DE2357345A1

DE2357345A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von hefe und deren verwendung

Info

Publication number: DE2357345A1
Application number: DE2357345A
Authority: DE
Inventors: Kenji Kato; Kenji Kida; Yoshiro Masuda; Meiseki Nakanishi; Yoshihiro Takayama
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1972-11-17
Filing date: 1973-11-16
Publication date: 1974-05-22
Also published as: FR2207188A1; NL7315575A; JPS5610028B2; GB1417074A; US3868305A; CS177871B2; JPS4971188A; FR2207188B1

Description

"Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Hefe und deren Verwendung^ir

Priorität: 17. November 1972, Japan, Nr, 115 270/72

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefe und deren Verwendung.

Es sind eine Reihe von als Pröteinquellen verwendbare Hefen bekannt, die neben saccharoiden Materialien η-Paraffine verwerten können. Jedoch weisen Hefezellen, die unter Verwendung von η-Paraffinen als Kohlenstoffquellen hergestellt sind, viele Nachteile auf. Beispielsweise haftet diesen Hefen häufig ein Petroleurageruch an, der durch Waschen nur schwierig entfernt werden kann. Außerdem muß wegen der geringen Löslichkeit der η-Paraffine und wegen des hohen Sauerstoffbedarfs eine hohe Rührenergie während des Hefewachstums aufgebracht werden₀ Schließlich- tritt bei der Herstellung einer Einheitszelimen^e

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eine erhöhte Wärmeentwicklung auf, welche auf die Abwesenheit von Sauerstoff im Paraffinmolekül zurückzuführen ist, was ein-Ansteigen der Energiekosten für den Sauerstoffnachschub und die Wärmeabführung bewirkt. . .

Im Verlauf der Untersuchungen zur vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß Äthanol eine wertvolle Kolilensto ff quelle zur

Nahrungs- und Herstellung von Hefen ist. Da Äthanol in/Futtermitteln erlaubt .

ist, brauchen geringe Restmengen an Äthanol in der Hefe nicht entfernt v/erden. Außerdem ist Äthanol vollständig wasserlöslich

im Vergleich zu n-Psraffinen

und weist/einen geringen Sauerstoffbedarf und eine geringe Wärmeentwicklung auf. Dies ist auf die Anwesenheit des im Äthanolmolekül enthaltenen Sauerstoffatoms, das in η-Paraffinen nicht vorhanden ist, zurückzuführen. Aus diesen Gründen ist Äthanol als-wertvolle Kohlenstoffquelle zur Züchtung von Hefen zu betrachten. Außerdem ist der Preis von Äthanol in letzter Zeit gesunken, da es großtechnisch durch Wasseranlagerung an Äthylen hergestellt werden kann.

Die Züchtung von Hefestämmen wird im allgemeinen bei Temperaturen von etwa 30 bis etwa höchstens 35°C durchgeführt. Es ist aber wünschenswert, die Züchtung bei etwa M-O⁰G durchzuführen, um die Kosten für die Kühlung zu reduzieren.

Bei der großtechnischen Herstellung von Hefezellen müssen Ver-

durch
imreinigungan / infektiöse Mikroorganismen möglichst verhindert werden. Daher ist es erwünscht, die Züchtung unter sterilen Bedingungen durchzuführen, was aber mit sehr hohen Kosten für die

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entsprechenden Einrichtungen verbunden ist. Es wurde festgestellt, daß sich Verunreinigungen durch infektiöse Mikroorganismen durch Einstellen des pH-Wertes des Mhrmediums unter 4,0 auf ein Minimum senken lassen.

