DE1907977A1 - Reaktive Teilchen zur Herstellung von unsolubilisierten biologischen Reagenzien - Google Patents
Reaktive Teilchen zur Herstellung von unsolubilisierten biologischen ReagenzienInfo
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Description
biologischen Reagentien
Die Erfindung bezieht sich auf aktive Teilchen, die zur direkten chemischen Anlagerung an biologische Substanzen
fähig sind, und. auf die durch diese Reaktion gebildeten unsolubilisierten
biologischen Reagentien sowie auf Verfahren zur Herstellung derartiger Teilchen und Reagentien. Die erfindungsgemäßen
reaktiven Teilchen und unsolubilisierten biologischen Reagentien besitzen eine gesteuerte Reaktivität bzw,
Teilchengröße.
Bis jetzt fanden zwei allgemeine Typen von Teilchen, an welche biologische Substanzen mindestens temporär angelagert
werden können,'Verwendung. Der erste Typus waren feste Teilchen,
wie Kollodium- oder Latexteilchen und rote Blutkörperchen, die als inerte Teilchen verwendet wurden, an welche aufgrund
ihrer Oberflächeneigenschaften die verschiedensten biologischen Substanzen temporär adsorbiert werden konnten. Es
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zeigte sich jedoch, daß viele "biologische Stoffe an derartigen
inerten Teilchen nicht derart adsorbiert werden konnten, daß sie an der Teilchenoberflache lange genug festgehalten wurden,
um eine entsprechende Verwendung zu ermöglichen. Typisch für den zweiten Teilchentyp waren rote Blutkörperchen, die zunächst
zwecks Stabilisierung gegen lyse mit !Formaldehyd und dann mit
einem chemischen Kupplungsmittel, wie Bisdiazobenzidin, behandelt worden waren. Derartige Teilchen konnten durch Kuppeln
über ein Kupplungsmittel chemisch mit biologischen Substanzen,
umgesetzt werden.
Aufgrund ihrer festgelegten Reaktionsfähigkeit und Größe
sind beide erwähnten Teilchenarten nur von begrenzter Verwendungsfähigkeit. So sind bei dem zweiten Teilchentypus die stabilisierten roten Blutkörperchen von praktisch einheitlicher
Größe und haben alle gleiche Oberflächeneigenschaften,und wenn
diese Oberflächeneisenschafteri durch Zugabe von chemischen
Kupplungsmitteln geändert werden, wird der Oberfläche eine neue chemische Reaktionsfähigkeit erteilt. Außer der Verwendung
von unterschiedlichen Hiefe% chemischen Kupplungsmitteln zeigt
sich kein Weg, auf welchem die Oberflächenreaktivität dieser behandelten Teilchen geändert werden kann, und da die ursprünglichen
chemischen Eigenschaften des Ausgangsteilehens stets " für die Auswahl der chemischen Kupplungsmittel maßgebend sind,,
war in der Vergangenheit für derartige Teilchen nur ein sehr enger Reaktivitätsbereich möglich.
Eine weitere Einschränkung ergab sich daraus, daß die Größe und infolgedessen das Gewicht der Teilchen nicht geändert
werden kann. Einige Teilchen, insbesondere rote Blutkörperchen, sind so klein, daß für ihre Sedimentierung bei gewissen
immunologischen Versuchen sehr lange Zeiten notwendig
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sind. Der Fachmann weiß, daß derartige Versuche 1 bis 2 Stunden
lang beobachtet werden müssen, um zu entscheiden, ob eine Agglutination eingetreten ist oder nicht. Diese Versuchszeiten
könnten wesentlich verringert werden, wenn Teilchen von größerem Umfang verfügbar wären.
Die Erfindung hat sich daher zum Ziel gesetzt, zur unmittelbaren chemischen Anlagerung an biologische Substanzen
fähige reaktive Teilchen zur. Verfügung zu stellen, die wesentlich
größer sind als die bisher bekannten und dabei eine variable Reaktionsfähigkeit aufweisen.
Ferner können erfindungsgemäß unsolubilisierte biologische Reagentien hergestellt werden, die größer und schwerer
sind als die bisher verfügbaren.
