DE1816712A1

DE1816712A1 - Reaktive Teilchen fuer biologische Untersuchungen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1816712A1
Application number: DE19681816712
Authority: DE
Inventors: Louis Csizmas; Davis Vincent Ind; Patel Virendra Ind
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1967-12-28
Filing date: 1968-12-23
Publication date: 1969-07-24
Also published as: US3553310A; FR1599421A; GB1252769A; NL6818724A

Description

Beschreibung
zu der Patentanmeldung

MIIES LABORATORIES, INC. 1127 Myrtle Street, Elkhart, Indiana 46514, U.S.A.

betreffend

Reaktive Teilchen für biologische Untersuchungen und Verfahren zu,ihrer Herstellung.

Die Erfindung betrifft unlösliche reaktionsfähige (hier kurz: reaktive) Teilchen, die nach ihrer erfindungsgemäßen Herstellung unmittelbar mit biologischen Stoffen ch-emisch gekuppelt werden können und dann zu verschiedenen Zwecken, insbesondere für immunologische Versuche verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen werden dadurch hergestellt, daß man an die Oberflächen von diskreten Trägerteilchen Verbindungen angliedert, welche die Teilchen stabilisieren und an ihrer Oberfläche Aldehydaktivität hervorrufen. Die für diesen Zweck brauchbaren Verbindungen sind die oc-,ß-ungesättigten Aldehyde und Dialdehyde. Wenn immunologische Stoffe an die Trägerteilchen gekuppelt sind, können mit den erfindungsgemäßen Indikatorteilchen immunologische Versuche durchgeführt werden.

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Die Erfindung "bezieht sich demnach auf stabilisierte, aldehydreaktive Teilchen, die verwendet werden können zur Bildung eines biologischen Reagens¹ in Form von unlöslich gemachten Teilchen. Die erfindungsgemäiSen reaktiven Teilchen haben an ihrer Oberfläche aldehydaktive Hälften und können mit einem immunologischen Stoff zu Indikatorteilchen umgesetzt werden, mit denen immunologische Untersuchungen durchgeführt werden können. Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung der stabilisierten, aldehydreaktiven Teilchen. -Es wurden bereits die verschiedensten Teilchen verwendet, an welche biologische Stoffe mindestens temporär angegliedert werden können und die dann konserviert und so gegen Zerstörung stabilisiert wurden. Typisch für die bisher benutzten Teilchen waren mit Formalin behandelte rote Blutkörperchen, die dann noch mit Gerbsäure behandelt wurden; gemäß einer Yerwendungsart für derartige Teilchen wurde ein biologisches Material mit immunologischen Eigenschaften physikalisch an den Teilchen adsorbiert, so daß man Indikatorteilchen erhielt. Diese Teilchen ließen sich jedoch nicht chemisch mit den immunologischen Stoffen kuppeln und es zeigte sich, daß die letzteren von der Oberfläche der Teilchen weggespült wurden, so daß man bei den mit derartigen Teilchen ausgeführten Untersuchungen falsche Resultate erhielt.

Andere bisher verwendete Teilchen waren z.B. rote Blutkörperchen, die mit Formaldehyd behandelt wurden, um sie gegen Lyse (Haemolyse) zu stabilisieren, worauf sie dann mit einem chemischen Kupplungsmittel, wie bis-Diazobenzidin, behandelt wurden. Derartige Teilchen können dann durch Kuppeln über das bis-Diazobenzidin chemisch mit immunologischen Stoffen umgesetzt werden. Das Kupplungsmittel bis-Diazobenzidin ist jedoch schwer herzustellen und zu lagern, da es außeror-

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deutlich reaktionsfähig ist, so daß das Kupplungsmittel und das immunologische Material, das gekuppelt werden soll, "beinahe gleichzeitig dem Trägerteilchen zugefügt werden. Auf diese Weise hergestellte reaktive Teilchen, die fähig sind, mit den immunologischen Stoffen zu kuppeln, sind daher hinsichtlich ihrer Existenz und Brauchbarkeit nicht unabhängig und können nicht gelagert werden, um später mit ausgewählten immunologischen Stoffen zu kuppeln. Außerdem setzt ihre Verwendung zwei getrennte Verarbeitungsstufen voraus, wobei das rote Blutkörperchen in der ersten Stufe stabilisiert werden muß, damit in der zweiten Stufe durch Kuppeln das reaktive Teilchen hergestellt werden kann; beide Stufen müssen aber sehr sorgfältig durch geschultes laboratoriumspersonal durchgeführt werden, wenn man brauchbare immunologische Indikatorsysteme erhalten will.

Ling, N.R.: J. Haematology, 1961, 7, S. 299-3o2, berichteten, daß rote Blutkörperchen mit verschiedenen Aldehyden gemischt worden seien, worauf der Versuch gemacht worden sei, ihnen Serumproteine anzugliedern. Es wurde aber auch berichtet, daß der Grad der so erreichten Bindung zu unsicher sei, um im technischen Maßstab zum Angliedern von Proteinen an Zellen angewandt zu werden. An den Zellenoberflächen ließen sich keine aldehydaktiven Hälften feststellen. Der zur Behandlung der Zellen verwendete Glutaraldehyd müßte eigentlich theoretisch fähig sein, an den Zellenoberflächen aldehydaktive Hälften auszubilden;· praktisch ließ sich dies jedoch nicht realisieren, wahrscheinlich wegen der Verwendung von Glutaraldehyd als Äquivalent von Formaldehyd, Methylglyoxal und anderen Monoaläehyden. Nach Vermischen mit den Aldehyden blieben die roten Blutkörperchen nur kurze Zeit in Kontakt mit

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den Froteinen_t während deren sie nicht mit ggf. anwesenden Aldehydgruppen reagieren konnten. Auch die Serumproteine wurden mit den so behandelten roten Blutzellen bei 5O⁰C in Kontakt gebracht, bei welcher Temperatur die Proteine auf den Zellenoberflächen konglomerieren, jedoch keine Kuppelreaktion stattfindet. Weder experimentell noch auf andere Weise konnte daher irgendeine Reaktionsfähigkeit an den Oberflächen der behandelten Zellen nachgewiesen werden. Dies zeigt sich durch die Wahl des Methylglyoxals als bevorzugtes Konservierungsmittel} bekanntlich ist dieser Aldehyd nicht fähig, aidehydreaktive rote Blutkörperchen zu bilden.

£b wurde nun gefunden, daß stabilisierte und konservierte reaktive Teilchen gebildet werden können, wenn man gewisse Aldehyde mit Trägerteilchen reagieren läßt. Diese reaktiven Teilchen können dann dazu verwendet werden, unlöslich gemachte Reagentien zu bilden, indem man sie unmittelbar an biologische Stoffe kuppelt.

Die Erfindung hat sich daher zum Ziel gesetzt, reaktive Teilchen bereitzustellen, die stabilisiert und gegen Lyse geschützt sind und sich an biologische Stoffe kuppeln lassen. Insbesondere ist ein Verfahren zur Herstellung derartiger Teilchen Gegenstand der Erfindung.

Auch die durch Kuppeln der erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen an die verschiedensten biologischen Stoffe erhältlichen biologischen Reagentien sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung werden von der Erfindung umfaßt. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man Trägerteilchen mit eiweißartiger Oberfläche, wie Mikrobenzellen, rote Blutkörperchen oder Polymerteilchen mit eiweißartiger Oberfläche, um-

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setzt mit einem U-_t ß-ungesättigten Aldehyd oder mit einem Dialdehyd bzw. mit Gemischen aus beiden, so daß man 'aldehydreaktive Teilchen erhält, die konserviert und gegen lyse stabilisiert sind. Diese reaktiven Teilchen müssen trocken und wasserfrei oder aber in nassem Zustand gelagert werden^und durch Kuppeln mit den verschiedensten biologischen Stoffen erhält man die gewünschten spezifischen Reagentien.

Der J- -, ß-ungesättigte Aldehyd kann eine beliebige Verbindung der allgemeinen Formel

R, R₂ 0

η rt η ττ

O \j \j Π.

sein, worin R₁ und R_? gleich oder verschieden sein können und für Wasserstoff oder eine Methylgruppe stehen. Beispiele für derartige Aldehyde sind: Acrolein, Methacrolein und 2-Butenal (Crotonaldehyd). Darunter ist Acrolein bevorzugt.

