JP3653801B2 - ジメチロールカルボン酸誘導体の製造法 - Google Patents
ジメチロールカルボン酸誘導体の製造法 Download PDFInfo
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、水溶性架橋剤として有用な2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)酪酸などのジメチロールカルボン酸誘導体を、微生物酸化を用いてトリス(ヒドロキシメチル)誘導体から製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来より、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化して2,2−ビス(ヒドロキシメチル)アルカン酸を製造する化学的な方法は、酸化剤として過酸化水素を用いる方法(特開昭62−263141)、過イソ酪酸を用いる方法(有機合成化学協会誌,36,1095 (1978) )が知られている。しかし、化学的酸化では危険な酸化剤を使用する上、ジメチロールカルボン酸誘導体の収率が低い。また、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化してジメチロールカルボン酸誘導体を製造する別の化学的な方法としては、白金及び/またはパラジウムを主触媒とする接触空気酸化により、ペンタエリスリトールからトリメチロール酢酸ソーダを合成する方法(特開昭54−138886)が開示されているが、高価な白金を用いる必要があり不経済である。従って、微生物的酸化によって、高収率で安価、安全に製造する方法の出現が期待されてきた。
【0003】
しかしながら、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体は生物の主な代謝経路にないネオペンタン骨格を有するため、生物的酸化が非常に困難である。例えば、同様にネオペンタン骨格を有するペンタエリスリトールを酸化する微生物の存在は、フラボバクテリウム属(特公昭48−18827)、コリネバクテリウム属又はアースロバクター属(特開昭52−72882)において、知られているのみであった。しかし、これらの細菌においてさえ、ペンタエリスリトール以外のトリス(ヒドロキシメチル)誘導体の酸化は知られていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物の酸化能力を利用して、常温・常圧にて安全かつ安価で、より高収率かつ高選択率でトリス(ヒドロキシメチル)誘導体からジメチロールカルボン酸誘導体を製造する方法を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段・作用】
本発明者らは上記課題を解決するべくトリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化する微生物を広く自然界に求めた。目的の微生物の取得は極めて困難であったが、ついにロドコッカス(Rhodococcus )属、アグロバクテリウム(Agrobacterium )属に属する微生物を得、この細菌を用いることにより高収率で効果的にトリス(ヒドロキシメチル)誘導体からジメチロールカルボン酸誘導体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
即ち、本発明は、一般式(1)
【化3】
(式中、Rは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す)で表わされるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体のメチロール基を酸化する能力を有するロドコッカス(Rhodococcus )属もしくはアグロバクテリウム(Agrobacterium )属に属する微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用せしめることを特徴とする、一般式(2)
【0007】
【化4】
(上記一般式中、Rは前記の意味)で表わされるジメチロールカルボン酸誘導体の製造方法を提供したものである。
【0008】
本発明の製造法で使用される微生物のうち代表的な菌株であるロドコッカス・エリスロポリス SD806株の性状を表1に示した。本菌株は、赤色系のコロニーを形成すること、多極出芽により増殖し、子のう胞子を形成しないこと、糖の発酵性をまったく有さないことなどから、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)と同定された。本菌株はロドコッカス・エリスロポリス SD806(Rhodococcus erythropolis SD806)株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−14956号として寄託されている。
【0009】
【表1】
【0010】
さらに、アグロバクテリウム・sp.SD807の性状を表2に示した。本菌株は、周毛による運動性を有すること、グラム陰性の桿菌であること、3−ケトラクトースを生成すること、エタノールから酸を生成しないことなどから、Agrobacterium biovar 3 ではないかと考えられたが、マロン酸ナトリウムからアルカリを産生せず、リトマスミルクを酸化することから性状が完全には一致せず、種の確定には至らなかった。本菌株はアグロバクテリウム・sp.SD807(Agrobacterium sp. SD807)株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−14957号として寄託されている。
【0011】
【表2】
【0012】
本発明記載の微生物を用いることで、例えば1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを酸化して、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸を製造することができる。このとき、突然変異株の中から、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生産性の増大したものを選択して用いることもできる。
このような突然変異体としては、例えば、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸に対する耐性の向上した変異株、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸を分解しなくなった2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸非資化変異株などが挙げられる。
