glycolipide

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DE2150375A1 DE19712150375 DE2150375A DE2150375A1 DE 2150375 A1 DE2150375 A1 DE 2150375A1 DE 19712150375 DE19712150375 DE 19712150375 DE 2150375 A DE2150375 A DE 2150375A DE 2150375 A1 DE2150375 A1 DE 2150375A1
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

11 Verfahren zur biotechnischen Herstellung rhamnosehaltiger •Glycolipide "
Priorität: 14. Oktober 1970, Japan, .Nr. 8984-3/70
Es war bekannt, daß rhamnosehaltige Glycolipide intrazellulär in Spuren von bestimmten Mikroorganismen, z.B. zur Gattung Pseudomonas gehörenden Bakterien, produziert werden. Es war jedoch schwierig, rhamnosehaltige Glycolipide extrazellulär in vergleichsweise großen Mengen herzustellen. Weiterhin wurde ein zwei L-Rhamnose-Einheiten enthaltendes Glycolipid aus solchen Bakterien erhalten. Es konnte jedoch kein Glycolipid mit nur einer L-Rhamnose-Einheit erhalten werden.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung rhamnosehaltiger Glycolipide zur Verfugung zu stellen, bei der hohe Ausbeuten erhalten werden. Diese Auf-
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cjabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung rhamnosehaltiger Glycolipide, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein rhamnosehaltige Glycolipide produzierendes Bakterium der Gattung Pseudomonas in einem wäßrigen; mindestens eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium bei pH-Werten von 4 bis 10 und Temperaturen von 25 bis 37°C aerob züchtet und die Glycolipide aus der Kulturbrühe isoliert.
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, insbesondere η-Paraffine verwerten können, in hohen Ausbeuten extrazellulär Glycolipide aus η-Paraffinen oder einer anderen, von dem betreffenden Mikroorganismus assimilierbaren Kohlenstoffquelle produzieren.
Nach dem Verfahren der Erfindung gelingt es, rhamnosehaltige Glycolipide, die als Emulgiermittel oder als Arzneimittel dienen, in industriellem Maßstab auf billige Weise unter Verwendung von billigen Kohlenwasserstoffen oderJiohienhydraten. als: Ausgangsmaterial herzustellen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können rhamnosehaltige Glycolipide weit besser und rationeller aus der Kulturbrühe isoliert werden als nach dem bi stier· bekannten Verfahr en, won ach rhamnosehaltige Glycolipide in Spuren durch Extrahieren von ZeI-
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len von Mikroorganismen gewonnen wurden. Es wurde festgestellt, daß zur Herstellung von Glycolipiden, die eine L-Rhamnose-Einheit enthalten, als Kohlenstoffquelle insbesondere n-Paraffine geeignet sind, obwohl auch andere Kohlenstoffquellen, wie Alkohole, Kohlenhydrate ,.Sorbit und Glycerin, verwendet werden können.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vorzugsweise die nachstehend aufgeführten Mikroorganismen eingesetzt:
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Pseudomonas fluorescens ATCC 15453
Pseudomonas putida ATCC 4359
Pseudomonas cruciviae ATCC 21283
Pseudomonas boreopolis ATCC 15452
Pseudomonas oleovorans ATCC 8062.
Im erfindungsgemMßen Verfahren können jedoch alle rhamnosehaltige Glycolipide produzierendem Stämme der Gattung Pseudomonas und deren natürliche oder künstliche Mutanten eingesetzt werden.
Die rhamnosehaltigen Glycolipide werden durch Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas unter geeigneten Kulturbedingungen hergestellt . Die Glycolipide können sowohl intrazellulär als auch extrazellulär durch Züchten dieser Mikroorganismen in einer Flüssigkultur hergestellt werden. Um jedoch große Mengen rhamnosehaltiger Glycolipide zu erhalten, werden diese vorzugsweise aus der Kulturbrühe isoliert. Das Züchten
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der vorgenannten Mikroorganismen erfolgt gewöhnlich bei 25 bis
Als Kohlenstoffquelle sind im erfindungsgemäßen Verfahren n-Pa·- raffine oder η-Paraffine enthaltende Kohlenwasserstoff-Fraktionen bevorzugt. Vorzugsweise v/erden η-Paraffine mit IO bis 20 C-Atomen als Kohlenstoffquelle benutzt, wobei im allgemeinen Gemische solcher Paraffine eingesetzt werden. Es können auch andere assimilierbare Kohlenstoffquellen, z.B. ein- oder mehrwertige Alkohole, wie Glycerin, Sorbit und Äthanol, organische Säuren und Kohlenhydrate,als assimilierbare Kohlenstoffquellen verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können anorganische und verschiedene organische Stickstoffquellen verwendet werden, Solche Stickstoffquellen sind z.B. Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ainmoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat und Ammoniumcarbonat, oder natürliche, stickstoffhaltige Materialien, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysa-
Cascln,
te, Aminosauregemisehe aus^bei der Fischverwertung erhaltene lösliche Produkte, Reiskleieextrakt,'NZ-Amin (eine Reihe von Caseinhydrolysaten), entfetteter Sojabohnenkuchen, angedaute Produkte, wie angedautes Fischmehl oder angedauter entfetteter Sojabohnenkuchen, und Chrysalishydrolysat, verwendet werden. Die genannten Substanzen können entweder einzeln oder als Gemisch aus mindestens zwei dieser Materialien eingesetzt werden.
