DE2022649A1 - Mikrobiologisches Oxydationsverfahren - Google Patents

Description

Eastman Kodak Company, 343 State Street, Rochester, Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Mikrobiologisches Oxydationsverfahren

(Zusatz zu Patent (Patentanmeldung 19 22 843.4-42))

In der deutschen Patentschrift . (Patentanmeldung

P 19 22 843.4) wird ein mikrobiologisches Oxydationsverfahren beschrieben, bei dem organische Verbindungen unter aeroben Bedingungen mit einem Bakterium in einem das Wachstum des Bakteriums fördernden Nährmedium oxydiert werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Bak- j terium Flavobacterium oxydans (ATCG Nr, 21245) verwendet, j

Das aus der deutschen Patentschrift (Patentanmeldung P 19 22 843.4) bekannte Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von Carbonsäuren durch Oxydation von Alkoholen. Ganz speziell eignet sich das bekannte Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch Oxydation von Alkanolen, insbesondere mehrwertigen Alkoholein. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Herstellung von Carbonsäuren durch Oxydation 4-wertiger Alkanole, insbesondere^Pentaerythritol. So.eignet sich das bekannte Verfahren in vorteilhafter Weise zur Her

stellung :von Tris(hydroxymethyl)es

Jigsäura.

■ f i

■' .' -Uq-

ioMao/2o«i

2022549

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß sich das aus der deutschen Patentschrift . ... ... (Patentanmeldung P 19 22 843.4) bekannte Verfahren weiterhin dadurch verbessern läßt, daß man ein Nährmedium verwendet, das Formiatanionen enthält.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein mikrobiologisches Oxydationsverfahren, bei dem organische Verbindungen unter aeroben Bedingungen mit Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21245) in einem das Wachstum des Bakteriums fördernden Nährmedium

oxydiert werden, nach Patent (Patentanmeldung

P 19 22 843.4-42), welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Nährmedium verwendet, das Formiatanionen enthält.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann das Nährmedium die Formiatanionen in Form von Ameisensäure oder einem Ameisensäuresalz enthalten.

Die Tatsache, daß sich Formiatanionen enthaltende Nährmedien besonders gut für mikrobiologische Oxydationsverfahren, bei denen organische Verbindungen unter aeroben Bedingungen mit einem Bakteriuia in einem das Wachstum des Bakteriums fördernden Nährmedium oxydiert werden, eignen würden, war nicht voraussehbar, sondern muß vielmehr .auf den bekannten Stand der Technik als überraschend.angesehen werden.

Aus der USA-Patentschrift 3 062 723 ist es zwar bekannt, Fermentationsverfahren in Gegenwart von starken Mineralsäuren, z. B, Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure durchzuführen. Bei diesen Fermentationsverfahren werden die Säuren jedoch lediglich zur Abfrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes

ORIGINAL !MSPECTED

1Q003O/2Q8S

des Fermentationsextraktes nach und nicht während der Inkubationsperiode verwendet. Dies ist deshalb nicht überraschend, weil die beiläufige Bildung und/oder das Vorhandensein von Säuren als Fermentationsnebenprodukte bisher stets als unerwünscht angesehen wurde. So wurden denn auch, wie sich beispielsweise aus der USA-Patentschrift 3 093 552 ergibt, Säuren während des Fermentationsprozesses durch Zugabe von basischen Stoffen, z. B. Ammoniumhydroxyd, neutralisiert. Es ist des weiteren bekannt, beispielsweise aus der USA-Patentschrift 2 823 171, zur Durchführung von verschiedenen Fermentationsverfahren Fettsäuren mit mindestens 14 Kohlenstoffatomen zu verwenden. In der Literatur findet sich jedoch kein Hinweis auf die vorteilhafte Verwendbarkeit von Formiationen, insbesondere Ameisensäure, als Kohlenstoffüeferant bei aeroben Fermentationsprozessen. Vielmehr ergibt sich beispielsweise aus der USA-Patentschrift 2 695 864, daß Formiatanionen ausdrücklich als Kohlenstofflieferanten, d. h. Stoffe, die das mikrobiologische Wachstum fördern, nicht in Frage kommen.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind als Formiat anionen liefernde Verbindungen nicht nur Ameisensäure und Ameisensäurcsalzc geeignet, sondern vielmehr ganz allgemein solche Verbindungen, die Formiatanionen zu bilden oder zu liefern vermögen, dies bedeutet, daß beispielsweise auch Ester der Ameisensäure als Formiatanionen liefernde Verbindungen in Frage kommen und abgesehen von den verschiedensten Ameisensäuresalzen die verschiedensten löslichen Verbindungen, wie beispielsweise auch Oxydationsprodukte, z. B. solche des Formaldehydes und dergleichen.

109830/2095

Nach dem Verfahren der Erfindung lassen sich die verschiedensten Kohlenstoffverbindungen oxydieren, insbesondere aliphatische, aromatische und alicyclische Alkohole und Aldehyde. Die zur Durchflirung des Verfahrens der Erfindung verwendbaren oxydierbaren Verbindungen können dabei gesättigter oder ungesättigter Natur sein und ferner geradkettige oder verzweigtkettige Verbindungen darstellen.