【0013】
このような突然変異体の取得方法としては、通常、栄養細胞、例えば、栄養培地で30℃で2〜3日間程度振とう培養し得られた細胞を使用して変異誘起処理すればよい。突然変異源としては、一般に変異誘起化合物として知られている、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)等のアルキル化剤、5−ブロモウラシル(5BU)等の塩基アナログ、ジメチルアミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム(DAPA)、アザセリンやアクリジンオレンジなどおよび紫外線が用いられる。DAPAの場合は、栄養源存在下で増殖させながら処理し、また他の変異誘起化合物や紫外線の場合には細胞を生理食塩水やリン酸緩衝液等に懸濁して処理を行う。
【0014】
これら人工突然変異による2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生産性に関する特性は、各々単一の特性を付しても効果があるが、これらを組合せ複合した特性を有する変異株を得ることによって著しい生産性の向上を見ることが可能である。
【0015】
本発明記載の菌株は、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体のヒドロキシメチル基酸化に係わる酵素をコードする遺伝子の取得源としても有用である。目的遺伝子を有するクローンの選択のためには、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンからの2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生成に伴うpHの下降を指標にして行う。すなわち、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタン、適当な栄養源、pHインジケーターを混入した寒天平板培地に処理後の細胞を塗布して培養し、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生成によるpHの下降に伴うpHインジケーターの色調変化を認めるコロニーを釣菌する。こうして得られたクローンのなかに、高頻度で求めるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体酸化能を有する株を見いだすことができる。
【0016】
本発明において微生物の培養に用いる培地の炭素源・窒素源としては、菌株が資化し生育できる炭素化合物・窒素化合物であればいずれでも使用可能である。ヒドロキシメチル基酸化酵素の誘導は不用であり、通常の培養後、直ちに1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンなどを添加して酸化反応を進行させることができる。
【0017】
培養は通常、好気的条件下、20〜35℃の温度範囲、好ましくは27〜32℃の温度範囲で行われる。培養時間は培地組成、培養条件により異なるが、通常1〜3日間で行われる。培養時のpHは6.0〜8.0の範囲、好ましくは6.4〜7.6の範囲で行われる。
【0018】
本発明におけるジメチロールカルボン酸誘導体製造は、培養後の菌体を培養液から分離し、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を含む緩衝液等に再懸濁して反応させる、いわゆるレスティング・セル・サスペンジョン法によっても可能である。この方法によれば、液中に培地成分や菌の代謝産物が少ないため、ジメチロールカルボン酸誘導体の分離、精製が容易である。
【0019】
培養した菌体は遠心分離などの方法によって集めることができる。これに、例えば、リン酸、酢酸などとその塩を混合した緩衝液または水を加えて懸濁する。緩衝液の濃度は50〜200mM程度で行なう。反応時の溶液のpHは6.0〜8.0の範囲、好ましくは6.4〜7.2の範囲で行う。
【0020】
菌体懸濁液に加える基質トリス(ヒドロキシメチル)誘導体の濃度は 0.5〜100g/l、好ましくは5〜10g/lの濃度で行う。反応は好気的条件下、反応温度は20〜35℃の温度範囲、好ましくは27〜32℃で行う。反応中にpHが変動するが、pHのコントロールを行うことが望ましい。
【0021】
本発明におけるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体としては、下記一般式(1)
【化5】
(上記一般式中、Rは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す)で表わされるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体であれば特に制限はないが、Rがアルキル基の場合、炭素数が1〜20の炭素鎖を有するものが好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。又、Rが水酸基を有するアルキル基の場合、炭素数が1〜20の炭素鎖を有するもので、その任意の炭素に1以上の水酸基を有するものが好ましく、ヒドロキシメチル基が特に好ましい。
【0022】
なお、本発明の製造法において、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体、ジメチロールカルボン酸誘導体の検出および定量は、 Showdex KC-811 カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって行なった。
【0023】
【実施例】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
(実施例1)
表3に示す培地1の組成の培地(L培地)に1.8%寒天を加えた固形培地上で生育したロドコッカス・エリスロポリス SD806株、アグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を用いて、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタン、もしくは1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)プロパン、もしくはペンタエリスリトール、もしくはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを1%の濃度で含む50mMリン酸カリウムバッファーを加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液をそれぞれ調整した。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で1.0であった。これを、30℃で40時間振とうし反応を行った。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、それぞれの基質由来の、ヒドロキシメチル基が酸化された物質の生成・蓄積を認めた。