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Zur Züchtung der genannten Mikroorganismen wird ein.aus einer oder aus einem Gemisch der vorgenannten Kohlenstoffquellen. Stickstoffquellen. Phosphat-, Sulfat- und Chloridvexbindungen, Salzen organischer Säuren, Salzen von Schwermetallen, wie Kupfer-, Eisen-, Nickel-, Kobalt- und Mangansalze, und anderen notwendigen Wuchsstoffaktoren bestehendes Nährmedium hergestellt und sterilisiert. Das so hergestellte Nährmedium wird mit einem rhamnosehaltige Glycolipide produzierenden Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas beimpft, und die Züchtung wird aerob durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums auf einen Wert von 4 bis 10, vorzugsweise von 6 bis 8, durch Zugabe einer Harnstoff lösung, einer wäßrigen Ammoniaklösung oder einer Ammoniumcarbonatlösung eingestellt. Die Züchtung ist innerhalb von 1 bis 6 Tagen beendet« Sie wird dann abgebrochen, wenn die rhamnosehaltige Glycolipidmenge ihr Maximum erreicht hat,.
Zur Isolierung der rhamnosehaltigen Glycolipide aus der Kulturbrühe wird die Gärmaische angesäuert und die Zellen des Mikroorganismus und hochmolekulare Verbindungen, wie Proteine, durch Zentrifugation abgetrennt. Die rhamnosehaltigen Glycolipide können dann aus der schwachsauren Kulturbrühe mit Lösungsmitteln, wie Butanol und Essigsäureäthylester, extrahiert werden. Der so erhaltene Extrakt enthält in vielen Fällen verschiedene rhamnosehaltige Glycolipide, die durch Chromatographie an Kieselgel isoliert werden können. Die isolierten rhamnosehaltigen Glycolipide können durch Auflösen in Wasser und Einstellen des pH-Wertes der so erhaltenen Lösung mit Salzsäure auf 3 bis 4 oder durch Auflösen in Äthanol und anschließendes· Abkühl! en der er-
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haltenen Lösung aufgetrennt werden. Entsprechend dem jeweiligen Produkt v/erden entweder eine weiße Masse und/oder weiße, schuppenförmige Kristalle isoliert.
Insbesondere werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Lipide Λ und B isoliert. Das Lipid A hat die Formel I
HO
II
C-
?■
C-
II
(D
-O - CH - CH COOCIICH COOH
CH CU
7 15- 7 15
OH OH
und wird als &-L-Rhamnopyranosyl-ß-hydroxydecanoyl-ß-hydroxy-
decansäure.bezeichnet. Das JLipid B hat die Formel II
HO C O <n)
1/cH, Vh-
H C\ H H ^ C
I H-\l !/ I—Ω — r.TT _
CH,
II
i
C-
H C
O — CH — CH COOCHCH COOH j 2 j 2
H t
OH -O -
C7H15
15
OH OH
und wird als 2-0-oC-L-Rhamnopyranosyl-t^L-rhaEmopyranosyl-ß-
hydroxydecanoyl-ß-hydroxydecansäure bezeiciinefc.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herqestellten und isolierten rhamnosehaltigen Glycolipide wirken gegen Mycoplasmen und zeigen eine bestimmte Wirkung gegen Viren. Ferner besitzen
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BACT ORIGlNAU
diese Verbindungen dispergierende Eigenschaften. Weiterhin kann aus den erfindungsgemäß hergestellten Glycolipidendurch Behandeln mit Alkali oder Säuren auf einfache Weise Rhamnose oder hydroxy lierte Fettsäure hergestellt werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 wird unter Schütteln 24 Stunden in einem 2,O % Sorbit, 1,O % Fleischextrakt, 1,0 % Polypepton und 0,3 % übliche Salze enthaltenden Nährmedium vom pH 7,3 (vor der Sterilisation) gezüchtet. Mit der so hergestellten Vorkultur wird ein 3O Liter fassender Fermenter aus Glas beimpft, der 15 Liter eines Kulturmediums folgender Zusammensetzung (bei einem Verhältnis von 5 Volumprozent) enthält:
- 0,5 Prozent
0,2 Prozent 0,2 Prozent O,l Prozent 0,1 Prozent 0,1 Prozent 0,005 Prozent 0,001 Prozent 100 ,jVLiter 0,3 Prozent 0,2 Prozent
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KH2PO4 -
Na2HPO4 7H2O
K2SO4 7H2O
MqSO4 · 4H2O
FeSO4 - 7H2O
MnSO4 ·
ZnSO4 · Maisquellwasser
Biotin Hefeextrakt
η-Paraffin
(Gemisch von C^ bis
C, r-Kohleiiwasserstoffen) - IO Prozent (v/v)
pH 6,5
(vor der Sterilisation)
Die Züchtung wird 72 Stunden bei 3O°C unter Rühren mit 400 UpM
sterilisierter·Luft und einer Belüftung von 1 Liter^Liter Kährmedium und Minute durchgeführt. Während des Züchtens wird der pH-Wert des Mediums mit wäßriger Ammoniaklösung auf 6fO bis 7,5 eingestellt. Nach beendeter Züchtung ist das η-Paraffin nahezu verbraucht.