Das Verfahren der Erfindung eignet sich insbesondere zur Oxydation von Alkoholen, vorzugsweise polyhydrischen Alkanolen mit bis zu etwa 18 Kohlenstoffatomen und ganz speziell zur Oxydation von verzweigtkettigen Verbindungen mit mindestens einem primären Alkoholrest. Ein typischer Vertreter für derartige Polyole ist Pentaerythritol. Nach dem Verfahren der Erfindung lassen sich derartige Verbindungen leicht in hohen Ausbeuten in die entsprechenden Carbonsäuren überführen.

Von besonderer Bedeutung ist die Erfindung für die Herstellung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure durch Oxydation von Pentaerythritol.

Die beim Verfahren der Erfindung verwendeten Formiatanionen dienen als Kohlenstofflieferant für die oxydierenden Mikroorganismen.

Wie bereits dargelegt, «ignet sich das Verfahren der Erfindung insbesondere zur Herstellung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure in ökonomischer Weise. Infolgedessen eröffnet das Verfahren der Erfindung die Möglichkeit, Tris(hydroxymethyl)essigsäure in günstigen Ausbeuten herzustellen und weiter zu verwenden. ,So lassen sich beispielsweise durch Veresterung der Säure die

109830/2095

verschiedensten Alkylester herstellen, beispielsweise die Methyl-, Äthyl-, Butyl- und Propylester. Diese Ester lassen sich in vorteilhafter Weise als Zwischenverbindungen zur Herstellung photographischer Chemikalien, insbesondere zur Herstellung von Entwicklerverbindungen zur Entwicklung von lichtsensibilisierten, latente Bilder enthaltenden photographischen Elementen verwenden.

Des weiteren läßt sich die Tris(hydroxymethyl) essigsäure mit einer Vielzahl von Verbindungen, z» B. Aldehyden und Ketonen, umsetzen. Zu diesen Verbindungen gehören beispielsweise die verschiedensten Alkylaldehyde und Arylaldehyde, z. B. Isobutyraldehyd, Formaldehyd, Benzaldehyd, Terephthalaldehyd und dergleichen wie auch die verschiedensten Aryl- und Alkylketone, z. B. Butanon-2, Aceton, Cyclohexanon und dergleichen.

Von besonderer Bedeutung ist dabei.das Benzaldehydacetal, 2-Phenyl-5-carboxy~5-hydroxymethyl¹-1,3-dioxan, welches eine homopalymerisierbare Verbindung ist, die sich entweder direkt oder indirekt über das entsprechende Lacton polymerisieren läßt, wobei anstelle der zu erwartenden 3-dimensionalen Polymeren überraschenderweise lineare Polymere gewonnen werden können.

Die unter Verwendung von Tiis(hydro?cymethyl)essigsäure herstellbaren niedermolekularen Säurederivate, insbesondere Acetale und Ketale, eignen sich in hervorragender Weise als Plastifizierungsmittel für die verpchiedensten Polymeren und als Gelatine-Emulsionszusätze für photographsiche Zwecke., Des weiteren ist das Benzaldehydacetal der Tris(hydroxymethyl)- , essigsäure diö Ausgangsverbiiidung iur Herstellung der ver-

ORIGINAL INSPECTED

schiedensten anderen Verbindungen, ζ. B. von polymerisierbaren Lactonen, der verschiedensten Ester und dergleichen. Zur letzteren Gruppe gehört auch ein Sulfitester, der für die verschiedensten Zwecke verwendbar ist, u. a. auch als Silberhalogenidkomplexbildner.

Die nach dem Verfahren der Erfindung herstellbare Tris(hydroxymethyl)essigsäure läßt sich selbst in verschiedenster Weise verwenden, beispielsweise als kalorienfreies Säuerungsmittel für Nahrungsmittel, Getränke und dergleichen, ferner als Chelatbildner zur Steuerung und Kontrolle von Metallionenkonzentrationen in sowohl biologischen als auch chemischen Systemen. Die Säure kann ferner zur Modifizierung von Entwicklern und Farbstoffen verwendet werden, die in photographischen Verfahren bzw. textlien Verfahren und Druckverfahren verwendet werden, wobei durch die Säure wasserlöslich machende Gruppen eingeführt werden. Die Säure kann schließlich als Säurekatalysator verwendet werden, beispielsweise beim Härten von synthetischen Kunststoffen und Harzen, beispielsweise von Kunststoffen des Phenol-Formaldehydtyps.

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Formiatanionen lassen sich durch die folgende Strukturformel wiedergeben:

HC - O^{1 j}

Wird d*s Verfahren der Erfindung zur Oxydation von mehrwer- tigtn, polyhydirischen Alkoholen verwendet, beispielsweise zur Oxydation von Pentaerythritol, so besitzt das Verfahren der

109830/2091

Erfindung den besonderen Vorteil, daß alkoholische Lösungen oder die Alkohole enthaltende Flüssigkeiten verwendet werden können, ohne daß es erforderlich ist, diese Lösungen oder Flüssigkeiten, beispielsweise Pentaerythritol enthaltende Lösungen und Flüssigkeiten in einem kostenaufwendigen und zeitraubenden Verfahren vorher zu reinigen. Ein weiterer Vorteil des zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung Verwendeten Fermentationsmediums ist, daß es sichresistent gegenüber der üblichen unerwünschten Ansiedlung von Mikroorganismen der Luft verhält.