【0024】
【表3】
【0025】
(実施例2)
表3に示す培地1の組成の培地200mlにロドコッカス・エリスロポリス SD806株の菌体を1白金耳接種し、30℃で2日間振とう培養した。培養終了後、遠心により集菌し、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを5g含む50mMリン酸カリウムバッファーを1リッター加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整した。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で0.8であった。これを、30℃で24時間振とうした。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、3.3gの1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンが酸化分解され、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオンアルデヒドが1.1g、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が2.0g生成していた。
【0026】
(実施例3)
表3に示す培地2の組成の培地5mlにアグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を1白金耳接種し、30℃で1日間振とう培養した。培養終了後、遠心により集菌し、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを5g/lの濃度で含む50mMリン酸カリウムバッファーを加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整し、これを、30℃で振とうした。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で0.2であった。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、反応開始後66時間で4.9g/lの1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンが酸化され、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオンアルデヒドが0.1g/l、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が4.8g/l生成していた。1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンから2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸への変換率は約88%である。
【0027】
(実施例4)
表3に示す培地3の組成の培地10mlにアグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を1白金耳接種すると同時に、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを0.5g添加した。30℃の好気的環境で培養と反応を行い、660nmでの吸光度と反応液組成の経時変化を調べた。2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生成に伴いpHが低下するため、1N NaOHによってpH6.8にコントロールした。培養・反応開始後20時間での菌体の濁度は2.0に至りその後菌体量はほぼ一定となった。1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタン量は培養・反応開始後30時間まで直線的に減少し、同時に2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が蓄積した。培養・反応開始後30時間では、0.4gの1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンが酸化され、0.41gの2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が生成蓄積していた。1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンから2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸への変換率は約93%である。
【0028】
(実施例5)
L寒天培地上に生育したアグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を50mMリン酸カリウムバッファーで洗浄の後、これをトリス(ヒドロキシメチル)誘導体を5g/lの濃度で含む50mMリン酸カリウムバッファーに加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整し、これを、30℃で6時間振とうした。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で1.0であった。反応後に液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、それぞれからの酸化物の生成蓄積速度を算出した結果を表4に示した。
【0029】
【表4】
【0030】
【発明の効果】
本発明によりロドコッカス属、アグロバクテリウム属に属し、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化してジメチロールカルボン酸誘導体を生成する能力を有する微生物を使用して、ジメチロ−ルカルボン酸誘導体を効率良く安全に製造することが可能である。
【産業上の利用分野】