Aufgabe der Erfindung ist es, Hefestamme zur Verfügung zu stellen, die unter Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle rasch und unter hohen Zellausbeuten gezüchtet werden können. Die Züchtung soll auch bei einer Zuchtungstemperatur von 40°C und einem pH-Wert des Hähermediums unter 4,0 unter hoher Wachstumsgeschwindigkeit und mit guten Zellausbeuten durchführbar sein. - ■

Bei der Suche nach Hefestämmen, die den vorgenannten Anforderungen genügen, wurde festgestellt, daß viele Hefen unter diesen Bedingungen überhaupt nicht .wachsen oder nur ein so geringes Wachstum zeigen, daß sie praktisch nicht zu verwerten sind.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Hefezellen, das dadurch gekennzeichnet ist,

EY-IOlO daß man Candida ethanothermophilum/ATCC 20 380 oder Candida

EY-1130
acidothermophiluin/ATCG 20 38Ί in einem Äthanol enthaltenden

Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet.

In Tabelle I sind die erfindungsgemäßen Hefestamme näher beschrieben. .

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ο to οο ro

Tabelle I Morphologische und physiologische Eigenschaften

Stamm *	C. ethanothermophilum ΞΥ-1010	2,5 - 5 x 5 - 10	C, acidothermophilum EY-1130
ATCC Nr.	20380	oral	20381
Hinterlegungs-Nr. in Japan . (Technical Research Institute of Microbial Industry)	1677 '	nein	1679
CBS L^Tr.	^; 6520	reichlich	6521
I. Mikroskopische Beobachtunge	η
Größe (u) *1	rund	3 - 5x5- 10
Gestalt . *1	wellenförmig nein	oval
Ascosporenbildung *2	nein • rauh ■	nein
Pseudomycel *3	spärlich
II.Kolonien "4
Gestalt	rund
Rand erhabener Vertikal— schnitt	glattrandig oder leicht well f örinig ja
. Glanz L oberfläche	matt ■ glatt

ο co OO

ο cn

Stamm,	0. ethano.thermophilum EY-1010	C. acidothermophilum EI-1130	gut ,
III. Aufstre'ichkultur . *5		•	cremefarben
Wachstum	gut
Pigment	cremefarben	nein
IY. Züchtung in flüssigem Medium		nein
Hautbildung	da ".	^a
Trübung ■ ■ ,	nein .
Sediment	Ja	aerob , · ■
V. Physiologische Eigenschaften		8 - 4-8⁰C
(1) Sauerstoffbedarf	aerob	35 - 4O⁰C
(2) Wachstumstemperatur	8 - 48°C	2 - 10
.(3) Optimale Wachstumstempe- ; ' . ■ ratur . , ■ . . _;. .. ·	35 _ 40⁹C	3- 8
^: (4) Wachstum "bei pH-Wert'	2-10
(5) Optimales Wachstum bei pH-Wert	3 - 8 ■ ,

VJi
I

CJ

cn

CO

cn

Stamm

(6) Vitaminbedarf _

(7) Carotenoidbildung

(8) Osmo-Toleranz (KaCl-Test)

(9) Stickstoffverwertung " Kaliumnitrat Harnstoff ·

Ammoniumsulfat Asparagin , Pepton

(10) Lackmusmilch-Test

(11) Gelatinenydrolyse

(12) Bildung yon überschüssiger ■Säure

(13) Bildung von stärkeähnlichen Verbindungen

Fettspaltung ' (15) Arbutinspaltung

G. ebhanothermophilum EY-1010

nein nein 10 - 12%

Blaufärbung

nein

C. acido the rmophilum EY-1130

nein nein - 12%

keine Veränderung

nein nein

nein nein nein

cn •-j co

OO PO

cn

Stamm	O. ethanothermophilum ET-IO^-IO	C. acidothermophilum EY-1130	■	+
VI. Bildung von Kohlenhydraten		-
Glucose	• +	. - ■ .
Galactose	-	-
Saccharο se	-
Maltose '
Lactose		—
Raffinose	-	+
Trehalose	-	+
VII. Verwertung von Kohlenstoff- ' quellen D-Glucose	+	' -
D-GaIactose	+ ·	+
L-Sorbose	■ -	—
Saccharose	+
Maltose.	—