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Formiatanionen können der alleinige Kohlenstofflieferant sein. Andererseits können die Formiatanionen j edoch auch gemeinsam mit anderen Kohlenstofflieferanten für das Wachstum der Mikroorganismen verwendet werden.

Vorzugsweise werden zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung wässrige Nährmedien verwendet, welche die zu oxydierenden Verbindungen, vorzugsweise Alkanole, in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 10 -GeWYrI, insbesondere etwa 1 bis etwa 6 Gew..-ΐ pro Liter Nährmedium enthalten. Im Falle der Verwendung von Pentaerythritol beispielsweise stellt ein wässriges Nähr- . medium mit 10 Gew.-I Pentaerythritol bei einer Temperatur von etwa 30° C eine an Pentaerythritol gesättigte Lösung dar.

Obgleich es sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat, wenn das Nährmedium als Kohlenstofflieferant lediglich Formiatanionen enthält, kann es doch auch vorteilhaft sein, die Formiatanionen gemeinsam mit anderen üblichen Energiespendern und Kohlenstofflieferanten, wie z. B. Essigsäure, Glykose, Glyzerin, Bernsteinsäure» Äthylenglykol, Zitronensäure und dergleichen zu

1098307 20 95 original inspected

verwenden. Ganz allgemein hat sich gezeigt, daß die Konzentration an Kohlenstofflieferanten bei etwa 0>1 bis etwa 1,0, vorzugsweise bei etwa 0,2 Gew.-3, bezogen auf das Nährmedium, liegen soll, wenn ein ausreichendes Wachstum der Organismen gewährt sein soll.

Das zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung benötigte Fermentationsmedium enthält in üblicher bekannter Weise die üblichen Mineralsalze, die für das Wachstum des Flavobacterium oxydans erforderlich sind. Vorzugsweise enthält das Medium ferner mindestens einen Lieferanten für Stickstoff, Phosphor, und Schwefel. Vorzugsweise enthält das Medium zusätzlich Eisen- und/oder Manganionen sowie ferner gegebenenfalls Spuren von anderen Metallionen. Beispiele für geeignete Verbindungen mit derartigen Ionen sind Ammoniumnitrat, Kaliumdiphosphat, Ferrosulfat, Magnesiumsulfat und dergleichen, Zweckmäßig werden diese Verbindungen zunächst in Wasser aufgelöst, worauf die erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 8,5, vorzugsweise etwa 7j2 bis etwa 7,6 eingestellt wird.

Gegebenenfalls lassen sich die Ausbeute an Säure sowie deren Produktionsgeschwindigkeit, beispielsweise die Ausbeute und Produktionsgeschwindigkeit von Tris(hydroxymethyl)essigsäure, weiter dadurch steigern, daß man dem Fermentationsmedium zusätzlich pro Liter etwa 0,1 g bis etwa 0,3 g, vorzugsweise etwa 0,2 g eines das Wachstum des Mikroorganismus stimulierenden Stoffes, beispielsweise einen Hefeextrakt, zusetzt. Andere, das Wachstum des Mikroorganismus stimulierende Stoffe sind beispielsweise reine Vitaminmischungen, getrocknete und pulverisierte Maismaisehe sowie flüssige Mais- oder Getreidemäische.

109830/2095

Als Stickstofflieferanten können die verschiedensten Stoffe, beispielsweise getrockneter Hefeextrakt, in einer Konzentration von z. B. etwa 1 % verwendet werden. Bei dieser Konzentration liefert der Hefeextrakt auch noch andere Nährstoffe, z. B. Sulfat-, Phosphat- und verschiedene Metallionen.

Zu der angegebenen Gruppe von Nährstoffen gehören ferner beispielsweise Baumwollsaatmehl und Sojabohnenmehl. Weitere geeignete einfache Stickstofflieferanten sind beispielsweise ' ,j Glutaminsäure, Glutamin, Aspartate, d. h. Salze der Asparaginsäure, ζ-. B. das Natriumsalz der Asparaginsäure, Harn- ' stoff, Nitrate und Mischungen solcher Stoffe, beispielsweise Mischungen aus Glutaminsäure und Asparagin.

Kulturen des aur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismus sind erhältlich unter der Nummer ATGC 21245 "bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C.,USAund dem Büro in Rockville, Maryland, USA, 12301 Park Lawn Drive.

Das Verfahren der Erfindung eignet sich, wie bereits dargelegt, insbesondere zur Gewinnung von Tris(hydroxymethyl)essig- ί säure aus handelsüblichen Pentaerythritollösungen, die im technischen Umfang bei vielerlei Verfahren anfallen und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie nicht unbeträchtliche Mengen an Formiationen, beispielsweise in Form von Ameisensäure, enthalten.