本発明は、水溶性架橋剤として有用な2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)酪酸などのジメチロールカルボン酸誘導体を、微生物酸化を用いてトリス(ヒドロキシメチル)誘導体から製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
従来より、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化して2,2−ビス(ヒドロキシメチル)アルカン酸を製造する化学的な方法は、酸化剤として過酸化水素を用いる方法(特開昭62−263141)、過イソ酪酸を用いる方法(有機合成化学協会誌,36,1095 (1978) )が知られている。しかし、化学的酸化では危険な酸化剤を使用する上、ジメチロールカルボン酸誘導体の収率が低い。また、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化してジメチロールカルボン酸誘導体を製造する別の化学的な方法としては、白金及び/またはパラジウムを主触媒とする接触空気酸化により、ペンタエリスリトールからトリメチロール酢酸ソーダを合成する方法(特開昭54−138886)が開示されているが、高価な白金を用いる必要があり不経済である。従って、微生物的酸化によって、高収率で安価、安全に製造する方法の出現が期待されてきた。
【0003】
しかしながら、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体は生物の主な代謝経路にないネオペンタン骨格を有するため、生物的酸化が非常に困難である。例えば、同様にネオペンタン骨格を有するペンタエリスリトールを酸化する微生物の存在は、フラボバクテリウム属(特公昭48−18827)、コリネバクテリウム属又はアースロバクター属(特開昭52−72882)において、知られているのみであった。しかし、これらの細菌においてさえ、ペンタエリスリトール以外のトリス(ヒドロキシメチル)誘導体の酸化は知られていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物の酸化能力を利用して、常温・常圧にて安全かつ安価で、より高収率かつ高選択率でトリス(ヒドロキシメチル)誘導体からジメチロールカルボン酸誘導体を製造する方法を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段・作用】
本発明者らは上記課題を解決するべくトリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化する微生物を広く自然界に求めた。目的の微生物の取得は極めて困難であったが、ついにロドコッカス(Rhodococcus )属、アグロバクテリウム(Agrobacterium )属に属する微生物を得、この細菌を用いることにより高収率で効果的にトリス(ヒドロキシメチル)誘導体からジメチロールカルボン酸誘導体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
即ち、本発明は、一般式(1)
【化3】
(式中、Rは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す)で表わされるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体のメチロール基を酸化する能力を有するロドコッカス(Rhodococcus )属もしくはアグロバクテリウム(Agrobacterium )属に属する微生物の培養液、菌体または菌体処理物を作用せしめることを特徴とする、一般式(2)
【0007】
【化4】
(上記一般式中、Rは前記の意味)で表わされるジメチロールカルボン酸誘導体の製造方法を提供したものである。
【0008】
本発明の製造法で使用される微生物のうち代表的な菌株であるロドコッカス・エリスロポリス SD806株の性状を表1に示した。本菌株は、赤色系のコロニーを形成すること、多極出芽により増殖し、子のう胞子を形成しないこと、糖の発酵性をまったく有さないことなどから、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)と同定された。本菌株はロドコッカス・エリスロポリス SD806(Rhodococcus erythropolis SD806)株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−14956号として寄託されている。
【0009】
【表1】
【0010】
さらに、アグロバクテリウム・sp.SD807の性状を表2に示した。本菌株は、周毛による運動性を有すること、グラム陰性の桿菌であること、3−ケトラクトースを生成すること、エタノールから酸を生成しないことなどから、Agrobacterium biovar 3 ではないかと考えられたが、マロン酸ナトリウムからアルカリを産生せず、リトマスミルクを酸化することから性状が完全には一致せず、種の確定には至らなかった。本菌株はアグロバクテリウム・sp.SD807(Agrobacterium sp. SD807)株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−14957号として寄託されている。
【0011】
【表2】
【0012】
本発明記載の微生物を用いることで、例えば1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを酸化して、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸を製造することができる。このとき、突然変異株の中から、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生産性の増大したものを選択して用いることもできる。
このような突然変異体としては、例えば、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸に対する耐性の向上した変異株、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸を分解しなくなった2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸非資化変異株などが挙げられる。
【0013】
