DE2025718B2 - Verfahren zum Stabilisieren von lyophilisierten Erythrozyten - Google Patents
Verfahren zum Stabilisieren von lyophilisierten ErythrozytenInfo
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Description
Dieses Verfahren ist eine weitere Ausgestaltung zum Hauptpatent 18 08 435.
Gemäß Deutschem Patent 18 08 435 werden Erythrozyten
für direkte und passive Hämagglutinationsuntersuchungen durch Methylglyoxal und Formaldehyd
stabilisiert. Vor oder nach dem Überziehen mit Antigen werden die Erythrozyten potenziert, um den Hämagglutinationstiter
zu erhöhen.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Stabilität von mit Aldehyd verarbeiteten Erythrozyten zu verbessern, so
daß sie insbesondere zur Lyophilisation geeignet sind. Die Anmeldung betrifft daher ein Verfahren zum
Stabilisieren von Erythrozyten durch getrenntes Behandeln von nativen Erythrozyten sowohl mit Methylglyoxal
als auch mit Formaldehyd in beliebiger Reihenfolge gemäß Deutschem Patent 18 08 435, dadurch gekennzeichnet,
daß dem wäßrigen, für die Lyophilisierung geeigneten Erythrozytenpräparat, enthaltend 0,1 bis 10
Vol.-% an aldehydstabilisierten Erythrozyten 0,2 bis etwa 1 Gew.-% Blutserumalbumin und zusätzlich noch 5
bis 30 Gew.-°/o eines Zuckers aus der Gruppe Saccharose und Lactose und Mischungen davon
hinzugefügt werden.
Nach diesem Verfahren stabilisierte Erythrozyten weisen eine erhöhte Aktivität und stark verbesserte
Lagerungsstabilität auf. Weiterhin eignen sich diese Erythrozyten für ein Testpräparat für indirekte oder
passive Hämagglutinationsuntersuchung mit sehr überlegener Lagerungsstabilität.
Native Erythrozyten und nach bereits bekannten Verfahren behandelte Erythrozyten, die für direkte
Hämagglutinationsuntersuchung, beispielsweise Blutgruppenbestimmung, brauchbar sind, haben den Nachteil,
daß sie bei der Lagerung schnell verderben, so daß sie für viele Zwecke nach etwa 21 Tagen unbrauchbar
sind. Außerdem sind native Zellen für die Gefrierlagerung nur in speziellen Medien geeignet und sind nach
der Lyophilisierung und Wiederaufbereitung unbefriedigend. Native Erythrozyten sind außerdem empfindlich
im Hinblick auf die Ionenzusammensetzung, den pH-Wert und den osmotischen Druck der Suspendierungsmedien,
so daß unerwünschte Einschränkungen im Hinblick auf den Umfang der Tests bestehen, die mit
ihnen durchgeführt werden können.
Erythrozyten, die mit bekannten Antigenen überzogen sind, sind in anerkannten Präparaten für die
Verwendung als Testmittel für Antikörper enthalten, die im Hinblick auf solche Antigene spezifisch sind. Wenn
ein Antiserum oder ein Serum, das den vermuteten Antikörper enthält, mit den überzogenen Erythrozyten
in Kontakt gebracht wird, tritt Agglutination oder Zusammenballung ein, was anzeigt, daß der vermutete
Antikörper tatsächlich in dem Serum vorhanden ist. Es ist bereits bekannt, daß derartige Agglutination eine
halbquantitative Information hinsichtlich der Anwesenheit und des Auftretens von spezifischen Antikörpern
und auch eine brauchbare Information hinsichtlich der Zustände liefert, die für die Anwesenheit solcher
Antikörper Anlaß geben.
Bei der Herstellung, der Lagerung und dem Gebrauch solcher überzogener Erythrozyten sind viele Probleme
aufgetreten, von denen einige allgemein mit der Stabilität der Erythrozyten unter Lagerungsbedingungen,
mit ihrer Empfindlichkeit in ausgewählten passiven Hämagglutinationstests und mit der Reproduzierbarkeit
solcher Hämagglutinationsuntersuchungen in Zusammenhang stehen. Die einzelnen Erythrozytenzellen
können sich zusammenballen oder nichtspezifische Hämagglutination, das heißt eine Aktivität zeigen, die
die Hämagglutinationsuntersuchung im Hinblick auf einen spezifischen Faktor stört. Überzogene Erythrozyten
werden gewöhnlich in gefrorenem Zustand gelagert, jedoch können beim Auftauen von gefrorenen Präparaten
Zusaminenballungen auftreten, oder die Zellen können durch Hämolyse zerstört werden. Die Aufbewahrung
von gefrorenen Zellen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis ist teuer und hat einen beträchtlichen
Raumbedarf zur Folge. Der Transport ist besonders beschwerlich. Zusätzlich besteht eine Neigung zu einer
gewissen Verschlechterung der Zellen bei sehr ausgedehnter Lagerung.