Der Dialdehyd kann aliphatisch sein, wie Glutaraldehyd, der zwei Carbonylgruppen aufweist; allgemein gesprochen kann er ein .beliebiger aliphatischer Dialdehyd mit mindestens einer die beiden Carbonylgruppen trennenden Methylengruppe sein. Propandial (Malonaldehyd) und Butandial (Succinaldehyd) können demnach ebenfalls verwendet werden.

Bei der Reaktion eines dieser Aldehyde mit der Oberfläche von Trägerteilchen treten zwei Wirkungen auf: Der erste Effekt ist, daß die Oberflächen gegen Reißen (Lyse der Zellen) stabilisiert werden und der zweite besteht darin, daß an den Zelloberflächen aldehydaktiv.e Hälften befestigt werden. Es ist

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anzunehmen, daß diese Hälften Garbonylgruppen von Aldehydform darstellen und als solche hoch reaktiv mit den Aminogruppen von biologischen Stoffen sind, da sie zwischen den. Trägerteilchen und dem biologischen Material Covalenzbindungen ausbilden,

Die Schutzwirkung der Aldehyde auf die Trägerteilchen wirkt sich rasch aus, wenn man sie bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) vermischt. Die Entwicklung einer befriedigenden Aldehydaktivität an der Teilchenoberfläche benötigt allerdings 16 Stunden. Das darauffolgende Kuppeln der biologischen Stoffe mit den präparierten Trägern verläuft bei Raumtemperatur langsam und Kupplungszeiten von mindestens 48 Stunden, vorzugsweise von 5 bis 7 Tagen, sind daher zweckmäßig. Die resultierenden unlöslichgemachten biologischen Reagentien können unmittelbar zum Test auf einen immunologischen Stoff verwendet werden, wenn die an die Trägerteilchen gekuppelte Substanz das immunologische Gegenstück dazu ist; sie können aber auch zwecks Lagerung getrocknet und später zur Verwendung als Testvehikel wieder aktiviert werden. Das Trocknen wird im allgemeinen durchgeführt mittels eines Lyophilisierungsverfahrens.

Der Ausdruck "immunologisches Gegenstück" bezeichnet entweder ein Antigen oder einen Antikörper, der spezifisch mit dem betreffenden Antikörper bzw. Antigen reagiert und der Ausdruck "biologisches Material" bzw. "biologischer Stoff", wie er hier gebraucht wird, bezeichnet Substanzen von biologischer Abstammung, wie Antigene, Antikörper, Enzyme und auch Haptene (Halbantigene); all diese Stoffe sind zu einer chemischen Reaktion mit den Aldehydgruppen fähig.

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Da die Aldehydhälften nur langsam mit biologischen Stoffen reagierenf muß die nicht umgesetzte dieser beiden Hälften nicht unbedingtHocklert werden, ehe man das Präparat als Indikator verwendet ι da das durch den Test zu ermittelnde immunologische Material nicht fähig ist, sich während der zur Durchführung des Tests notwendigen Zeit an das reaktive Teilchen anzugliedern.

Die erfindungsgemäßen Indikatoren können auch als Immuno-Adsorbentien verwendet werden," wenn das gekuppelte biologische Material immunologische Eigenschaften hat. Derartige Reagentlen adsorbieren aus flüssigen Medien das immunologische Material, welches eich durch, seine Immuno-Spezifität an das auf dem stabilleierten Trägerteilchen sitzende Material bindet. Wenn Enzyme an die reaktiven Teilchen gekuppelt sind, können die Reagentlen als enzymatische Umwandlungsmittel verwendet werden.

Eine andere Verwendungsart für diese zellförmigen Trägerteilchen beeteht darin, daß man sie, da die Aldehydbehandlung die Zellen schützt, ohne die Aktivität der gesamten natürlichen Antigengruppen zu ändern, unmittelbar als Indikatorteilchen verwendet. So können beispielsweise das M-Antigen aus Schafs-, Pferde- und Ochsenblutkörperchen, das Forssman-Antigen aus den roten Blutkörperchen des Schafes und die A-, B- und AB-Antigene aus den roten Blutkörperchen des Menschen auf ihren Zellen konserviert und dann zur Ermittlung ihrer immunologischen Gegenstücke verwendet werden. Auch viele der Mikrobenzellen können unmittelbar zum Nachweis der Anwesenheit ihrer Antikörper in Testproben verwendet werden. Ausgewählte rote Blutkörperchen aus dem Ziegenblut haben die Eigenschaft, daß sie durch menschliche Sera nicht agglutiniert werden, was

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sie zu idealen inerten Trägerteilchen macht, zumal diese Eigenschaft selbst nach der Aldehydbehandlung erhalten bleibt.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen aldehydbehandelten Zellen besteht darin, daß sie längere Zeit gelagert werden können, ohne daß auch dann die Gefahr einer Schädigung durch Mikroben besteht, wenn während der letzten Behandlungsstufen nur eine minimale Sterilitätvorsorge getroffen wurde.

Die erfindungsgemäßen biologischen Reagentien, die zur , Verwendung als immunologische Indikatorteilchen bestimmt sind, werden dadurch hergesta.lt, daß man ein spezifisches Antigen- oder Antikörpermaterial mit den reaktiven Teilchen umsetzt.

die

Wenn das immunologische Gegenstück zu dem an /reaktiven Teilchen gekuppelten Material unmittelbar durch Verwendung der immunologischen Indikatorteilchen bestimmt werden soll, so wird der Versuch als Agglutinationsversuch bezeichnet und wird so durchgeführt, daß.man die Indikatorteilchen mit einer Probe der Flüssfekeit mischt, von der angenommen wird, daß sie das immunologische Gegenstück enthält und daß man dann beobachtet, ob eine Agglutinierung erfolgt oder nicht. Das Auftreten einer Agglutinierung zeigt die Anwesenheit der vermuteten Stoffe an, während keine Agglutinierung eintritt, wenn diese nicht vorhanden sind. Die Agglutinationsversuche können so durchgeführt werden, daß man entweder das Antigen oder den Antikörper an die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen kuppelt und dann unmittelbar auf die Anwesenheit des immunologischen Gegenstückes in der Probeflüssigkeit testet.

Die meisten Flüssigkeiten, die Antikörper enthalten, bewahren ihre Antikörpereigenschaften, wenn sie unmittelbar an ,die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen gekuppelt sind und können daher zur Bestimmung ihrer entsprechenden Antigene verwendet werden.

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Die gleichen Indikatorteilchen lassen sich verwenden zur Peststellung der Agglutinierungsverhinderung, indem man dem Testmedium in ungebundener Form ein Material zufügt, das eine reaktive Stelle aufweist, welche dem an die ae&ireaktiven Teilchen gebundenen immunologischen Material entspricht. Prüft man beispielsweise auf einen Antikörper, so kann dem Testmedium vor oder gleichzeitig mit den Indikatorteilchen, die aus den reaktiven Teilchen, gekuppelt mit dem Antigen, bestehen, eine Menge des Antigens zu diesem Antikörper in ungebundenem Zustand zugefügt werden. Enthält die Prüfflüssigkeit dann den Antikörper, so reagiert dieser mit dem ungebundenen Antigen im Testmedium und ist infolgedessen unfähig, mit dem Indikatorsystem zu agglutinieren, d.h. die Agglutinierung, die sonst eintreten würde, ist verhindert. Eine solche Prüfung auf Agglutinierungsverhinderung kann mit den entsprechenden Indikatorteilehen durchgeführt werden, um die Anwesenheit entweder eines Antikörpers oder eines Antigens in Probeflüssigkeiten festzustellen. Auf diese Weise läßt sich also entweder ein Antigen oder sein Antikörper mit Hilfe der eifLndungsgemäßen Indikatorteilchen feststellen.