このような突然変異体の取得方法としては、通常、栄養細胞、例えば、栄養培地で30℃で2〜3日間程度振とう培養し得られた細胞を使用して変異誘起処理すればよい。突然変異源としては、一般に変異誘起化合物として知られている、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)等のアルキル化剤、5−ブロモウラシル(5BU)等の塩基アナログ、ジメチルアミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム(DAPA)、アザセリンやアクリジンオレンジなどおよび紫外線が用いられる。DAPAの場合は、栄養源存在下で増殖させながら処理し、また他の変異誘起化合物や紫外線の場合には細胞を生理食塩水やリン酸緩衝液等に懸濁して処理を行う。
【0014】
これら人工突然変異による2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生産性に関する特性は、各々単一の特性を付しても効果があるが、これらを組合せ複合した特性を有する変異株を得ることによって著しい生産性の向上を見ることが可能である。
【0015】
本発明記載の菌株は、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体のヒドロキシメチル基酸化に係わる酵素をコードする遺伝子の取得源としても有用である。目的遺伝子を有するクローンの選択のためには、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンからの2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生成に伴うpHの下降を指標にして行う。すなわち、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタン、適当な栄養源、pHインジケーターを混入した寒天平板培地に処理後の細胞を塗布して培養し、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生成によるpHの下降に伴うpHインジケーターの色調変化を認めるコロニーを釣菌する。こうして得られたクローンのなかに、高頻度で求めるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体酸化能を有する株を見いだすことができる。
【0016】
本発明において微生物の培養に用いる培地の炭素源・窒素源としては、菌株が資化し生育できる炭素化合物・窒素化合物であればいずれでも使用可能である。ヒドロキシメチル基酸化酵素の誘導は不用であり、通常の培養後、直ちに1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンなどを添加して酸化反応を進行させることができる。
【0017】
培養は通常、好気的条件下、20〜35℃の温度範囲、好ましくは27〜32℃の温度範囲で行われる。培養時間は培地組成、培養条件により異なるが、通常1〜3日間で行われる。培養時のpHは6.0〜8.0の範囲、好ましくは6.4〜7.6の範囲で行われる。
【0018】
本発明におけるジメチロールカルボン酸誘導体製造は、培養後の菌体を培養液から分離し、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を含む緩衝液等に再懸濁して反応させる、いわゆるレスティング・セル・サスペンジョン法によっても可能である。この方法によれば、液中に培地成分や菌の代謝産物が少ないため、ジメチロールカルボン酸誘導体の分離、精製が容易である。
【0019】
培養した菌体は遠心分離などの方法によって集めることができる。これに、例えば、リン酸、酢酸などとその塩を混合した緩衝液または水を加えて懸濁する。緩衝液の濃度は50〜200mM程度で行なう。反応時の溶液のpHは6.0〜8.0の範囲、好ましくは6.4〜7.2の範囲で行う。
【0020】
菌体懸濁液に加える基質トリス(ヒドロキシメチル)誘導体の濃度は 0.5〜100g/l、好ましくは5〜10g/lの濃度で行う。反応は好気的条件下、反応温度は20〜35℃の温度範囲、好ましくは27〜32℃で行う。反応中にpHが変動するが、pHのコントロールを行うことが望ましい。
【0021】
本発明におけるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体としては、下記一般式(1)
【化5】
(上記一般式中、Rは水素原子、アミノ基、アルキル基、又は水酸基を有するアルキル基を示す)で表わされるトリス(ヒドロキシメチル)誘導体であれば特に制限はないが、Rがアルキル基の場合、炭素数が1〜20の炭素鎖を有するものが好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。又、Rが水酸基を有するアルキル基の場合、炭素数が1〜20の炭素鎖を有するもので、その任意の炭素に1以上の水酸基を有するものが好ましく、ヒドロキシメチル基が特に好ましい。
【0022】
なお、本発明の製造法において、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体、ジメチロールカルボン酸誘導体の検出および定量は、 Showdex KC-811 カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって行なった。
【0023】
【実施例】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
(実施例1)
表3に示す培地1の組成の培地(L培地)に1.8%寒天を加えた固形培地上で生育したロドコッカス・エリスロポリス SD806株、アグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を用いて、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタン、もしくは1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)プロパン、もしくはペンタエリスリトール、もしくはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを1%の濃度で含む50mMリン酸カリウムバッファーを加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液をそれぞれ調整した。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で1.0であった。これを、30℃で40時間振とうし反応を行った。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、それぞれの基質由来の、ヒドロキシメチル基が酸化された物質の生成・蓄積を認めた。
【0024】
【表3】
【0025】
(実施例2)