Bei mikroskopischer Untersuchung der Zellen tut sich eine solche Verschlechterung durch eine Veränderung
der Größe, Gestalt und Ebenheit kund. Die verschlechterten Zellen bilden, wenn sie bei den Hämagglutinationsuntersuchungs-Arbeitsweisen
Verwendung finden, keinen scharf definierten und dichten »Knopf« in der Vertiefung und bewirken leicht, daß der Hämagglutinationstiter
unvorhersehbar von Partie zu Partie des lyophilisierten Produktes schwankt.
Durch verbesserte Lyophilisierung der stabilisierten Erythrozyten werden Probleme, wie sie vorstehend
angegeben wurden, vermieden.
Somit wird ein stabilisiertes Erythrozytpräparat bereitgestellt, das für die Lyophilisierung besonders
geeignet ist. Ferner sind derart hergestellte Erythrozytpräparate, nach der Bereitstellung zur Infusion nicht
lyophilisierten, stabilisierten Erythrozyten-Präparationen äquivalent.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte Erythrozytpräparat, kann während längerer Zeitspannen gelagert
werden, ohne daß sich irgendeine Hämolyse oder Zusammenballung der Blutzellen ergibt. Es kann auch
bei der Hämagglutinationsuntersuchung eingesetzt werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Erythrozytpräparat kann, wie gesagt, wirksam
mit verschiedenen Antigenen überzogen werden, wobei die überzogenen Erythrozyten ein Präparat darstellen,
das wirkungsvoll verpackt und während längerer Zeitspannen, bis es einer speziellen passiven Hämagglutinationsuntersuchung
zugeführt wird, gelagert werden kann.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.
Native Erythrozyten werden im Gesamtblut von verschiedenen Tieren, wie Kaninchen. Ratten. Tauben.
Schafen und Hühnchen, sowie von Menschen, gesammelt. Die Blutprobe wird mit herkömmlichen isotonischen
Antikoagulierungslösungen behandelt, dann werden die Erythrozyten zusammengepreßt, beispielsweise
durch Zentrifugieren, und mit verträglichen Pufferlösungen mit einem im wesentlichen neutralen pH gewaschen,
um Hämolyse der Erythrozyten zu verhindern und unerwünschte Stoffe zu entfernen, die auf den
Erythrozyten aus dem Serum vorliegen können.
Eine Suspension der gewaschenen Erythrozyten wird in der neutralen Pufferlösung in einer geringeren
Konzentration von vorzugsweise unter 10% Vol/Vol hergestellt. Die Erythrozyten werden mit einer kleineren
Menge, bezogen auf das Volumen der Erythrozyten, an Methylglyoxal für eine Zeitspanne behandelt, die
ausreicht, um den Erythrozyten die erwünschte Stabilität zu verleihen, beispielsweise über Nacht unter
Mischen. Im Anschluß an den Behandlungsschritt mit Methylglyoxa! werden die Erythrozyten mehrere Male
gewaschen, um überschüssiges Methylglyoxal und etwaige andere Stoffe zu entfernen, die aus dem Serum
stammen können. Die mit Methylglyoxal behandelten Erythrozyten werden dann einer kleineren Menge,
bezogen auf das Volumen der Erythrozyten, an Formaldehyd ausgesetzt, und der überschüssige Formaldehyd
wird durch mehrere Waschungen mit einer gepufferten Lösung entfernt.
Die vorstehenden Behandlungen mit Methylglyoxal und Formaldehyd können zusammen als »doppelte
Aldehydbehandlung« bezeichnet werden, um ein »stabilisiertes Erythrozytpräparat« zu erhalten, vgl. DT-PS
18 08 435. Es ist bei der vorliegenden Ausgestaltung gemäß Deutschem Patent 18 08 435 wesentlich, daß die
Behandlung mit Methylglyoxal vor der Behandlung mit Formaldehyd stattfindet, da festgestellt worden ist, daß
bei Erythrozyten bestimmter Individuen eine anfängliche Formaldehydbehandlung zu einer Schädigung
solcher Zellen führt, weshalb diese Reihenfolge empfohlen wird. Bei Erythrozyten anderer Individuen
kann jedoch eine anfängliche Formaldehydbehandlung nicht als besonders schädlich erscheinen, weshalb bei
manchen Verfahrensweisen eine anfängliche Formaldehydbehandlung trotzdem zu vorteilhaften Ergebnissen
führen kann.
Wie bereits erwähnt, können erfindungsgemäß stabilisierte Erythrozytpräparate für beträchtliche Zeitspannen
gelagert werden, ohne daß unerwünschte Hämolyse, Zusammenballung oder andere schädliche
Erscheinungen auftreten.
