DE2133181A1 - Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Description
Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, das im Folgenden als Tuberaotinomycin-N bezeichnet ist sowie
ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Fermentation und Verfahren für dessen Gewinnung aus der Fermentationsbrühe.
Es ist bekannt, dass es eine grosse Anzahl von Antibiotika gibt, die durch Boden-Organismen, speziell der Art Streptomyces
produziert werden. Einige dieser Antibiotika sind klinisch als Antituberkulosemittel angewendet worden, wie
beispielsweise Streptomycin, Kanamydin, Cycloserin, Viomycin und dergleichen. Es sind jedoch früher häufig Stämme
von Tuberkulose-Baζillen aufgetreten, die gegen diese Antituberkulose-Antibiotika
resistent sind, und dies hat in der Tuberkulose-Therapie ernste Schwierigkeiten verursacht.
109387/1904
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Antituberkulose-Antibiotikum
zu schaffen. Diese Aufgabe wird gelöst mittels eines neuen basischen Peptids Tuberactinomycin-N.
Es wurde gefunden, dass ein zur Gruppe des Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus gehörender
Stamm ein Anti tuberkulöse-Antibiotikum zu produzieren
vermag. Dieses wird bezeichnet als Tuberactin oder Tuberactinomycin (entsprechend J. Antibiotics, 21,
681 (I968), Britisches Patent Nr. 1,201,727). Es wurde
weiterhin ein Mutant des besagten Streptomyces erforscht und untersucht, und dabei wurde gefunden, dass dieser
ein neues antibiotisches Tuberactinomycin-N zu produzieren
vermag, welches eine überlegene Antituberkulose-Aktivität aufweist, verglichen mit Tuberactinomycin, und
zwar eine stärkere Antituberkulose-Aktivität gegenüber Tuberkelbazillen hat, die gegen Streptomycin, p-Aminosalizylsäure
oder Kanamycin resistent sind. Ausserdem
zeigt dieses neue Antibiotikum eine niedrige Toxizität gegen Versuchstiere.
Der besondere Vorteil des erfindungsgemassen Antibiotikums
besteht darin, dass ein neues, klinisch brauchbares Mittel zur Verfügung steht, demgegenüber die Tuberkelbazillen
nicht resistent sind.
Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung des neuen erfindungsgemässen
Antibiotikums Tuberactinomycin-N weist folgende Verfahrensschritte auf: in einem Nährmedium
wird Streptomyces griseoverticillatus var. tuberaeticus No. N 6-I5O PERM P-619 gezüchtet, dieses Nährmedium wird
aerob behandelt, bis es beachtlich antibiotische Aktivität aufweist, dann wird das Antibiotikum von dem Näbcmedium
abgetrennt und das Antibiotikum wird als im wesentlichen kristallines Pulver gewonnen, welches eine Antituberkulose-Aktivität
besitzt.
109887/1
Der Erfindungsgegenstand sowie dessen Vorteile werden in der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden
Zeichnungen noch näher veranschaulicht. Es
zeigen:
Pig. 1 ein Schaubild des Ultraviolett-Absorptionsspektrums
von Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid,
Fig. 2 ein Schaubild des Infrarot-Absorptionsspektrums von Tuberactinomycin/N,
Fig. 5 eine graphische Darstellung, die das kernmagnetische
Resonanzspektrum von Tuberactinomycin-N-hydrochlorid
zeigt, und
Fig. 4 ein Schaubild, in welchem die analytische Aminosäure-Struktur
von Tuberactinomycin-N-hydrochlorid dargestellt ist.
Der Tuberactinomycin-N produzierende Stamm kann ausgewählt
werden aus Microorganismen-Arten, die zu den Streptomyces gehören, vorzugsweise wird ein Mutant-Stamm von
Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL
J482 verwendet, der erhalten wurde durch Nitrosoguanidin-Behandlung.
Nachfolgend wird eine allgemeine Beschreibung der taxonomischen Eigenschaften dieses Mutant-Organismus gegeben,
die auf beobachteten diagnostischen Eigenschaften basiert.
(1) Das kulturelle Verhalten 1st in Tabelle I niedergelegt.
