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Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Novobiocin auf biologischem
Wege Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Novobiocin
sowie dessen Überführung in die Salzform. Novobiocin hat folgende Formel:
und ist sowohl in freier Form als auch in Form seiner Salze gegen gram.negative
als auch grampositive Bakterien wirksam.
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Es wurde gefunden, daß man durch Kultivierung einer bisher nicht beschriebenen
Mikroorganismenart Streptomyces niveus, die aus einer Bodenprobe, welche in Oueens
Village, New York, entnommen wurde, isoliert wurde unter kontrolliertenBedingungen
und auf einem geeigneten Nährmedium Novobiocin erhalten kann. Eine Kultur des lebenden
Mikroorganismus ist bei der Abteilung für Fermentation des Northern Regional Research
Laboratory in Peoria, Illinois, deponiert und in die dortige Sammlung als NRRL 2466
aufgenommen.
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Eine sorgfältige Studie der Morphologie und Physiologie von S. niveus,
zeigt, daB dieser Organismus von allen bisher in Bergey's »Manual of Determinative
Bacteriology«, 6. Auflage, S. 929 bis 977, und Waksman und Lechevaliers, »Actinomycetes
and Their Antibiotics«, beschriebenen Streptomycesarten deutlich verschieden ist.-Der
Mikroorganismus wird in Tabelle I charakterisiert. Alle Impfungen erfolgten mit
einem lebensfähigen Inokulum, das in 100 ccm Trypton-Hefewürze auf einem hin- und
hergehenden Schüttelapparat bei 28° C gezüchtet wurde. Nach 48 Stunden wurde das
Inokulum während einer Minute gemischt (Waring-Mischer) und dann jedem Reagenzrohr
0,2 ccm Inokulum zugesetzt. Die Ablesungen erfolgten am 4., 7. und 14. Tag.
Tabelle I |
Kulturcharakteristiken von S. niveus |
*Medium Vegetatives Wachstum Wachstum an der Luft Bemerkungen |
'Gewöhnliche Gelatine - Verflüssigung ein Drittel der |
Tiefe des Mediums |
zNährgelatine -f- - Verflüssigung ein Drittel der |
Tiefe des Mediums |
-E- = Wachstum. |
- = kein Wachstum; Inkubationstemperatur, 28°C; Gelatine, 24°C. |
*Die Ingredienzien dieser Medien (g/11 werden unten angegeben.
Die Medien wurden bei einem Druck von 1,05 kg/cma, 120° C, 15 Mi- |
nuten im Autoklav behandelt. |
Gewöhnliche Gelatine (Gelatine 120), |
ßNährgelatine (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Gelatine 120,
eingestellt- auf pg 7,0), |
Fortsetzung Tabelle i |
Kulturcharakteristiken von S. niveus |
*Medium " I ;.y _- J Vegetatives Wachstum- I Wachstum an der
Luft Bemerkungen |
3Nähragar -f- ziemlich gut, grauweiß Rückseite rahmfarbig; |
schwachgelbes Pigment |
4Nährbouillon . -@- schnee- bis ascheweiß |
- Ring an der Oberfläche; flok- |
"-. kiges Wachstum am Boden |
äd-Glukosebouillon schnee- bis ascheweiß |
Ring und Häutchen an der |
_ Oberfläche; flockiges Wachs- |
tum am Boden |
6 d-Glukose-Agar -)- schnee- bis ascheweiß Rückseite gelb;
gelbes Pigment |
7Triptonbouillon + schnee- bis grauweiß |
Häutchen an der Oberfläche, |
flockiges Wachstum am |
Boden |
$Tripton-Hefeextrakt- + schnee- bis grauweiß |
bouillon Häutchen an der Oberfläche, |
flockiges Wachstum am |
Boden |
sN,@raksman's -)- ziemlich gut; grauweiß Rückseite rahmfarbig, |
schwachgelbes Pigment |
10Tyrosinbouillon -j- - gute Rosafarbe; löslich |
flockiges Wachstum am |
Boden |
11Czapek's Sucrose-Agar -)- rahmweiß Rückseite rahmfarbig; |
schwachgelbes Pigment |
12Lalzmusmilch - Peptonisierung |
Ring an der Oberfläche; flok- |
kiges Wachstum am Boden |
13Nährnitratbouillon + schnee- bis ascheweiß Nitrate nicht
reduziert |
Häutchen an der Oberfläche, |
flockiges Wachstum am |
Boden |
11Synthetische Nitrat- -)- schwach; weiß Nitrate nicht reduziert |
bouillon Ring an der Oberfläche; flok- |
kiges Wachstum überall |
15Pepton-Eisen-Agar - keine H2SverdunkelndeRück |
Wachstum schlecht; Kultur- seitenfarbe des Mediums; |
farbe des Mediums schwachgelbes Pigment |
-[- = Wachstum. |
- = kein Wachstum: Inkubationstemperatur, 28° C; Gelatine,
24° C. |
* Die Ingredienzien dieser Medien (g/1) werden unten angegeben.
Die Medien wurden bei einem Druck von 1,05 kg/cm2, 120 ° C, 15 Mi- |
nuten im Autoklav behandelt. |
"Nähragar (Fleischextrakt 3,0, "Pepton 5,0, eingestellt auf
pg 7,0, Agar 15,0), |
4Nährbouillon (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0), |
5d-Glukosebouillon (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Glukose
10,0), |
cd-Glukosebouillon (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Glukose
10,0, eingestellt auf pg 7,0, Agar 15,0), |
7Tryptonbouillon (Trypton 10,0), |
aTrypton-Hefeextraktbouillon. (Trypton 5,0 g und Hefeextrakt
3,0 g), |
9'%7G'alvman's Tyrosin-Agar (Glukose 10,0, Tyrosin 1,0, |
0,5, K2HPO4 0,5, pg eingestellt auf 7,0, Agar 15,0), |
1°Tyrosinbouillon (Tyrosin 1,0, eingestellt auf pg 7,0), |
"Czapek's Sucrose-Agar (NaN03 2,0, K2HPO4 1,0, M9S04. 7H20
0,5, -KCl 0,5, FeS04# 711.0 0,01, Sucrose 30,0, eingestellt auf |
pg 6,6, Agar 15,0), |
i2Lakmusmilch (Trockenmilch mit Lakmusfarbstofr), |
1"NährnitratbouiIlon (Fleische%-trakt 3,0, Pepton 5,0, KNO3
1,0), |
14Synthetische Nitratbouillon (KZHPO4 0,5, NaCl 0,5, M9S04#
7H20 0,2, NaN03 2,0, Glukose 10,0), |
11>Pepton-Eisen-Agar (Pepton 15,0, Proteosepepton -[Hydrolysat
von animalischem Protein mit hohem Molekulargewicht]) 5,0, Ferri- |
Ammoniumcitrat 0,5, Dikaliumphosphat 1;0, hTatriumthiosulfat
0,08; Agar 15,0), |
Fortsetzung Tabelle I |
Kulturcharakteristiken von S. niveus |
*Medium Vegetatives Wachstum Wachstum an der Luft Bemerkungen
- |
isBennett's Agar gut; rahmweiß Rückseite gelb; Pigment gelb |
i7Calciummalat-Agar rahmweiß Rückseite rahmfarbig; |
schwachgelbes Pigment |
18 Maltose-Trypton -f- rahmweiß Rückseite gelb ;gelbes Pigment |
i9 Caseinstärke-Agar rahmfarbig Rückseite gelb; gelbes Pigment |
2oNährstärke-Agar rahmrosa Rückseite gelb; Hydrolyse gut |
2i Waksman's rahmfarbig Rückseite rahmfarbig; Hydro- |
Stärke-Agar A lyse schwach |
22 Waksman's -j- rahmfarbig Rückseite rahmfarbig; Hydro- |
Stärke-Agar B lyse gut |
= Wachstum. |
- =kein Wachstum: Inkubationstemperatur, 28° C; Gelatine, 24°
C. |
* Die Indegredienzien dieser Medien (g/1) werden unten angegeben.