Menschliche Erythrozyten können durch Methylglyoxal/Formaldehyd-Behandlung
stabilisiert werden, ohne daß eine sichtbare Veränderung bei ihrer Fähigkeit auftritt, mit Antisera für die Blutgruppenbestimmung
zu reagieren. Stabilisierte menschliche Zellen vom Typ A, B oder AB werden spezifisch durch Anti-A-
oder Anti-B-Serum agglutiniert. Die Empfindlichkeit der Agglutinationsreaktion unter Verwendung der
stabilisierten Zellen ist der Empfindlichkeit bei Verwendung von nativen Zellen gleich oder um ein Mehrfaches
höher. Stabilisierte Zellen vom Typ 0 reagieren nicht mit Anti-A- oder Anti-B-Serum. Die obigen Reaktivitäten
werden für mehrere Monate beibehalten, wenn die Zellen bei 4°C oder in Gefrierlagerung gelagert werden.
Diese stabilisierten Zellpräparate sind als Bezugszellen für die Blutgruppenbestimmung brauchbar.
Das vorstehend stabilisierte Erythrozytpräparat kann in ein überzogenes stabiles Erythrozytpräparat umgewandelt
werden, indem eine Probe der Aldehyd-behandelten Erythrozyten mit einem Antigen kontaktiert wird
und nachfolgend ein oder mehrere Waschschritte zur Entfernung von überschüssigem Antigen durchgeführt
werden. Im allgemeinen werden die stabilisierten Erythrozyten mit Antigenen in einer Lösung überzogen,
die auf einen pH unter 7 und erwünschtermaßen a'if einen pH von etwa 3,6 bis 6 gepuffert ist. Mit
Polysaccharidantigenen, wie E. coli-Endotoxin, kann das Überziehen bei pH 7 durchgeführt werden. Es ergibt
ίο sich überlegene Sensibilität, wenn die behandelten
Erythrozyten konditioniert werden, indem sie in der gepufferten Lösung vor dem Überziehen mit Antigen
etwa 1 Stunde bewegt werden. Der Überziehungsschritt ist gewöhnlich in etwa 1 Stunde vollständig, jedoch
können manche Überziehvorgänge 24 Stunden erfordern. Eine Überziehungstemperatur von 24° C ist
bevorzugt, Temperaturen von 5O0C oder höher liefern Erythrozytpräparate mit verminderter Empfindlichkeit.
Diese vorstehenden Bedingungen können für ver-
>o schiedene Antigene etwa variieren, der Fachmann kann
jedoch leicht die notwendigen Überziehungsbedingungen unter Berücksichtigung des Auftretens der Agglutination
mit Reihenverdünnungen eines gewählten Antiserums bestimmen. Beispielsweise können einem
>■> Kaninchen verschiedene Mengen an Antigen injiziert
werden, das mit dem Antigen identisch ist, das auf dem Erythrozytpräparat adsorbiert ist. Es wird eine Serumprobe
gesammelt, in der die Antikörper vorliegen, und Reihenverdünnungen dieses Serums können in Plastik-
jo schalen mit V-Boden angesetzt werden, denen ein
gleiches Volumen des stabilen, mit Aldehyd behandelten Erythrozytpräparats zugesetzt wird. Eine Reaktionsmischung,
die Zellen und Verdünnungsmittel enthält, dient als Vergleich, bei dem die Zellen am Boden einen
π »Knopf« bilden, was eine negative Reaktion darstellt. Das Auftreten einer »mattierten Oberfläche« stellt eine
positive Agglutinationsreaktion dar, die befriedigendes Überziehen anzeigt. Nichtspezifische Agglutination
muß sorgfältig unterschieden werden.
in Wenn bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung von einem »Antigen«-Überzug gesprochen
wird, so soll damit ein Material bezeichnet werden, das ein Antikörper oder ein Antigen sein kann, wenn nicht
besonders auf spezielle Antigene oder Antikörper
4-Ί hingewiesen wird.
Zu repräsentativen Antigenen, die erfolgreich zum Überziehen der stabilisierten Erythrozytpräparate verwendet
werden können, gehören Proteinantigene, wie Rinderserumalbumin oder BSA, unlöslich gemachtes
">o BSA, Menschenserumalbumin, Kaninchen-y-Globulin,
Menschen-y-Globulin, Streptokokken-M-Protein, Ambrosiapflanzenantigen
»E« (ragweed antigen »E«), Polysaccharidantigene, wie E. coli-Endotoxin (ET), acetyliertes
ET, succinyliertes ET, entestertes ET, entester-
-)-, tes und bromacetyliertes ET, synthetische Polyglucose,
gemische Antigene, wie RNS-Bakteriophag (Ribonuoleinsäure), QS, Entamoeba histolytica-Antigen und
andere. Es ist ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß das stabilisierte Erythrozytpräparat für
bii das Überziehen mit einer derartigen Vielzahl von
Substanzen mit unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen geeignet ist.
Der Hämagglutinationstiter entweder des stabilisierten oder des überzogenen Erythrozytpräparates kann
iv") dadurch erhöht werden, daß die Temperatur des
Präparates auf etwa -190°C erniedrigt und dann bei einem Temperaturwert, der mehrere Grade unterhalb
der Gefriertemperatur liegt, vorzugsweise bei einem
gleichmäßig eingehaltenen Temperaturwert und bei etwa —20°C während eines Zeitraums von etwa 16
Wochen gehalten wird. Andererseits ergibt sich eine gleichermaßen wirksame Potenzierung auch innerhalb
von etwa 6 Wochen, indem die Temperatur der ■-, stabilisierten oder überzogenen Erythrozyten periodisch
für mehrere Stunden und ohne Bewegung, vorzugsweise in Intervallen von etwa 6 oder 7 Tagen auf
24° C erhöht wird.
