DE2002048B2

DE2002048B2 - Verfahren zur Herstellung von Citronensäure

Info

Publication number: DE2002048B2
Application number: DE2002048A
Authority: DE
Inventors: Shunichi Kyogo Akiyama; Hideo Osaka Fukuda; Yasuhiro Hyogo Sumino; Takashi Hyogo Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-01-22
Filing date: 1970-01-17
Publication date: 1979-04-05
Also published as: FR2028886A1; DE2002048A1; DE2002048C3; US3689359A; NL7000842A; IT1055511B; NL168553B; BE744416A; GB1297243A; JPS496117B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure.

Für Citronensäure besteht ein großer Bedarf. Sie wird beispielsweise als Säuerungsmittel in Getränken und in pharmazeutischen Sirupen verwendet. Für die Herstellung von Citronensäure durch Fermentation sind Verfahren, bei denen Mikroorganismen wie Pilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus usw. verwendet werden, bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen und Patenten beschrieben. Bei diesen Verfahren ist man jedoch stets auf die Verwendung von Zuckern und anderen teuren Kohlenstoffquellen angewiesen, und die Fermentationsdauer ist sehr lang und beträgt 5 bis 12 Tage.

Es ist bekannt, daß verschiedene Hefen die Fähigkeit haben, Citronensäure in einem Medium anzureichern, das Kohlenwasserstoffe enthält. Diese Hefen verbrauchen jedoch im Laufe der Fermentation allmählich die gebildete Citronensäure, und die endgültige Ausbeute hängt von der Bilanz zwischen Produktion und Verbrauch von Citronensäure ab. Aus diesem Grunde war die auf die eingesetzten Kohlenwasserstoffquellen bezogene Ausbeute an Citronensäure nie so gut, wie dies wünschenswert wäre.

In Untersuchungen des Stoffwechsels von Pilzen der Gattung Candida gelang der Anmelderin die Isolierung gewisser Mutanten, denen die Fähigkeit fehlt, Citronensäure zu verwerten, und die Kohlenwasserstoffe unter Bildung und Anreicherung von Citronensäure in guter Ausbeute zu verwerten vermögen. Der Erfindung liegen diese Untersuchungen zugrunde.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.

Die Herstellung von Citronensäure nach dem Verfahren gemäß der Erfindung hat zahlreiche Vorteile. Vor allem ist die Ausbeute äußerst hoch. Es wird angenommen, daß diese verbesserte Ausbeute der Unterdrückung der Bildung anderer organischer Säuren, hauptsächlich Isocitronensäure, zuzuschreiben ist die andernfalls fast in einer ebenso großen Menge wie die Citronensäure durch Verbrauch der gewünschten Citronensäure gebildet würden. Der zweite Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die Fermentation in verhältnismäßig kurzer Zeit beendet ist Drittens ist es äußerst' leicht, den Zeitpunkt der Ernte zu bestimmen. Die Fermentation kann durchgeführt werden, ohne eine Überfermentation zu befürchten, da die einmal gebildete Citronensäure vom Mikroorganismus nicht verbraucht wird. Dies sind erhebliche Vorteile in der Fermentationsführung. Ferner wird durch die ungewöhnlich niedrigen Konzentrationen anderer organischer Säuren, die als Nebenprodukte gebildet werden, die Isolierung der Citronensäure in gereinigter Form aus der Kultur stark erleichtert Beim Verfahren gemäß der Erfindung ist das Verhältnis von Citronensäure zu Isocitronensäure gewöhnlich nicht niedriger als 9 :1.

Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Citronensäure in guter Ausbeute bei leichter Fermentationsführung, Isolierung und Reinigung der gewünschten Citronensäure.

Die gewünschten Mutanten, die Citronensäure nicht zu verwerten vermögen und die oben genannten Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle unter Bildung von Citronensäure zu verwerten vermögen, können durch spontane oder induzierte Mutation erhalten werden. Die Mutation kann beispielsweise durch Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Kobalt 60, Röntgenstrahlen und anderen energiereichen Radikalen oder durch chemische Behandlung mit Mutagenen wie NaNO₂, H₂O₂, N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin und Acryflavin erreicht werden.