TABELIE I
Medium Untersuchte Eigenschaften
Medium Untersuchte Eigenschaften
G: gut
Czapek-Dox. Agar AM: weiss bis perlrosa (3ca)
SM: hellweizenfarben (2ea)
oder bambusfarben (2gc) SP: keine
0: massig
AM: massig, weiss bis mattrosa
Asparagin-Glukose Agar (5ba) oder frischrosa (5ca)
SM: manchmal in das Medium eindringend, perlrosa (j5ca)
bisquit (3ec) '
SP: keine ^09887/1904 ~
TABELIiE I - P ort setzung
Medium
Untersuchte Eigenschaften
BennettJ's Agar
G: sehr gut
AMä gut, weiss bis frischrosa (4ca) bis hellrosabeige (4ec),
Tröpfchen
Tröpfchen
SMs bambusfarben (2gc) bis graduell dunkel- bis hellbraun (5ng)
SP: keine
Bouillon Agar
Calcium malate Agar
Gelatin-Medium
G: schlecht AMs keine
SMi nahezu farblos bis kalkig (ll/2eo)
SPs keine
massig
weiss bis bisquit (Jec), kurzes Mycelium
schlechtes Wachstum, perlförmig bis schalenförmig gefärbt (j5ba)
keine
G: sehr schlecht AM! keine
inkubiert bei 24 C SMf hellbraun (4ng) oder kakaobraun
(51g)* Gelatine-Verflüssigung
SPi keine
Löfflerfs Serum
G ι massig AMs keine
SMi hellweizenfarben (2ea) oder
bambusfarben (2gcj, keine
Haemolyse
SP: keine
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TABELLE I - Portsetzung
Medium
Untersuchte Eigenschaften
Stärke Agar Gi massig
AM: gut, weiss bis frischrosa (4ca) bis hellrosabeige (4ec)
SM: manchmal in das Medium eindringend, frischrosa (4ca)
bis hellrosabeige (4eo)
SP: keine
Kartoffelpfropfen G: massig
AM: seitlich mit weissem Mycelium
bedeckt
SM: gekrümmtes Wachstum, hellweizenfarben (2ea)
SP: keine
Möhrenpfropfen G: keines
Eier-Medium
G: gut
AM: weiss bis perlfarben (2ba)
SM: -
SPi keine
Milch-Medium G: massig
AM: massig, weiss bis hellweizenfarben (2eaJ oder bisquitfarben
()
SM: an der Oberfläche Ring bildend, schwache Koagulation
SP: keine
Cellulose 0: ke ine
109887/1
TABELLE I - Portsetzung
Medium
Untersuchte Eigenschaften
Tyrosin Agar
G: massig
AM: sehr schlecht
AM: sehr schlecht
SM: hellweizenfarben (2ea) bis zimtfarben ()
SP: keine
Hafermehl-Agar
G: sehr gut
AM: weiss bis hellbeige (4ec), mit vielen Tropfen bedeckt
SM: hellweizenfarben (2ea) bis hellwürzbraun (4lg)
SP: meist nicht vorhanden oder hell kalkig (1 1/2 ec) oder ecrufarben (2ec)
G: AM: gut
weiss bis hellrosabeige (4ec),
Wassertröpfchen
SM: perlrosa (3oa oder 4ca)
SP: keine
SP: keine
G: | gut | |
Kartoffel- Gluc öse-Agar |
AMs | hellrosabeige (4ee), Wassertröpfchen |
SM: | hellamberfarben (3ic) bis zimtfarben (3Ie) |
|
SP: | keine | |
G: | gut | |
Glucose-Bouillon | AM: | keine |
SM: | nahezu farblose Mycelium- Klumpen am Boden |
|
SP: | keine |
109887/19 (H
- 7 | Medium | 2133181 | Fortsetzung | gut |
TABELLE I - | Untersuchte Eigenschaften | hellrosabeige (4ec) bis rosabeige (4gc) |
||
Pepton-Glucose Agar |
G: | Butterscotch (j5ne) bis goldbraun (3pg) |
||
AM: | keine | |||
SM: | massig | |||
SP: | frisohrosa oder perlrosa (4ca) |
|||
C/lycerin-Czapek | G: | keine Färbung | ||
AM: | keine | |||
SM: | ||||
SP: |
Diese Eigenschaften wurden, ausgenommen der Versuch mit
Gelatin-Medlum, bei 3Q°C und zehntägiger Züchtung beobachtet.
Die Angabe der Färbungen wurde gemSss dem "Color Harmony
Manual" (Container Corp. of Araerlaa, 1958) gemacht und
bei nördlichem Tageslicht beobachtet.
In Tabelle 1 bedeuten G = Wachstum, AM = Luft-Mycelium,
SM = Substrat-Mycelium und SP = löslicher Farbstoff.
(2) Struktur von Hyphae-tragenden Sporen:
Ein Luft-Mycelium wird in vielen Medien gut ausgebildet, und es wurden viele primäre und sekundäre Windungen mit
einer starren oder flexiblen Form beobachtet.
(3) Sporen-Struktur:
Bei einer elektronenmikroskopischen Betrachtung zeigten die Sporen glatte Oberfläche, lange elliptische oder
zylindrische Form, 0,7 bis 1,5/ι χ 0,5 Ms 0,6 fi.
109887/1904
(4) Färbung des Myceliums:
Die Färbung des Luft-Myceliums ist in zahlreichen Medien
zu Beginn weiss, verändert sich allmählich in rosa oder beige. Manchmal ist es mit Wassertröpfchen bedeckt. Die
Färbung des Sufostrat-Myceliums ist im allgemeinen gelblich-braun
oder fahlbraun,
(5) Lösliches Pigment?
Es wurde in dem untersuchten Medium keine Bildung von
löslichem Pigment beobachtet, ausgenommen eine hellkalkige oder ecrufarbene Färbung in dem Harnstoff-Glycerin-Medium.
(6) Physiologische Charakteristiken!
(a) Gelatine-Verflüssigung? sehr schlechtes Wachstum,
positive Verflüssigung
(b) Starke-Hydrolyse s positive Hydrolyse
(c) Nitrat-Reduktion: keine
(d) Peptonisation von Milchs kaum beobachtet
(e) Cellulose-Zersetzungs keine
(f) Produktion von H2S: keine
(g) Haemolysei negativ
(h) Melanin-Pigment-Bildungt keine
(7) Verwendung von Kohlenstoffquellen;
Glukose, Maltose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Maimose und
Inosit! lässt sich verwenden (+).
Xylose, Fruktose, Thaimose,, Raffinose, Salicin und
Arabinoseg lässt sich nicht verwenden {-).
Laktose,, Saccharose und Mannitol: nicht eindeutig (±).
(8) Kolonies
Grösskolonle zeigt eine Chrysanthemen-artige Form und
ist mit baumwollartigem f^oelium bedeckt.