L·

cn co cn

(O 00 ro

cn

Stamm	Cellobiose	C. eth.anothermoph.ilum EY-1010	0. acidoth.ermoph.ilum EY-1130
Trehalose	-	'-
Lactose	-	—
Melibiose	-	-
Eaffiriose	-	-
Melecitose	.+	+ ·
Inulin	+	+
Lösliche Stärke	' + ■	+
Xylose	-	-
L-Arabinose	' +	-
D-Ribose	-	-
Glycerin >		—
Erythrit	+	+
Adonit	-	-
Galactit	-	-
-	—

OJ

N3

cn co cn

Stamm	Sorb it	0. ethanothermophiium EI-1Q10	-	0. acidothermophilum EI-1150
■Ina sin	■ · .	-	- ■ ■
s*. -Methylglucosid
Salicin		-
Läctat ·	H-
Succinat	+ .	+
Oitrat	₊	+
lthanol	+
₊

Beobachtet nach dreitägiger Züchtung bei 25⁰O, in einem Malsextraktmerdium (Ballg,-Grad 10, pBt-VJert ^N5,0) .

Gips,■Gorodkowa-Agar ' ■ ·

Objektträgerkultur auf, Kartoffelglucose-Agar-Medium Malzextrakt-Medium (Ballg,-Grad 10, pH-Wert 5,0) mit 2% Agar Gleiches Medium wie in *4

Gleiches .Verfahren wie in *1 ,

Malzextrakt-Medium* (BaI Ig.-Grad 10, pHr-Wert 5,0), mit 20% Gelatine

unter Verwendung von Rindertalg .. .

cn Cn

Unter Berücksichtigung von "The Yeast", J. Loder S; J.l-J. Kreger-VanRij, 1970? wurde festgestellt, daß die "beiden erfindungsgemäßen Stämme zwei vei-schledene Arten der Gattung Candida, darstellen. Dies wird durch die morphologischen Eigenschaften, wie ovale Gestalt_t keine Sporenbildung und Bildung von Pseudo:r;/cel, gestützt. Weitere Hinweise sind die fehlende Bildung von "Odium" und physiologische Eigenschaften, wie fehlende Bildung von Carotenoiden, starken Säuren und stärkeähnlichen Verbindungen. . .

Aus den weiteren morphologischen und physiologischen .Untersuchungen ergibt sich, daß zu den Stämmen ΒΪ-1010 und EY-II30 bisher keine identischen oder ähnlichen.Stämme bekannt sind. Diese Stämme sind daher als neu anzusehen.

Aus einem Vergleich des Stammes EY-1010 mit dem Stamm EY-II30 ergibt sich, daß beide Stämme verschiedenen Arten angehören. Dies geht aus den verschiedenen morphologischen Eigenschaften der Kolonien, der Pseudomycelbildung und der Haut bildung sowie aus ihren unterschiedlichen physiologischen Eigenschaften, wie Verhalten gegen Lackmusmilch und Xylose hervor. Wie bereits aus Tabelle I hervorgeht, wurden die erfindungsgemäßen Stämme bei drei verschiedenen Hinterlegungsstellen hinterlegt:

1. Technical Research Institute of Microbial Industry,

Agency of Industrial Science &. Technology, Ministry of International Trade and Industry, Kr. I6.77 und 1679,

2. American Type.Culture. Collection, ATCC 20380 und 20JSI, 3· Centraalbureau Voor Schimmelcultures, Delft, Niederlande,

CBS 6520 und 6521. '

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Bei der Züchtung der erfindungsgemäßen Stämme beträgt die Äthanolkonzentration im Nährmedium im allgemeinen höchstens 5 Prozent und. vorzugsweise höchstens 2 Prozent.

Außer einer Kohlenstoffquelle werden andere !Nährstoffe verwendet, wie sie zur Züchtung von Hefen üblich sind. Als Stickstoffquel3ei können beliebige assimilierbare Stickstoffquellen verwendet werden, z.B. Sojabohnenmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, Mehl aus Baumwollsaat, Polypepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat, Harnstoff, Ammoniak oder dessen Salze. Als anorganische Salze können beispielsweise Salze der Phosphorsäure, Magnesium-, Kalium- oder Eisensalze verwendet werden. Gegebenenfalls können verschiedene anorganische oder organische Verbindungen, die das Wachstum.der Hefen begünstigen, dem Hährmedium zugesetzt werden.