-Pentaerythritol läßt sich bekanntlich chemisch auf verschiedene Weise gewinnen. Ein besonders vorteilhaftes Herstellungsverfahren beruht auf der Umsetzung von 5 Molen Formaldehyd mit einem Mol Ameisensäure in Gegenwart von einem halben Mol

109830/20

- ίο -

Calciümhydroxyd, wobei ein Mol Pentaerythritol und ein halbes Mol Calciumformiat anfallen. Es hat sich gezeigt, daß das auf diese Weise gewonnene rohe Pentaerythritol in der Regel etwa 3 bis etwa 5 I, meistens etwa 3,4 bis etwa 4,3 % Formiatanionen enthält. Des weiteren enthalten die rohen Pentaerythritollösungen in der Regel auch noch andere Nebenprodukte und zwar (1) Dipentaerythritol, in Konzentrationen von etwa 5 bis etwa 15 %, bezogen auf die gesamte Pentaerythritolmenge und (2) geringere Mengen an Tri- und (3) Tetrapentaerythritol sowie ferner (4) Methyläther und Formale des Pentaerythritol.

In der Regel hat es sich als vorteilhaft erwiesen, diese technischen Lösungen oder Flüssigkeiten vor Verwendung im Rahmen des Verfahrens der Erfindung zu verdünnen. So hat es sich beispielsweise als zweckmäßig erwiesen, die Lösungen mit Wasser derart zu verdünnen^ daß die PentaerythritollcQazenf/fation etwa 6 % und die Aineisensäurekonzentration entsprechend etwa 2 % beträgt. Auf Gewichtsbasis umgerechnet liegen diese Werte bei etwa 2 bzw. etwa 0,7 %. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen, zur Verminderung der Ameisensäurekonzentration auf etwa 1 I, eine rohe technische Lösung mit etwa 15 % Pentaerythritol mit Wasser auf ein Verhältnis von 1:5,2 zu verdünnen.

Bisher hat man es als notwendig angesehen, derartige rohe alkoholische Lösungen vor der Weiterverarbeitung von Formiaten und Ameisensäure zu befreien. Das Verfahren der Erfindung vermeidet diese zeitaufwendige und kBtenaufwendige Reinigungsoperation und erzielt dabei noch eine beträchtliche Ausbeutesteigerung an Tris(hydroxymethyl)essigsäure.

109830/2095

2022849

Werden zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung Nährmedien verwendet, die keine Formiatanionen enthalten, so werden diesen Formiatanionen zugesetzt.

Überraschenderweise hat sich ferner gezeigt, daß bei Durchführung des Verfahrens der Erfindung die Verschmutzung des Nährmediums durch auf dem Luftwege angesiedelte Mikroorganismen, die beispielsweise stets dann beobachtet wird, wenn als Kohlenstofflieferanten beispielsweise Essigsäure, Zitronensäure und dergleichen verwendet wird, vermieden werden kann.

Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, das Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 37° C, vorzugsweise bei Temperaturen von 28 - 30° C unter aeroben Bedingungen durchzuführen. In vorteilhafter Weise wird das Medium bewegt, beispielsweise durch Rühren oder durch Schütteln der Flaschen oder Kolben, in denen das Verfahren durchgeführt wird.

Die Wachstumsraten des Mikroorganismus können leicht dadurch gesteuert werden, daß* die Temperaturbedingungen, die Belüftung

ulumcröSe
und die Inoc gesteuert werden. In an Nährmitteln reichten Medien erlauben Wachstumsraten des Mikroorganismus unterhalb maximaler Raten eine maximale Induktion von oxydierenden Enzymen. So läßt sich beispielsweise die Wabhstumsrate in Fermentationsgefäßen unter Rühren leicht dadurch steuern, daß man die Temperatur von 30° C auf etwa 22 bis etwa 24° C und insbesondere etwa 23° C vermindert.

Des weiteren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, geringe Belüftungsraten anzuwenden, d. h. bei einer Belüftung von etwa

'■ . ■■■■■.' ■ ■. ' ML,

109830/2095

0,10 bis etwa 0,14, vorzugsweise 0,12 Volumeneinheiten Luft pro Volumeneinheit Medium pro Minute zu arbeiten.

Des weiteren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Inocula aus der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase zu verwenden, d. h. in der Periode von etwa 40 bis etwa 72 Stunden des Wachstums und vorzugsweise etwa 48 Stunden des Wachstums. Bei dieser W'ächstumsräte wird eine Pentaerythritolenzyminduktion erzeugt, die dem maximalen Wert nahekommt, so daß etwa 50 bis ein wenig unterhalb 100 I, beispielsweise bis zu etwa 97 % des Alkohols zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure oxydiert werden. Es hat sich gezeigt, daß nur wenig Pentaerythritol durch Nebenreaktionen verloren geht.

Der pH-Wert wird zweckmäßig innerhalb eines Bereiches von etwa 3,0 bis etwa 9,5 und vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0 gehalten. In der Regel wird zunächst in der frühenydes Verfahrens ein pH-Wertanstieg des Nährmediums von beispielsweise 7,0 auf etwa 8,0 beobachtet, worauf infolge der Bildung der Tris(hydroxymethyl)essigsäure ein Abfall des pH-Wertes auf etwa 5,6 zu beobachten ist.