Wenn ein Mikroorganismus unter einigen oder mehreren der nachstehend genannten Bedingungen nicht zu wachsen vermag, gilt er im Sinne der Erfindung als »unfähig, Citronensäure zu verwerten«, obwohl noch die Möglichkeit besteht, ihn bei weiterer Bebrütung zu züchten.

1) Medium	%
Trinatriumcitrat	0,05
NH₄NO₃	0,1
NH₄Cl	0,1
KH₂PO₄	0,1
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05
Agar	2,2

Notwendige Nährstoffe, wie Vitamine, Aminosäuren, Nucleinsäurebestandteile usw. werden in Fällen zugesetzt, in denen der untersuchte Mikroorganismus solche Stoffe für sein Wachstum benötigt.

pH 6,5

2) Kulturbedingungen

Bebrütung 2 Tage bei 28°C.

	20 02 048	Vitamine, Ami	sind auch solche Mutanten geeignet,	fehlt, Citronen-	Ursprungsstamm Nr.	Candida sp.	4	Vergleich zu den Ursprungsstämmen	Candida sp.
		nosäuren, Nucleinsäurebestandteile usw. für die Zwecke	vorausgesetzt, daß ihnen die Fähigkeit	säure auszunutzen, und daß sie Kohlenwasserstoffe als	Candida lipolytica	IFO 1461			164
	Fähigkeit, Gitro-	der Erfindung		IFO 1437				IFO 1460
3	Zellen aufzunehmen. Andere brauchen		ί ATCC 20114)		einzige Kohlenstoffquelle zur Bildung von Citronensäu
Einigen dieser Mutanten fehlt die	gewisse Nährstoffe, z. B. verschiedene		Mutantenstamm Nr.	Candida sp.	re zu verwerten vermögen.	Candida tropicalis	Candida sp.
nensäure in die		Candida lipolytica	H-22 IFO 1464		IFO 0589	164 K-I IFO 1504
	L-36 IFO 1463	Rund bis	Einige der vorstehend genannten Mutanten und ihre	(ATCC 201J5)	Rund bis ellip
	Rund bis ellip	elliptisch;	mikrobiologischen Merkmale sind in der folgenden		tisch, Anfangs
	tisch; Pseudo-	Pseudomycel,	5 Tabelle im	Candida tropicalis	stadium,
Malzextrakt	mycel, echtes	echtes Mycel	aufgeführt	9 M IFO 1505	Pseudomycei und
25°C	Mycel			Rund bis ellip	echtes Mycel
3 Tage				tisch, Anfangs
		Elliptisch,	Candida sp.	stadium,	Rund bis ellip
	Elliptisch,	echtes Mycel,	IFO 1462	Pseudomycel und	tisch, echtes
	echtes Mycel	Pseudomycel		echtes Mycel	Mycel und
Malz-Schräg					Pseudomycel
kultur,		Oval bis	Candida sp.	Rund bis ellip	Rund bis ellip
25°C	Rund bis ellip	elliptisch,	FRZ-3 IFO 1465	tisch, echtes	tisch, keine
3 Tage	tisch, geister	echtes Mycel,	Rund bis ellip	Mycel und	Pellicula ge
Malzextrakt	haft, Mycel ist	keine Pelli	tisch, Anfangs	Pseudomycel	bildet, Ober
25°C,	fragmentiert.	cula gebildet;	stadium,	Rund bis ellip	flächenwachstum
17 Tage	Trocken mit Fal	Hefering	Pseudomycel	tisch, gelegent
	ten, in 2-3 Tagen		und echtes	lich dünne
	gebildet, keine		Mycel	Pellicula gebil
	Pellicula	Hefering, der	Rund bis ellip	det, Hefering	Dünne Pellicula
	Sediment am 17.	zur Ablösung	tisch, echtes		gebildet.
	und 37. Tag fest	neigt; keine	Mycel und		Hefering
Malzextrakt	gestellt	Pellicula	Pseudomycel
25°C,			Rund bis ellip	Hefering keine
37 Tage		Weiß bis	tisch, echtes	Sedimentations	Trüb, gelb,
	Unklares Gelb,	gelb, trocken	Mycel, dünne	insel,	leicht faltig,
	faltig, trocken,	und filmartig	Pellicula	Pellicula	feucht
Malzagar	Medium wird
17°C	braun			Blaßgelb oder
1 Monat	Mutantenstamm	Candida sp.		weiß bis gelb,	Candida sp. 64 K-I
	Candida lipolytica	H-22 IFO 1464		trocken, »liable«	IFO 1504
	L-36 IFO 1463		Hefering,
		+	Sedimentations		-
	-	+	insel, Pelli	Candida tropicalis	-
Fermentation	-	+	cula, trübes	9 M IFO 1505	-
I Glucose	-	-	Medium		-
I Galactose	-	±~ +	Weiß bis	+	-
I Maltose	-		gelb, trocken	+
I Lactose			und filmartig	+
i Saccharose		±
	+
Candida sp.
FRZ-3 IFO 1465