Die Gärmaische wird zur Koagulation hochmolekularer Verbindungen, wie Proteine, .auf pH 3 eingestellt und zur Entfernung die-* ser Verbindungen und der Zellen zentrifugiert. Der erhaltene überstand wird unter Verwendung eines gleichen Volumens Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt wird konzentriert, und das Konzentrat wird durch eine mit Kieselgel gefüllte Säule geleitet. Anschließend wird mit Chloroform als Elutionsmittel chromatographiert. Hierbei werden mit Chloroform zuerst die η-Paraffine und sodann das rhamnosehaltige Glycolipid A eluiert. Anschließend wird das rhamnosehaltige Glycolipid B mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch (90:1O) eluiert. Die Fraktia—'
nen, die das Glycolipid A bzw. B enthalten, werden getrennt konzentriert, und jedes Konzentrat wird weiter chromatographisch gereinigt. Nach dieser Reinigung werden die die Glycolipide A und B enthaltenden Konzentrate in warmem Äthanol gelöst, und die Lösungen werden bei niedriger Temperatur stehengelassen, wobei das Glycolipid B in kristalliner Form erhalten wird. Nach
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Auflösung der Niederschläge in Wasser können die Glycolipide A und B durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 3,0 bis 3,5 umgefällt bzw. umkristallisiert v/erden, wobei 3 g Glycolipid A in Form einer weißen Masse und 8 g Glycolipid B in kristalliner Form aus 5 Liter Kulturbrühe erhalten werden.
Die Elementaranalysen, Infrarot-Absorptionsspektren und andere physikalisch-chemischen Daten ergaben, daß die Glycolipide A und B die durch die Formeln I und II wiedergegebenen Strukturen haben. Die Glycolipide A und B werden innerhalb von 2 Stunden durch 1 η I^SO. hydrolysiert, wobei eine reduzierend wirkende Verbindung erhalten wird. Das Infrarot-Absorptionsspektrum', die Elementaranalyse und die Papierehromatographie ergaben, daß es sich bei dieser Verbindung*um Rhamnose (6-Desoxymannose) handelt. Der Rhamnosegehalt der Glycolipide A bz\*. B beträgt 42 bzw. 57 Gewichtsprozent. Die Glycolipide A und B werden unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Essigsäure-Gemisches (85:10:5) der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unterworfen. Die Kieselgelplatten werden nach der Chromatographie mit Anthron-Reagens besprüht und anschließend auf 1000C erhitzt; der Rf-Wert des Glycolipids A bzw. B beträgt O,75 bzw. 0,45.
Beispiel 2
Pseudomonas fluorescens ATCC 15453 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Nach der Extraktion der Kulturbrühe mit Essigsäureäthylester werden pro Liter 1,8 g Glycolipid A und 3,2 g Glycolipid B erhalten.
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Beispiel 3
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß Glycerin als Kohlenstoffquelle dient. Nach 82stündiger Züchtung wird die Gärmaische zentrifugiert. Der erhaltene überstand wird mit Butanol extrahiert, und der.Extrakt wird weitgehend konzentriert. Nach 15stündigem Stehen wird dor Niederschlag abzentrifugiert, in Äthanol gelöst und zur Kristallisation abgekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden aus Wasser umkristallisiert, wobei 2,6 g Glycolipid B aus 3 Liter Kulturbrühe erhalten werden.