Erythrozyten können auch durch Behandlung mit m einer verdünnten Lösung eines Oxidationsmittels
potenziert werden, wobei Natriumperjodat ein geeignetes Reagens ist.
Ein potenziertes, stabilisiertes Erythrozytpräparat kann hergestellt werden, indem dessen Zellen vor dem
Überziehen mit dem Antigen mit Fibrinogen überzogen werden. Rinderfibrinogen ist ein geeignetes Potenzierungsmittel.
Zu diesen Verfahrensmaßnahmen vgl. auch die Ausführungen in DT-PS 18 08 435. Das potenzierte, 2<
> stabilisierte oder überzogene Erythrozytpräparat kann im lyophilisiertem Zustand oder bei einer Temperatur
von etwa -19O0C gelagert werden, bis es für
Hämagglutinationstests benötigt wird. Verbesserte Ergebnisse bei der Herrichtung zur Infusion werden >-,
erzielt, wenn die Zellen in einer wäßrigen Saccharoseoder Lactose-Lösung, die eine geringe Menge Blutserumalbumin
enthält, lyophilisiert werden. Die Zellenmenge in der Lösung ist nicht kritisch und kann von
etwa '/10% bis zu etwa 10% oder mehr des M
Gesamtvolumens des Präparates variieren. Ausgezeichnete Ergebnisse werden bei einer Konzentration
zwischen 0,5% und 5% erzielt; die bevorzugte Konzentration beträgt 1%.
Zur Infusion hergerichtete Erythrozyten von gleich- j-,
mäßig hoher Güte erhält man, wenn die Zuckerkonzentration vor der Lyophilisierung von mehr als 5 Gew.-%
bis zu etwa 30 Gew.-% der Lösung reicht. Gute Ergebnisse erzielt man in einem Konzentrationsbereich
von etwa 10% bis zu etwa 20%, und der bevorzugte Bereich geht von etwa 15% bis zu etwa 20%. Die
Verwendung von Zucker bei einer Konzentration von weniger als 5% bietet nichtsdestoweniger eine gewisse
Verbesserung gegenüber einer Zusammensetzung, in der Zucker abwesend ist. Zuckerkonzentrationen 4-,
oberhalb etwa 30% sind weniger erwünscht, weil übermäßig viel Zeit benötigt wird, um die Erythrozyten
nach der Lyophilisierung zur Infusion herzurichten.
Blutserumalbumin von verschiedenen Tieren ist verwendbar; das von Kaninchen, Hühnern und Rindvieh w
führt zu guten Ergebnissen. Mindestens etwa 0,1 Gew.-% werden verwendet, um die gewünschten
Eigenschaften in den zur Infusion hergerichteten Erythrozyten zu erhalten. Bessere Ergebnisse werden
erzielt, wenn die Zusammensetzung etwa 0,3% enthält, und eine bevorzugte Zusammensetzung enthält 0,5%
Blutserumalbumin. Bis zu 1% können verwendet werden, jedoch wird eine geringere Menge gewöhnlich
bevorzugt, weil das Blutserumalbumin verhältnismäßig teuer ist. Von der vorliegenden Erfindung umfaßt
werden auch die lyophilisierten Erythrozytpräparate, deren Zusammensetzung gemäß der Zusammensetzung
der Suspension, aus der sie herstammen, variiert. Der Zucker und das Blutserumalbumin sind auf Gewichtsbasis
zugegen und erleiden beim Lyophilisieren praktisch keinen Verlust. Die Erythrozytfraktion, die auf Volumenbasis
als wäßrige Suspension mit einer Dichte, die sich eine annähert, vorhanden ist. verliert etwa 85%
ihres Gewichtes, wenn sie lyophilisiert wird. So enthält eine repräsentative Erythrozytsuspsnsion, die aus 0,1%
Zellen, 0,2% Blutserumalbumin und 5% Lactose besteht, nach dem Lyophilisieren etwa 0,3 Gew.-% Zellen, 3,8
Gew.-% Blutserumalbumin und 96 Gew.-% Lactose. In ähnlicher Weise enthält eine Erythrozytsuspension, die
aus 10% Zellen, 1% Blutserumalbumin und 5% Saccharose besteht, nach dem Lyophilisieren etwa 20%
Zellen, 13,3% Blutserumalbumin und 66,5% Saccharose. In gleicher Weise liefern Suspensionen von 10% Zellen
und 1% Blutserumalbumin in 30%iger Zuckerlösung und von 0,1% Zellen und 0,2% Blutserumalbumin in
30%iger Zuckerlösung nach dem Lyophilisieren 4,6% Zellen, 3,1% Blutserumalbumin und 92,3% Zucker bzw.