Die Medien wurden bei einem Druck von 1,05 kg/cm@,120° C, 15 Mi- |
nuten im Autoklav behandelt. |
18Bennet's Agar (Hefeextrakt 1,0, Fleischextrakt 1,0, N-2-Amin
A [enzymatisch abgebautes Casein] 2,0, Glukose 10,0, eingestellt auf |
pg 7,0, Agar 15,0), |
17Calciummalat-Agar (Calciummalat 10,0, NH4C1 0,5, K,HP04 0,5,
eingestellt auf pH 7,0, Agar 18,0), |
18Maltose-Trypton-Agar (Maltose 10,0, Trypton 5,0 [Pankreasabbauprodukt
von Casein mit hohem Tryptophatgehalt], |
K,HP04 0,5, NaCI 0,5, FeS04# 7H,0 Spuren, Agar 15,0), |
leCaseinstärke (Na-Caseinat 2,0, lösliche Stärke 1,0; K,HP04
0,2, M9S04# 7H,0 0,2, FeS04# 7H,0 Spuren, Agar 15,0), |
=0Nährstärke-Agar (Fleischextrakt 3,0, Pepton [Hydrolysat von
animalischem Protein mit niedrigem Molekulargewicht] 5,0, lösliche |
Stärke 2,0, eingestellt auf pH 7,0, Agar 15,0), |
a1Waksman's Stärke-Agar A (Maisstärke 2,0, K,HP04 0,3, M9C03
1,0, NaCI 0,5, NaN03 1,0, auf pH 7,0 eingestellt, Agar 15,0), |
a3Waksman'sStärke-AgarB(löslicheStärke2,0,K,HP040,5,MgS04#
7H,00,2,CaC1,0,05,NaN030,05,Asparagin0,05,FeS04# 7H,0 |
Spuren, eingestellt auf pH 7,4, Agar 20,0). |
Die Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch S. niveus in einem synthetischen
Medium ist in Tabelle II gezeigt. Man arbeitete nach der Methode von Pridham und
Gottlieb, J. Bact., 56, S. 107 bis 114 (1948), mit folgenden Abänderungen: (1) Geschüttelte
Kolben wurden mit einer Bodenprobe von S. niveus geimpft. Die Kolben wurden auf
einer hin- und hergehenden Schüttelmaschine bei 28° C bebrütet.
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(2) Nach 120 Stunden wird das Überstehende abdekantiert, der Rückstand
mit 100 ccm sterilem destilliertem Wasser gewaschen und das Überstehende wiederum
abdekantiert. Dann gibt man zum gewaschenen Produkt 100 ccm steriles destilliertes
Wasser und schüttelt weiter bei 28° C auf der Maschine.
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(3) Nach weiteren 48 Stunden wird das Überstehende abdekantiert, der
Rückstand wie oben gewaschen und 1 Minute im Waring-Mischer mit 100 ccm sterilem
destilliertem Wasser vermischt.
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(4) Die Agarkeile werden mit 0,2 ccm des gemischten Inokulums beimpft.
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Die Kultur von S. niveus bildet verästelte fadenförmige Mycele, die
aus den Luftmycelien sich erhebenden Conidiophoren sind unten gerade und oben korkzieherförmig.
Die fruchtbaren Zweige treten in Büscheln auf und tragen längliche Conidien. Bei
der Kultur auf Bennett's Agar (14 Tage Bebrütung bei 28° C) haben die Kolonien eine
lederartige Textur mit kompakter Peripherie. Die sporenbildende Zone ist von blaß
rahmweißer Farbe, die Rückseite von rahmgelber Farbe (Maerz und Paul, »A Dictionary
of Color«, 2. Auflage, McGraw-Hill BookCo. 1950; Tafel 10, A-1, S. 43, und Tafel
11, F-4, S. 45). Das Wachstum und die Sporenbildung sind gut
Tabelle I1 |
Animilierung von Kohlenstoffverbindungen durch S. niveus |
im synthetischen Medium von Fridham und Gottlieb |
Medium ( Ergebnis Medium Ergebnis |
Kontrollversuch . + Inulin . . . . . . . . . . - f- |
d-Xylose. . . . . . . . + lösliche Stärke . |
1-Arabinose ..... Glycerin . . . . . . . |
1-Rhamnose ..... Dulcit . . . . . . . . -t- |
d-Fructose ... + d-Mannit ...... |
d-Galactose ..... d-Sorbit . .. . ... |
d-Glukose ..... --E- dl-Inosit ...... -4- |
d-Mannose .... -f- Salicin.......... -E- |
Maltose ....... Na-formiat .... |
Sucrose . . . . . . . . Na-oxalat ...... Lactose . .
. . . . . -f- Na-tartrat ...... Cellobiose ....... + Na-salicylat
.... - |
Raffinose ....... -f- Na-acetat ....... Dextrin.........
Na-citrat ...... |
Phenol . . . . . . . . - Na-succinat ..... Kresol ........
- |
positive Assimilierung. |
- = negative Assimilierung. |
-/- = positive Assimilierung - nur schwaches Wachstum. |
bei Temperaturen zwischen etwa 24 und 32° C. Auf Bennett's Agar findet bei 37° C
kein Wachstum statt.
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Obschon S. niveus in einigen Beziehungen ähnlich ist wie S. albus
NRRL B-1333 und S. cellulosae ATCC 3313 unterscheiden ihn seine in Tabelle III zusammengestellten
Kulturcharakteristika von diesen Mikroorganismen.
Tabelle III |
Unterscheidende Merkmale von S. niveus, S. albus NRRLB-1333
und S. cellulosae ATCC 3313 |
Medium - S.. niveus S. albus S. cellulosae |
NRRL 2266 - -NRLL B-1333 ATGC 3313 |
Bennett's Agar kein Wachstum bei 37°C gutes Wachstum und gutes
Wachstum, geringe |
Sporenbildung bei 37° C Sporenbildung bei 37° C |
d-Glucose-Agar schnee- bis aschenweiße rahmfarbige Sporen-
rahmweiße Sporenbildung; |
Sporenbildung, gelbe Bildung, Rückseite Rückseite gelblichbraun; |
Rückseite, gelbes Chartreuse, gelbes gelblichbraunes Pigment |
Pigment Pigment |
Waksman's Tyrosin- hell-grau-weiße Sporen- schwaches Wachstum;
schwaches Wachstum; |
Agar bildung;Rückseite rahm- keine Sporenbildung; keine Sporenbildung; |
farbig, schwachgelbes Rückseite Farbe des Rückseite Farbe des |
Pigment Mediums Mediums |
Caseinstärke-Agar rahmfarbige Sporen- schwach rahmfarbige rahmrosa
Sporenbildung; |
Bildung ; Rückseite Sporenbildung, Rück- Rückseite gelb |
rahmfarbig seite gelb |
Assimilierung von Kohlenstoffverbindungen |
1-Rhamnose ............ - @+ |
d-Fructose ............. -E- -f- |
Sucrose ................ -E- - |
Lactose................. + -1- |
Raffinose . . . . . . . . . . . . . . . + - (-) |
Inulin ................. - (-) |
Dulcit . . . . . . . . : . . . . . . . . . - (-) |
dl-Inosit................ |
Na-Formiat ............ - (-) |
Na-Oxalat .. . . . . . . . . . . . . = - (-) |
Na-Tartrat.............. - (-) |
-[- = positive Assimilierung. |
(J = positive Assimilierung - nur geringes Wachstum. |
= keine Assimilierung. |
(-j = schwaches Wachstum - keine Assimilierung. |
Zur Herstellung von N ovobiocin wird S. niveus im wäßrigen Medium, das vorteilhafterweise
assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter sübmersen aeroben Bedingungen
fermentiert. Wird jedoch frisch gesammelte Erde, die mit Sporen von S. niveus inoculiert
ist, bei 28° C 10 Tage bebrütet, so finden sich keine Anzeichen einer antibiotischen
Aktivität.