Im allgemeinen erfolgt das Wachstum der Kultur während der ersten drei Inkubationstage, worauf die Kultur in einer stationären Wachstumsphase verbleibt, während welcher jedoch der Oxydationsprozess fortschreitet.

Die bei Durchführung des Verfahrens der Erfindung anfallenden Oxydationsprodukte, beispielsweise Tris(hydroxymethyl)essigsäure, können durch Zusatz einer geeigneten basischen Verbindung, beispielsweise K₂CO₃ oder CaCO₃ neutralisiert werden.

109830/2095

Durch stufenweise Zugabe von Pentaerythritol zum Nährmedium unter Aufrechterhaltung einer Pentaerythritolkonzentration von etwa 1 bis 3 \ unter Aufrechterhaltung einer Gesamtkonzentration von 10, vorzugsweise etwa 6 Gew.-% Pentaerythritol, lassen sich beispielsweise Ausbeuten von bis zu etwa 64 g Tris(hydroxymethyl)essigsäure pro Liter, entsprechend 97 % der Theorie erhalten.

Zur Erzielung reiner Oxydationsprodukte, beispielsweise reiner' Tris(hydroxymethyl)essigsäure lassen sich die verschiedensten Verfahren anwenden. Ein Verfahren besteht darin, die ganze Kultur einschließlich der Mikroorganismen zu zentrifugieren, wobei letztere entfernt werden. Die dabei anfallende Brühe kann dann auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert werden, beispielsweise durch Zugabe von KOH, NaOH, Soda oder dergleichen. Die neutralisierte Brühe kann dammit einem lonenaustauscherharζ in Kontakt gebracht werden, wobei die erzeugte Säure von dem Harz adsorbiert wird, worauf sie mit Hilfe einer sauren wässrigen Lösung eluiert wird. Andererseits ist es jedoch auch möglich, zur Reindarstellung der Säuren stark basische Anionenaustauscherharze zu verwenden, in welchem Falle eine Eluierung vorzugsweise mit Ameisensäure durchgeführt wird.

Das Oxydationsp.rodükt, z.B. Tris (hydroxymethyl) essigsäure läßt sich aus wässrigen Lösungen leicht isolieren, beispielsweise durch Eindampfen bis zur Trockne. Das erhaltene Reaktionsprodukt kann dann gegebenenfalls noch weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Umkristallisation aus einem organischen Lösungsmittel, z. B, Äthanol, Benzol oder Isopropanol oder Mischungen derartiger Lösungsmittel, beispielsweise aus einer Äthanol-Benzolmischung,

109830/2095

In vorteilhafter Weise kann man beispielsweise wie folgt verfahren:

Zunächst wird durch Zentrifugieren die Fermentationsbrühe von den Bakterien abgetrennt. Daraufhin wird die zentrifugierte Lösung bei vermindertem Druck und einer Temperatur von etwa 50° C bis nahezu zur Trockne eingedampft, wobei zur Erzeugung des verminderten Druckes beispielsweise das Vakuum einer Wasserstrahlpumpe ausreicht. Daraufhin wird eine Suspension des festen Rückstandes in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise in einem Alkanol oder einem höheren Alkohol, vorzugsweise Butanol in Gegenwart eines Säurekatalysators, beispielsweise Schwefelsäure, in einem Molverhältnis von vorzugsweise etwa 10:1 auf Rückflußtemperatur erhitzt« Daraufhin wird das nicht umgesetzte Lösungsmittel von der auf Rückflußtemperatur erhitzten Mischung abgetrennt, worauf der Rückstand der auf Rückflußtemperatur erhitzte» Mischung d©stiilie?t wird» Auf diese Weise erhält man den eratsipfacheadea Allylester der Säure, beispielsweise Butyl-trisChydro&ymethyl)acetat.

Selbstverständlich läßt sich dieses Verfahren in der verschiedensten Weise modifizieren.

Ein anderes Isolierungsverfahren besteht darin, die Tris-(hydroxymethyl)essigsaure in das Triacetat zu überführen, beispielsweise mittels Essigsäureanhydrid oder in der Umsetzung der Säure mit einer Acetylverbindung, beispielsweise Acetylchlorid in ein gemischtes Anhydrid des Triacetates.

Da die biologische Oxydation von Kohlenstoffverbindungen stufenweise über verschiedene Zwischenverbindungen bis zur

10983 0/2095

Entwicklung von CO₉ verläuft, kann ein weiteres Gewinnungsverfahren dann von Vorteil sein, wenn es erforderlich ist, gebildete Carbonate zu zersetzen. So hat es sich beispielsweise als vorteilhaft erwiesen, die zunächst zentrifugierte Fermentationsbrühe auf einen pH-Wert von etwa 4 durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Ameisensäure, anzusäuern* Daraufhin wird etwa eine Stunde läng Stickstoff durch die Brühe perlen gelassen. Der pH-?Wert der Brühe wird nun auf etwa 7 mittels einer Base, beispielsweise KOH oder NaOH eingestellt. Daraufhin wird die Brühe nochmals zentrifugiert, worauf sie \ in eine Ionenaustauscherkolonne eingeführt werden kann.