0,05% Zellen, 0,7% Blutserumalbumin und 99% Zucker.
Die Art und Weise der Durchführung von Hämagglutinationstests ist dem Fachmann geläufig. Im allgemeinen
wird eine Tierserumprobe mit dem vermuteten Antikörper mit dem nichtüberzogenen oder überzogenen
Erythrozyt in einem flüssigen Trägermittel vereinigt, um zu bestimmen, ob eine Agglutination auftritt.
Ebenso können die stabilisierten Erythrozytpräparate mit einem spezifischen Antikörper überzogen werden,
so daß bei nachfolgender Hämagglutinationsuntersuchung die Erythrozyten in Gegenwart eines freien
spezifischen Antigens agglutinieren. Andere Variationen und Modifikationen des Hämagglutinationsuntersuchungsverfahrens
liegen für den Fachmann auf der Hand, und alle derartigen Tests können vorteilhaft mit
den verbesserten stabilen und überzogenen Erythrozytpräparaten durchgeführt werden.
Der passive Hämagglutinationstest kann dazu verwendet werden, die Anwesenheit von y-Globulin auf
den Zellen festzustellen, wie im Coomb Test, für die Entdeckung von bakterieller Infektion, wie in Anwesenheit
von Endotoxinantigen, für die Entdeckung von Virusinfektion, für die Bestimmung der Gewebeverträglichkeit,
für die Entdeckung von Autoimmunitätskrankheiten und von anderen Phänomenen dieses Typs. Die
überzogenen und stabilen Erythrozytpräparate können auch als Testreagens in chemischen Analysen verwendet
werden, um das Vorliegen von Antigen in quantitativer oder halbquantitativer Weise festzustellen.
Die folgenden Beispiele werden gebracht, um die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung zu
zeigen. Obwohl diese Ausführungsformen die besten Methoden einschließen, die zur Zeit für die praktische
Durchführung der Erfindung in Betracht kommen, versteht es sich jedoch, daß sie nicht ausschließliche
Ausführungsformen darstellen. Sie schließen auch nicht notwendigerweise diejenigen Ausführungsformen ein,
die möglicherweise in Zukunft den Vorzug finden werden.
Herstellung eines stabilen, mit Aldehyd
behandelten Erythrozytpräparates
behandelten Erythrozytpräparates
Eine 20-ml-Probe an Gesamtblut wird einem 2 bis 3 kg schweren Kaninchen dutch Herzpunktion entnommen,
und die Probe wird in einer Spritze gesammelt, die ein gleiches Volumen an steriler Alsever-Lösung
enthält. Diese Lösung ist im allgemeinen isotonisch und enthält ein Natriumcitratantikoagulans, Natriumchlorid,
Dextrose und destilliertes Wasser. Die abgezogene Probe wird über Nacht bei etwa 4°C stehen gelassen
und dann mit 1500 Upm 10 Minuten zentrifugiert, wobei
etwa 10 ml zusammengepreßte Kaninchencrvthrozyten
erhalten werden. Die zusammengepreßten Erythrozyten werden dann mit 10 Volumina einer 0,11 molaren
Phosphatpufferlösung mit pH 7,2 vereinigt. Diese gepufferte Lösung wird aus Monokaliumphosphat und
Dinatriumphosphat durch wirbelndes Mischen hergestellt. Die Mischung aus Erythrozyt und Pufferlösung
wird zentrifugiert und dann 5 getrennten Waschvorgängen mit 10 Volumina der oben genannten gepufferten
Lösung unterworfen, um Serumprotein und etwaige andere Serumstoffe zu entfernen. Die gewaschenen
Erythrozyten werden dann wieder in der obenerwähnten gepufferten Lösung suspendiert, um eine Kaninchenerythrozytsuspension
mit 8% Vol/Vol zu erhalten.
In einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben werden 125 ml der mit Phosphat gepufferten Lösung, die 3% Vol/Vol
Methylglyoxal enthält, und 125 ml der vorstehenden 8%igen Erythrozytsuspension eingebracht und die
Mischung wird etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird dann durch ein Gazekissen
filtriert, um etwaige große Stücke zu entfernen, und die Erythrozyten werden dann bei 5 getrennten Gelegenheiten
mit dem lOfachen ihres Volumens an mit Phosphat gepufferter Lösung gewaschen. Das mit
Methylglyoxal behandelte Erythrozytpräparat wird dann wieder in der obenerwähnten gepufferten Lösung
in einer Konzentration von 10% Vol/Vol suspendiert.