表3に示す培地1の組成の培地200mlにロドコッカス・エリスロポリス SD806株の菌体を1白金耳接種し、30℃で2日間振とう培養した。培養終了後、遠心により集菌し、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを5g含む50mMリン酸カリウムバッファーを1リッター加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整した。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で0.8であった。これを、30℃で24時間振とうした。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、3.3gの1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンが酸化分解され、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオンアルデヒドが1.1g、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が2.0g生成していた。
【0026】
(実施例3)
表3に示す培地2の組成の培地5mlにアグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を1白金耳接種し、30℃で1日間振とう培養した。培養終了後、遠心により集菌し、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを5g/lの濃度で含む50mMリン酸カリウムバッファーを加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整し、これを、30℃で振とうした。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で0.2であった。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、反応開始後66時間で4.9g/lの1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンが酸化され、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオンアルデヒドが0.1g/l、2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が4.8g/l生成していた。1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンから2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸への変換率は約88%である。
【0027】
(実施例4)
表3に示す培地3の組成の培地10mlにアグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を1白金耳接種すると同時に、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンを0.5g添加した。30℃の好気的環境で培養と反応を行い、660nmでの吸光度と反応液組成の経時変化を調べた。2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸生成に伴いpHが低下するため、1N NaOHによってpH6.8にコントロールした。培養・反応開始後20時間での菌体の濁度は2.0に至りその後菌体量はほぼ一定となった。1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタン量は培養・反応開始後30時間まで直線的に減少し、同時に2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が蓄積した。培養・反応開始後30時間では、0.4gの1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンが酸化され、0.41gの2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸が生成蓄積していた。1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンから2,2−ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸への変換率は約93%である。
【0028】
(実施例5)
L寒天培地上に生育したアグロバクテリウム・sp.SD807株の菌体を50mMリン酸カリウムバッファーで洗浄の後、これをトリス(ヒドロキシメチル)誘導体を5g/lの濃度で含む50mMリン酸カリウムバッファーに加え、レスティング・セル・サスペンジョン反応液を調整し、これを、30℃で6時間振とうした。反応液の濁度は、660nmでの吸光度で1.0であった。反応後に液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、それぞれからの酸化物の生成蓄積速度を算出した結果を表4に示した。
【0029】
【表4】
【0030】
【発明の効果】
本発明によりロドコッカス属、アグロバクテリウム属に属し、トリス(ヒドロキシメチル)誘導体を酸化してジメチロールカルボン酸誘導体を生成する能力を有する微生物を使用して、ジメチロ−ルカルボン酸誘導体を効率良く安全に製造することが可能である。
Claims (5)
- ロドコッカス属に属する微生物がロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcuserythropolis)である請求項1記載の製造法。
- ロドコッカス・エリスロポリスに属する微生物がロドコッカス・エリスロポリス SD806(Rhodococcus erythropolis SD806)株(寄託番号 FERM BP−5521)である請求項2記載の製造法。
- アグロバクテリウム属に属する微生物がアグロバクテリウム・sp.SD807(Agrobacteriumsp. SD807 )株(寄託番号 FERM BP−5522)である請求項1記載の製造法。
- 微生物を培地中で培養し、得られた培養液、菌体または菌体処理物にトリス(ヒドロキシメチル)誘導体を作用させる請求項1〜4記載のジメチロールカルボン酸誘導体の製造法。
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