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Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit werden für die Nov obiocinfermentierung
gewisse Kulturmedien bevorzugt. Die zur Zeit bevorzugten Kohlenstofflieferanten
im Nährmedium sind z. B. Kohlehydrate, wie Glucose, Sucrose, Dextrin und/oder eine
Mischung von Glucose und Stärke. Andere Lieferanten sind Melassen, Maltose, Fructose,
Inulin, Raffinose, Xylan, Lactose, Glycerin u. dgl. Der bevorzugte Stickstoftlieferant
ist vDistiller's solublesc (getrocknetes Filtrat eines bei der Hefegärung erhaltenen
Destillationsrückstandes). Andere Lieferanten sind Baumwollsamenmehl und dessen
Derivate, Eiprodukte (Eipepton, ganzes Ei, Eigelb u. dgl.), Brauereihefe, Erdnußmehl,
Sojabohnenmehl und seine Derivate, Maisglutenmehl (Rückstand aus der Stärke und
Glutenfabrikation), Fleischextrakt, Fleischprodukte wie Fleischmehl und Knochenschrot,
tierischer Leim u. dgl., Guarsamenmehlprotein (Rückstand aus Samen von Cyamopsis
tetragonalabus), Maiseinweichwasser, Fischmehl, Leinsamenmehl, getrockneter Kehricht,
Lebermehl, Hefeextrakt (ein wasserlösliches, durch Autolyse von Hefe erhaltenes
Produkt), Milchprotein u. dgl.
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Anorganische Nährsalze, die sich mit Vorteil verwenden lassen, sind
assimilierbare Salze, die Ionen wie Natrium, Kalium, Kalzium, Phosphat, Sulfat u.
dgl. abgeben. Anorganische Stickstofflieferanten wie Nitrate oder Ammöniumsalze
können ebenfalls Verwendung finden.
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Wichtige Spurenelemente wie Magnesium, Mangan, Zink, Eisen u. dgl.
können für die Kultur von S. niveus ebenfalls im Nährmedium enthalten sein. Solche
Spurenelemente werden meist bei der Zugabe der andern Komponenten des Mediums als
Verunreinigungen eingeführt.
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Zur Erzielung des besten Wachstums und der besten Entwicklung von
S. niveus sollte das Kulturmedium vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus auf
ein p" zwischen 7,5 und 8,5, vorzugsweise etwa 8,0, eingestellt werden.
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Bei der Herstellung großer Mengen Novobiocin bevorzugt man submerse
aerobe Kulturbedingungen. Zur Herstellung beschränkter Mengen des Antibiotikums
kann man in Schüttelflaschen oder mit Oberflächenkulturen in Flaschen arbeiten.
Erfolgt die Kultur in großen Behältern oder Tanks, bevorzugt man zur Beimpfung die
vegetative Form des Mikroorganismus, um eine ausgesprochene Verzögerung der Bildung
des Antibiotikums und dadurch eine schlechte Ausnutzung der Anlage zu vermeiden.
Es wird deshalb bevorzugt, zunächst ein vegetatives Inokulum herzustellen, indem
man eine verhältnismäßig kleine Menge des Kulturmediums mit Sporen des Mikroorganismus
beimpft, und wenn ein junges aktives, vegetatives Inokulum entstanden ist, dieses
aseptisch in die großen Behälter oder Tanks einführt. Das Medium, in dem das Inokulum
erzeugt wird, kann gleich sein wie das Kulturmedium oder von diesem verschieden.
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Die besten Ausbeuten an Novobiocin werden erhalten, wenn das Kulturmedium
bei Temperaturen zwischen etwa 24 und etwa 32°C, vorzugsweise bei etwa 28°C, gehalten
wird.
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Das Verfahren der Erfindung beschränkt sich nicht auf die Erzeugung
von Novobiocin durch S. niveus oder Organismen, welche den vorstehenden Charakteristiken
voll entsprechen, die nur zur Illustration angeführt wurden. Es versteht sich, daß
das Fermentierungsverfahren der vorliegenden Erfindung auch andere Novobiocin bildende
Stämme von S. niveus, die man leicht durch routinemäßige Verfahren erzeugen und
isolieren kann oder durch Modifizierungsverfahren, indem man einen gezüchteten Organismus
auswählt und diesen modifizierenden Einflüssen wie Röntgenstrahlen, ultraviolettem
Licht und Mutationen bewirkenden- Chemikalien, wie Stickstoffsenfen u. dgl., aussetzt.
Die
Geschwindigkeit der Novobiocinproduktion und die Konzentration des Antibiotikums
im Kulturmedium lassen sich während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus durch
Prüfung von entnommenen .Proben des Kulturmediums auf ihre Wirksamkeit gegen einen
Organismus, von dem man weiß, daß er auf das Antibiotikum anspricht, wie K. pneumoniae
(ATCC 10 031), leicht verfolgen. Hierzu empfiehlt sich ein Test, in welchem serienweise
Verdünnungen der Kulturproben hergestellt werden, von denen man Portionen geschmolzenen
Nähragars zusetzt, den Agar in einer Petrischale fest werden läßt, die Platte mit
einer jungen Kultur von K. pneumoniae (ATCC 10 031) beimpft und die höchste Verdünnung
des Kulturmediums feststellt, die noch eine vollständige Hemmung des Wachstums des
Mikroorganismus auf dem Nähragar bewirkt.
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Die Bildung des Novobiocins kann auch durch Prüfung der Trübung, wie
sie bei der Herstellung anderer Antibiotika allgemein Anwendung findet, verfolgt
werden. Im allgemeinen findet nach der Beimpfung die maximale Bildung des Antibiotikums
bei submersen aeroben Kulturen zwischen etwa 2 und 6 Tagen statt.
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Das antibiotische Material kann aus dem Kulturmedium durch Extraktion
oder Adsorption, z. B. auf Ionenaustauschharzen, wie Permutit D. R. (ein poröses
anionisches Polymer mit schwachem Anionenaustauschvermögen fürstarkeSäuren [s.U
SA.-Patentschrift2702263, 2. Kolonne, Zeilen 62 bis 73]) u. dgl., und Eluierung
des Antibiotikums. mit Eluiermitteln, wie wäßrige niedrige Alkanole u. dgl., isoliert
werden. Für die technische Herstellung werden die Extraktionsverfahren bevorzugt,
da sie wirtschaftlich und weniger zeitraubend sind.
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Ein geeignetes Isolierungsverfahren- besteht darin-, das fermentierte
Nährmedium anzusäuern - und - den erhaltenen Niederschlag zu trocknen. Man kann
aber . den Niederschlag auch in einem wäßrigen Medium lösen und dann der `Gefriertrocknung
unterwerfen, um das antibiotisch wirksame Material in Salzform zu erhalten.