Die erfindungsgemäß als Trägerteilchen verwendbaren Mikrobenzellen können beliebige selbst reproduzierende Mikroorganismen sein, die mit oder ohne Abhängigkeit von anderen Organismen fortgepflanzt werden. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterienzellen können verwendet werden. Auch Pilz- und Protozoenzellen lassen sieh verwenden, ebenso wie Virenpartikel. Es handelt sich allgemein um einzellige Organismen j die gelegentlich in Klumpen oder Aggregaten zusammengeschlossen sind. Die Zellen können in dieser Form verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Aggregate nicht aufgrund ihrer Große ein Trägerteilchen bilden, das so groß ist, daß das da-

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mit gebildete Testsystem in Anwesenheit einer Substanz, die ein immunologisches Gegenstück zu der an die aggregierten Zellen gebundenen Antigensubstanz darstellt, nicht agglutiniert. Bevorzugt als Mikrobenzellen sind im allgemeinen Bakterienzellen bzw. Aggregate von solchen, die von gleichmäßiger Form und Größe sind und maximale Außenabmessungen in einer Richtung von 0,2 bis 10 Mikron haben. Es können auch Gemische von.verschiedenen, jedoch gleichmäßigen Zellen verwendet werden, obwohl solche Gemische nicht bevorzugt sind. Unter den Bakterien sind u.a. diejenigen in Teil I des Pflanzenreiches einschließlich der Klassen I, II und III, Ordnung I, verwendbar. Die Mikrobenzellen der Klasse III, Ordnung I, umfassen die interzelluaren Virenteilchen, die Dimensionen von etwa 0,2/U haben.

Es sei hierzu verwiesen auf "Sergey's Manual of Determinative Bacteriology" von R.S. Breed, E.G.D. Murray, N.R. Smith, 7. Auflage, 1947, Williams and Wilins Company, wo sich eine komplette Liste von verwendbaren Bakterienzellen findet. Besonders brauchbar sind die Bakterien der Klasse II, Unterordnung II, Familie I? (Pseudomonadaceen") und Klasse II, Ordnung IV, Familie IV (Enterobacteriaceen). Es kann angenommen werden, daß sämtliche Stämme I - V bevorzugte Mikrobenzellen für Zwecke der Erfindung darstellen. Auch Klasse il* Ordnung IV, Familien V (Brucellaceen), X (Laetobacillaceeh) und XIII (Bacillaceen) sind bevorzugt. Beide Ordnungen I und II von Organismen der Klasse III können verwendet werden, wenn kleinere Teilchengrößen von etwa 0^2 ,u und darunter erwünscht sind. Die Ordnung II, Virales, sind allerdings von so kleinen Dimensionen, daß ihre Verwendbarkeit eingeschränk-fc wird.

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Eine besonders bevorzugte Bakterienzelle für Zwecke der Erfindung iet Escherichia coli. Eine andere besonders bevorzugte Mikrobenzelle ist die gewöhnliche Hefe, Saccaromyces cerevisiae. Die Hefewachstumsphasen der Funguszellen stellen ebenfalls bevorzugte Trägerteilchen dar.

Die beiden Aldehydverbindungen wirken als Konservierungsmittel und etabilisieren und konservieren die Zelle gegen Lyse, wobei sie gleichzeitig die Mikrobenzellen nicht reproduzierend machen.

Ggf. können die Mikrobenzellen oder andere Trägerteilchen angefärbt, werden, um die visuelle Unterscheidung der Indikatorteilchen von der Umgebung bzw. dem Hintergrund zu erleichtern. Ein üblicher Farbstoff, wie Hämatoxylin, Fuchsin oder Kristallviolett können für diesen Zweck verwendet werden. Eine andere besonders günstige Vorbehandlung für Mikrobenzellen besteht darin, daß man sie mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. einem Alkohol, einem Äther oder dgl., wäscht, um etwa vorhandene Polysaccharide oder Wachsschichten zu entfernen, welche die Reaktion zwischen den Mikrobenzellen und den Aldehydverbindungen stören könnten.

Die als Trägerteilchen benutzten roten Blutkörperchen können von den verschiedensten Tieren gewonnen sein, z.B. von den folgenden: Opossum, Ratte, Kaninchen,-Meerschweinchen, Ziege, Pferd, Schaf, Huhn, Alligator, Schildkröte und schließlich auch aus Menschenblut. Zwecks Gewinnung der roten Blutkörperchen nimmt "man eine Blutprobe von dem betreffenden Tier ab und trennt die roten Blutkörperchen durch Zentrifugieren von dem Serum. Vor der erfindungsgemäßen Behandlung mit der Aldehydverbindung werden die Blutkörperchen in physiologischer Salzlösung aufbewahrt.

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Die Polymerteilchen mit eiweißähnlicher Oberfläche können so hergestellt werden, daß man unlösliche Teilchen in einer Größenordnung von etwa 0,1 Ms 10/U mit Gelatine, einem eiweißartigen Material, überzieht, wozu man eine Technik, wie Coacervierungs-Überziehen oder Einkapseln anwendet. So können beispielsweise Polystyrolteilchen gemäß U.S. Patentschrift 3 234 096 durch Emulgieren in Gelatinelösung und Sprühtrocknen der Emulsion eingekapselt werden. Es muß nur ein dünner Gelatinefilm auf der Oberfläche der Teilchen erzeugt werden, so daß die Aldehydverbindungen noch mit den Teilchen umgesetzt werden können. Es können auch Teilchen aus Gelatine, zusammen mit einem Vernetzungsmittel, wie einem solubilisierten PoIyacrolein, verwendet werden.

Die Aldehydverbindungen müssen in verhältnismäßig reinem Zustand sein, wenn sie mit Erfolg verwendet werden sollen. Eine unter mehreren Arten der Prüfung auf Reinheit besteht darin, daß man die betreffende Verbindung unter Stickstoff destilliert, um sicherzustellen, daß sie in monomerer Form vorliegt. Im allgemeinen kann die Umsetzung der Aldehydverbindung mit den Trägerteilchen in Salzlösungen durchgeführt werden, deren Konzentration unter der physiologischen liegt; hierbei spielen osmotische Vorgänge eine Rolle. Das Kuppeln der so gebildeten reaktivenTeilchen an biologische Stoffe kann ebenfalls in Salzlösung durchgeführt werden. Da jedoch die reaktiven Teilchen gegen lyse stabilisiert sind, kann auch jede andere mit dem umzusetzenden biologischen Stoff verträgliche Lösung als Reaktionsmedium dienen.

Es können die verschiedensten biologischen Stoffe an die reaktiven Teilchen gekuppelt werden. Im folgenden sind einige Beispiele aus einer großen Reihe der verschiedensten Stoffe mit immunologischen Eigenschaften aufgeführt, die verwendet werden können, um die erfindungsgemäßer immunologischer Indikatorteilchen herzustellen:

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Menschliches Serumalbumin, Rinder-Serumalbumin (BSA) und sein Antikörper aus dem Kaninchen; Eialbumin; menschliches chorionisches Gonadotropin (HCG-); Antigene der Blutgruppen A und B; Gamma-Globuline; Beta-Globuline; Beta-Lipoprotein; Alpha-G-lobuline der menschlichen Plasmafraktion; anti-C-reaktives Protein aus der Ziege oder dem Schaf; Diphtherie-Antitoxin; Tetanus-Antitoxin; menschliches Transferrin; Trichinella-Antigen; Thyroglobulin und ähnliche antigene Stoffe von entweder pathogenen oder natürlichen Organismen; Myoglobin, Hämoglobin, leutinisierendes Hormon und Insulin.

Da Antikörper Gamma-Globulinmoleküle darstellen, die auf solche Weise modifiziert sind, daß sie Antigenrezeptorstellen für das Antigen, dessen immunologisches Gegenstück sie sind, aufweisen, kann die Anwesenheit von Antikörpern angezeigt werden durch ihre Reaktion mit £h entweder ihrem entsprechenden Antigen oder mit dem Antikörper zu dem Gamma-Globulin, aus welchem sie gebildet sind.

Die hier erwähnten antigenischen immunologischen Stoffe

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zeigen Stoffe/f die, wenn sie in den Kreislauf eines Tieres eingeführt werden, Antikörper produzieren, die zu diesem besonderen antigenischen Stoff spezifisch sind. Derartige antigenische Stoffe umfassen Serumproteine, wie Gamma-Globulin und Serumalbumin oder Substanzen der Blutgruppen "A" und "B", von denen Blutgruppenbestimmungen gemacht werden können so_r wie die anderen oben aufgeführten Antigene.