Die beiden wichtigsten Verwendungszwecke für unsolubilisierbare biologische Reagentien in Teilchenform ist die Durchführung
von immunologischen Versuchen und von enzymatischen Umsetzungen und Verfahren. Bei dem ersteren Anwendungszweck
muß die Reaktionsfähigkeit und die Größe der Teilchen, an welche die biologischen Stoffe angelagert werden, sorgfältig gesteuert
werden. Da sehr große Teilchen nicht agglutinierungsfähig sind, wie dies für immunologische Versuche Voraussetzung
ist, können nicht von vornherein besonders große Teilchen verwendet werden. Derartige Teilchen würden sich vielmehr sofort
absetzen, da di-e Teilchengröße und das Teilchengewicht die recht schwachen Agglutinierungskräfte überwinden würden. Um
für die enzymatischen Umsetzungsprozesse verwendbar zu sein, müssen die Teilchen des Reagens so groß sein, daß sie filtrierbar
sind, um zu verhindern, daß die Enzyme aus einer Stufe des Verfahrens in eine spätere Stufe, in welcher ihre Anwesenheit
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nicht erwünscht ist, mitgenommen werden. In diesem Falle sind
daher größere Teilchen notwendige
Dank der Erfindung verfügt man nun über ein Verfahren, mit
dessen Hilfe ursprünglich kleine Teilchen, wie rote Blutkörperchen,
Mikrobenzelien und mit Gelatine überzogene inerte Teilchen als Trägerteilchen verwendet werden können, auf welche
über chemische Kupplungsmittel ein oder mehrere Überzüge eines eiweißartigen Stoffes mit Hilfe einer Kovalenzbindung aufge-Φ
bracht werden können. Auf das Trägerteilchen können mehrere derartige Überzüge aufgebracht werden, so daß zum Schluß seine
Größe und sein Gewicht wesentlich größer ist als. bei dem ursprünglichen Teilchen. Mit Hilfe dieser Methode ist eine bessere
Kontrolle über die zum Kuppeln von zwei biologischen Stoffen verfügbare Reaktivität und über die Teilchengröße zu erreichen.
Der größere Umfang ist deshalb zweckmäßig, weil beispielsweise die Sedimentationszeit für Trägerteilchen, wie
E. coli, von 12 bis 18 Stunden, die benötigt werden^, wenn kein
Überzug vorhanden ist, auf 6 bis 8 Stunden verringert werden kann.
Bei der Herstellung der reaktiven Teilchen werden zunächst " Trägerteilchen mit eiweißartiger Außenfläche in ein flüssiges
Medium eingebracht, worauf dann mindestens ein-eiweißartiges
Material unter Verwendung eines ersten chemischen Kupplungsein
mittels an diese Teilchen gekuppelt wird, so daß sich/einheitlicher
Überzug auf den Trägerteilchen ausbildet. An die Außenfläche der auf diese Weise einheitlich überzogenen Teilchen
wird dann ein zweites chemisches Kupplungsmittel angelagert, das ungebundene, freie reaktionsfähige Gruppen bereitstellt,
die zu einer Reaktion mit biologischen Substanzen durch Ausbildung einer Kovalenzbindung fähig sind.
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Um mit Hilfe eines derartigen reaktionsfähigen Teilchens
ein unsolubilisiertes biologisches Reagens herzustellen, braucht^man nur eine biologische Substanz in einem flüssigen
Medium mit den reaktiven Teilchen zu vermischen. Die an der Außenseite der Teilchen vorhandenen freien reaktionsfähigen
Gruppen reagieren mit der biologischen Substanz und halten diese unter Ausbildung von Kovalenzbindunsen an der Oberfläche
fest. Wie bereits erwähnt, können mehrere Überzüge aus eiweißartigem Material verwendet werden, um die Teilchengröße entsprechend
einzustellen.
Mit den erfindungsgemäßen Teilchen können die verschiedensten biologischen Stoffe gekuppelt werden, jedoch erhält
man die am besten verwendungsfähigen biologischen Reagentien mit Substanzen, die eine Antigenwirkung aufweisen. Derartige
Substanzen sind Antigene und Haptene mit immunologischen Eigenschaften sowie Enzyme mit enzymatischen Eigenschaften. Im
folgenden werden diese Stoffe ganz allgemein als "Substanzen mit Antigenwirkung" bezeichnet.
Auf jeder Stufe des oben beschriebenen Verfahrens können die Kupplungsmittel und die Eiweißstoffe derart gewählt werden,
daß der Außenfläche der Teilchen in jedem gegebenen Stadium die gewünschte Reaktivität verliehen wird.