Die Konzentration an Oxydationsprodukt, beispielsweise Tris-(hydroxymethyl)essigsäure in der Brühe läßt sich leicht durch Isolieren des Oxydationsproduktes oder auch auf gaschromatographischem Wege ermitteln.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung kann das Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21245) als Inoculum mit ganzen Zellen, aufgebrochenen Zellen, Zellextrakten und dergleichen verwendet werden. Das Aufbrechen der Zellen kann auf physikalischem oder chemischem Wege erfolgen, beispielsweise durch Anwendung von Vibrationen. '

Ks hat sich gezeigt, daß, wenn Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21245) auf einem nährwertreichen, nicht exklusiven, nicht spezifischen Medium, beispielsweise einem Nährmedium von Hefeextrakt (1 I) und Glukose (1 I) kultiviert wird oder einem ■· der angegebenen Säure produzierenden Medien, die Mikroorganismen

allmählich ihre Fähigkeit zu oxydieren einbüßen. Damit höhe ! Ausbeuten an Oxydationsprodukten erhalten werden, hat es sich ; daher eis zweckmäßig erwiesen, Kolonien von Säure erzeugenden

ORIGINAL INSPECTED

109830/2095

- 16 -

Stämmen selektiv aus ihren Kulturen auszuwählen. Derartige Kolonien lassen sich leicht drei bis fünf Tage nach ihrer Ansiedlung auf einem pH-Wert anzeigenden Kulturmedium,, das Pentaerythritol enthält, erkennen und von dem keine oder nur wenig Säure erzeugenden Kolonien abtrennen. Die Säure erzeugenden Kolonien können dann in einer unschädlichen Aufbewahrungslösung, beispielsweise einer physiologischen Kochsalzlösung dispergiert werden, worauf die erhaltene Dispersion auf ein Nährmedium, beispielsweise eine Agar-Platte aufgetragen werden kann. Nach einer Wachstumsperiode von etwa zwei Tagen bei etwa 30° C können die gezogenen Kulturen dann bei verminderten Temperaturen ohne jeden Potenzverlust mehrere Monate oder noch länger aufbewahrt werden. Andererseits ist es beispielsweise auch möglich, die Kulturen mittels wässriger Suspensionen, beispielsweise Magermilch, zu lyophilisieren, wenn sie länger aufbewahrt und geschützt werden sollen. Auf derartige Weise lyophilisierte Kulturen lassen sich, wenn sie versiegelt werden, über lange Zeiträume hinweg aufbewahren.

Wie bereits angegeben, lassen sich die Konzentrationen an Trts(hydroxymethyl)essigsäure in den Fermentationsbrühen nicht nur durch Isolierung der Säure ermitteln, sondern beispielsweise auch auf gaschromatographischem Wege. Zur Durchführung derartiger Konzentrationsbestimmungen können übliche Gaschromatographen (thermische Leitfähigkeitsdetektoren) verwendet werden«

Zur Durchführung der Bestimmung der Konzentration ah Tris-(hydroxymethyl)essigsäure in einer Fermentationsbrühe kann beispielsweise ein Gaschromatogrjaph mit einer Kolonne aus ■rostfreiem Stahl einer Länge von 1,82 m und einem äußeren

109830/209 5

Durchmesser von 3,175 mm verwendet werden. Die Kolonne kann beispielsweise mit Füllkörpern aus calcinierten Diatomeenaggregaten mit 10 Gew.-% Silikongummi gepackt sein. Der Heliumfluß beträgt in diesem Falle etwa 30 ml pro Minute. Die Temperatur der Injektionsöffnung beträgt 295° C. Die Kolonnentemperatur wird auf 120 bis 265° C bei einem Temperaturanstieg von 30° C pro Minute programmiert. Der thermische Leitfähigkeitsdetektor wird bei 300° C unter Verwendung eines 150 m.a. Brückenstromes· betriehen.

Zur Durchführung des Bestimmungsverfahrens wird zunächst eine 1 ml Probe der Fermentationsbrühe zur Trockne eingedampft, wozu eine Gefriertrockenvorrichtung verwendet wird. Zu deia erhaltenen trockenen Rückstand werden dann 0,3 ml Chlorotrimethylsilan, 0,3 ml 1,1,1,3/3,3™Hexamethyldisilazan und 0,3 ml einer Pyridinlösung von Octadecan (0,08 g Octädecan, aufgefüllt auf ein Milliliter mit Pyridin) zugegeben. Nach vierstündigem Stehenlassen wird die Probe auf gaschromatographischem Wege analysiert. Dabei werden Injektionsvolumina von 1,4 bis 1,6 .u Liter verwendet. Die Konzentration an Tris(hydroxymethyl)essigsäure in einer 1 ml Probe der Fermentationsbrühe wird dann in der folgenden Weise bestimmt.

Verschiedene Anteile von analytisch reiner Tris(hydroxymethyl) essigsäure von 1 bis 40 mg werden in ihre Trimethylsilylderivate überführt. Die Proben werden dann wie beschrieben analysiert.

Durch Auftragen des Verhältnisses des Scheitelbezirks des

109830/209 5

Trimethylsilylderivates zum Scheitelbezirks des Octadecans in Abhängigkeit der Milligramm Tris (hydroxymethyl)essigsäure in jeder Probe wurde eine Standardkurve erhalten.