Mikrobenantigene können an die reaktiven Teilchen gekuppelt werden, um zu Indikatorsystemen zu kommen, mit deren Hilfe man in Körperflüssigkeiten Antikörper feststellen kann.

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In dem Flüssigkeitssystem von Organismen anwesende antigenische Hormonsubstanzen können ebenfalls an die reaktiven Teilehen gekuppelt werden. Auch Enzyme können als antigenische Stoffe benutzt werden. Die Mikrobenantigene für die Antikörper können aus Bakterien oder Pungi stammen oder parasitologischer oder viraler Herkunft sein und werden im allgemeinen von den natürlich vorkommenden Zellen abgestreift, ehe sie an die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen gekuppelt werden.

Das an die als Unterlage dienenden Trägerteilchen gekuppelte biologische Material kann ein Enzym sein, wie Diastase, Maltese, Zymase, Amylase oder ein anderes Enzym und/oder Coenzym. Wenn ein Enzym an ein Trägerteilchen gekuppelt ist, kann es verwendet werden, um enzymatische Umwandlungsprozesse auf bevorzugte Weise durchzuführen. So können die ersten drei der obigen Enzyme in einem Dreistufenverfahren zur Umwandlung von Stärke in Alkohol verwendet werden, während das letzte aufgeführte Enzym dazu dienen kann, Stärkeaufschlämmungen in Zuckersirupe überzuführen. Ein Vorteil der Verwendung der Enzyme in ungelöster Form durch Kuppeln an die erfindungsgemäßen festen Trägerteilchen besteht darin, daß die Enzyme nicht mit dem zu verarbeitenden Material vermischt werden, wenn die Teilchen in fester Stellung zurückgehalten oder in einem Bett angeordnet sind, durch welches das umzusetzende Material durchlaufen kann. AIp weiteres Beispiel eines enzymatischen Umsetzungsprozesses sei die Umsetzung von "Schwarzlaugen"-Melassen genannt, die so durchgeführt werden kann, daß man sowohl Invertase als auch Zymase an erfindungsgemäße Trägerteilchen kuppelt und die Melasse dann darüberlaufen läßt.

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Das Haupterfordernis für die hier erwähnten "biologischen Stoffe ist, daß sie mindestens eine Gruppe aufweisen, die mit einer Aldehydgruppe reagieren kann. Unsubstituierte Aminogruppen oder Gruppen in den Eiweißketten der meisten biologischen Stoffe stellen derartige Gruppen dar.

Blutgruppen, Isoagglutininsubstanzen und verschiedenstes Krankheitszustände können durch Verwendung der erfindungsgemäß herstellbaren immunologischen Indikatoren bestimmt und festgestellt werden. Die Bestimmung wird normalerweise durchgeführt mit Hilfe der Glasstreifen-Agglutinierungsmethode oder mit einer Mikrotitrator-Agglutinierungsmethode. Die erste Methode beruht darauf, daß man die Testreagentien und die Flüssigkeitsprobe auf einer flachen Glasoberfläche vermischt und wird im allgemeinen nur auf qualitativer Basis durchgeführt, um eine erwartete Konzentration des zu testenden Materials festzustellen. Beide erwähnten Bestimmungsmethoden können entweder als Agglutinierungs- oder als Agglutinierungsverhinderungstest durchgeführt werden, je nachdem, ob ein ungebundenes immunologisches Material der gleichen Natur wie das an die reaktiven Teilchen gebundene im Testmedium anwesend ist oder nicht. Die Technik dieser Versuche, die entweder auf der Agglutinierung oder auf der Verhinderung der Agglutinierung beruhen, sei wie folgt erklärt:

Die Mikrotitrator-Agglutinierungsmethode wird so durchgeführt, daß man die Testreagentien für jeden Versuch in eine Anzahl Vertiefungen einbringt, die in einer Reihe auf einer Platte aus Kunststoff oder dgl. angeordnet sind. Die lineare Anordnung der Vertiefungen erlaubt eine fortlaufende Verdünnung des für die Versuche zur Agglutinierung oder zu deren Verhinderung verwendeten Antikörpers. Die laufende Verdünnung

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wird so durchgeführt, daß man zuerst einen Tropfen des Verdünnungsmittels in jede der Vertiefungen in der Reihe einbringt und dann in die erste Vertiefung einen Tropfen einer Ausgangs-Antikörperlösung zufügt, die beispielsweise im Verhältnis 1:5 verdünnt ist, wozu man eine entsprechend kalibrierte Schlinge oder Spirale verwendet. Nach Vermischen wird die Spirale in die erste Vertiefung eingetaucht und daraus ein Flüssigkeitstropfen entnommen, der dann mit dem Verdünnungsmittel in der zweiten Vertiefung vermischt wird. Die Verdünnung in der ersten Vertiefung beträgt dann 1:10, diejenige in der zweiten Vertiefung 1:20. Dieser Prozeß der lau-r fenden Verdünnung wird so lange wiederholt, bis sämtliche Vertiefungen in der Reihe behandelt sind, so daß man eine Serie von Antikörperverdünnungen hat, in der sich von Vertiefung zu Vertiefung der Verdünnungsgrad um den Faktor von o,5 von der vorangehenden unterscheidet.

Zwecks Durchführung des Agglutinierungstestes fügt man zu den Vertiefungen, welche die verschiedenen Verdünnungsgrade enthalten, je einen Tropfen einer Suspension der Indikatorteilchen hinzu. Beruht der Versuch auf einer Verhinderung der Agglutinierung, so gibt man in jede Vertiefung vor Zusatz des Indikatorsystems einen Überschuß an ungebundenem Antigen über die Menge an Antikörper. Werden Proben von Körperflüssigkeiten untersucht, so werden diese als das Antigen zugefügt und im allgemeinen werden die laufenden Verdünnungen des Antikörpers derart eingestellt, daß die Konzentration des Antikörpers der Konzentration des ggf. zu bestimmenden Antigens äquivalent ist und in dem Mittelteil der Verdünnungsreihe liegt. Hierdurch läßt sich der Titer des Antigens in der Körperflüssigkeitsprobe feststellen, womit man eine semiquantitative Bestimmungsmethode »in der Hand hat.

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Die Herstellung der erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen erfolgt so» daß man die Trägerteilchen mit der betreffenden Aldehydverbindung so lange mischt, bis die Reaktion zwischen der Verbindung und/Oberfläche der Trägerteilchen erfolgt ist. Diese Reaktion geht bei Raumtemperatür (20 bis 25 C) langsam vor sich, so daß Zeitspannen von etwa 16 bis 80 Stunden notwendig sind, bis die Reaktion vollständig verlaufen ist. Vorzugsweise schüttelt man das Reaktionsgemisch" auf einer laboratoriumsmäßigen Schütteleinrichtung während eines Teiles oder der ganzen Reaktionsdauer. Ggf. kann eine Vorbehandlung mit einem Konservierungsmittel, wie Formaldehyd, erfolgen, Jedoch ist dies nicht notwendig, da die erfindungsgemäßen Aldehydverbindungen ebenfalls als Konservierungsmittel dienen.

Eine bevorzugte Methode für die Behandlung von roten Blutkörperchen mit den Aldehydverbindungen sei am Beispiel der Methode, die eine Behandlung mit G-lutaraldehyd einschließt, erklärt. Das Blut wird in einer Lösung nach Alsever gesammelt, zentrifugiert und die roten Zellen abgetrennt. Die roten Blutkörperchen werden dann zu einer 1o ^igen Suspension in Salzlösung resuspendiert und durch die Suspension eine bis zwei Stunden lang Stickstoff geleitet. Ein gewisses Volumen der so vorbehandelten Zellen kann dann bei etwa 25 C 17 Stunden lang umgesetzt werden mit zwei Volumen einer 2 Vol.-^igen Lösung von destilliertem Glutaraldehyd in einer Salz-Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,2 (0,0075 M UaCl und O_fOO75 M Phosphationen-Konzentration). Der G-lutaraldehyd wurde vorzugsweise im Vakuum destilliert. Nachdem die Reaktion durchgeführt ist, werden die eine Glutaraldehydreaktion aufweisenden Zellen zentrifugiert, dreimal gewaschen und in 0,85 ^iger Salzlösung zu einer 10 folgen Zellensuspension suspendiert, worauf sie in sterilen

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Behältern bei 4°C gelagert werden. Wird Acrolein verwendet, so arbeitet man wie bei Glutaraldehyd, wobei man jedoch eine 5 $ige Zellensuspension von 0,85 $iger Kochsalzlösung umsetzt mit einer 4 Vol.-$igen Lösung von frisch destilliertem Acrolein in einer Kochsalz-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2; 0,09 M NaCl und 0,0037 M Phosphationen-Konzentration) Nach dem Waschen werden die Zellen in 20 $iger Suspension gelagert. Da bei diesen Behandlungen der pH-Wert nicht kritisch isjt, können pH-Wer.te von 6 bis 8 ohne Gefahr angewandt werden.