Die Züchtung im erfindungsgemäBen Verfahren wird Vorzugspreise unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Züchtung kann chargenweise, halbchargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Die Züchtungstemperatur liegt vorzugsweise bei etwa 4ü°C, es können aber auch Temperaturen von 30 bis 35°C angewendet werden.

Bei der Wahl des pH-Werts des Nährmediums wird das.Material des Fermentationsbehälters berücksichtigt. Weiterhin soll der pH-Wert so gewählt werden, daß eine Verunreinigung durch infektiöse Mikroorganismen möglichst ausgeschlossen wird. Der pH-Wert liegt im. allgemeinen im Bereich von 2,5 bis 4-,O und vorzugsweise im

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Bereich von 3?O bis 3ι5·

Die Hefezellen können aus der Gärmaische nach, üblichen Verfahren abgetrennt und. gereinigt werden. Beispielsweise können die Zellen durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt werden und anschließend durch Vaschen mit Wasser oder gegebenenfalls anderen Waschflüssigkeiten gereinigt werden. Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß das Waschen mit Wasser ausreichend ist.

Nach dem Abtrennen und der Reinigung der Hefezellen können diese je nach ihrem Verwendungszweck- auf übliche Weise weiterbehandelt werden. Beispielsweise kommen Lagern im Rohzustand ohne läfeiterbehandlung, Erhitzen, Trocknen und Gefriertrocknen in Frage.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Hefen von hohem Nährwert unter Verwendung von Äthanol leicht großtechnisch herstellen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Hefen eignen sich zur Verwendung als Nahrungs- und Futtermittel bzw. als Zusätze zu Nahrungs- und Futtermitteln.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich Prozentangaben auf Gewicht pro Volumen.

Beispieli

Ein flüssiges Nährmedium, das 0,15 Prozent KH₂PO₄, 0,15 Prozent , 0,1 Prozent MgSO₄.7H₂O, 0,005 Prozent FeSO₄^TH₂O,

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0,001" Prozent MnSO₄^H₂O₅ 0,001 Prozent CaCl₂* 2ΙΙ2Ο, 0,1 Prozent Maisquellflüssigkeit und 0,025 Prozent (HH^)₂SO₄ enthält,· wird durch Zusatz vqn Schwefelsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt.

In ein 30 Liter fassendes ITermentationsgef aß werden I7 Liter des vorgenannten Mhrmediums gegeben. Nach 10minütiger Dampfsterilisation bei 120⁰C werden I70 g A'thanol zugesetzt. Sodann

v/erden. 200 cm einer Anzuchtkultur von Candida ethanothermophi-

ATCC 20"580 ■
Ium/zügesetzt, die durch 15stündiges· Züchten bei JO⁰C in einem flüssigen Nährmedium der vorgenannten Zusammensetzung (mit der Ausnahme, daß 0,4 Prozent 00(ΝΙί₂)₂ anstelle von (KH^)₂SO₄ verwendet wird und der pH-Wert 4,0 beträgt) hergestellt worden ist, als Inoculum unter aseptischen Bedingungen in das Fermentationsgefäß gegeben. Die Züchtung wird 13 Stunden bei einer !Temperatur von 40⁰C und einem pH-Wert von 3,5 "bei 5OO U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von I7 Liter/min durchgeführt.

Nach beendeter Züchtung wird eine 50 ml-Probe der Gärmaische 'entnommen und "10 Minuten bei 4000 Ü/min zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die so abgetrennten Zellen werden einmal iait destilliertem Wasser gewaschen und nochmals zentrifugiert. Sodann werden sie bei 7O⁰C und 20 Torr getrocknet. Man erhält . 0,42 g trockene Zellen, was 84 Gewichtsprozent des verwendeten Äthanols entspricht. Die spezifische Wachstumsgesehwindigkeit

-1

CyU max) bei der Züchtung beträgt 0,45 Stunde während

der logarithmischen Phase.