In Tabelle II sind die Verschiedenheiten veranschaulicht, die sieh beim Vergleich der taxonomischen Eigenschaften
zwischen dem hier beschriebenen Streptomyces und dem Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus
NRRL 3482 ergeben. Es ist aus diesem Grund der hier beschriebene
Streptomyces als Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus No. N 6-1J5O bezeichnet.
Streptomyces hier be schrie-
griseoverticillatus bener
var. tuberacticus Streptomyces Medium NRRL 48
Harnstoff- gutes Wachstum sehr gutes
Glycerin- Wachstum Agar
Möhrenpfropfen massig kein Wachstum
Milch keine schwache
Koagulation Koagulation
Der hier beschriebene Streptomyces wurde hinterlegt beim Institute for Microbiological Industry and Technology,
Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan und der dort befindlichen
permanenten Kulturen-Kollektion unter der Hinterlegungsnummer PERM P-619 beigegeben. Ferner wurde
dieser Stamm bei dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization
Research and Development Division hinterlegt und dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL ... registriert.
Der zuvor beschriebene Streptomyces griseovertioillatus var. tuberacticus No. N 6-I30 ist nur ein Beispiel für
im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbare Mikroorganismen, und der Erfindungsgegenstand umfasst darüber
hinaus die Verwendung von anderen Tubera"ctinomycin-N
produzierenden Stämmen, die zu der Art Streptomyces gehören.
1Ö888 7/1SÖ4
Erf indungsgemäss wird Tubergcotinomycin-N durch Beimpfung
eines geeigneten Nährmediums mit Tuberaotinomyein-N produzierenden
Streptorayeesj, zum Beispiel Streptomyces
griseovertieillatus var* tuberacfcicus No. N 6-1J5O, Beimpfen
dieses Gemisches unter für die gebräuchliche Antibiotika-Produktion üblichen Bedingungen, und anschliessender
Isolierung des Antibiotikums aus dem Nährmedium gewonnen» Die Züchtung der Mikroorganismen kann auf
zahlreiche verschiedene Weise durchgeführt werden, beispielsweise in flüssigen Kulturen oder auf festen Nährböden.
Der für die industrielle Herstellung von Tuberactinomycin-N vorteilhafteste Weg ist das Kulturverfahren,
bei dem unter der Flussigkeitsoberflaoiie und mittels Be-'
lüftung gezüchtet wird.
Nährmedien, die für die Produktion von Tuberactinomycin-N
verwendbar sind* sollen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoffj wie beispielsweise ölukose, Saccharose, Laktose,
Maltose, Stärke, Dextrin, Melasse, Glycerin u.s.w., eine
Quelle für assimilierbaren organischen und anorganischen Stickstoff- wie beispielsweise Kornweichflüssigkeit,
Sojabohnenpulver., Ba-umwollsaatöl, Gluten, Pepton, Fleischextrakt,
Hefeextraktρ Hefe, Kaseinhydrolysat, und dergleichen,
oder beispielsweise Ammoniumsalze, anorganische Nitrate und dergleichen enthalten. Die Medien weisen
weiterhin Salze, beispielsweise Phosphat, Magnesium, " Kalzium, Kalium, Natrium, Zink, Mangan und dergleichen
auf.
Bei der Durchführung der Züchtung der für die Produktion
von Tuberactinomycin-N verwendeten Organismen kann die
Züchtungstemperatur ganz allgemein in dem Bereich variieren,
in welchem die MikDoorganismen zu wachsen vermögen und Tuberactinomycin-N produziert werden kann, vorzugsweise
kann sie bei 25 - 30 C liegen.
Die Züchtungs-Zeitspanne liegt im allgemeinen bei zwei bis zehn Tagen, wobei diese Zeitspanne je nach den speziellen
Arbeitsbedingungen variiert. Wenn die Kulturbrühe die höchste Potenz an antibiotischer Produktion aufweist,
sollte das Züchtung s\rs rf afereü te endet werden.
* fl O «» £ "V * i £ $ A
Aus der Kufcurbrühe wird das Taberactinomycin-N wie nachstehend
im einzelnen beschrieben entfernt. Im allgemeinen ist es nicht möglich, das Produkt mit mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmitteln zu extrahieren, weil es von Natur aus leicht löslich in Wasser ist. Daher wird bei industrieller Herstellung auf
solche Arbeitsmaßnahmen für die Isolierung und Reinigung des Tuberactinomycins-N zurückgegriffen, die durch dessen basiche
Natur sich anbieten.
Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird die gesamte Nährmedium-Masse
filtriert, das Tuberaetinomycin-N wird durch Zugabe von
Sulfonsäure-Fabstoff, wie beispielsweise Methylorange, Eriochrom-Violett, Alizarinrot S und dergleichen, als Farbstoff-Salz aus
dem Filtrat ausgefällt. Das so gebildete Tuberactinomycin-N-Farbstoffsalz wird in einem organisdBn Lösungsmittel, wie beispielsweise
Methanol, Aceton oder dergleichen suspendiert, dann wird ein anorganisches Salz von Triäthylamin, wie beispielsweise
Triäthylarain-Hydrochlorid, -sulfat oder dergleichen dazugegeben,
und es fällt das entsprechende anorganische Salz von Tuberactinomycin-N, beispielsweise Tuberactinomycin~N-Hycrochlorid,
-sulfat oder dergleichen aus* Man kann auch so arbeiten, daß man das Farbstoffsalz von Tuberyctinomycin-N in wässriger Salzsäure,
wässriger Schwefelsäure oder dergleichen löst und, nachdem man den Farbstoff durch Extraktion mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmitteln daraus entfernt hat, die wässrige Schicht konzentriert, ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise
Methanol, Aceton oder dergleichen dazu gibt und in dieser Weise das anorganische Salz von Tuberaetinomycin-N ausfällt.