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Nach einer bevorzugten Methode zur Isolierung der antibiotisch aktiven
Komponente wird das fermentierte Nährmedium in einem mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittel, z. B. einem niedrigen Alkanol oder Alkylacetat, Alkylketon
usw., extrahiert, - der erhaltene Lösungsmittelextrakt auf ein verhältnismäßig kleines
Volumen eingeengt und aus dem erhaltenen Konzentrat - das Antibiotikum mit einem
weiteren Lösungsmittel, das sich mit dem ExträktiönsmitteI mischt, ausgeführt. Hierbei
fällt das Antibiotikum, in amorpher Form an. _ Nach einer weiteren Methode zur Isolierung
von Novobiocin wird die ganze Kultur beim p$ 7 bis -10, vorzugsweise 8, filtriert;
das. Filtrat mit Mineralsäure, wie H Cl, HIS 04, Phosphorsäure usw., auf einen pH-Wert
zwischen 2 -und 7, vorzugsweise 6, eingestellt und das antibiotische Material mit
einem niedrigen Alkylacetät@ vorzugsweise mit Amylacetät, Äthylacetät, Butylacetat
od. dgl:, extrahiert. Man kann als Extraktionsmittel auch reit Wasser nicht mischbare
niedrige Alkanole, wie n-Butanol, n-Amylalkohol, Isoamylalkohol u. dgl., wasserunlösliche
Ketone, wie Methyl isobutylketon, Methyl-isopropylketon u. dgl.,. benutzen. Der
Extrakt wird im Vakuum öder in sonst geeigneter Urleise konzentriert und dem Konzentrat
ein Kohlenwasserstoff mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, d. h. Skellysolve Lösungsmittel,
vorzugsweise solche mit 6 oder 7 Kohlenstoffatomen, wie Hexan (Skellysolve B) oder
Heptan, zugesetzt. Das Antibiotikum wird ausgefällt und getrocknet, wobei man ein
teilweise gereinigtes Produkt erhält. Zur weiteren Reinigung kann das Produkt bei
saurem p$, z. B. unterhalb von etwa 4, aus Wasser-Aceton umkristallisiert werden:
Novobiocin besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: Optische
Drehung[a] bis 211 p - -63,0° (Konz.l °/a in absolutem Äthanol, 2 dm).
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In kristalliner Form hat das Novobiocin zwei verschiedene Schmelz-
oder Zersetzungspunkte. Eine Form, d. h. Form 1, schmilzt zwischen 174 und 178°C;
die andere Form 2 zwischen 149 und 151'C (nach vielmaligem Umkristallisieren
beträgt der Schmelzpunkt 152 bis 156°C).
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Die Form 1 des kristallinen Novobiocins weist folgende Röntgendaten
auf:
2 Flächenabstände t1 |
6,16 ........................ 14,34 |
9,02 ........................ 9,79 |
11,52 ........................ 7,67 |
13,18 ........................ 6,71 |
14,33 ........................ 6,17 |
15,88 ........................ 5,58 |
23,10 ........................ 3,85 |
25,90 ........................ 3,44 |
42,28 ........................ 2,14 |
49,05 ........................ 1,86 |
Die Form 2 des kristallinen Novobiocins weist folgende Röntgendaten auf
2 Flächenabstände t1 |
7,27 ........................ 12,16 |
12,27 ........................ 7,21 |
14,63 ...........:............ 6,05 |
21,14 ........................ 4,20 |
23,65 ........................ 3,76 |
25,95 ............:........... 3,43 . |
28,21 ........................ 3,16 |
Die Daten wurden nach der Pulvermethode in einer Picker-Waite-Beugungseinrichtung
mit nickelfiltrierter Kupfer-Kal-Strahlung ermittelt.
Kristallographische Eigenschaften |
System ... ........, ... Orthorhombisch |
Klasse ... : ... . ..... .. . Rhombisch Dipyramidal |
Vorhandene Formen .... Makroprismatisch ....
(210) |
Brachydom . ......... (913). |
Flächenwinkel . . - . . . . . 2107" 210 = 54,5° |
013 @., 013 = 1440 |
Achsenverhältnis ....... 0,514:1:0,324 |
Zellendimension . . . . . . . . a = 13,56 A |
`- b = 26,38 Ä |
c = 8,54A. |
Optisches: Vorzeichen ... negativ |
Dispersion .. . . . . . . ... . : : . extrem, z > u |
Allgemeine. Orientierung geneigte spitzwinklige Halbier |
rungslinie , |
Brechungsindizes . . : . .-. a = 1,608 |
ß = 1,638 |
y = 1,654 |
Optischer Achswinkel ... 2 K = 71 |
Optische Orientierung . . a = x - |
b-y -. a |
3 |
Molare Refraktion ...... a, ß, y =
1,633, |
Dichte = 1,3448 |
Mr = 164,23 (D) |
Molekulargewicht ....... Röntgenkristallographische |
Messungen ergeben ein |
Molekulargewicht von 618 |
Novobiöcin ist in wäßrigen Medien bei p11-Werten oberhalb 'von etwa 7,5 löslich
(> 100 mg/ccm). Mit
Abnahme des pA-U'ertes von 9,0 nach 5,0 nimmt
die Löslichkeit ab. Das Antibiotikum löst sich in niedrigen Alkanolen, wie Methanol,
Äthanol u. dgl., niedrigen Alkylacetaten, wie Äthylacetat ü. dgl., Methyläthylketon
und Aceton.
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Die Elementaranalyse des Novobiocins ergibt folgende Werte
Element |
C ... . ............................ 59,406/o |
H ....................:.......... 6,446/6 |
............................... 4,54-6/6 |
0 (Differenz) ..................... 29,626/6 |
aus vorstehenden U"erten berechnet sich die Bruttoformel des Novobiocins zu C36_32H38-42011-12N2#
Die elektrometrische Titration in Wasser zeigt die Anwesenheit von zwei sauren ('Truppen
an pKa, (Niederschlag), pKa, = 9,1. Die Absorptionsspektren im Ultraviolett bei
verschiedenen pH-Werten (zwischen 1 und 7) in Wasser ergeben ein pKa, von 4,3, In
Dimethylformamid sind zwei Umkehrpunkte: pKal = 5,7 und pKa, = 11,9. Das berechnete
Äquivalenzgewicht für C36HseO12N2 und C31H42011N2 = 618; gefunden 636.
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Die polarographische Untersuchung von Novobiocin (Form 1 und 2) ergab,
daß die Verbindung in 1:1-Äthanol-Wasser-Lösung, die 0,001 n-H2S04, 0,05 n-(CH3)4NCI
oder 0,001 n-K O H als Elektrolyt enthielt, an der Quecksilbertropfelektrode nicht
reduzierbar ist. Die Potentialbereiche waren 0 bis -1,5, 0 bis -2,0 und 0 bis -2,0
Volt gegen S. C. E. für saure, neutrale bzw. alkalische Lösungen.
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Kristallines Novobiocin ist etwas lichtempfindlich, indem es am Licht
gelb wird und etwas seiner biologischen Wirksamkeit einbüßt. Lösungen sind beim
p$ 2 bis 10 und 4'C 60 Tage stabil.
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Nach viehmaligem Umkristallisieren erhielt man folgende Elementaranalyse:
Element |
C ................................. 59,696j6 |
H ............................... 6,666/6 |
N ...............................- 4,486/6 |
0 (Differenz) ..................... 29,176/6 |
Verdünnte wäßrige Lösungen, d. h. 0,1 bis 1 mg/ccm, die 60 Tage bei 25°C gehalten
wurden, zeigten bei Prüfung in vitro folgende Stabilität:
p$ Halbwertszeit |
2 ............................... >60 Tage* |
7 bis 10 ........................ 60 Tage |
12 ............................ . 3 Tage |
Keine Anzeichen von Verlust au biologischer Wirksamkeit |
nach 60 Tagen. |
Mit dem Beckman-Quarz-Spektrophotometer Modell DU oder dem Carry-Registrierspektrophotometer
ergibt Novobiocin (Form 1 und 2) folgende UV-Spektten: In 956/6igem Äthanol mit
0,01 n-H2S04-Gehalt gelöst (Fig. 1, gestrichelt)
Maxima , - Wendepunkte |
334 m#t, EE.6. = 437,0 250 m#t, E'1'"". = 210,8 |
262 m#t, El..-. = 192,8 |
282 m#t, Ei m = 206,8 |
304 mp" E,".". = 273,1 |
In 956/6igem Äthanol mit 0,01 n-KOH-Gehalt gelöst (Fig.1, ausgezogen):
Maxima Minima Wendepunkte |
311 m#t, Ei m = 512,4 263 mit,, El l%.. = 162,5 237
mit,, Ei m = 313,8 |
255 m#t, Ei ö = 205,4 |
287 m#t, EIL = 347,6 |
Das charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum (Natriumchloridprisma) des kristallinen
Novobiocins der Form 1 (Fig. 2) in Mineralölsuspension zeigt Absorptionsbanden (in
cm-1 ausgedrückt), bei folgenden Frequenzen: 3500, 3445, 3395, 1744, 1738, 1694,
1642, 1607, 1542, 1500, 1374, 1360, 1320, 1294, 1280, 1252, 1235, 1219, 1162, 1138,
1124, 1103, 1091,
1080, 1062, 1029, 1000, 969, 930, 904, 879, 846, 800, 789,
770, 755, 739 und 716.