Weitere Vorteile der Erfindung bestehen darin, daß auf allen Stufen durch die Eiweißstoffe .reaktionsfähige Gruppen
verfügbar gemacht werden. Diese einheitliche Reaktivität ist möglich, weil die an der Oberfläche von Trägerteilchen, wie
roten Blutkörperchen oder Mikrobenzellen, von Natur aus vorhandenen
reaktiven Gruppen inaktiviert werden, wenn die betreffenden Teilchen mit dem Eiweißstoff überzogen werden. Ein
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weiterer Vorteil besteht darin, daß, da die verschiedensten Eiweißstoffe als Überzug dienen können, hoch reaktive Kupplungsmittel
verwendet werden können, ohne daß Gefahr besteht, daß die Zellwände des Trägerteilchens, falls das Teilchen von
zellularer Natur ist, brechen, denn die Kupplungsmittel kommen mit den-Zellenoberflächen nicht in Berührung. Schließlich hat
man noch den weiteren Vorteil, daß jedem der Überzüge ein Farbstoff oder eine Beize zugefügt werden kann, so daß die
Reagensteilchen besser zu sehen sind.
Bei Verwendung von Mikrobenζeilen und roten Blutkörperchen
als Trägerteilchen ist es manchmal vorteilhaft, sämtliche von Natur aus vorhandenen Antigenstellen auszuschalten» Dies
gilt insbesondere für Mikrobenzellen als Trägerteilchen. Ebenfalls gilt es bei der Untersuchung von biologischen "Flüssigkeiten
auf die Anwesenheit von immunologischen Stoffen, worin Antikörper zu den antigenen Gruppen auf den Trägerteilchen anwesend
sein können, welche eine nicht spezifische Agglutinierung verursachen und daher zu JäLschen Testresultaten führen
könnten, wenn die antigenen Stellen nicht überdeckt wären. So können das N-Antigen von roten Blutkörperchen aus dem Schaf-,
Pferde- und Rinderblut, das Forssman-Antigen von Blutkörperchen aus dem Schafsblut und das A-, B- und AB-Antigen der
menschlichen roten Blutkörperchen sämtliche mit Hilfe des eiweißhaltigen Überzuges abgedeckt werden.
Die Trägerteilchen können rote Blutkörperchen, Mikröbenzellen,
mit Gelatine überzogene Teilchen oder Gemische aus den erwähnten Stoffen sein. Die roten Blutkörperchen als Trägerteilchen
können von den verschiedensten Tieren stammen. Beispiele für verwendbare rote Blutkörperchen sind diejenigen,
die man aus den folgenden Tieren erhält: Opossum, Ratte, Kanin-
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chen, Meerschweinchen, Ziege, Pferd, Schaf, Alligator, Schildkröte
und schließlich Mensch. Die roten Blutkörperchen werden dadurch gewonnen, daß man dem betreffenden Tier Blut abzapft
und die roten Blutkörperchen durch Zentrifugieren vom Plasma trennt·. Die Körperchen werden dann in physiologischer Salzlösung
aufbewahrt, bis sie mit dem ersten Kupplungsmittel umgesetzt werden.
Die erfindungsgemäß als Trägerteilchen verwendbaren Mikrobenzellen
können ein beliebiger selbstreproduzierender Mikroorganismus sein, dessen Portpflanzung nicht unbedingt von anderen
Organismen abhängig sein muß. Sowohl grampositive als gramnegative Bakterienzellen können verwendet werden. Auch
Funguszellen und Protozoenzellen, ebenso wie Virenteilchen, können verwendet werden. Es handelt sich dabei im allgemeinen
um einzellige Organismen, die gelegentlich zu Klumpen oder Aggregaten vereinigt sind. Die Zellen können in dieser Form
verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie nicht aufgrund ihrer Aggregatgröße ein Trägerteilchen darstellen, das so groß ist,
daß das damit gebildete Testsystem in Anwesenheit einer Substanz, die der an die aggregierten Zellen gebundenen Antigensubstanz
homolog ist, agglutiniert. Bevorzugt als Mikrobenzellen sind im allgemeinen Bakterienzellen oder ihre Aggregate,
die von gleichmäßiger Form und Größe sind und eine maximale Ausdehnung in einer Richtung von etwa 0,2 bis 10 /U haben.