Eine weitere Arbeitsweise, die das für industrielle Zwecke besonders
vorteilhafte Verfahren darstellt, besteht darin, daß man zum Isolieren des Tuberactinomycin-N aus der Kulturbrühe
Kationenaus taus c her harz einsetzt. Bei d.'.esem Verfahren wird
das Tuberactinomycin-N im Ka ti onenaus taus eu.;-rhar ζ festgehalten,
mit verdünnter Lösung von Schwefelsäure, Salzsäure oder dergleichen,
oder auch mit verdünnter alkalischer Lösung elulert,
109887/19 (H
und die Tuberaetinomycin-N aktiven Fraktionen werden gesammelt,
neutralisiert und konzentriert, es wird ein Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton oder dergleichen dazu gegeben,
und dann wird das Salz von Tuberactinomycin-N als Ausfällung gewonnen. Man kann auch so vorgehen, daß man das Piltrat des
Kulturmediums dialysiert oder einer Gel-Filtration unterzieht, um die Substanzen mit hohen Molekulargewichten, wie beispielsweise
proteinartige Substanzen, Polysaccharide oder dergleichen, die in der Brühe vorhanden sind, zu entfernen, danach durch Zugabe
einer Säure konzentriert und anschließend mittels organischem Lösungsmittel das Säuresalz von Tuberaetinomycin-N ausfällt,,
Das so gewonnene rohe Tuberaotinomycin-N-Salz wird vorzugsweise
durch Umkristallisation gereinigt, und dazu löst na» in Wasser,
miecht dann ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie beispielsweise
Methanol, Äthanol, Aceton, Methylcellusolve, Dioxan,
Tetrahydrofuran oder dergleichen zue Man kann die Reinigung auch
durch Aufgeben auf eine Chromatographie-Säule, beispielsweise aus Kationenaustausoherharz, Silicagel, Cellulosepulver oder
dergleichen, die als Trägerstoffe bei der Reinigung von Tuberactinomycin-N geeignet sind, eluieren und die aktiven Fraktionen
sammeln, daran anschließend konzentrieren und ein Lösungsmittel zugeben und auf diese Weise das Material in Form eines Salzes
eluieren.
Eine weitere Methaode für die Reinigung von Tuberactinomycin-N-SaIz
besteht darin, daß die konzentrierte wässrige Lösung von Tuberactinomycin-N-Salz mit einem Überschuß von wässrigem Triäthylaminsulfat
versetzt wirdö Es bildet eich dann Tuberactinomycin-N-Sulfat,
und anschließend wird eine große Menge von mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel, wie beispielsweise
Methanol, Aceton oder dergleichen zugegeben, wodurch das Tuberactinomycin-N als Sulfat abgetrennt wird. Dieses läßt sich
durch Wiederholung dieser Arbeitsvorgänge reinigen.
109887/190^
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen
Tuberactinfmycin-N, wie es nach den oben beschriebenen
Verfahren gewonnen winde, sind folgende»
(1) Elementaranalyse
(1) Elementaranalyse
Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid:
gefunden C: 37,70$, Et 6,12$, N: 22,5O#, GIi 13,32#
theoretisch berechnet für C25H43N13°10 · ^ HC1:
C: 37,76#, Hj 5,83#, Ns 22,9O#, Cl:
(2) Molekulargewicht^ 778,4 (durch Titrationsmethode ermittelt)
(3) Molekularformel,'durch Berechnung ermittelt aus den bei der
Elementaranalyse gefundenen Werten und dem festgestellten
Molekulargewicht: G25H43N13°10 * -* HG1 als Hydrocillorid·
(4) Schmelzpunkt: 245°C (unter Zersetzung)
(5) Optische Drehung des Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid:
■ fa J I1 - -19,1 (c-1, H2O)
(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids:
veranschaulicht in Fig. 1 (Konzentration 20 7/ml)
_ : 268 m /U, e}# -» 342,5 (in Wasser)
max / jLfj cm
: 269 m /U, Ef* - 320,0 (in 0,1 η HCl).
max '
max
: 288 m /U, E^cm - 215,0 (in 0,1 η NaOH)
(7) Infrarotspektrum (in KBr tablettiert)« in Fig. 2 veranschaulicht«
Charakteristische Maximal 3300, I66O, 1500, 1225 und
105p cm"1.
(8) Löslichkeit:
Anorganische Salze von Tuberactinomycin-N, wie beispiels·
weise Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid und -sulfat, sind
leicht löslich in Wasser und schwer löslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln.
(9) Färbungsreaktion:
Positiv: Ninhydrin, Biuret.
Positiv: Ninhydrin, Biuret.
Negativ: Sakaguchi, Isatin, Pauli, Molisch·
109887/19Q4
(D) Isolationskoeffizieten: pka-j^ = 7,25, pka2 = 10,05,
pka^ 11
(11) Aussehens Als Hydrochlorid oder Sulfat weisses kristalli
nes Pulver*
(12) Aminosäure-Bestandteile: in Pige 4 veranschaulicht,
Säurehydrolyae von Tuberactinomycin-N gibt Serin, DAFA
(α,β-Diaminopropionsäure), 7-Qxy-ß-lysin und Capreomycindin,
(15) Kernmagnetisches Resonanzspektrum 1 in Pig, j5 veranschaulicht.