-
Das Infrarotabsorptionsspektrum (Natriumchloridprisma) der kristallinen
Form 2 (Fig. 3) zeigt Absorptionsbanden (in cm-' ausgedrückt) bei folgenden Frequenzen:
3480, 3360, 3280, 1715, 1690, 1635, 1610, 1586, 1507, 1374, 1344, 1315, 1293, 1259,
1186, 1157, 1121, 1084, 1064, 1022, 998, 972, 934, 919, 837, 818, 809, 789, 781,
761, 753 und 741.
-
Die sauren und/oder neutralen Metallsalze des Novobiocins einschließlich
der Alkali- und Erdalkalisalze stellt man in der Weise her, daß man eine wäßrige
oder organische Lösung oder Suspension des Antibiotikums ein oder zwei Äquivalente
einer wäßrigen Base wie NaOH, K O H, [(Ca(O H)2 Ba(0 H) 2] u. dgl. oder den entsprechenden
Alkoxyden, wie Methoxyden (in wasserfreiem Medium), zugibt und trocknet, indem man
die Lösung entweder im Vakuum zur Trockne eindampft oder der Gefriertrocknung unterwirft.
Verwendet man beispielsweise ein Äquivalent der Base, so erhält man das entsprechende
Monoalkali- bzw. -erdalkalisalz des Novobiocins.
-
Saure Salze des Novobiocins erhält man auch durch Zusatz eines Salzes
einer schwächeren Säure, d. h. eines .Mkalicarbonats, -bicarbonats, -acetats od.
dgl., zu einer wäßrigen oder organischen Lösung oder Suspension des Antibiotikums
und vorzugsweise zu einer organischen Lösung desselben, ein Eindampfen oder Abfiltrieren
des Niederschlags vom organischen Lösungsmittel.
-
Eine weitere Methode zur Herstellung der sauren Salze des Novobiocins
ist die doppelte Umsetzung, bei der ein saures Salz des Antibiotikums mit einem
anorganischen Salz umgesetzt wird; gibt man beispielsweise saures Natriumnovobiocin
zu einer wäßrigen oder organischen, z. B. äthanolischen Lösung von Calciumchlorid,
so erhält man das saure Calciumnovobiocin als weißen Niederschlag.
-
In analoger Weise erhält man bei Behandlung des Antibiotikums mit
zwei Äquivalenten einer Base wie NaOH, KOH, Ca(OH)2 oder Ba(OH)2 u. dgl. die entsprechenden
Neutralsalze des Novobiocins.
-
Das neutrale Dinatriumsalz des Novobiocins hat folgende Bruttoformel:
C36_32H36--46N2011-12Na2-
Berechnet für C36Hs6N2012Na2 und-C"H46N2011Na2: |
Na 6,94; |
gefunden .............................. Na 6,77. |
Das neutrale Dikaliumsalz des Novobiocins hat die Bruttoformel C36-32Hs6-46N2011-12K2.
Berechnet für C36H86N2012K2 und C"H46N2011K2# |
K 11,25; |
gefunden .............................. K 11,14. |
Das charakteristische Infrarotspektrum des neutralen Dinatriumsalzes des Novobiocins
mit einem Natriumchloridprisma in Mineralölsuspension zeigt Absorptionsbanden (Fig.4),
in cm-' ausgedrückt bei folgenden
Frequenzen: 3360, 2190, 1718,
1645, 1605, 1525, 1465, 1425, 1377, 1325, 1265, 1217, 1132, 1115, 1084, 1022, 995,
969, 955, 825, 797, 771, 740 und 717.
-
Zur Herstellung der Amin- oder Ammoniumsalze des Novobiocins wird
eine Lösung des Antibiotikums in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol,
Äthanol, Propanol (und dessen Isomeren), Butanol (und dessen Isomeren) u. dgl.,
Amylacetat usw. mit einem Äquivalent Ammoniak oder des gewünschten Amins, wie Mono-,
Di-und Trimethylamin, Mono-, Di- und Triäthylamin, Mono-, Di- und Tripropylamin
(iso- und normal), Äthyldimethylamin, Benzyldiäthylamin, Cyclohexylamin,Benzylamin,
Dibenzylamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, bis-(Ortho-methoxyphenylisopropyl)-amin
und ähnlichen niedrigaliphatischen, niedrigcyclöaliphatischen und niedrigarylaliphatischen
Aminen mit bis einschließlich 8 Kohlenstoffatomen; heterocyclischen Aminen, wie
Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, Piperazin und deren niedrige Alkylderivate, wie
1-Methylpiperidin, 4-Äthylmorpholin, 1-Isopropylpyrrohdin, 1,4-Dimethylpiperazin,
1-n-Butylpiperidin, 2-Methylpiperidin, 1-Äthyl-2-methylpiperidin, Aminen, die wasserlöslichmachende
oder hydrophile Gruppen enthalten, wie Mono-, Di- und Triäthanolamin, Äthyldiäthanolamin,
n-Butyl-monoäthanolamin, 2-Amino-l-butanol, 2-Arnino-2-äthyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol,
Trisoxymethyl-aminomethan, Phenylmonoäthanolamin, p-Tertiäramylphenyldiäthanolamin,
und Galactamin, N-Methylglucamin, N-Methylglucosamin, Ephedrin, Phenylephedrin,
Epinepherin, Procain, usw. ; Tetraäthylammoniumhydroxyd u. dgl., quaternäre Ammoniumhydroxyde;
Guanidin u. dgl., umgesetzt.
-
In analoger Weise kann man andere Salze des Novobiocins herstellen,
indem man das Antibiotikum mit komplexeren Aminen, wie N eomycinen (einschließlich
Neamin, Neomycin und Neomycin C), Erythromycinen (Erythromycin und Erythromycin
B), Tetracyclinen usw. umsetzt.