+
+
+
-
±~ +

	5	20 02 048 6	Candida sp. 64 K-I
Fortsetzung			IFO 1504
	Mutantenstamm
	Candida lipolytica	Candida sp. Candida sp. Candida tropicalis	₊
	L-36 IFO 1463	H-22 IFO 1464 FRZ-3 IFO 1465 9 M IFO 1505	±
Assimilation			+
Glucose	+	+ + +	—
Galactose	-	+ + +	-
Maltose	-	+ + +	—
Lactose	-	- - -	blau
Saccharose	-	+ + +	⁺
Ausnutzung von Kalium nitrat			_
Lacmusmilch	peptonisiert	blau blau blau
Zersetzung von Escurin	±	+ + +
Säurebildung	+	+ + +

Die Kohlenwasserstoffe werden im allgemeinen in einer solchen Menge verwendet, daß die Normalparaffine mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül etwa 3 bis 20 Vol.-% des Kulturmediums ausmachen.

Da diese Kohlenwasserstoffe in Wasser schwer löslich sind, erfolgt die Zugabe zu einem wäßrigen Kulturmedium unter Rühren oder Schütteln, wobei eine Suspension gebildet wird, die sehr feine Teilchen enthält. Gegebenenfalls kann ein Suspendiermittel, z. B. ein oberflächenaktives Mittel vom Typ des Polyoxyäthylensorbitanmonostearats verwendet werden.

Diese Kohlenwasserstoffe sind als solche als Kohlenstoffquellen geeignet, jedoch können gegebenenfalls gebräuchliche Kohlenstoffquellen, z. B. Kohlehydrate (z. B. Glucose) zusammen mit den Kohlenwasserstoffen verwendet werden.

Als notwendige Stickstoffquellen können verschiedene anorganische Ammoniumsalze, z. B. NH4CI, (NH₄J₂SO₄, (NH₄J₂HPO₄, NH₄OH und NH₄NO₃, Harnstoff, die Ammoniumsalze von verschiedenen organischen Säuren, z. B. Ammoniumacetat, und organische stickstoffhaltige Materialien, z. B. Trockenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Sojabchnenmehl, Maisquellwasser, Pepton und Brennerreirückstände verwendet werden. Diese Stickstoffquellen können allein oder in Kombination verwendet werden.

Außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kann das verwendete Medium gegebenenfalls beliebige anorganische Salze, die üblicherweise verwendet werden, z. B. Salze von Eisen, Mangan, Magnesium und Calcium, und verschiedene Nährstoffe, die für das Wachstum des Mutanten notwendig sind, enthalten.

Der pH-Wert des Mediums kann innerhalb eines weiten Bereichs liegen, der das Wachstum der verwendeten Mutanten ermöglicht. Im allgemeinen liegt der pH-Wert im Bereich von 2 bis 7, wobei ein Wert von 3 bis 6 besonders bevorzugt wird. Wenn im Laufe der Kultivierung der pH-Weirt durch die gebildete Citronensäure fällt, ist es zweckmäßig, den pH-Wert des Mediums von Zeit zu Zeit unter Fortsetzung der Kultivierung zu korrigieren. Zu diesem Zweck kann die Kultivierung unter gelegentlicher 2^ugabe eines Neutralisationsmittels, z. B. CaCO₃, Ca(OH)₂, NH₄OH, NaOH oder Na₂CO₃ durchgeführt werden. Es ist auch möglich, dem Medium eine ausreichende Pufferwirkung zu verleihen, indem beispielsweise CaCO₃ vorher in einer Menge zugesetzt wird, die dem möglichen Abfall des pH-Wertes entspricht