Das zuvor beschriebene Tuberactinomycin-N hat die nachfolgende
chemisches Strukturt
I * | B | 9 | -NH- | OH j r |
H | ( | m | 0 | |
ΝΗ2 OH NH,, | C- | QI | • ΝγΝΗ | CH, | Il NH-C-NH |
||||
ί
ι |
I | s NH | |||||||
-C-NH-CH | —-CH—c:~ | T | |||||||
. { | I! Ü |
-CH NH- | -CH | ||||||
CH.-CH,-CH-CH-CH, | Nil—C— | ||||||||
Γ- ' | C=U | ||||||||
I! | |||||||||
1 | 0 | -NH- | NH | ||||||
I I ^ |
|||||||||
I | |||||||||
-C=C' | |||||||||
\ | |||||||||
-C | |||||||||
Ii | |||||||||
(J | |||||||||
Tuberactinomycin-N stellt, wie hier beschrieben und veranschaulicht,
ein Peptid-Antibiotikum mit Antituberkulose-Aktivität dar, welches aus 2 Molen Serin, 1 Mol I^-c^ß-Diarainopropionsäure,
1 Mol 3-areidodehydroalanin, 1 Mol L-Capreomycidin und 1 Mol
Erythro-7-hydroxy-L-ß-lysin zusammengesetzt ist, das ein Maximum
der Ultraviolett-Absorption bei 268 nyu zeigt, das bei der
Ninhydrin- und Biuret-Reaktion positiv und bei der Sakaguchi-Reaktion
negativ reagiert,
10988-7/19(U
BAD 0RH31NAL
- 15 -
Von den bisher bekannten Antibiotika, über die berichtet worden
ist, ähneln Tuberactinoraycin (Tuberactin), Viomycin, eine
vioraycinartige Substanz (Arai, et.al, Antibiot. & Chemothe, 7
(8), 435 (1957) ), Phthiomycin (vergl. Maeda, K., et al., J0
Antibiotics, Ser. Ae 6(4), 183 (1953)* Japanische Patentpubli«
kation 3096/1955), Capreomycin'(verglβ W0MeStark et al.. Anti«
microb. Agents and Chemoth, 201 (1962) ), Vinactin (vergl. US-Patentschrift
2,633, 445) und Älboverticillin (Maedä, K. et al, J. Antibiotics, HA, 30 (1958)) dem erfindungsgemäßen Tuberactino.
mycin-N hinsichtlich einiger Eigenschaften. Dieses Tuberactinomycin-N unterscheidet sich Jedoch von diesen bekannten Antibiotika
wie folgtt
(1) Vergleich mit Tuberactinomycin:
Tuberactinomycin zeigt positiveSAkaguchi-Reaktion, wohingegen
Tuberactinomycin-N negative Sakaguchi-Reaktion aufweist.
Tuberactinomycin-N enthält Capreomycidin als strukturelle Aminosäure, enthält dagegen nicht Tuberactidin (basische
Guanidin-Verbindung), wohingegen Tuberactinomycin Capreomycindin nicht enthält, dagegen Tuberactidin enthält. Demzufolge
ist Tuberactinomycin vollständig verschieden von Tuberactinomycin-N·
(2) Vergleich mit Viomycin!
Viomycin weist positive Sakaguchi-Reaktion auf, dagegen hat Tuberactinomycin-N negative Sakaguchi-Reaktion, wodurch die
Differenz zwischen den beiden Antibiotika zum Ausdruck kommt.
(3) Vergleich mit Älboverticillin:
Älboverticillin wist im Ültraviolett-Spektrum kein Maximum
bei 220 - 320 nyu auf. Tuberactinomycin-N zeigt dagegen ein
Maximum bei 268 nyu.
(4) Vergleich mit Capreomycin*
Capreomycin enthält Alanin und ß-Lysin als strukturelle
Aminosäuren, wohingegen Tuberactinomycin-N diese Aminosäuren nicht enthält, dagegen Serin und ?-Oxy-ß-lysin aufweist.
109887/ 1 9CU
(5) Vergleich mit viomycinartiger Substanz:
Das Verhältnis von DEt"* der Absorptionsmaxima in Säure
und alkalischer Lösung von viomycinartiger Substanz beträgt 1,20, hingegen beträgt der entsprechende Verhältniswert für
Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid l,49j und das Maximum der
Ultraviolett-Absorption in 0,1 η NaOH liegt für viomycinartige Substanz bei 280 nyu, wohingegen dieses Maximum für Tuberactinomycin-N
bei 288 m/U liegt. Dies macht die Unterschiede
dieser beiden Antibiotika anschauliche
(6) Vergleich mit Phthiomycin:
) ' Der Verhältniswert von % cm der Absorptionsmaxiraa in Säure
und alkalischer Lösung liegt für Phthiomycin bei 1,09, wohingegen der entsprechende Verhältniswert für Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid
bei 1,49 gelegen ist. Dies zeigt die
Unterschiede dieser beiden Antibiotika.
(7) Vergleich mit Vinactin:
Vinpctin ist das gleiche Antibiotikum wie Viomycin ( H,
Umezawa, Index of Antibiotics from Actinomycetes, S* 684,
1970, University of Tokyo Press), dementsprechend ist es ebenso verschieden gegenüber Tube#actinomycin-N·
Bei Tuberactinomycin-N handelt es sich um ein neues Antibiotikum, " das sich von den bisher bekannten Antibiotika unterscheidet.