Beispiel 4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 1Ol45 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß das Medium nach lOstündiger Züchtung mit 500 (f/ml FeSO4"7H2O und 50 £-/ml CoSO4-TH2O versetzt wird. Die Züchtung wird nach 48 Stunden abgebrochen. Mach Extraktion der Kulturbrühe mit Essigsäureäthylester v/erden pro Liter 4,5 g Glycolipid A und 5,2 g Glycolipid B erhalten.
Beispiel 5
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß 5 % Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Nach 24stündiger Züchtung wird das Medium mit 5 % Glucose versetzt. Die Züchtung wird nach 55 Stunden abgebrochen. Nach der Extraktion der Kulturbrühe mit Essigsäureäthylester werden pro Liter 2,1 g Glycolipid A und 3,5 g Glyco-
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- 11 lipid B erhalten.
Beispiele
Ein 5 Liter fassender Fermenter aus Glas, der 3 Liter eines Mediums enthält, das mit der Ausnahme, daß Glycerin anstelle von η-Paraffin verwendet wird, dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1 hat, wird mit Pseudomonas fluorenscens ATCC 15453 beimpft. Die Züchtung wird 72 Stunden bei 3O°C unter Rühren mit 600 UpM und einer Belüftung von 1 Liter sterilisierter Luft/
und liinute
Liter Kährmedium / durchgeführt. Die aufgearbeitete Kulturbrühe enthält pro Liter 3,Og Glycolipid A und 7,0 g Glycolipid B.
Beispiel7
Die Untersuchung des neuen Glycolipids A ergab, daß diese Verbindung die folgenden Eigenschaften hat:
(1) Löslichkeit:
Löslich in Essigsäureäthylester, Aceton, Methanol, Äthanol, Diäthylather, Wasser (alkalisch) und n-Butanol; unlöslich.in angesäuertem Wasser.
(2) Farbreaktion:
Anthron-Reaktion? positiv
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion: positiv alkalische Silbernitrat-Reaktion: negativ Ninhydrin-Reaktion: negativ.
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(3) Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel:
Fließmittel Rf-Wert
Chloroform:Methanol:Essigsäure
80 : 15 : 5 0,73 - 0,85
90 :. 5 : 5 0,50
(4) Schmelzpunkt:
wurde nicht bestimmt.
(5) Antibiotische Wirkung:
die minimale Heramkonzentration gegen Bacillus subtilis beträgt 10 "bis ^O jug/ml
Die antibiotische Aktivität ist 10- bis 20 fach höher als die des .Glycolipids B.
(6) Akute Toxizität:
etwa 200 mg/kg (Maus, intravenös).
(7) Wirkung gegen Mycoplasmen:
2,04 cm (10 mg/ml wäßrige Lösung) nach der Disk-Methode.
(8) InfrarotSpektrum:
in der· Zeichnung dargestellt
209817/163 9 BAD ORIGINAL

Claims (8)

- 13 Patentansprüche
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung rhamnosehaltiger Glycolipide, dadurch gekennzeichnet , daß man ein rhamnosehaltige Glycolipide produzierendes Bakterium der Gattung Pseudomonas in einem wäßrigen, mindestens eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium bei pH-Werten von 4
aerob
bis 10 und Temperaturen von 25 bis 37 C-^züchtet und die Glycolipide aus der Kulturbrühe isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Pseudomonas fluorescens ATCC 15453, Pseudomonas putida ATCC 4359, Pseudomonas cruciviae ATCC 21283, Pseudomonas boreopolis ATCC 15452 und Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit einem n-Paraffin oder einer n-Paraffine enthaltenden Kohlenwasserstoff-i'raktion durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man während des Ztichtens den pH-Wert mit einer Harnstofflösung, einer wäßrigen Ammoniaklösung, oder einer Ammoniumcarbo-1 natlösung einstellt.
5. Verfahren nach Anspruch.1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man 06-L-Rhamnopyranosyl-ß-hydroxydecanoyl-ß-hydroxy-
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decansäure herstellt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß .man 2-0-5(/-L-Rharanopyranosyl-3!>L-rhamnopyranosyl~ß-hydroxy-· decanoyl-ß-hydroxydecansäure herstellt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadui'ch gekennzeichnet, daß man die Glycolipide durch Ansäuern der Gärmaische> Abzenfcri· fugieren der Zellen und anderer hochmolekularer Verbindungen, Extrahieren der schwachsauren Kulturbrühe mit organischen Lösungsmitteln und Chromatographieren des konzentrierten Extrakts isoliert.
8. cO-L-Rhamnopyranosyl-B-hydroxydecanoyl-B-hydroxydecansaur-e.
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