125 ml der vorstehenden mit Methylglyoxal behandelten Suspension werden auf 8% verdünnt und mit
125 ml der mit Phosphat gepufferten Lösung gemischt, die 3% Vol/Vol Formaldehyd enthält. Die Mischung
wird über Nacht mit einem Magnetrührer bei Raumtemperatur gerührt und dann durch ein Gazekissen
filtriert, um etwa mögliche Bruchstücke zu entfernen. Die mit Methylglyoxal und Formaldehyd
behandelten Erythrozyten werden dann bei 5 verschiedenen Gelegenheiten mit dem lOfachen ihres Volumens
der vorstehenden gepufferten Lösung gewaschen. Das mit Aldehyd behandelte Erythrozytpräparat wird dann
in einer Konzentration von 10% wieder in der vorstehenden gepufferten Lösung suspendiert und in
Glasbehälter überführt und zur Lagerung verschlossen. Das vorstehende mit Aldehyd behandelte Erythrozytpräparat
ist für mindestens 2 Monate bei verminderten Temperaturen von 4°C oder für unbegrenzte Zeitspannen
stabil, wenn es in flüssigem Stickstoff gefroren ist.
Das stabilisierte Erythrozytpräparat kann potenziert werden, jedoch wird bei dem bevorzugten Verfahren
der Potenzierungsschritt erst durchgeführt, nachdem die Erythrozyten überzogen worden sind.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte stabilisierte Erythrozytpräparat besitzt die
meisten, wenn nicht alle der verbindenden Stellen, die auf dem nativen Erythrozyten vorliegen, wobei mit
verbindenden Stellen speziell die Stellen bezeichnet werden, die mit einem Antikörper oder Virus reagieren
können.
Potenzierung eines stabilisierten
Erythrozytpräparates
Erythrozytpräparates
Dieses Beispiel veranschaulicht die Zunahme des Hütnagglutinalionstitcrs, die erreicht wird, indem
Fibrinogen mit den Zellen des stabilisierten Erythrozytpräparats
verbunden wird. Rindcrfibrinogcn wird bei einer Konzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter in
0,1 molarer mit Acetat gepufferter Lösung mit pH 4,0 Stunde lang auf 60°C erhitzt und dann auf R&umtempe
ratur abgekühlt. Eine 10%ige Suspension der de doppelten Aldehydbehandlung unterworfenen Erythro
-> zyten, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhalte! wird, wird zu der Fibrinogeniösung gegeben und es win
1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Dii potenzierten stabilisierten Erythrozyten werden mi
einer Phosphatpufferlösung mit pH 7,2 gewaschen um
κι die Erythrozytkonzentration wird auf 10% Vol/Vo
eingestellt. Diese Zellen werden später mit hervorra genden Ergebnissen für Blutgruppenbestimmungei
verwendet.
Beispiel 3
Überziehen eines potenzierten stabilisierten
Überziehen eines potenzierten stabilisierten
Erythrozytpräparates
1 ml der 10%igen Suspension des potenziertei stabilisierten Erythrozytpräparates, die nach den
Verfahren von Beispiel 2 erhalten wird, wird mit eine
r> 0,1 molaren Acetatpufferlösung mit pH 4,0 gewaschei
und in 9 ml der Acetatpufferlösung mit 24°C wiede suspendiert. 1 ml der Acetatpufferlösung, die 1 mj
Rinderserumalbumin enthält, wird zugegeben. Dii Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lanj
in gerührt und dann 5mal mit eine Überschuß an mi
Phosphat gepufferter Lösung mit pH 7,2 gewascher Diese Zellen werden später für passive Hämagglutina
tionsreaktionen verwendet.
Überziehen eines stabilisierten
Erythrozytpräparates mit Antigen
Erythrozytpräparates mit Antigen
In ein konisches 12 ml Zentrifugenröhrchen wird be
24°C 1 ml der 10%igen Suspension des mit Aldehy< behandelten Erythrozytpräparats gegeben, die nach dei
Verfahrensschritten von Beispiel 1 erhalten wird. Diesi
4i Probe wird dann mit einer 0,1 molaren Acetatpufferlö
sung mit pH 4,0 gewaschen. Die stabilisierten Erythro zyten werden bei diesem erniedrigten pH-Wert nich
hämolysiert und ballen sich nicht zusammen. Dii gewaschenen Erythrozytpräparatzellen werden in 9 m
■]() der mit Acetat gepufferten Lösung mit pH 4,0 bei 24°C
wieder suspendiert und es wird bei diesem pH und be dieser Temperatur 1 Stunde lang gerührt. Dann wir(
1 ml der Acetatpufferlösung, die 1 mg Rinderserumalbu min enthält, zugegeben. Die Mischung von Antigen un<
v> stabilen mit Aldehyd behandelten Erythrozyten wird be
Raumtemperatur 2 Stunden lang rotieren gelassen um dann 5 getrennten Waschvorgängen mit überschüssiger
Volummengen einer mit Phosphat gepufferten Lösunj mit pH 7,2 unterworfen. Die mit Rinderserumalbumir
w) überzogenen stabilen Erythrozyten werden in den
vorstehenden Phosphatpuffer in einer Konzentrator von 0,5% Vol/Vol wieder suspendiert und es werdet
aliquote Teile dieser Suspension mit 10 ml in 20 m Glaskölbchcn verpackt und verschlossen. Die verpackt!
hi vorbestimmte Menge des überzogenen stabilen mi
Aldehyd behandelten Erythrozytpräparats wird dann ir einer Gcfricrcinrichtung mit flüssigem Stickstoff raset
gefroren und -20°C gelagert.