Der exakte Verlauf der Reaktion der einzelnen Aldehydverbindungen mit den entsprechenden Trägerteilchen ist noch nicht restlos bekannt. Es ist anzunehmen, daß eine der Carbonylgruppen des Dialdehyds unmittelbar mit der Aminosäuregruppe an der Oberfläche des Trägerteilchens reagiert, so daß die restliche Carbonylgruppe frei bleibt und mit einem immunologischen Stoff reagieren kann, wenn dieser mit dem behandelten Trägerteilchen in Kontakt kommt. Eine gewisse eingeschränkte Polymerisierung des Dialdehyds an der Oberfläche des Trägerteilchens kann erfolgen, so daß einige Monomermoleküle gebunden werden und eine Gruppe mit Polyaldehydbindung entsteht. Es ist anzunehmen, daß bei <*,ß-ungesätt±gten Aldehyden eine nukleophile Addition des Michael-Typs zwischen einer Aminogruppe an der Oberfläche des Trägerteilchens und der Doppelbindung des Aldehyds stattfindet. Einige der Aldehydgruppen reagieren daraufhin mit den Oberflächen der Trägerteilchen und die übrigbleibenden Aldehydgruppen sind frei zur Reaktion mit chemischen Gruppen in den zugesetzten biologischen Stoffen. Die Anwesenheit der freien Aldehydgruppen kann z.B. mit dem Schiff'sehen Reagens nachgewiesen werden, und zwar selbst nachdem die Teilchen bis zu 30-mal innerhalb einer Woche vor Durch-

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Schiff'sehen Reaktion gewaschen wurden. Unter dem Mikroskop ist ohne weiteres eine intensive Purpurfärbung an der Oberfläche der Teilchen festzustellen.

Die Erzeugung von biologischen Seagentien unter Verwendung der so hergestellten erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen ist verhältnismäßig leicht. Man gxbt die wie oben hergestellten reaktiven Teilchen in ein flüssiges Medium und fügt dann das damit zu kuppelnde biologische Material zu,worauf man das G-emisch bei Raumtemperatur etwa 48 Stunden oder langer , stehen läßt, um das Eintreten der Kiapplungsreaktion zu bewirken. Vorzugsweise rührt man während eines Teiles oder während • der ganzen Periode und^endet gegen Ende der Reaktionszeit eine höhere Temperatur von etwa 37⁰G an. Da die Trägerteilchen stabilisiert und gegen Lyse konserviert sind, ist es nicht nötig, für diese Reaktion eine physiologische Salzlösung zu verwenden.

Wie aus dem obigen ersiehtXie&₉ Iaat die Verwendung der erfindungsgemäßen Teilchen groß© Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren. Die reaktiven Teilchen lassen sich leicht herstellen und können längere Zeit vor der Verwendung gelagert werden. Dies bedeutet einem wesentlichen technischen Fortschritt, da man auf diese Weise die reaktiven Teilchen auf einmal herstellen und sie dann zur Bildung der verschiedensten biologischen Reagentiea verwesaöesi kann.

Die bevorzugten Trägerteilefeea für die Durchführung von Agglutinationsversuchen auf der Glasscheibe sind Mikrobenzellen, die mit Hilfe der "bekannten Ztaltiariaethoden leicht erhältlich sind» Vorzugsweise werden flis rsafc'feiven Teilchen gebildet durch Addieren»von Äsroleiii an die Hikrobenzellen und Schütteln bei Raumtemperatur Woe? sins Zeitdauer von j etwa 40 ho

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Diese bevorzugten Teilchen -können dann gekuppelt werden mit einem biologischen Stoff aus einer großen Reihe solcher Stoffe· Das Kuppeln erfolgt durch Reaktion der Teilnehmer b*ei Raumtemperatur über etwa 2-5 Tage, worauf, man das Gemisch noch etwa 2 h bei erhöhter Temperatur von 37⁰C hält. Die resultierenden Indikatorteilchen sind besonders vorteilhaft zur Durchführung von Versuchen, bei denen entweder das Eintreten der Agglutination oder ihre Verhinderung nachgewiesen werden soll»

Die bevorzugte Mikrobenzelle ist aufgrund ihrer leichten Züchtung und ihrer nicht nichtpathogenen Eigenschaften E. coli,

Rote Blutkörperchen aus dem Ziegenblut sind als inerte Trägerteilchen für Mikrotitrationsversuche bevorzugt.

Der bevorzugte Aldehyd zum Kuppeln, insbesondere mit Antikörpern, ist Acrolein, da bei seiner Verwendung die resultierenden Titer höher sind als diejenige, die bei der Verwendung von anderen Aldehyden erzeugt werden₀

Die Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie einzuschränken«

Beispiel 1»

Zur Bildung von reaktiven Teilchen wurden Mikrobenzellen mit Acrolein und Glutaraldehyd umgesetzt» Die erhaltenen reaktiven Teilchen wurden dann mit biologischen Stoffen zu, Reagentien umgesetzt« Als Mkrobenzellen wurden Eschericb/coli (E. coli) und Saccharomyces cerevisiae (Hefe) verwendet und als biologische Stoffe kamen Pferde-gamma-globulin und menschliches Chorion-Gonadotropin (HCG) zur Verwendung,,

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Herstellung der reaktiven Teilchen

Aus einer gutgedeienden Kultur von E₀ coli in G-ehirn-Herz-Infusionsbrühe wurden nach 4 1/2 h Wachstum bei 37 C die Mikrobenzellen gewonnen, die dann dreimal mit einer sterilen Salzlösung gewaschen wurderie Die Zellen wurden dann in Salzlösung zu einer 1,5-^igen Suspension suspendierte

Der pH-Wert einer gewissen Menge einer 50$igen wässrigen Lösung von G-Iu tar aid ehyd (Handelssorte) wurde mit Natronlauge auf pH 7 eingestellte Dann wurde eine 2$ige Lösung (Gew./Vol.) von Glutaraldehyd in einem Lösungsmittel mit einem Gehalt von 0,00375 M IaCl und 0,00375 M Natriumphosphat, eingestellt auf pH 7,2, angesetzt,, Eine 4,5$ige Lösung (Gew./Vol.) von destilliertem Acrolein wurde derart angesetzt, daß sie in ihrer Endzusammensetzung 0,10 M NaCl und 0,00375 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) enthielt. Das verwendete Acrolein war das Handelsprodukt, destilliert in einem Rundkolben mit Thermometer, Liebigkühler und elektrisch beheiztem Mantel, gefüllt mit einer Stickstoffatmosphäre_o Die Destillationseinrichtung wurde mit einem schwarzen Tuch bedeckt um sie gegen Licht abzuschirmen und die Destillation wurde-unter dem Abzug bei 52,5⁰C durchgeführte Das Destillat wurde in einer braunen, an den Liebigkühler angeschlossenen Flasche aufgefangen, die ebenfalls Stickstoff enthielte

Zu je 2 Volumina der folgenden Reagentien wurde ein Vol.-Teil der wie oben bereiteten l,5$igen Zellensuspension zugefügt? (1) Zu der 2$igen fflutaraldehydlösung (3 Monate gealtert), (2) zu einer 2$igen, frisch bereiteten Glutaraldehydlösung, (3) zu dem wie oben bereiteten 4,5$igen Acrolein und (4) zu einer 4,5$igen Acroleinlösung, bereitet wie oben jedoch unter Verwendung· von undestilliertem Acrolein Diese Gemische wurden dann 44 h bei 4⁰C unter gdegentlichem