-
Novobiocin und dessen Salze kennzeichnen-sich durch ihre große antibakterielle
Wirkungsbreite. Die Wirksamkeit des Antibiotikums gegen verschiedene Mikroorganismen
ist in der folgenden Tabelle .zusammengestellt:
Tabelle IV |
Antibakterielle Wirkungsbreite - Minimale Hemmungskonzentration
(mg/ml) |
*Minimale Hemmungskonzentration in mg/ml |
Organismus IHirn-Herz-MediumI ' 2 Synthetisches Medium (7 AW)
An äere Medien |
Grampositiv |
M. aureus 284 .................................. 0,1 0,04 |
S. hemolyticus C 203 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 3,1 0,39 |
S. hemolyticus L-2 .............................. 0,78 |
S. viridans U 25-11 .............................. 0,78 25 |
S. viridans L-17 .............................. 25 |
S.fecalis 176 ................................... 1,56 0,78 |
S.fecalis 6057 .................................. 1,56 - |
S. uberis 175 ................................... 6,2 |
S. agalactiae 7077 ............................... - 0,39 |
D. pneumoniae FI ............................... 1,56 0,78 |
C.sporogenes ................................... - 25 |
C. novyi UC 213 ................................ 25 12,5 |
M..albus 151 .................................... 0,2 - |
B. subtilis (Ill. strain) . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 1,5 - |
L. mesenteroides ................................ 2,5 |
L. citrovornm UC-221 . ... . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 25 - |
C. faciens UC 168 ................. ......... . .... - 1,56
3Difco NIH |
C. diphtheriae .................................. - 0,04 |
C. diphtheroides................................: - 3,1 |
L. monocytogenes ............................... - 1,5 |
B. anthracis .................................... - - 1,0 |
Gramnegativ |
A. aerogenes ATCC 8308 ......................... 12,5 - i |
A. aerogenes 1-1 ................................ 50 |
E. coli ATCC 26 ................................ 50 - |
E. coli 9-12 .................................... - > 100 |
E. coli L-74 .................................... - >
1,00 |
P. vulgaris ATCC 8427 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 6,25 - |
P. vulgaris ATCC 6380 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . - > 100 |
P. vulgaris P-2 ................................. - > 100 |
P. vulgaris 43 ................................... 3,1 `100 |
P. vulgaris 47 ................................... 25 400 |
P.vulgaris 58 ................................... 6,2 > 400 |
P. vulgaris ATCC 6897 . .. . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . - 25 |
P. vulgaris 347 .................................. 3,1 100 |
P. morgani 59 .................................. 400 > 400 |
P. morgani 99 .................................. 50 200 |
P. morgani 118 ................................. 200 j > 400
, |
Fortsetzung Tabelle IV |
Organismus *Minimale Minimale Hemmungskonzentration in mg/ml |
Organismus zSynthetisches |
1Hirn-Herz-Medium l Medium (7 AW) I Andere Medien |
Gramnegativ |
P. rettgeri 74 ,.................................. > 100 >
400 |
P.rettgeri 100 ....................... .......... 6,2
50 |
P. rettgeri 121 .................................. > 100 >
400 |
Ps. aeruginosa ATCC 9027 ....................... > 400 - |
Ps. aeruginosa 10 145 . .......................... - > 100 |
Ps. aeruginosa L-55 ............................. - > 100 |
Ps. aeruginosa YED ............................. - > 100 |
Pseudomonas sp. B 20 ........................... > 400 > 400 |
Pseudomonas sp. B 22 ........................... > 400 > 400 |
Pseudornonas sp. C 33 ............................ 12,5 12,5 |
Pseudomonas sp. C 40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 12,5 12,5 |
Pseudomonas sp. C 77 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 12,5 12,5 |
Pseudomonas sp. C 79 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 12,5 12,5 |
Pseudomonas sp. C 85 ............................ > 400 > 400 |
S. paratyphi B Ho. 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . > 400 > 100 |
S. pullorum 75 .................................. 50 > 100 |
S.typhi TG-3 ................................:. 12,5 > 100 |
S. marcescens ATCC 60 .......................... 25 - |
K. pneumoniae AD .............................. 6,25 > 100 |
K. pneumoniae K 2 ................... . ........ - 100 |
P. multocida 449 .............................. 1,56 0,78 |
S. gallinarum 74 . . . . . . . . . . . . . ._. . . . . . :
. " "........... - > 100 |
S. fiesneri 77 ... : . . . . . . . . . . . . . . . .
. . : . . . .-. . . . _ . : . - > 100 |
S.flexneri 73 ................................... - > 100 |
X. pruni .............................. ,........
- - 3 Difco NIH |
X. campestris . .. . . .. . . .. .. . . ... . . . . .. . .
.. . . . . . . . 50 - 1;56 Difco NIH |
A. tumefaciens ........................ . . .... . . 100 -
° 1,56 Difco NIH |
E. carotovora .......................... ........ > 100 - |
E. Amslovora ......... ...................... > 100 = 100 Difco
N IH |
N. gonorrheae 337 . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . - 1,5 25 4(Blut-Agar) |
N. meningitidis UC-546 . ..... . . . . . . . . . .. . . . .
.. .. . 1,5 |
N. meningitidis UC-548 .-................ ...... . ` 0,39 |
N. meningitidis UC-549 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . > 0,09 |
S. enteriditis .................................... - - 50,0 |
Shig.fiexneri ................................... - - 50,0 |
Malleomwes mallei . . .... . ... . . . .. . . . .. . . ...
. ... . - - 3,0 |
P. pestis ....................................... - - 30,0 |
Brucella suis .................................... - - 3,0 |
teilweise bei 1,0 |
Bacterium tularense ............................. - - = 3,0 |
-teilweise bei 1,0 |
Säurefest |
11. tuberculosis H 37 Rv . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . - 2,5 (7 Tage Test) |
- (5Kirchner's |
Nährbouillon) |
*iNiedrigste Konzentration des Antibiotikums, welche das Wachstum
bei 37' C innerhalb 18 bis 24 Stunden vollkommen verhindert. |
'Infusion von Kalbshirn 200, Infusion von Rinderherz 250, Proteosepepton
(teilweise hydrolysiertes Protein) 10,0, Dextrose 2,0, |
Natriumchlorid 5,0, Dinatriumphosphat 2,5 (Bestandteile in
g11). |
=Synthetisches Medium (7 AW Medium) |
Glukose ....................................... 2,5 g Z3racil...........................................
0,5 mg |
N acl ......................................... 2,5 g Nicotinsäure
. ................................ O ,l mg |
KF.=P04 .. ................................... 3,0 g Thiamin-Chlorhydrat..........................
.... 0,1 mg |
N-7--Amin A ... . .... .............. . 4,0 g M9S 04
.................................. - ....... 100 mg |
HefeAxtral,-t (Fleischmann Ho. 3) ..... ..... . .. ... 0,5
mg MnS04 . . .. .. . . . ... . . .. . . . . . . .. . . . . ... . . .. .... . ..
510M9 |
Tyrr>in ...................................... 0125M9
FeS 04 ................. ....... ,................. 510M9 |
Try--tophan .... .. . . . ... . . ..... 7,0 mg Aqua dest. ..
.. .. ............1000 ml |
mit @ 3,1 1-NaOH auf pg 7,5 eingestellt, 10 Minuten im Autoklav
bei 120° C und #6,8 kg Druck behandelt. |
"In Cramm pro Liter: Cassitone (Panlreasabbauprodukt des Caseins)
15,0, Hefeextrakt 5,0, Dextrose 1,0, latriumchlorid 2,5, |
1-Cystein 0,05. 10 Minuten bei 120'C und 6,8 kg Druck im Autoklav
behandelt. |
-'In Gramm pro Liter: Proteose Pepton 15,0, Dextrose 2,0, lösliche
Stärke 10,0, Natriumchlorid 5,0, Dinatriumphosphat 3,0, Gelatine |
20,0 und Agar 10,0. 15 Minuten bei 121° C und 16,8 kg Druck
im Autoklav behandelt, auf 45 bis 50' C abgekühlt und mit 50 ml ent- |
&briniertem Blut pro Liter versetzt. |
sln Gramm pro Liter: Asparagin 5,0 Mononatriumsulfat
0 ,6, `atriumcitrat 2,5, Feriammoniumcitrat 0,05, Glycerin 20 ml, Poly- |
sorbat 80, 0,5 r71. 10 Minuten bei 120'C und 6,8 kg Druck im
Autoklav, dann Zusatz von 20/0 Rinderserumalbumin. |
Infolge seines hohen Wirkungsspiegels gegen L. mesenteroides,
den Organismus, der die Verstopfung der Leitungen in der Zuckerindustrie hervorruft
(Frobisher, Fundamentals of Bacteriology, S. 555, 3. Auflage, 1944) sind Novobivein
und dessen Derivate wertvoll zur Behebung dieses unerwünschten Zustandes. Das Antibiotikum
wird in der ersten Stufe des Raffinationsprozesses der Rohzuckerlösung in Mengen
von 1 bis 10 mcg/ ml zugesetzt, worauf die Lösung die folgenden Raffinationsstufen
durchläuft. Novobiocin und dessen Derivate eignen sich auch in Form einer Zerstäubung
(Konzentrationen von 0,5 bis 5 mcg/ml) zur Behandlung der Kronengalle, die durch
A. tumefaciens an Wurzelpflanzen und der durch X. campestris hervorgerufenen Welkkrankheit.
-
ovobiocin und seine Derivate sind zur Bekämpfung vieler bei Mensch
und Tier durch Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionskrankheiten wertvoll. Hierfür
wird das antibiotische Material zweckmäßig mit einem pharmazeutisch geeigneten flüssigen
oder festen Träger gemischt und in geeignete Dosierungsformen gebracht. Falls gewünscht,
können weitere Antibiotika und andere therapeutische Mittel, z. B. Sulfonamide,
zugesetzt werden.