Das Tuberactinomycin-N hat die nachfolgenden biologischen Eigenschaften*
(1) Akute Toxizität von Tuberactinomycin-N-sulfat:
LDc0 =* 385 mg/kg (ddy Stamm Mäuse, i.v«)
LD50 = 1240 mg/kg'(ddy Stamm Mäuse, i.m.).
(2) Antimicrobiologisches Spektrum, ermittelt durch die Verdünnungsmethode auf Agar-Streifen
109887/ 1
Organismus
Minimum-Konzentration für die Inhibierung (η» π r /ml ^
i'seudomonas aeruginosa Escherichia coli NIHJ
Escherichia coli .B Proteus vulgaris OX 19 Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B
Shigella dysenteriae E-I Shigella flexineri Shigella sonnei E-33 Bacillus subtilis PCI
Staphylococcus aureus FDA 209 P Staphylococcus albus
Staphylococcus citreus Micrococcus flavus Sarcina lutea
Sarcina lutea ATCC 1001 Mycobacterium ATCC 607 100
Sarcina lutea ATCC 1001 Mycobacterium ATCC 607 100
50
100
• 100
25 100
25 100 100
12.5 100 100
25 100 100 100
12.5
Vibrio comma (A) | > IUO |
Vibrio comma (B) | > ICO |
Staphylococcus aureus Yoshioka | > 100 |
Staphylococcus aureus Yonemoto | 25 |
109887/1904
Antituberkulose-Aktivität:
i) Verwendeter Stamm: Mycobacterium tuberculosis IL57Rv
ii) Medium: Kirchner1S halbflüssiges Medium, pH 6,9
iii) Beimpfungsmenge:" 1Ö~^ mg
iv) Beobachtung: nach dreiwöchiger Incubation,
a) Konzentrationsminimum für die Inhibierung an sensitiven Stämmen: 4 mcg/ml.
b) Konzentrationsminimum für die Inhibierung an resistenten Stämmen: in der nachfolgenden Tabelle
veranschaulicht.
f Minimum-Konzentration für die Inhi
bierung ( mcg/ml)
Vergleichsdroge Tuberactinomycin-N
Streptomycin-resistenter
Stamm 64 2
p-Arainosali oyls äure-
resistenter Stamm 256 4
Isonicotinsäurehydrazid-
resistenter Stamm 256 4
Viomycin-resiatenter
Stamm 64 32
Kanamyoin-resistenter
Stamm 8 4
»Cycloserin-reaistenter
Stamm 256 2
Stamm 256 2
(4) Experimentell ermittelter chemotherapeutischer Effekt bei Mäusen:
Es wurden drei Gruppen von je 10 ddY Stamm Mäusen, männlich,
mit einem Gewicht von 20 g, die mit pathogenen Tuberculose-Bazillen,
Mycobacterium tuberculosis H^7Rv, intravenös infiziert
wArden waren, mit Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid behandelt,
und dabei wurden je Maus und Tag für die eine Gruppe 0,5 mg, für die andere Gruppe 1 mg/Maus und Tag und für die dritte
Gruppe 2 rag nach dreitägiger Infektion subkutan verabreicht»
109887/ 190/.
Die Behandlung wurde drei Wochen lang kontinuierlich wiederholt« Einer aus zehn lausen bestehenden weiteren Gruppe, die als Kontrollgruppe
diente, wurde physiologische Salzlösung verabreicht· Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle veranschaulicht:
Einige Tage nach Infektion mit dem Stamm
Maus | Kontrolle | Gruppe II | Behandelte Mäuse | 24 | >42 |
No. | Gruppe I | 20 | 25 | tt | |
1 | 20 | 21 | (Dosierung: mg/Maus/Tag) .0,5 1,0 2,0 |
>42 | U |
2 | 21 | 21 | 21 | η | tt |
3 | 21 | 22 | 22 | H | tt |
4 | 21 | 23 | 25 | tt | H |
5 | 22 | 28 | 29 | tt | N |
6 | 22 | 29 | 35 | tt | It |
7 | 23 | 30 | >42 | tt | «1 |
8 | 25 | >42 | η | It | tt |
9 | 26 | η | tt | ||
10 | 29 | η | |||
It |
In den nachfolgenden Beispielen, die lediglich zur weiteren
Illustration des Erfindungsgegenstands und dessen Herstellung dienen, ist keine Begrenzung der Erfindung zu sehen, und es
sind alle Prozentangaben als Gewichteprozente zu lesen und alle Verhältniswerte für Gemische von Lösungsmitteln als Volumen-Verhältnisse
zu verstehen, sofern nichts anderes gesagt ist.
Zwei Liter eines wässrigen Mediums, welches 3# Glukose, 2$ Stärke,
3# Sojabohnenmehl und 1,5# Natriumchlorid enthielt, würden
in gleichmäßige Teilmengen aufgeteilt und in zwanzig 500-Milliliter
Erlenmeyer-Kolben gefüllt. Der pH-Wert wurde auf 6 eingestellt, es wurde 30 Minuten bei 1200C sterilisiert, danach
mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus N 6-130 beimpft und danach in einer Drehschüttel-Einrichtung (Radius
2,5 cm, 330 UpM) bei 300C 7 Tage lang bebrütet. Es wurden 1,5 1
einer Kulturbrühe erhalten, die 2,3$0 mcg/ml an Tuberactinowycin-N
enthielt.