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Schütteln stehegelassen um die Reaktion des Acroleina und des Glutaraldehyds mit den Mikrobenzellen zu beschleunigen. Eine nach 40 h durchgeführte Prüfung mit Schiffschem Reagens (Fuchsin, entfärbt durch schweflige Säure) zeigte, daß alle behandelten Zellen an der Oberfläche reaktive Aldehydgruppen aufwiesenβ

Auf gleiche Weise wie oben wurden Hefezellen mit den Glutaraldehyd-und Acroleinlösungen behandelt. -Zwei Portionen von Je 1 g Bierhefe (Fleishmans "Active Dry" der Firma Standard Brands, Inc., Few York ^"Saccharomyces cerevisiae_7) wurden dreimal mit Salzlösung gewaschen und dann wieder in 200 ml Salzlösung suspendiert. Zu einer der beiden Suspen~ sionen wurden dann 400 ml der oben erwähnten 2$igen Glutaraldehydlösung, zu der anderen 200 ml der obigen 4,5$igen Acroleinlösung hinzugefügt. Die Ansätze wurden dann 40 h bei 22⁰C stehegelassen, damit die Konservierungsreaktion eintreten konnte. Die Prüfung mit dem Schiff sehen Reagens wie oben zeigte, daß die Zellen bei-der Portionen an ihren Oberflächen reaktive Aldehydgruppen trugen.

Herstellung des fertigen Reagens'.

Das Kuppeln von HCG (4 mg/ml) und Pferdeglobulin (200AU/-ml Diphterieantitoxin) an die wie oben bereiten reaktiven Teilchen wurde durchgeführt, indem man die Teilchen zunächst dreimal mit Salzlösung wusch. Die für HCG bestimmten Teilchen wurden nochmals mit einer Salzphosphatpufferlösung (SPB) vom pH 7,3 und die für Pferdeglobulin bestimmten zusätzlich mit SPB vom pH 9,5 gewaschen. Die Teilchen wurden dann mit ihren entsprechenden Puffern auf lO^ige Suspensionen verdünnt, worauf zu jeweils 10 Volumina 5 Volumina HCG bzw. 1 Vol. Pferdeglobulin zugegeben wurden. Die Gemische wurden 16 h bei 22⁰C und etwa 100 min bei 57⁰C geschüttelt, um die -e Indikatorteilchen für Jedes der Antigene zu bilden«,

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Sie wurden dann zweimal mit physiologischer\Salzlösung und einmal mit 0,6?Sigem Rinderserumalbumin (BSA) in Salzlösung gewaschen und dann in dem BSA zu einer Suspension mit einer Teilchenkonzentration von 2 # suspendiert· Es wurden auf diese Art acht Ansätze von Indikatorteilchen hergestellt, vier mit HCG- und vier mit Pferdeglobulin*

Die Antikörperlösungen für diese Indikatorteilchen wurden so hergestellt, daß je 1 Vol. von.Kaninchen-Anti-HCG-Berum und Kaninehen-Antipferdeglobulinserum mit 10 Vol. physiologischer Salzlösung verdünnt wurde, Vergleichslösung war eine Lösung 1 : IO von normalem Kaninchenserum in physiologischer Salzlösung·

Prüfen des Reagens£

Die wie oben hergestellten Indikatorteilchen wurden dann mit den obigen Antikörperlösungen getestet, wozu das oben bereits beschriebene Mikrotitrator-Agglutinationsverfahren diente. Es wurde auf folgende Weise gearbeitet, wobei die mit T - 3 numerierten Zusätze Tn jede von in einer Reihe angeordneten 12 Vertiefungen gegeben wurden:

(1) ein Tropfen 0,6 $iges BSA in Salzlösung als Verdünnung smi11 e1;

(2) eine Schlinge von der entsprechenden Antiserumverdünnung, die dann in die elf folgenden Vertiefungen übertragen wurde;

(3) eia Tropfen der entsprechenden 2 folgen Indikatorteilchensuspension.

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Die Verteilungstechnik mit 'der Schlinge führte schließlich zu Antiserumverdünnungen nach Stufe (3)» die von 1:40 bis zu 1:81 920 für die zwölf Vertiefungen in einer Reihe reichten. .

In jeder Serie von Vertiefungen, welche die spezifischen Antisera enthielten, bildeten sich positive Agglutinationsbilder bis zur Mitte des Titrationsbereiches. Es ließ sich auf diese Weise durch Beobachtung des Titers beim letzten positiven Bild eine quantitative Messung der Antikörperkonzentration durchführen.

Auf analoge Weise wurden mit 1t20-Verdünnungen der Sera Agglutinationsversuche auf dem Glasstreifen durchgeführt und die Spezifizität der Antisera qualitativ bestimmt.

Der Schluß, der aus den gebildeten Agglutinationsbildern gezogen wurde, war, daß die immunologischen Stoffe HCG und Pferdeglobulin mit Erfolg an jedes der reaktiven Teilchen gekuppelt worden waren.

Beispiel II

Zwecks Herstellung von reaktiven Teilchen wurden rote Blutkörperchen mit Glutaraldehyd und Acrolein behandelt. Die Teilchen wurden dann mit einem menschlichen Blutgruppenantigen eines menschlichen Gamma-Globulins umgesetzt, um Indikatorteilchen zur Bestimmung ihrer entsprechenden Antikörper (immunologischen Gegenstücke) zu bekommen. .

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Herstellung von reaktiven Teilchen

Eine gewisse Menge Segenblut wurde mit der gleichen Menge Alsever-Iösung vermischt. Das Gemisch zeigte eine Hämatokritzellensuspension von 18,5 f>» Die Blutmischung wurde dann viermal mit steriler, 0,85 $iger Salzlösung gewaschen, worauf 16 ml einer 10 .^igen Suspension in phyiologischer Salzlösung hergestellt wurden.

Eine 50 $ige GIutaraldehydlösung wurde mit natronlauge auf einen pH von 6 eingestellt und dann auf 2 fo verdünnt, indem man 40 ml der lösung vermischte mit 960 ml einer auf 1 bis 10 verdünnten, mit Phosphat gepufferten Salzlösung (pH 7,2) in destilliertem Wasser. Mit 6 ml dieser 2 folgen Glutaraldehydlösung wurden 3 ml der obigen Zellensuspension vermischt und 2 Stunden auf einer rotierenden Schütteleinrichtung bewegt. Dann wurde das Gemisch abgenommen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die behandelten Zellen wurden viermal in Salzlösung gewaschen und dann wieder zu einer 10 'folgen Suspension in Salzlösung unter sterilen Bedingungen suspendiert.

Durch Zugabe von 8 g (9,.3 ml)Acrolein zu 10 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,2) wurde eine 8 folge Lösung von undestilliertem Acrolein hergestellt, die dann mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt wurde. Nachdem die lösung einige Tage gestanden hatte, wurde sie etwas irübe und wurde mit 10 000 Umdr./min 3o Minuten zentrifugiert. Durch Verdünnen dieser 8 folgen Lösung mit dem gleichen Volumen einer 1,115 feigen Salzlösung wurde eine 4 folge Acrcleinlösung bereitet. Dann wurden 3 ml der obigen Zellensuspension vermischt mit 6 ml dieser 4 $igen Acrolein-

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lösung, die Mischung geschüttelt und in gleicher Weise wie bei der Glutaraldehydbehandlung inkubiert. Die so behandelten Zellen wurden dann viermal in Salzlösung gewaschen und unter sterilen Bedingungen zu einer 10 $igen Suspension in Salzlösung resuspendiert. -

Herstellung von Indikatorteilchen mit Blutkörperchen der Blutgruppe A '· ·

Die wie oben hergestellten zwei Arten von reaktiven Teilchen wurden benutzt, um Indikatorteilchen zur Bestimmung der Antisubstanz für die menschliche Blutgruppe A und der Antisubstanz für menschliches Gamma-Globulin, gewonnen aus einem Kaninchen, zu beko mmen. Die Indikatorteilchen zur Bestimmung des ersteren dieser immunologischen Stoffe werden dadurch hergestellt, daß man eine für die menschliche Blutgruppe A spezifische Substanz auf die mit Glutaraldehyd bzw. mit Acrolein behandelten reaktiven Indikatorteilchen aufkuppelte .Die Indikatorteilchen zur Bestimmung des im Kaninchenblut vorkommenden Antikörpers gegen menschliches Gamma-Globulin wurden so hergestellt, daß man menschliches Gamma_Globulin mit den reaktiven Teilchen kuppelte, die mit Glutaraldehyd bzw. mit Acrolein behandelt worden waren.