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Beispiele 2 und 3

Die Züchtung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine Züchtungstemperatur von 35°C anstelle von 4O°C angewendet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II Beispiel

Stamm

Zellausbeute
(Gew.%)

ι-max

(Std."')

2 3

Candida ethanothermophilum 85 Candida acidothermophilum 86

0,4-6 0,42

Beispiel 4 Die Züchtung wird im wesentlichen gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß beim Erreichen eines Zellgehalts von 8,0 g/Liter ein Bahrmedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 zusammen mit 1 Prozent Äthanol mit einer bestimmten Geschwindigkeit dem Fermentationsgefäß zugesetzt und gleichzeitig Gärmaische abgezogen wird, wobei eine Raumgeschwindigkeit

-1
von 5,1 Std. aufrechterhalten wird. Die entfernte Gärmaische wird gemäß Beispiel 1 behandelt. Man erhält pro 100 cm Gärmaische 0,93 g trockene Zellen. Die Analysendaten der so erhaltenen Zellen sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt.

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Tabelle III Zellanalyse

Feuchtigkeit

Gesamtstickstoff

Fett

Gesamtphosphor

Asche

Gesamtzucker

3,78 Prozent 8,46 Prozent 0,61 Prozent 1,49 Prozent 7,97 Prozent 29,10 Prozent

Tabelle IV Aminosäurezusammensetzung der Zellen

Ly s
His-Arg
Asp
Thr
Ser
Väl
Met
lie

10,6 Prozent

2.8 Prozent

5.9 Prozent 11,1 Prozent

6,1 Prozent

5.5 Prozent

5.6 Prozent 1,6 Prozent 5,0 Prozent

Leu	7,2	Prozent
Tyr	3,7	Prozent
Phe	4,2	Prozent
GlU	15,1	Prozent
Pro	2,4	Prozent
GIy	4,7	Prozent
AIa	6,1	Prozent
MH,	2,4	Prozent

100,0 Prozent

(Die Aminosäurereste mit Ausnahme von Try und Cys werden als 100 angesetzt.) ·■" '

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Beispiel 5

Die Züchtung wird gemäß Beispiel 4- durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von reinem Äthanol ein Hvdratationsprodukt von Äthylen (24,6 Prozent Äthanol, 71,5 Prozent Wasser und 3,9 Prozent andere Bestandteile) in einer der Äthanolkonzentration in Beispiel 4 entsprechenden Konzentration verwendet wird. Die

3 '

Gärmaische enthält 0,95 g/100 cm trockene Zellen, was 95 Prozent des verwendeten Äthanols entspricht.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Hefezellen', dadurch gekennzeichnet , daß man Candida ethanothermophj.luni EY-IOlO ATCC 20.3580 oder Candida acidothermophilum ΕΥ-1Γ50 ATCC 20281 in einem Äthanol enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Gärung erhaltenes Äthanol oder ein Hydratationsprodukt von Äthylen, das mindestens 20 Prozent Äthanol enthält, als Kohlenstoffquelle verwendet.
3* Verfahren nach Anspruch Λ , dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem pH-Bereich des Nährmediums von 2,5 bis 4,0 durchführt'.
4-, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 30 bis 4-0⁰C durchführt.
5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hährmedium als Stickstoffquelle Sojabohnenmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, gemahlene Baumwollsaat, Polypepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat, Harnstoff, Ammoniak oder dessen Salze enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch'gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das als anorganisches SaIa Mag-

nesiumphosphat, Kaliumphosphat oder Eisenphosjxhat enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung chargenweise> halbchargenweise oder kontinuierlich durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das höchstens 2 Prozent (Gewicht/ Volumen) Äthanol enthält.
9. Verwendung der nach Anspruch .1 bis 8 hergestellten He/*"Kellen iu Futter- oder Nahrungsmitteln.

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