Auch eine Mischung aus verschiedenen, jedoch gleichförmigen Zellen kann verwendet werden, jedoch ist dies nicht die bevorzugte
Arbeitsweise. Unter diesen Bakterien sind die verwendbaren Mikrobenzellen unter anderem diejenigen von Teil I des
Pflanzensystems einschließlich der Klassen I, II und III, Ord-
und nung I. Die Mikrobenzellen entsprechen Klasse HI, Ordnung I/
schließen die intrazellularen Virenteilchen ein, die eine maximale Ausdehnung von etwa 0,2 /U haben.
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Für eine komplette Liste von verwendbaren Bakterienzellen sei verwiesen auf Bergey's Manual Of Determinative Bacteriology
von R.S. Breed, E.G.D. Murray, U.R. Smith, 7. Auflage,
194-7» Verlag Williams and Wilkins Company. Besonders gut verwenden
lassen sich Bakterien der Klasse II, Unterordnung II, Familie IV (Pseudomonadaceen) und Klasse II, Ordnung IV, Familie
IV (Enterobacteriaceen). Sämtliche Stämme I - V können als bevorzugte Mikrobenzellen zur erfindungsgemäßen Verwendung
angesehen werden. Ebenso sind die zu Klasse II, Ordnung IV, Familie V (Brucellaceen), X·(Lactobacillaceen) und XIII
(Bacillaceen) gehörenden Mikrobenzellen bevorzugt. Will man kleinere Teilchengrößen, wie etwa 0,2 ax und darunter haben,
so kann man Organismen aus Ordnung I und II der Klasse III verwenden. Insbesondere die Virales der Ordnung II sind sehr klein ,
was jedoch ihre Verwendungsfähigkeit einschränkt.
.Eine für Zwecke der Erfindung bevorzugte Bakterienzelle
ist Escherichia coli. Eine andere, ebenfalls besonders bevorzugte Mikrobenzelle ist die leicht verfügbare Hefe, Saccharomyces
cerevisiae. Die Hefewachstumsphasen der Funguszellen sind ebenfalls bevorzugt als Trägerteilchen.
Andere besonders gut verwendbare Mikrobenzellen sind Bacillus subtilis, Lactobacillus leich'mannii, Bacillus pumilus
und Pseudomonus fragi.
Diese Mikrobenzellen können erhalten werden durch Züchten einer Ausgangskultur der betreffenden Zellen in einem
Nährmedium. Wenn die Zellen ihr maximales Wachstum erreicht haben, werden sie geerntet. .
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Die Trägerteilchen mit eiweißhaltiger Oberfläche können
dadurch gebildet werden, daß man unlösliche Teilchen mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 10/U mit Gelatine, einem eiweiß-
/ jnan
haltigen Material, überzieht, wozu^eine Technik, wie Coacer-
haltigen Material, überzieht, wozu^eine Technik, wie Coacer-
vierungs-Überziehen oder Einkapseln, anwendet. So kann man beispielsweise Polystyrolteilchen, wie die in der US-Patentschrift
3 234 096 beschriebenen, dadurch einkapseln, daß man
sie in Gelatinelösung emulgiert und die Emulsion dann sprühtrocknet. An der Oberfläche der Teilchen muß nur ein dünner
G-elatinefilm abgelagert werden, mit dem dann die Kupplungsmittel
umgesetzt werden. Man kann die Trägerteilchen auch ganz aus Gelatine, zusammen mit entsprechenden Vernetzungsmitteln,
wie einem solubilisierten Polyacrolein, herstellen.
Die entweder in der ersten oder in der zweiten Stufe zum chemischen Kuppeln erfindungsgemäß zu verwendenden Kupplungsmittel
sind., allgemein gesprochen, Verbindungen mit zwei oder mehr der folgenden reaktiven Gruppen: Azo-, Sulfonsäure- oder
mit Nitrogruppen aktivierte Fluorgruppen, Azid-, Imin- und reaktive Chlorgruppen, gebunden an einen Ring mit guten Resonanzstrukturen.
Diese reaktiven Gruppen reagieren mit primären Aminogruppen, SuIf hydryl-(Mercapto )_-gruppen, Carboxylgruppen
und Hydroxylgruppen in den die Oberfläche der Trägerteilchen darstellenden Stoffen und den eiweißhaltigen Stoffen
sowie mi't den biologischen Substanzen, die mit den reaktiven
Teilchen gekuppelt werden sollen.