Je 2 ml der 10 folgen Zellensuspensionen aus den obigen reaktiven Teilchen wurden hergestellt durch Waschen und Resuspendieren in einem Salz-Phosphat-Puffer vom pH 9,5. Jede der 2 ml-Portionen wurde dann in gleiche Teile geteilt und wie folgt zum Kuppeln verwendet: Zu der ersten der 1 ml-Portionen der mit Glutaraldehyd behandelten Zellen wurden 0,5 ml einer für die menschliche Blutgruppe A spezifischen Substanz zugegeben; zu der zweiten 1 ml-Portion wurden 0,1 ml eines ■Gemisches aus einem Teil· menschlichem Gamma-Globulin in 10 Tei-

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len physiologischer^Salzlösung zugefügt. Die gleichen Zugaben wurden-ZiU; den 1 ml-Portionen der mit Acrolein behandelten Zellen ^hinzugegeben# Dann wurden die Gemische bei Raumtemperatur .etwa 17 Stunden geschüttelt, um der Kuppelreaktion genügend Zeit zum vollständigen Verlauf zu geben. Eine geeignete Substanz der menschlichen Blutgruppe A kann bezogen werden von Chas. Pfizer & Co·, Brooklyn, New York, unter der Handelsbezeichnung "Substanz A".

Jeder der vier Ansätze mit Indikatorteilchen wurde dann in zwei Hälften geteilt, so daß man vier Paar Ansätze erhielt, die paarweise zusammengehörten. Der eine Ansatz von jedem Paar wurde 2 Stunden ohne Schütteln auf 37°C gehalten, der zweite Partner'blieb die gleiche Zeit bei Raumtemperatur ohne Schütteln stehen* Dann wurden die Ansätze aus Zellen dreimal mit einer Salzlösung vom pH 7,0 gewaschen und in einer 0,6 folgen Lösung von Rinder-Serumalbumin in 0,85 #iger physiologischer Salzlösung (abgekürzt BSA 0,6 ^δ) resuspendiert zu einer Zellenkonzentration von 0,5 #. Die verschiedenen Indikatorsysteme wurden dann verwendet zur Durchführung von Mikrotitrator-Agglutinationsversuchen, die in der oben beschriebenen Weise durchgeführt wurden. Die Antikörperpräparate zur Verwendung mit den Indikatorteilchen für die Blutgruppe A bestanden aus handelsüblich erhältlichem, gereinigtes menschliches Serum enthaltendem Antikörper zur Blutgruppe A· Die Antikörperpräparate zur Verwendung mit menschliches Gamma-Globulin enthaltenden Indikatorteilehen bestanden aus Kaninchenblutserum mit einem Gehalt an Antikörpern für menschliches Gamma-Globulin.

♦ Die Titer der zugefügten Antikörper lagen zwischen 1x10 und 1:128o bei einer Serie von 8 Reihen, von welchen jede 8 Vertiefungen aufwfesl

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Mit diesen Präparaten wurde das in Beispiel I "beschriebene Mikrotitratorverfahren neben entsprechenden Vergleichsversuchen durchgeführt. · ·

In jeder der 8 Reihen erschienen bei niedrigeren Verdünnungen von etwa 1:10 bis 1:80 agglutinierte Bilder, während in den Vertiefungen, welche die höchsten Verdünnungen enthielten, wie erwartet nicht agglutinierte Bilder erschienen, da die Antikörperkonzentration bei diesen Verdünnungen nicht für eine Agglutinierungsreaktion ausreichte. Wie a us früheren Forschungen bekannt ist, erlaubt diese Versuchsanordnung den Schluß, daß mit derartigen Indikatorteilchen Agglutinationsprüfungen durchgeführt werden/und zwar sowohl auf die Anwesenheit von Blutgruppen-Isoagglutininen (Antikörpern) als von .Antikörpern zum menschlichen Gamma-Globulin in den Testproben. Ebenso kann durch einen Agglutinationsverhinderungstest auf die entsprechenden Antigene geprüft werden.

Beispiel III . ·

Es wurden reaktive Teilchen aus roten Blutkörperchen, die an ihrer Oberfläche Acroleinmoleküle trugen, bereitet und ψ jeweils mit den folgenden biologischen Stoffen gekuppelt: Rinder-Gamma-Globulin (BG), menschliches Gamma-Globulin (HG), Diphtherie-Antitoxin (Equinglobulin) und Tetanus-Antitoxin (Equinglobulin). Die resultierenden Indikatorteilchen wurden zu einer Trockenform lyophilisiert und gelagert; zur Durchführung von immunologischen Untersuchungen wurden sie wieder mit -Flüssigkeit behandelt.

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Rote Blutkörperchen aus 2iegenblut wurden gemäß Beispiel II mit Acrolein behandelt. Die so behandelten Zellen wurden bei 4⁰C unter Stickstoff atmosphäre aufbewahrt unct dann wie folgt mit Antigenstoffen behandeltί

5 ml einer 10 folgen Suspension der reaktiven Teilchen wurden getrennt in 5 Versuchsröhrchen eingebracht, einmal mit 8 ml einer 0,85 folgen Kochsalzlösung gewaschen, 5 Minuten bei 5000 IJmär./min. zentrifugiert und dann wieder in 4 ml der gleichen Kochsalzlösung resuspendiert. Bann wurden auf die Röhrchen je 0,5 ml der folgenden Antigene, aufbereitet in 0_r85 fo lge? Kochsalzlösung,, verteilt: 1 fa BG; 1 $> HG? Diphtherieantitoxin (200 AU/ml, 2 f> Globulin) j Tetanusantitoxin (200 AU/ml). Man ließ die Gemische etwa eine Woche bei Raumtemperatur reagieren und nahm dann 0,2 ml aus jedem Röhrehen ab; jeder der Indikatoren, außer dem BG-Indikator, wurde dreimal mit 4,0 ml 0,6 ^igem BSA gewaschen. Die BG-Aufbereitung wurde mit einer 0,6 folgen Lösung von normalen Kaninchen-Serum-Proteinen in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Indikatorteilchen wurden dann zu einem 1 #igen Konzentrat in dem.0,6 $lgen BSA bzw. in dem normalen Kaninchenserum resuspendiert und zu den Mikrotitrator-Agglutinierungsversuchen verwendet. Diese Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung von laufenden Verdünnungen der folgenden Antikörper in den obigen Verdünnungsmitteln: Anti-Rinder-Gamma-Globulin aus einem Kaninchen; Anti-Equingamma-Globülin aus einem Kaninchen und Diphtherie- und Tetanus-Toxoid. Bis einschließlich der vierten Vertiefung in jeder Reihe von Vertiefungen erschienen Agglutinationsbilder, während von der fünften Vertiefung an kein Agglutinieren zu beobachten war, wenn das immunologische

* Anti-Menschen-Gsfmma-Globulin aus einem Kaninchen

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'Gegenstück zugefügt wurde« Mit anderen Stoffen wurden negative Bilder erhalten. Demnach waren die Indikatorteilchen ordnungsgemäß gekuppelt worden durch einfaches Vermischen der Antigenpräparate mit den reaktiven Teilchen bei Raumtemperatur.