Die Bebrütungstemperatur kann in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Mutanten innerhalb gewisser Grenzen variieren. Sie liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 35° C, insbesondere im Bereich von 25 bis 3O⁰C. Da das Verfahren gemäß der Erfindung im allgemeinen unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, kann unter Rühren in einem Tank, der für den Zweck geeignet ist, gearbeitet werden. Wenn eine Schaumbildung verhindert werden muß, ist es zweckmäßig, bekannte Schaumverhütungsmittel wie Polyoxypropylenderivate, Sojabohnenöl, Siliconöl oder Schmalzöl zuzusetzen.

Die in der Kulturbrühe angereicherte Citronensäure wird nach an sich bekannten Verfahren wie Filtration, Zentrifugieren, Erhitzen, Ausfällung, Kristallisation, Entfärbung und Trocknung sowie Säulenchromatographie isoliert Diese Verfahren können allein oder in Kombination durchgeführt werden. Falls erforderlich, wird der pH-Wert der Kulturbrühe eingestellt. Wenn beispielsweise unlösliches Calciumcitrat in der Kulturbrühe vorhanden ist, ist es zweckmäßig, die Brühe mit Salzsäure anzusäuern, um das Salz löslich zu machen, worauf die Abtrennung fortgesetzt wird.

Gegebenenfalls wird die Kühlflüssigkeit nach Abtrennung von den Hefezellen mit Natriumhydroxyd, Calciumcarbonat, Kalkmilch od. dgl. neutralisiert. Die hierbei erhaltene Lösung wird bei Raumtemperatur (etwa 15 bis 30⁰C) oder unter Erhitzen stehengelassen und anschließned filtriert oder zentrifugiert und getrocknet, wobei Calciumcitrat als weißes Pulver erhalten wird. Dieses Pulver wird, falls erforderlich, nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Neutralisation, weiter gereinigt.

Wenn das Pulver aus einem Gemisch von Citronensäure und (+)-Isocitronensäure besteht, kann die Trennung beispielsweise wie folgt vorgenommen werden: Das in heißem Wasser gelöste Pulver wird heiß abgenutscht, wobei Calciumsalze der Citronensäuren erhalten werden, worauf neutralisiert und filtriert wird. Das Filtrat wird bis zur Konsistenz eines Sirups

eingeengt und dann der Säulenchromatographie an .Kieselgel unterworfen, wobei ein Gemisch von n-Butanol und Chloroform als Elutionsmittel verwendet wird und die Citronensäure und die ( + )-Isocitronensäure in verschiedenen Fraktionen abfließen.

Die Citronensäure und (+)-Isocitronensäure werden nach der Pentabromacetonmethode (S e i k a g a k u, 27, 72 [1955J und nach der enzymatischen Methode (Methoden der enzymatischen Analyse von Günther S i e b e r t, Seite 318 [Verlag Chemie]) bestimmt.

Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Prozentsätze sind auf der Basis Gewicht/Volumen berechnet. Die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten der erzeugten Citronensäure pro Gewichtseinheit des verbrauchten η-Paraffins angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Die Zahlen, die hinter den Namen der Hefen in der obigen Tabelle sowie in den Beispielen nach der Abkürzung »IFO« angegeben sind, sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osakajapan.

Beispiel 1

Mit einer Kultur von Candida lipolytica L-36 (IFO 1463), die von Candida lipolytica IFO 1437 abgeleitet worden ist, werden 10 Raumteile eines sterilisierten wäßrigen Mediums (pH 6,0) beimpft, das ein überwiegend aus η-Paraffinen mit 13 bis 15 C-Atomen (2%) bestehendes Kohlenwasserstoffgemisch, 0,2% NH₄Cl, 0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,001% MnSO₄-7 H₂O, 0,001% FeSO₄ ■ 7 H₂O und 0,5% CaCO₃ enthält und dann 48 Stunden bei 28° C unter Rühren und Belüftung bebrütet wird. 10 Raumteile der erhaltenen Vorkultur werden in 100 Raumteile eines Mediums überführt, das 6% der oben genannten n-Paraffine, 0,2% NH₄Cl, 0,01 % KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,001% MnSO₄ ■ 7 H₂O, 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O, 0,1% Trockenhefe und 0,5% CaCO₃ enthält Das geimpfte Medium wird unter Belüftung und Rühren bei 28° C bebrütet Am zweiten Tag werden 0,5% CaCO₃ und am dritten Tag 3% CaCO₃ aseptisch zugesetzt um den pH-Wert des Mediums zu korrigieren. Die Kultivierung wird bis zu einer Gesamtdauer von 5 Tagen fortgesetzt Die Ausbeuten an Citronensäure, die in der Brühe gebildet und angereichert worden ist und an Isocitronensäure, die in der höchsten Konzentration aller als Nebenprodukte gebildeten organischen Säuren vorliegt sind nachstehend zusammen mit den entsprechenden Ausbeuten genannt, die durch Kultivierung des Ursprungsstammes erzielbar sind.