-
Beispiel 1 In einen 500 ccm fassenden Erlenmeyerkolben gibt man:
Glukosemonohydrat . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .
. 2,5 g |
Baumwollsamenöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 4,0 g |
Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 100 ml |
Man sterilisiert im Autoldav 20 Minuten bei 120°C und 6,8 kg Druck. Nach dem Abkühlen
wird das Medium mit einer wäßrigen Sporensuspension von S. niveus NRRL 2466, erhalten
auf einem Maitose-Trypton-Schrägagar (Zusammensetzung in g/1 Maltose 10, Trypton
5, K2 H P 04 0,5, Fe S04 - 7H30 0,1, Agar 15) und bebrütet 3 Tage bei 28°C auf einer
rotierenden Schüttelmaschine nach Gump (250 Touren pro Minute mit 6 cm Rüttelbewegung).
0,2 ccm dieses vegetativen Saatgutes verwendet man für die Beimpfung eines 500-ccm-Erlenmeyerkolbens,
der folgendes Medium enthält
Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 2,8 g |
Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 2,0 g |
Wasser q. s. ...... . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 100 ml |
Na OH bis zum p, 7,8 bis 8,0 |
Vor der Beimpfung wurde der Kolben im Dampfautoklav bei 120°C und 6,8 kg Druck,
20 Minuten sterilisiert (das pH des Mediums nach der Sterilisation war zwischen
6,2 und 7,5). Das Kulturmedium wird nach dem Abkühlen und Impfen auf einer rotierenden
Schüttelmaschine nach Gump (250 Umdrehungen pro Minute und 6 cm Rüttelbewegung)
bei 28°C bebrütet. Am 3., 4. und 5. Tag wurde die Wirksamkeit des Mediums bestimmt.
Während des Wachstums der Kultur fällt das Anfangs-pH von 6,5 auf etwa 6,0, wonach
es ständig auf 8,0 bis 8,5 ansteigt. Nach 5 bis 6 Tagen war die unter diesen Bedingungen
erzielbare Höchstproduktion etwa 400 mcg/ccm.
-
Erhöht man die Menge des @>Distillers solublesr auf etwa- 4,0 g, so
erhält man eine merkliche Erhöhung des antibiotischen Titers. Ersetzt man Glukosemonohydrat
durch Sucrose (etwa 2,5 bis 4,0 g/100 ccm Medium), so erhält man ebenfalls eine
wesentliche Steigerung des antibiotischen Titers.
-
Die antibiotische Wirksamkeit wurde mittels des Standard-Diffusionsversuchs
bestimmt, indem man die Zone der Inhibierung gegen K. pneumoniae (ATCC10031) um
ein mit der zu prüfenden Lösung getränktes Filterpapier mißt, das auf ein mit dem
Testorganismus beimpftes Prüfagarmedium für Novobiocin gelegt ist.
-
Beispiel 2 In einen 500-ccm-Erlenmeyerkolben gibt man 100 ccm des
folgenden sterilen Mediums: Medium A
Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 10 g |
Natriumchlorid . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .
. ... 59 |
Pepton (hydrolysiertes Fleischprotein) ....... 5 g |
Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 10 g |
Leitungswasser q. s. .... . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 1 1 |
Nach Beimpfung mit einer wäßrigen Sporensuspension von S. niveus wird auf einem
hin- und hergehenden Schütteltisch bei 28°C 72 Stunden bebrütet. Die erhaltene Kultur
wird Vorkultur genannt.
-
Ein 25-1-Fermentierbehälter aus rostfreiem Stahl, der 121 des folgenden
sterilen Mediums enthielt Medium B
Brauner Zucker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 10 g |
Glycerin .................................. 5 g |
Lactose .................................. 5 g |
Dextrin .......... . ................. 5 g |
Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 7 g |
Bierhefe (S. cerevisiae für alkoholische Gärung) . 2 g |
Natriumchlorid ........... » ............... 5 g |
Ammoniumnitrat ... . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 2 g |
Maiseinweichwasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 2 g |
Calciumcarbonat .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 4 g |
Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .
. . . 1 1 |
wird mit 25 ccm der oben erhaltenen Vorkultur beimpft. Man bebrütet 2 Tage bei 28°C.
Die erhaltene Kultur wird Saat genannt.
-
In einen 3781 (100 Gallonen) fassenden Gärtank aus Stahl, der mit
Harz ausgekleidet ist und 2401 des sterilen Mediums B enthält, gibt man 121 der
vorstehend erhaltenen Saat. Das Fermentiermedium wird auf 28°C gehalten und unter
Rühren (280 Touren pro Minute - Saugrohrtyp-Rührer) mit 5,66 m3 Luft pro Stunde
belüftet. Zur Schaumbekämpfung gibt man am Anfang 300 ml Lardöl zu und im Verlauf
der Fermentation weitere 800 ml einer 1°/@gen Lösung von Octadecanol in Lardöl.
Nach 91 Stunden wird die Würze geerntet.
-
Eine aliquote Probe von 250 ccm der Würze, die 300 mcg/ccm Antibiotikum
enthält, wird durch Zusatz von 140 ccm 50°/Qiger Natronlauge auf p$ 8,0 eingestellt:
Man filtriert unter Verwendung von 12 g Dicalite (Infusorienerdefilter). Durch Zugabe
von 12 n-Schwefelsäure steilt man das Filtrat auf ein konstantes pH von 2,0. Der
Niederschlag wird abgetrennt, in Wasser wieder gelöst, indem man das pg mit Natronlauge
auf 9,0 stellt. Die Lösung wird dann der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält
so 117 mg Dinatriumnovobiocin mit einer Wirksamkeit von 500 mcg/mg (K. pneumoniae,
biologischer Test).
-
Beispiel 3 Zu sechs Erlenmeyerkolben von j e 500 ccm Inhalt gibt man
je 100 ccm des folgenden sterilen Mediums:
Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 10 g |
Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 5 g |
Pepton ................................... 5 g |
Fleischextrakt ............................ 10 g |
Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 1 1 |
Nach Beimpfung werden die Kolben auf einer Schüttelvorrichtung 72 Stunden bei 28°C
bebrütet. Man erhält so die Vorkultur:
3001 des folgenden sterilen
Mediums:
Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 25 g |
Baumwollsamenmehl (extrahiert) . . . . . . . . . . . . 40 g |
Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 1 1 |
werden in einem mit Harz ausgekleideten, 9081 fassenden Stahltank mit 600 ccm der
oben erhaltenen Vorkultur geimpft. Man belüftet mit 2261 Luft pro Minute und rührt
mit einem kührer mit gebogenen Flügeln mit 200 Touren pro Minute bei 28°C während
48 Stunden. Zur Verhinderung des Schäumens gibt man am Anfang 300 ccm Lardöl und
während der Fermentierung 1100 ccm einer 10Joigen Lösung von Octadecanol in Lardöl.