109887/19CU
Die abfiltrierte Brühe wurde mit 2,5 ml/Min durch eine Harzsäule, (2,5 cm Durchmesser, 28 cm Länge) die aus 150 ml Ionenaustauscher«
harz Amberlite IRC-50, Natrium-Typ (Rohm und Haas Co,, UoS0A.)
bestand, hindurchgeleitete Die Säule'wurde mit Wasser gewaschen, mit 0,5 η HOL bei einer Durchflußgeechwindigkeit von I,j5 ml/Min,
eluiert«, Die Eluafce wurden in Portionen von 10 ml aufgefangenj
Tuberactinomycin-N-Aktivltät wurde bei den Fraktionen Nose 45-63
durch Ultraviolett-Absorption und Bioversuoh ermittelt.
Die so gewonnene aktive Fraktion, etwa 200 ml, wurde mit Natriumhydroxyd
neutralisiert, im Vakuum zu etwa 15 ml konzentriert, und durch Ausfällung wurden anorganische Salze daraus abgetrennte
Nach Entfärbung mit Aktivkohle wurden 150 ml Methanol zugegeben, man ließ das Gemisch bei 50C über Naoht stehen und sammelte die
Ausfällung durch Abfiltrieren· Die Ausfällung wurde mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurde rohes Tuberactinomyoin-N-Hydrochlorid
gewonnen (Menget 5,07 g, Reinheit
Ausbeute« 62#)#
Belapiel 2
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle des dort angegebenen wässrigen Mediums ein Medium verwendet,
welches 3# Glukose, 2$ Stärke, 1,5# Melasse, 1,5# Sojabohnenmehl
und 1,5$ Natriumchlorid enthielt und auf pH 6,0 eingestellt
war. Es wurden 1,5 1 an Kulturbrühe erhalten, die 2150 mcg/ml an Tuberactinomycin-N enthielten, Tuberactinoraycin
N-Hydrochlorid fiel als Rohprodukt an (erhaltene Menget 2,98 g, Reinheltt 70,5#, Ausbeutet
Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle des dort angegebenen Mediums ein solches eingesetzt,
welches 2# Glukose, 3# Stärke, 1,4# Trookenhefe und 0,5# Natriumchlorid
enthielt, und es wurde 1 1 an Kulturbrühe mit I665 mcg/ml
an Tuberaetinomycin-N erhalten. Die Menge betrug 1,55 g an rohem
109887/1904
Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid (Reinheit 72#, Ausbeute
In einen 500 ml Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines wässrigen
Mediums eingefüllt, welches 1# Stärke, 1% Melasse, 1# Pepton,
1# Fleischextrakt und 0,5# Natriumohlorid enthielt. Der pH-Wert
würde auf 7,0 eingestellt, es wurde 30 Minuten lang bei 1200C
sterilisiert, dann wurde mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus No. N 6-I3O beimpft und anschließend unter
Hin- und Herschütteln, 7 cm Weglänge, I30 UpM bei 30°C während
zwei Tagen bebrütet. Die Fermentationsbrühe wurde in 20 1 an
sterilisiertem (bei 120°C, 30 Minuten lang) wässrigem Medium, welches l£ Stärke, l£ Melasse, 1# Pepton, IJi Fleischextrakt,
0,5# Natriumchlorid und 5 ml Antischaummittel ( Uniol D-2000,
Handelsbezeichnung der Firma Nissan Oil Co., Ltd. Tokyo) enthielt und sich in einem 30 1 Fermentationebehälter befand, als
Beimpfungsmittel zugegeben. Es wurde 24 Stunden lang unter Belüftung
mit 20 l/Min, und Rühren mit 200 UpM gezüchtet. Nach
24-stündiger Fermentation wurde die Brühe als Beinfpungsmittel zu 200 1 eines sterilisierten wässrigen Mediums mit 3# Stärke,
2# Glukose, 4,0J<
entfettetem Sojabohnenmehl, 1,5# Natriumchlorid
und 100 ml Antischaummittel ( pH 6,0 vor der Sterilisation), die sich in einem 250 1 Fermentationstank aus Edelstahl befanden,
hinzugegeben. Es wurde 90 Stunden lang unter Belüftung mit
100 l/Min und Rühren mit 300 UpM bei 3O0C gezüchtet. Dabei wurden
190 1 an Kulturbrühe gewonnen, die 2400 mcg/ml an Tuberactinomycin-N
enthielten.
Der pH-Wert der Kulturbrühe wurde mit Salzsäure auf 2,0 eingestellt.
Anechlißend wurden 25 Volumprozent an Diatomeenerde beigegeben, und das Gemisch wurde bei vermindertem Druck filtriert.
Dabei fielen I60 1 an filtrierter Brühe an. Nach dem Neutralisieren wurde das Filtrat durch eine Harzsäule aus 10
Ionenaustauscherharz IRC-50 (Na-Typ) mit einer Durchflußgeschwindigkeit
von 20 l/Stunde aufgegeben, und dabei wurde das Tuberactinomycin-N,
das darin enthalten war, absorbiert. Das Harz wurde
109887/1904
mit Wasser gewaschen, dann mit 1 η Salzsäure bei einer Durchflußgeschwindigkeit
von J 1 /Stunde eluiert. Jeweils 1,5 1 wurden
als Einzelfraktionen abgetrennt, und dabei wurde das Tuberactinomycin-N in den Fraktionen Nos. 10 - 17 gefunden. Die
aktive Fraktion wurde nach Neutralisieren mit Natriumhydroxyd im Vakuum zu etwa 13ΟΟ ml konzentriert, und es wurde das abgeschiedene
Natriumchlorid entfernt. Das so erhaltene Konzentrat wurde mit Aktivkohle entfärbt, und es wurden unter Rühren 10,4
Methanol hinzugegeben· Man ließ das Gemisch über Nacht bei 50C
stehen, wobei Tuberactinomycin-N ausfiel» Das Tuberactinoraycin-N
wurde mit Methanol gewaschen, über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet, und es wurde rohes Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid
gewonnen (Menget 395 g, Reinheit 11,0$, Ausbeute: 72,&#).