Ursprungsstanrm

Mutant

Citronensäure

Ausbeute, mg/ml 22,8

Auf Kohlenstoff- 38

quelle bezogene

Ausbeute, %
Isocitronensäure

Ausbeute, mg/ml 27

Auf Kohlenstoff- 45

quelle bezogene

Ausbeute, %

69,8
115,4

1,36
2,1

Ein Teil der vorstehend beschriebenen Kultur wird weitere 3 Tage bis zu einer Gesamtdauer von 8 Tagen bebrütet. Nach dieser Zeit erreicht die vom Mutanten angesammelte Citronensäure 69,1 mg/ml. Im Gegensatz hierzu fällt die angesammelte Menge beim Ursprungsstamm auf 13,2 mg/ml.

Am 5. Tag der Kultivierung werden 100 Raumteile der Kultur abgenommen und durch Zusatz von 3 n-HCi auf pH 2,0 eingestellt, worauf zur Entfernung der Zellen zentrifugiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 5 n-NaOH auf pH 6,8 eingestellt und 30 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach Abkühlung der Flüssigkeit wird das Sediment abfiltriert und in strömender Luft getrocknet. Hierbei wird Calciumcitrat erhalten, das 6,3 Gew.-Teile Citronensäure enthält. Das Salz wird in 40 Raumteilen Wasser suspendiert und mit 5 n-H₂SO₄ neutralisiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 1 Gew.-Teil Aktivkohle versetzt und anschließend filtriert

Das erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Konsistenz eines Sirups eingeengt. (Wenn Calciumhydroxyd ausgefällt wird, wird es während der Einengung abfiltriert) Das Konzentrat wird im Kühlschrank stehengelassen, wobei 5,7 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) gebildet werden.

Beispiel 2

Ein von Candida sp. IFO 1461 abgeleiteter Mutant H-22 (IFO 1464), der Citronensäure nicht verwertet (und L-Milchsäure ebenfalls nicht zu verwerten vermag) wird verwendet, um 100 Raumteile eines sterilisierten Mediums (pH 6,5) zu impfen, das 8% eines Gemisches von η-Paraffinen mit 12 bis 18 C-Atomen (Reinheit 92%), 03% NH₄Cl, 0,01% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,050/o FeSO₄ · 7 H₂O und 0,5% CaCO₃ enthält. Die Bebrütung wird 3 Tage bei 28° C vorgenommen. Von Zeit zu Zeit wird eine 14%ige NH₄OH-Lösung zugesetzt, um die gelblichgrüne Farbe des Mediums aufrechtzuerhalten (d.h. den pH-Wert zwischen 4 und 5 zu halten). Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen mit den Ergebnissen genannt, die bei Verwendung des Ursprungs-Mikroorganismus erreichbar sind.

Ursprungsstamm

Mutant

Citronensäure
Ausbeute, mg/ml 49

Auf Kohlenstoff- 61,2

quelle bezogene
Ausbeute, %

Isocitronensäure
(das in größter Menge
vorhandene Nebenprodukt)

Ausbeute, mg/ml 52

Auf Kohlenstoff- 65

quelle bezogene
Ausbeute, %

112
138

1,3
1,7

Ein TeD der vorstehend beschriebenen Kultur wird weitere 2 Tage bebrütet Nach dieser Zeit hat die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Mutanten gebildet worden ist, 109 mg/ml erreicht Es ist bemerkenswert, daß die entsprechende Zahl für den Ursprungsstamm nur 25,4 mg/ml beträgt

Am dritten Tag wird die vorstehend beschriebene Kultur zur Entfernung des Mikroorganismus filtriert. Das Filtrat wird durch Zusatz von Ca(OH)2 auf pH 7,0 eingestellt und 30 Minuten unter leicht vermindertem Druck gekocht. Nach dem Kochen wird das Sediment abfiltriert und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Hierbei werden 9,3 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) erhalten.