Beispiel 5 Potenzierung des überzogenen, stabilen Erythrozytpräparats
Behandelte Erythrozyten, die wie in Beispiel 4, jedoch bei einem pH-Wert von 3,6, überzogen und bei — 196°C
gefroren und 6 Tage lang bei -2O0C gelagert worden
sind, werden ohne Bewegen auf Raumtemperatur von 24°C aufgetaut, 2 Stunden bei 24°C gehalten und nach
dem Wiedereinfrieren bei -1960C wieder auf -200C
gebracht. Das Verfahren wird einmal pro Woche 6 Wochen lang wiederholt.
Die potenzierten, überzogenen Erythrozyten werden dann bei — 196°C gefroren und bei dieser Temperatur
gelagert, bis sie für den Hämagglutinationstest benötigt werden. Alternativ kann die Suspension der potenzierten,
überzogenen Zellen lyophilisiert und durch Zugabe von Wasser vor der Verwendung zur Infusion
hergerichtet werden.
Diese Arbeitsweise erhöht den Titer 30fach, wobei der nicht spezifische Hämagglutinationstiter lediglich
verdoppelt wird, was eine praktisch unbedeutende Zunahme darstellt. Weitere wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen
führen zu einer weiteren Erhöhung des Hämagglutinationstiters, rufen jedoch auch eine gleichzeitige
bedeutende Erhöhung des nicht spezifischen Hämagglutinationstiters hervor, so daß aus der
verlängerten Bearbeitung wenig Vorteile gezogen werden.
Die optimale Zahl der Gefrier-Auftau-Zyklen steht in Verbindung mit dem speziellen überzogenen Zellpräparat;
der Fachmann weiß jedoch, daß das Optimum bei demjenigen Zyklus liegt, über den hinaus die Erhöhung
des Hämagglutinationstiters von einer merklichen Erhöhung des nichtspezifischen Hämagglutinationstiters
begleitet ist. Ein überzogenes Zellpräparat, das für das Standardserum optimal ist, ist auch für andere
Antisera als optimal befunden worden. Somit können aufeinanderfolgende Standard-Sera gegen das ursprünglich
gewählte Antiserum standardisiert werden.
Beispiel 6 Potenzieren eines stabilisierten Erythrozytpräparates
Dieses Beispiel veranschaulicht eine weitere Ausführungsform des Potenzierungsmittels der vorliegenden
Erfindung. Human-Erythrozyten werden gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 1 verarbeitet, um stabilisierte
Human-Erythrozyten, suspendiert in einer mit Phosphat gepufferten Lösung (pH 7,2), zu erhalten. Die stabilisierten
Human-Erythrozyten werden dann bei 24°C 15 Minuten lang mit 0,00035 molarer Natriumperjodatlösung
behandelt und dann mittels phosphatgepufferter Lösung (pH 7,2) von diesem Reagens frei gewaschen.
Als die stabilisierten Zellen der direkten Hämagglutinationsreaktion
gegen Ratten-Antiserum unterworfen wurden, ergaben sie bei einer Verdünnung von 1 :100
in eine Reaktion, während die mit der Oxidationsreaktion potenzierten, stabilisierten Zellen Hämagglutination bei
einer Verdünnung von 1 : 2000 zeigten.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Lyophilisierung von Erythrozyten zur Bereitstellung von zur
π Infusion hergerichteten Zellen von hoher Qualität.
Vergleichs versuch
Eine Lösung von stabilisierten Erythrozyten, die mit Rinderserumalbumin (BSA) überzogen und gemäß der
Arbeitsweise des Beispiels 4 hergestellt waren, wurde bei einer Konzentration von 1% in piner 0,11 molaren,
mit Phosphat gepufferten Lösung mit Saccharose und Kaninchenserumalbumin derart suspendiert, daß sich in
der endgültigen Lösung eine Konzentration von 15% bzw. 0,5% ergab. Die Lösung wurde nach Standard-Arbeitsweisen
lyophylisiert und mehrere Tage lang in lyophilisiertem Zustand gelagert. Die lyophilisierten
Erythrozyten wurden dann mit Wasser zur Infusion hergerichtet und bei einer Hämagglutinationsreaktion
gegen Anti-BSA-Serum Nr. 8 verwendet. Die Ergebnisse werden als Versuch b, in Tabelle I zusammen mit den
als Versuch a, bezeichneten Ergebnissen eines Vergleiches gezeigt, der mit nichl-iyophilisierten Zellen
durchgeführt wurde.