Die erhaltene Kultur ist das Saatgut.
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Zu 50001 des folgenden sterilen Fermentationsmediums:
Glukosemonohydrat ....................... 14 g |
Stärke ................................... 12,5 g |
Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 20 g |
Genügend Na OH zur Einstellung des pA auf 8,0 |
Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 1 1 |
in einem 75701 fassenden Tank aus rostfreiem Stahl gibt man 3001 der oben erhaltenen
Saat. Man hält bei 28° C, belüftet 22601 Luft pro Minute und rührt mit zwei Turborührern
mit gebogenen Flügeln bei 166 Touren pro Minute. Zur Verhinderung des Schäumens
setzt man am Anfang 51 Lardöl zu und während der Fermentation 12,51 einer einprozentigen
Lösung von Octadecanol in Lardöl. Nach 115 Stunden wird die Kultur geerntet.
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2251 der Kultur werden mit 140 ccm 50°/oiger Natronlauge auf pn 8,1
gestellt. Man filtriert mit 10 kg Dicalite. Das p1; der geklärten Lösung wird durch
Zusatz von 30 ccm konzentrierter Schwefelsäure auf 6,0 gestellt, wonach man mit
701 Amylacetat extrahiert. 100 ccm des Amy lacetates werden mit 600 ccm Skellysolve
B behandelt und der Niederschlag abfiltriert. Das feste Material wird in einer Mischung
von 400 ccm Aceton und 350 ccm Wasser gelöst und mit 25 ccm 1 n-Salzsäure und 100
ccm Wasser versetzt. Das erhaltene kristalline Material wird durch Filtration gewonnen.
Man erhält so Novobiocin in praktisch reiner Form 1000 mcg/mg (K. pneumoniae biologische
Plattenprüfung) vom Schmp. 149 bis 151'C.
Nach viermaligem Umkristallisieren
aus Aceton-Wasser-Mischung erhält man ein bei 152 bis 156°C schmelzendes Produkt.
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Beispiel 4 Zu 10g kristallinem Novobiocin in 300 ccm Wasser gibt man
32 ccm (2 Äquivalente) 1 n-Natriumhydroxyd. Die Lösung wird filtriert und der Gefriertrocknung
unterw-orfen. Man erhält das Dinatriumsalz (neutrales Natriumsalz) des Novobiocins
als weißes amorphes Produkt. Die Prüfung ergibt 960 mcgjmg (K. pneumoniae, biologische
Prüfung). Das feste Produkt ist wasserlöslich. Beispiel 5 Zu 1 g in 20 ccm Amylacetat
gelöstem Novobiocin gibt man 0,162 g (1 Äquivalent) di-n-Propylamin. Der erhaltene
weiße, amorphe Niederschlag, das saure di-n-Propylaminsalz des Novobiecins (1,1
g) wird abgetrennt und getrocknet.
Analyse für C"H"01.2-X;3: |
Berechnet ...... N 5,99; |
gefunden........ N 5,72. |
Das charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum dieses Salzes (in hlineralölsuspension)
zeigt, in cm-' ausgedrückt, Absorptionsbanden bei folgenden Frequenzen: 3370, 3190,
1709, 1633, 1602, 1527, 1494,
1335, 1275, 1215, 1137, 1119, 1090, 1022, 995,
971, 952, 818, 774, 762, 744 und 719.
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Arbeitet man gleich wie im Beispiel 5, ersetzt aber das di-n-Propylamin
durch 0,162 g Triäthylamin, so erhält man das Triäthylaminsalz des Novobiocins.
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Beispiel 6 25 g (40,5 Millimol) Novobiocin werden in 167 ccm Methyläthylketon
gelöst. Die Lösung gibt man in einen 250-ccm-Dreihalskolben und setzt 2,7 ccm Wasser
zu. Zu der kräftig gerührten Lösung gibt man im Verlauf von 30 Minuten insgesamt
2,13 ccm 19 n-Natronlauge. Während des Alkalizusatzes hält man die Lösung zwischen
50 und 60°C und rührt dann weitere 45 Minuten bei dieser Temperatur. Man läßt dann
auf 40°C abkühlen und rührt bei dieser Temperatur eine weitere Stunde. Man filtriert
vom so erhaltenen kristallinen Mononatriumnovobiocin ab, trocknet etwa 1 Stunde
an der Luft und über Nacht im Vakuum. Man erhält 23,94 g kristallines Produkt, dessen
Prüfung 940 bis 950 Mikrogramm pro Milligramm ergibt und das folgende Eigenschaften
aufweist: ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 304 m#t, Eil = 345; Absorptionsbänder
im Infrarot (Mineralölsuspension) bei folgenden Frequenzen in cm-1: 3480, 3340,
1715, 1705, 1655, 1630, 1600, 1522, 1498, 1426, 1370, 1327, 1270, 1215, 1165, 1134,
1115, 1085, 1020, 996, 969, 950, 890, 817, 785, 771, 739 und 715 (Fig. 5). Beispiel
7 Zu 61,8 g (0,1 Mol) Novobiocin, die in 250 ccm Aceton suspendiert sind, gibt man
eine Lösung von 4,0 g (0,1 Mol) Natriumhydroxyd in 50 ccm Wasser. Unter Bildung
des Mononatriumsalzes erhält man eine klare Lösung. Zu dieser Lösung gibt man 12,7
ccm 4 n-Calciumchlorid (1 Äquivalent), erwärmt schwach und rührt, bis die Kristallisation
gut eingesetzt hat (etwa 45 Minuten). Unter ständigem Rühren füllt man langsam mit
Wasser auf 600 ccm auf. Die so erhaltene Suspension von Monocalciumnovobiocin wird
über Nacht im Kühlschrank gehalten und dann filtriert. Das Produkt wird mit etwa
100 ccm Wasser gewaschen, abgepreßt und auf Filterpapier ausgebreitet an der Luft
getrocknet. Nach 24 Stunden wird das saure Calciumsalz im Vakuum getrocknet, wonach
man 54,8 g (86 °/o Ausbeute) eines beinahe weißen mikrokristallinen Pulvers erhält.
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Das Infrarotabsorptionsspektrum des Monocalciumnovobiocins (in Mineralölsuspension)
zeigt Absorptionsbanden bei folgenden Frequenzen (Fig. 6), in cm-' ausgedrückt:
3480, 3340, 1715, 1702, 1650, 1620, 1600, 1521; 1500, 1425, 1330, 1262, 1214, 1170,
1132, 1111, 1085, 1020, 993, 969, 958, 895, 817, 785, 767, 760, 737 und 712. Beispiel
8 Zu einer Suspension von 10 g Novobiocin in 100 ml Wasser gibt man 32,4 ccm (2
Äquivalente) 1 n-Kaliumhydroxyd. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat der Gefriertrocknung
unterworfen. Man erhält 11,0 g amorphes @Dikaliumnovobiocin, dessen Prüfung 900
mcg/mg ergibt. Beispiel 9 Zu einer Suspension von 10 g Novobiocin in 100 ccm Wasser
gibt man 1,2 g (2 Äquivalente) Calciumhydroxyd. Die erhaltene Lösung wird filtriert
und das Filtrat der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält 9,6 g Dicalciumnovobiocin
in amorpher Form mit einem Gehalt von 780 mcg/mg.
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Das Infrarotabsorptionsspektrum (in Mineralölsuspension) zeigt Bänder
bei folgenden Frequenzen in cm-': 3340, 3200, 1715, 1702, 1650, 1602, 1525, 1430,
1332,
1265, 1217, 1135, 1090, 1030, 995, 968, 955, 820 und 767
(Fig. 7).