Wird nun eine Probe der .Fermentationsbrühe in der beschriebenen Weise analysiert, so wird der Milligrammwert der Tris-(hydroxymethyl)essigsäure der Testprobe in dem Diagramm entsprechend dem Verhältnis des Scheitelbezirks des Produktes zum Scheitelbezirk des Octadecans erhalten.

Das Infrarotspektrum von Tris (hydroxymethyl)essigsäure und das Massenspektrum der trimethylsilierten Säure, hergestellt durch mikrobiologische Oxydation der Säure, sind identisch mit dem Spektrum, das erhalten wird bei Untersuchung einer Probe der Säure, die hergestellt wurde durch mit Platin katalysierte Oxydation von Pentaerythritol..

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Zur Durchführung der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren, wurden mehrere 125 ml fassende Erlenmeyer-Kolben mit Stöpseln aus rostfreiem Stahl nach Morton verwendet. Zur Durchführung der Versuche wurde ein wässriges Nährmedium verwendet, das pro Liter 10 g Hefeextrakt und 20 g Pentaerythritol enthielt. Dem Nährmedium wurde des weiteren Ameisensäure in Konzentrationen von 1 bis 10 g pro Liter zugesetzt. Die Medien wurden dann durch Zusatz von Kaliumhydroxyd neutralisiert und

109830/·2 095

daraufhin im Autoklaven sterilisiert.

Jeder Kolben mit jeweils 25 ml Nährmedium wurde dann mit einer Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21245) Kultur inoculiert, deren Trockengewicht ungefähr 0,75 mg betrug. Zum Inoculieren wurden Kulturen verwendet, die zwei Tage lang auf einem Nährmittelboden gezogen wurden.

Die Kolben wurden dann bei einer Temperatur von 30° C- 1⁰C in eine Rotiervorrichtung eingespannt und in dieser bei 400 Umdrehungen pro Minute 144 Stunden lang in Bewegung gehalten.

Die Konzentration an Tris(hydroxymethyl)essigsäure wurde dann in der beschriebenen Weise auf gaschromatographischem Wege bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in'der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Kolben Nr.	Ameisensäure	Tris(hydroxymethyl)-	Ausbeute in %
	(g/Liter)	essigsäure (g/Liter)
1	1 '	8,4	43
2	1	9,6	49
3	2	12,3	63
4	2	12,0	61
5	5	16,5	85
6	5	15,6	80
7	10	16,3	84
8	10	16,0	82

Entsprechend günstige Ergebnisse wurden dann erhalten, wenn Nährmedien aus einer rohen Pentaerythritollösung mit entsprechenden Ameisensäurekonzentrationen verwendet wurden.

109830/2095

- 20 -

Beispiel 2

Dies Beispiel veranschaulicht die überlegene unerwartete Wirksamkeit von Ameisensäure gegenüber anderen bekannten Kohlenstofflieferanten, wie insbesondere der üblicherweise verwendeten Essigsäure.

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde mit folgenden Abweichungen wiederholt:

1. Zu den Vergleichsversuchen wurden Ameisensäure und Essigsäure in Konzentrationen von 2 g pro Liter verwendet;

2. In weiteren Versuchen wurden die im folgenden angegebenen Nährsalze den Fermentationsmedien zugesetzt um zu zeigen, daß die erzielbare Ausbeuteerhöhung lediglich eine Funktion der Ameisensäure ist:

K₂HPO₄ 2¹g/Liter

MgSO₄-7H₂O 0,25 g/Liter

CaCl₂-2H₂O 0,001 g/Liter

FeSO₄«7H₂0 0,028 g/Liter

MnSO₄-7H₂O 0,17 g/Liter

ZnSO₄-7H₂O 0,0006 g/Liter

NaCl 0,006 g/Liter

Die Ergebnisse der erhaltenen Fermentationsversuche veranschaulichen einen beträchtlichen Anstieg der Säurekonzentration bis zu etwa 8 % , wenn Ameisensäure anstelle von Essigsäure verwendet wird.

109830/2095

Kolben Nr.	Kohlenstofflieferant
1	Ameisensäure
2	Ameisensäure
3	Essigsäure
4	Essigsäure
5	Ameisensäure
6	Ameisensäure
7	Essigsäure
8	Essigsäure

(+) zum Fermen- methyl)essigtationsmedium säure g/Liter

1	3,0
1	2,9
1	2,5
1	2,5
1	2,2
1	2,1
1	1,1
10,9

Entsprechend günstige Ergebnisse wurden dann erhalten, wenn zur Durchführung der Verfahren rohe Pentaerythritollösungen mit entsprechenden Gehalten an Ameisensäure verwendet wurden«

Beispiel 3

!Vie bereits dargelegt, führt der Zusatz oder das Vorhandensein von Formiatanionen zum bzw. im Nährmedium nicht nur zu einer Erhöhung der Ausbeute an Säure, sondern vielmehr wird auch eine Verunreinigung oder Verschmutzung des Nährmediums, durch die luftübertragenen Mikroorganismen beträchtlich vermindert. IJm dies zu zeigen, wurden drei Agarnährplatten aus den im folgenden aufgeführten Medien hergestellt:

^$AD

(1) Nährmedium

Glucose Hefeextrakt K₂HPO₄ MgSO₄-7H₂O FeSO₄-7H₂O CaCl₂

MnSO₄*7H₂O NaMoO--2H0

[V) Nährmedium

Pentaerythritol Hefeextrakt

Essigsäure

(3) N.ährmediiTO~

Pentaerythritol

Hefeextrakt

Ameisensäure'

Konz./g/Liter

1	0
1	0
	1
	0,2
	0,05
	0,02
	0,002
	0,001

20

20

Zu jedem der neutralisierten Medien 1₉ 2 und 3 wurden 150 Agar-Agar Tabletten Nr. 5 pro Liter zugegeben, xvorauf die
Medien 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 121⁰C und einem j)ruck von 6,8 kg in einem Autoklaven behandelt κ\ατΛ

Die erhaltenen flüssige» !ledien wurden dann auf etv:a 5ü°C abgekühlt, worauf jeweils 30 ml eines jeden ."iediun·-;? in
he^?4;-!cre Petrischale gegossen wurden» Die Petri schalen h Γ:ΤπΗ,-.:.α ;.>ich dabei unter einer flaube, durch uelclie tin lüm

8AD ORIGINAL

1995 'A 0/209 I=

steriler Luftstrom geführt wurde. Nach Festwerden der Nährmedien wurden die erhaltenen Platten über Nacht, d. h. durch 16 - 18 Stunden langes Aufbei^ahren bei 37° C getrocknet. Die Platten wurden dann 5, 10 bzw. 20 Minuten an die Luft gebracht. Danach wurden die Platten wieder eingeschlossen und bei 30⁰C vier Tage lang reinkubiert.. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Anzahl der Kolonien und ihre Größe Minuten Exponierung 10 Minuten Exponierung 20 Minuten Exponieru

(1) Wachstum überdeckt die Wachstum überdeckt die Wachstum überdeckt Platte Platte - die Platte

(2) Eine Kolonie (1,5 cm Eine Kolonie (1,5 cm Eine Kolonie Durchmesser) Durchmesser) (8 cm Durchmesser)

(3)- Eine Kolonie (0,5 cm _{n n}

Durchmesser) °

109830/2095

Claims (4)

Patentansprüche

1. /liikrobiologisches Oxydationsverfahren, bei dem-organische

Verbindungen unter aeroben Bedingungen mit Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21245) in einem das V/achstum des fiakteriums fördernden Nährmedium oxydiert werden, nach

Patent (Patentanmeldung P 19 22 843.4-42),

dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kährmedium verwendet, das Formiatanionen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium Flavobacterium oxydans (ATCC i\^Tr. 21245) zur herstellung von Carbonsäuren durch Oxydation von Alkoholen verxvendet.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21245) zur Herstellung von Carbonsäuren durch Oxydation von Alkanolen, insbesondere mehrwertiger Alkoholen verwendet.

—s

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, W daß man das Bakterium Flavobacterium oxydans (ATCC .sir. 21245) zur Herstellung von Carbonsäuren durch Oxydation 4-wertiger Alkanole, insbesondere Pentaerythritol verwendet,

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein KUhrmedium verwendet, das Ameisensäure oder ein Salz derselben enthält.

C.,Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nahrr/.cdium verwendet, das pro Liter Nahrmedium etwa 1,0 bis 10 g Ameisensäure oder ein Salz derselben enthält.

109830/2095

ORIGINAL

7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei einer TFmperatur von etwa 28 bis 30 c durchführt.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 0,10 bis etv/a 0,14 Volumina Luft pro Volumen Nährmedium pro Minute durchführt.

9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit während ihrer 40- bis etwa 72-stündigen Wachstumsphase entnommenen Bakterien durchführt.

10. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien durch selektive Auswahl von Säure produzierenden Kolonien aus einem Nährmedium mit einer der Erzeugung der Säure dienenden Ausgangsverbindung, Dispergieren der entnommenen Bakterien in einer das Wachstum " der Bakterien ermöglichenden Lösung und Züchten der Bakterien in einem Nährmedium erhält.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, ä£> man ein wäßriges Nährmedium verwendet, das etwa 5 bis etwa 100 g Pentaerythritol pro Liter Nährmedium enthält. ^:

12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium zunächst Pentaerythritol in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gew.-% (pro Liter) und danach portionsweise so viel Pentaerythritol zugibt, daß dessen Konzentration (pro Liter Nährmedium) bis zu etwa 15 Gew.-°s beträgt.

13. Verfahren nach Ansprüchen 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure mit einem Nährmedium mit einem pH-Wert von etwa 3,0 bis etwa 9,5 arbeitet.

109830/2095

14. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung der Oxydationsprodukte die Bakterien bzw. Bakterienkolonien aus dem
wäßrigen rtährmedium abtrennt, die von den Bakterien bzw. Bakterienkolonien befreite Brühe neutralisiert und aus der neutralisierten Brühe die Carbonsäure isoliert.

i 03 #36 / olö9 y ■ bad