Lösungen wurden auch mit verschiedenen anderen Konzentrationen von Saccharose und Lactose für die
Lyophilisierung gemäß der Arbeitsweise des Vergleichsversuches hergestellt. Die Ergebnisse der Hämagglutinationsreaktionen
mit den zur Infusion hergerichteten Erythrozyten «.'erden in der Tabelle 1 als
Versuche c bis k dargestellt. Es ist zu bemerken, daß Zellen, die mit 0,5%igem Kaninchenserumalbumin und
20% Lactose lyophilisiert worden waren, in ihrer Wirkungsweise von Zellen, die nicht lyophilisiert
worden waren, nicht unterschiedbar waren. Der Ersatz der Lactose durch Saccharose in einer Menge von etwa
■in 15 bis etwa 20% führte zu ähnlichen Ergebnissen. Bei
geringfügig niedrigeren Konzentrationen von Zucker und Kaninchenserumalbumin wurde eine Erhöhung des
Hämagglutinationstiters beobachtet; die Wirkungsweise war jedoch trotzdem vortrefflich.
4i Die gemäß dieser Arbeitsweise lyophilisierten Zellen
können zur Infusion hergerichtet und wiederholt ohne nachteilige Wirkungen lyophilisiert werden.
Die wünschenswerten Eigenschaften, welche bei den lyophilisierten und zur Infusion hergerichteten, lyophilisierten
Zellen festgestellt werden, ergeben sich allein aufgrund der Verwendung des Blutserumalbumins in
Kombination mit Lactose oder Saccharose. Ein Präparat, das demjenigen des Versuchs c ähnlich war,
aber kein Blutserumalbumin enthielt, rief einen Häm-
v-, agglutinationstiter von I 280 000 und Kontroll-»Knöpfe«
von schlechter Qualität hervor. In gleicher Weise unbefriedigende Ergebnisse wurden bei Versuchen
aufgezeichnet, bei denen ein ähnliches Präparat wie das des Versuches c, das aber keine Saccharose oder
mi Lactose enthielt, verwendet wurde.
Ein Präparat, das 10% Saccharose und 4% normales Kaninchenserum enthielt, ergab einen Hämagglutinationstiter
von 1280 000 und Kontroll-»Knöpfe« von schlechter Qualität. Es ist daher klar, daß die
hi Anwesenheit von Saccharose oder Lactose zusammen
mit Blutserumalbumin für die erfolgreiche Durchführung der vorliegenden Erfindung kritisch ist.
Lyophilisierte, stabilisierte, mit Rinderserumalbumin überzogene Zellen;
Hämagglutinationstiter gegen Anti-BSA- Serum Nummer 8.
Beispiel | Suspendierungsmedien, enthaltend | Hämagglutinations | Qualität der |
0,11 molaren Phosphatpuffer Plus | titer, Reziprok | Kontroll-»Knöpfe« | |
a | nichtlyophilisiert | 160 000 | ausgezeichnet |
b | 15% Saccharose-0,5% RSA*) | 160 000 | ausgezeichnet |
C | 20% Saccharose-0,5% RSA | 160 000 | ausgezeichnet |
d | 20% Lactose-0,5% RSA | 160 000 | ausgezeichnet |
e | 10% Saccharose-0,5% RSA | 320 000 | ausgezeichnet |
f | 20% Saccharose-0,2% RSA | 320 000 | ausgezeichnet |
g | 10% Lactose-0,5% RSA | 320 000 | ausgezeichnet |
h | 15% Lactose-0,5% RSA | 320 000 | ausgezeichnet |
i | 5% Lactose-0,5% RSA | 640 000 | ausgezeichnet |
k | 10% Saccharose-0,1% RSA | 640 000 | ausgezeichnet |
*) RSA = Kaninchenserumalbumin.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zum Stabilisieren von Erythrozyten durch getrenntes Behandeln von nativen Erythrozyten sowohl mit Methylglyoxal als auch mit Formaldehyd in beliebiger Reihenfolge gemäß Deutschem Patent 1808435, dadurch gekennzeichnet, daß dem wäßrigen, für die Lyophilisierung geeigneten Erythrozytpräparat, enthaltend 0,1 in bis 10 Vol.-°/o an aldehydstabilisierten Erythrozyten, 0,2 bis etwa 1 Gew.-°/o Blutserumalbumin und zusätzlich 5 bis 30 Gew.-% eines Zuckers aus der Gruppe Saccharose und Lactose und Mischungen davon hinzugefügt werden. ι r>
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3105555A1 (de) * | 1980-02-15 | 1981-12-17 | Polypharma Lab | Reagens zum nachweis des rheumatoidfaktors, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung |
Families Citing this family (6)
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EP0356258A3 (de) * | 1988-08-26 | 1990-06-06 | Cryopharm Corporation | Gefriertrocknungsmethode für rote Blutkörperchen und Mittel dafür |
US5059518A (en) * | 1988-10-20 | 1991-10-22 | Coulter Corporation | Stabilized lyophilized mammalian cells and method of making same |
-
1970
- 1970-05-26 DE DE2025718A patent/DE2025718C3/de not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3105555A1 (de) * | 1980-02-15 | 1981-12-17 | Polypharma Lab | Reagens zum nachweis des rheumatoidfaktors, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung |
Also Published As
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8340 | Patent of addition ceased/non-payment of fee of main patent |