Beispiel 3

Der von Candida sp. IFO 1462 abgeleitete Mutant Candida sp. FRZ-3 (IFO 1465) wird auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert. Am dritten Tag der Kultivierung wird die Kultur auf Citronensäure und als Nebenprodukt gebildete Isocitronensäure analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.

Ursprungsstamm

Mutant

Citronensäure

Ausbeute, mg/ml 31,5 86

Auf Kohlenstoff- 39,4 107,5

quelle bezogene
Ausbeute, %

Isocitronensäure
Ausbeute, mg/ml 39 0,8

Auf Kohlenstoff- 48,7 1,0

quelle bezogene
Ausbeute, %

Die vorstehend beschriebene Kultur wird weitere 3 Tage bebrütet Nach dieser Zeit beträgt die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Mutanten gebildet worden ist, 84 mg/ml, d. h. sie ist gegenüber der Zahl am dritten Tag im wesentlichen unverändert Im Gegensatz hierzu fällt die Ausbeute an Citronensäure, die durch den Ursprungsstamm gebildet worden ist, auf 19 mg/ml.

Am dritten Tag der Kultivierung werden 100 Raumteile der Kultur des Mutanten abgenommen und auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise behandelt wobei 7,4 Gew.-Teile Kristalle von Citronensäure (als Citronensäureanhydrid) erhalten werden.

Beispiel 4

Candida sp. K-I (IFO 1504) (von Candida sp. 164 IFO 1460 abgeleitet) und Candida tropicalis 9M (IFO 1505) (von Candida tropicalis [IFO 0589] abgeleitet) werden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert Am dritten Tag der Kultivierung werden die Kulturen auf Citronensäure und Isocitronensäure analysiert. Die Ergebnisse sind nachstehend im Vergleich zu den mit

ίο den Ursprungsstämmen erhaltenen Ergebnissen genannt.

Citronensäure Isocitronensäure

Aus- Auf Kon- Aus- AufKoh-

beute lenstoff- beute lenstoffquelle quelle

bezogene bezogene

Ausbeute Ausbeute

mg/ml % mg/ml %

9	11,2
16	20
2	2,5
32	40

Candida 81 100,1

sp. K-I
(IFO 1504)

Candida 32 30

sp. 164
(IFO 1460)

Candida 88 110

tropicalis
9 M (IFO 1505)

Candida 46 57,5

tropicalis

(IFO 0589)

aus BE-PS 7 16 247

Wie man aus den Zahlenwerten ersieht sind sowohl die Ausbeuten als auch die auf Kohlenstoffquelle bezogenen Ausbeuten bei den Mikroorganismen gemäß der Erfindung überraschend erheblich höher bei sehr verringerter Ausbeute an Isocitronensäure als bei dem Mikroorganismus gemäß der BE-PS 7 16 247. Darin liegt der erhebliche technische Fortschritt der vorliegenden Erfindung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Citronensäure anreichernde Hefe der Art Candida lipolytica oder Candida tropicalis oder Candida sp. H 22 (IFO 1464), Candida sp. FRZ-3 (IFO 1465) oder Candida sp. 164 K-I (IFO 1504), die Kohlenwasserstoffe zu verwerten und Citronensäure nicht zu verwerten vermag in ein wäßriges Kulturmedium impft, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle wenigstens ein Normalparaffin mit 9 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält, die Kultur bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 7 bebrütet bis sich Citronensäure in der Kulturbrühe stark angereichert hat, und die so angereicherte Citronensäure aus der Kulturbrühe gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen zwischen 20 und 35° C vornimmt

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Kulturmediums zwischen 3 und 6 hält

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 —3, dadurch gekennzeichnet daß man als Hefe Candida lipolytica L-36 (IFO 1463) verwendet.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 —3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida tropicalis 9 M (IFO 1505) verwendet.