Die Fermentation wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt,
und es wurden 20 1 Kulturbrühe mit 2200 mcg/ml Tuberactinomycin-N
darin erhalten.
Mit Schwefelsäure wurde der pH-Wert der Brühe auf 2,0 eingestellt,
dann wurde nach Zugabe einer geringen Menge an Filterhilfsmittel
filtriert, und es fielen 1,76 an klarem Filtrat an. Dieses wurde
auf pH 5*5 eingestellt, es wurden 16,5 g Eriochromviolett hinzu gegeben, dann wurde 1,5 Stunden lang dialysiert und anschließend
die Ausfällung abfiltriert· Das auegefällte Farbstoffsalz
von Tuberaotinomycin-N wurde nach Waschen mit Wasser im Vakuum
getrocknet. Das so hergestellte Farbstoffsalz von Tuberactinomycin-N
wurde in 350 ml eines Gemisches aus 80# Aceton und 20#
Methanol suspendiert, dann wurde eine 50jf-ige Lösung von Triäthylamlnsulfat
in Methanol solange hinzu gegeben, bis sich kecäne
Ausfällung von Tuberactinomycin-N-sulfat mehr bildete. Nachdem
das Gemisch 1,5 Stunden lang gerührt worden war, wurde die Ausfällung abfiltriert, zur Entfernung des Farbstoffes mit Aceton
und Methanol gewaschen, in einer kleinen Menge an Wasser gelöst, und das Tuberactinomycin-N-sulfat wurde durch Zugabe von Methanol
ausgefällt (Menges 3,09 g, Reinheit» 79#, Ausbeutet
109887/1904
7,5 g an Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid, wie es gemäß Beispiel
1 erhalten worden war, wurden in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule hindurch geleitet, die
aus 50 ml Ionenaustauscherharz Amberlite IRA-411 (Sulfonsäure-Typ)
bestand, mit einer Dur chf lußges chwindigkeit von 20 ml/Std.
Es wurden je 10 ml Einzelfraktionen ausgewaschen, und die Fraktionen
No. 3-12 zeigten Tuberactinomycin-N-Aktivität. Diese Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, bis die
Konzentration an Tuberactinomycin-N 200 mg/ml betrug. Diesem
Konzentrat wurden 4 Volumina Methanol zugegeben, und die auegefällt
Substanz wurde abfiltriert· Es wurde Tuberactinomycirt-N-Hydrochlorid
erhalten (Menge 6,17 fe* Reinheit! 80,2#, Ausbeute:
Beispiel 7
Es wurden 100 mg an gemäß Beispiel 1 gewonnenem Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid
in 5 ml einer Lösung, bestehend aus n-Butanol»
Pyridini Essigsäuret Wasser (15 ι 10 : 3 ι 12, V/V) gelöst und
die Lösung wurde an*einer Säule (l cm~x 130 om) aus Cellulosepulver
in dem gleichen Lösungsmittelgemisch abaorgiert. Dann wurde
das gleiche Lösungsmittelgemisch mit einer Durchflußgeschwindigkeit
von 10 ml/Stunde durch die Säule hlnduch geleitet« Das Eluat
wurde in Fraktionen von je 3 ml aufgefangen. Tuberactinomycin-N wurde in den Fraktionen No, 39-46 gefunden» Die aktive Fraktion
wurde im Vakuum auf 1 ml konzentriert. Es wurden 5 ml Methanol hinzu gegeben, und es fielen 60 mg an Tuberaotinomycin-N-Hydrochlorid
an.
109887/1904
Claims (1)
- - 24 Patentansprüchelc Neues Antibiotikum, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Tuberactinomycin-N mit der chemischen FormelOh I9 \A rC NH--CU C NH (J)O j "ICH0-CH1-Ch-CH-CH1-C-NH-CH h L=ONH2 OH NH., i"H_. 1 ' NH2 L .NH 0,MH-C-NHNH-C CH NH C——C=CIl i! \,υ οhandelt.2β Antibiotikum gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycin-N im Gemisch mit sonstigen üblichen Zusätzen vorliegt.3ο Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces griseoverticillatus var0 tuberacticus FERM P-619 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Medium gezüchtet wird, bis dieses Medium eine deutliche antibiotische Aktivität aufweist.4, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem die antibiotische Aktivität aufweisenden Nährmedium das Tuberactinomycin-N mit der in Anspruch 1 angegebenen Formel als im wesentlichen kristallines Pulver isoliert wird»3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,von 18 - 57C / smperatur des Kulturmeidums/ und ei:5· Verfahren nach Anspruchdaß die Züchtung bei einer Temperatur deVTCuTturme'idums7 und einerZeitspanne für das Wachsen der Organismen von etwa 2-10 Tagen dxh geführt värd109887/ 19046. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5* dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycin-N unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes vom Carbonsäure-Typ aus dem Kulturmedium isoliert wird ο7ο Verfahren nach Anspruch 4 oder 5* dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycin-N durch Ionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes vom Carbonsäure-Typ gereinigt wird.8o Verfahren nach Anspruch 3 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Tuberactinomycln-N in Form eines seiner physiologisch unschädlichen Salze gewonnen wird.109887/190A
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