2 1/2 ml der so hergestellten und getesteten Indikatorteilchen wurden zu einer 10 $igen Suspension verarbeitet, dreimal je 5 Minuten bei 5ooo Umdr./min zentrifugiert und auf eine 10 $ige Konzentration resuspendiert. Als Wasch- und Resuspendierflüssigkeit für alle, außer dem BG-Indikator, wurde 6 $iges BSA verwendet. Das Verdünnungsmittel für den BG-Indikator war 6 folges normales Kaninchenserum in 0,85 $- iger Salzlösung. Die zum Schluß erhaltene Menge aus jedem der 2,5 ml-Volumlna je Indikatorsystem wurden gleichmäßig in kleine Röhrchen verteilt, so daß diese eine 5 mm tiefe Flüssigkeit enthielten,und die Präparate wurden 5 Minuten in einem trockenen Eis-Aceton-Bad eingefroren. Die Präparate wurden dann in einen Laboratoriums-Iyophilisator eingebracht und 48 Stunden der Gefriertrocknung unterworfen, wonach die Röhrchen verschlossen und bei 4⁰C aufbewahrt wurden.

Die Indikatorteilchen wurden dann in physiologischerKbcK.- ©alzlösung zu einer Konzentration von 1 $ resuspendiert und durch Mikrotitrator-Agglutinierung gegen laufende Verdünnungen ihrer jeweiligen Antikörper oder Antigene getestet, was analog Beispiel I durchgeführt wurde.

Auf der Mikrotitratorplatte zeigte sich eine Agglutinierung im gleichen Ausmaß wie vor der lyophilisierung, was anzeigte, daß die Reaktivität der Indikatorteilchen nicht zerstört worden war. Die Fähigkeit der Diphtherie- und Teta-

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nusant'itbxin-Indikatorteilchen, durch das entsprechende Antigen agglutiniert zu werden, zeigt an, daß der Kupplungsprozeß die Antikörpereigenschaften nicht zerstört.

Das Pferdeblut-Diphtherieantltoxin kann demnach betrachtet werden als ein Antigen, nämlich Pferde-Gamma-Globulin. Der Erfolg des Kuppeins wird dadurch bewiesen, daß man diese Indikatorteilchen mit einem Antikörper agglutiniert, der im Kaninchen gegen normales Pferde-Gamma-Globulin bereitet wird.

Mit den lyophilisierten Diphtherie-Antitoxinteilchen wurde eine weitere Reihe von Versuchen durchgeführt, um die Anwesenheit des sogenannten rheumatoiden Arthritisfaktors (RF) in menschlichen Sera nachzuweisen, da in der Literatur beschrieben ist, daß die meisten Patienten mit rheumatoider Arthritis RF in ihrem Serum beherbergen. Dieser Faktor wirkt wie ein Antikörper gegen eine Anzahl von animalischen Gamma-Globulinen, darunter das Pferde-Gamma-Globulin. Bei der Untersuchung der Sera von an rheumatoider Arthritis leidenden Patienten mit Hilfe der Mikroti-trator-Technik ergaben die erfindungsgemäßen Diphtherieantitoxin-Indikatorteilchen Agglutinierung.

Die mit den reaktiven Teilchen hergestellten erfindungsgemäßen Indikatorteilchen können demnach präpariert, lyophilisiert, rekonstituiert und zur Untersuchung von Patientensera verwendet werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß man erfindungsgemäß aus der Umsetzungyalpha; beta-ungesättigten Aldehyden und Dialdehyden mit Trägerteilchen, wobei an der Oberfläche der letzteren aldehydreaktive Gruppen gebildet werden, reaktive Teilchen herstellen kann. Diese reaktiven Teilchen können unmittelbar mit biologischen Stoffen zu Reagentien gekuppelt « werden, die für viele Zwecke, insbesondere zur Durchführung

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von immunologischen Untersuchungen durch Agglutinierungsverfahren, verwendet werden können.

Patentansprüche

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Claims

atentansprüche

1. Zur unmittelbaren Angliederung an biologische Stoffe fähige reaktive Teilchen in Form von Trägerteilchen, die an ihrer Oberfläche aldehydaktive Gruppen aufweisen, welch letztere mit biologischen Stoffen durch Bildung von kovalenten chemischen Bindungen reagieren können,

2. Reaktive Teilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägerteilchen Mikrobenzellen, rote Blutkörperchen oder polymere Teilchen mit proteinhaltiger oder proteinartiger Oberfläche sind.

3. Reaktive Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die an der Oberfläche der Trägerteilchen gebildeten aldehydaktiven Gruppen Reste eines ci( ,ß-ungesättigten Aldehyds, insbesondere der Acroleinrest oder eines Dialdehy.ds sind.

4. Reaktive Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß ihr größter Durchmesser zwischen etwa 0,2 und 10/U liegt.

5. Verfahren zur Herstellung von reaktiven Teilchen, die fähig sind, sich auf chemischem Wege an biologische Stoffe anzugliedern, dadurch gekennzeichnet, daß man zu einem flüssigen Medium Trägerteilchen in Form von Mikrobenzellen, roten Blutkörperphen oder polymeren Teilchen mit ei-

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weißartiger oder eiweißhaltiger Oberfläche hinzufügt, damit einen c(. , ß-ungesättigten Aldehyd, einen Dialdehyd,oder ein Gemisch aus beiden vermischt, den Mischvorgang so lange fortführt, bis der Aldehyd mit den Teilchen reagiert hat und die Teilchen gewinnt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der verwendete Aldehyd Acrolein ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die reaktiven Teilchen nach ihrer Gewinnung aus dem flüssigen Medium bis zum wasserfreien Zustand getrocknet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Vermischen mindestens 16 Stunden bei'20 bis 25°C fortgeführt wird.

9. Unlöslich gemachtes biologisches Reagens in Form des Reaktionsproduktes von unlöslichen Trägerteilchen mit Aldehydgruppen an ihrer Oberfläche und einem biologischen Stoff, der fähig ist, mit den Trägerteilchen chemische Kovalenzbindungen zu bilden

10. Reagens gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzei chn e t , daß der biologische Stoff ein Antigen, ein Antikörper oder ein Enzym ist.

11. Reagens nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet , daß die Trägerteilchen Mikrobenzellen, rote Blutkörperchen oder Polymerteilchen mit eiweißähnlicher oder eiweißhaltiger Oberfläche sind.

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12. Reagens nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet , daß die aldehydaktiven Gruppen Reste eines OCιß-ungesät&gten Aldehydes, eines Dialdehydes oder eines Gemisches aus beiden sind.

13. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die Aldehydgruppe ein Acroleinrest ist.

14. Reagens nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerteilchen einen größten Durchmesser von etwa 0,2 bis 10/U haben.

15· Reagens nach Anspruch 9;zur Bestimmung von immunologischen Stoffen, dadurch gekennzeichnet , daß sein Anteil an biologischen Stoffen das immunologische Gegenstück *zu dem zu bestimmenden Stoff ist.

16. Reagens nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende immunologische Stoff ein Antigen und das an die Trägerteilchen angegliederte immunologische Gegenstück der Antikörper zu diesem Antigen ist.

17. Reagens nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet , daß der zu bestimmende immunologische Stoff ein Antikörper und das an die Trägerteilchen angegliederte immunologische Gegenstück das Antigen zu diesem Antikörper ist.

18. Verfahren zur Herstellung eines biologischen Reagens nach Anspruch 9 bis 17» dadurch gekennzeichnet, "daß man zu einem flüssigen Mediumürägerteilchen in Form von j Mikrobenzellen, roten Blutkörperchen oder Polymerteilchen mit eiweifJartiger oder eiweißhaltiger Oberfläche hinzufügt, damit

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einen <λ ,B-ungesättigten Aldehyd und/oder einen Dialdehyd
vermischt und das Mischen so lange fortsetzt, bis zwischen den Trägerteilchen und der Aldehydverbindung eine Reaktion stattgefunden hat» worauf man dem Gemisch einen biologischen Stoff zufügt und das Reagens isoliert.

19· Verfahren nach Anspruch 18, dadurch g e k e η η zeichnet , daß der U ,ß-ungesättigte Aldehyd Acrolein ist.

2o· Verfahren nach. Anspruch 18 oder 19» dadurch gekennzeichnet , daß das biologische Reagens nach seiner Gewinnung bis zur Wasserfreiheit getrocknet wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 2o, dadurch gekennzeichnet , daß der biologische Stoff ein Antigen, ein Antikörper oder ein Enzym ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch g-ekennzeichnet , daß man das Vermischen mindestens 48 Stunden fortsetzt.

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