Eine repräsentative Aufzählung derartiger Kupplungsmittel
ist die folgende: Bisdiazobenzidin, Bisdiazobenzidindisulfonsäure,
Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, Difluordinitrodiphenylsulfon,
ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanursäurechlorid, Dichlor-s-triazin, lT-t-Butyl-5-methyl~
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isoxazoliumperchlorat, ein Dialdehyd, ein J. ,ß-ungesättigter
'Aldehyd und Gemische daraus. Einige dieser Kupplungsmittel,
insbesondere die Cyanuratverbindungen, die Dialdehyde und die o£ ,ß-ungesättigten Aldehyde, schützen die roten Blutkörper-.
chen und die Mikrobenzellen gleichzeitig mit ihrer Kupplungswirkung auf andere Gruppen an der Zellenoberfläche, so daß
diese Zellen dann gegen Lyse stabilisiert sind. Y/erden daher derartige Kupplungsmittel verwendet, so ist eine getrennte
Stabilisierungs- oder Konservierungsbehandlung überflüssig. Vor Anwendung des R-t-Butyl-5-iaethylisoxazoliumperehlorates
muß die Oberfläche, auf die es gekuppelt werden soll, mit φ einem Succinylierungsreagens, wie Bernsteinsäureanhydrid, behandelt
werden.
Als Carbodiimide können u.a. die folgenden verwendet werden: N,N'-Dicyelohexycarbodiimid; 1-Äthyl-3(3-dimethyIaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid
und 1-Cyclohexyl-3(2-morpholinyl-(4)-äthylcarbodiimid)metho-p-toluolsulfonat.
Ein spezifisches Difluordinitrobenzol, das verwendet werden kann, ist das 1,3-Difluor—4-,6-dinitrobenzol und ein spezifisches Difluordinitrodiphenylsulfon
ist das pjp'-Difluor-m.m'-dinitrodiphenylsulfon.
kann Das Beschichtungsmaterial für die Trägerteilchen/ein
" beliebiger eiweißhaltiger Stoff sein, z.B. ein Serum-Albumin
oder Globulin, erhalten von verschiedenen Tierarten, oder es kann auch ein anderer einheitlicher Stoff sein, wie ein Myoglobin
oder Hämoglobin. Besonders bevorzugt ist Rinderserum-Öllbumin,
das auch leicht verfügbar ist. Andere Stoffe, wie Ovalbumin, o^-ß- und «^-Globuline oder ß-^-Lipoprotein und Thyroglobulin
können ebenfalls verwendet werden. Im allgemeinen ■ ist es notwendig, daß das zu verwendende Überzugsmaterial so
homogen ist, daß man bei seiner Verwendung eine einheitliche Oberfläche erhält. Die oben genannten Stoffe entsprechen die-
• ser Anforderung.
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Als "biologische Substanzen, welche mit den erfindungsgemäßen
reaktiven Teilchen zu unsolubilisierten biologischen Reagentien umgesetzt werden können, kann eine große Zahl von
Stoffen mit antigener Wirksamkeit dienen (s. oben). So können beispielsweise die verschiedensten Antigene mit immunologischen
Eigenschaften als Überzugsstoffe verwendet werden und außer -den oben bereits angeführten seien die folgenden erwähnt:
menschliches Serumalbumin, menschliches chorionisches Gonadotropin (HCG-); Antigene der Blutgruppen A und B, c^-Globuline
der menschlichen Plasmafraktion; ^-Globuline von verschiedenen Tierarten; menschliches Transferrin; Trichinellaantigen
und ähnliche antigene Stoffe von entweder pathogenen oder natürlichen Organismen; Leutinisierungshormone; Insulin und von.
Tuberculin -a- gereinigte Proteinderivate.
Eine andere Klasse von antigenwirksamen Stoffen, die an die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen gekuppelt sein können,
sind Enzyme, wie Diastase, Maltase, Zymase, Amylase und andere Enzyme. Wenn ein Enzym an ein Trägerteilchen gekuppelt ■
ist, kann es vorzugsweise zur Durchführung von enzymatischen Umwandlungsprozessen verwendet werden. So können die ersten
drei der oben angeführten Enzyme in einem dreistufigen Verfahren für die Umwandlung von Stärke in Alkohol verwendet werden,
und. das letzte der angeführten Enzyme kann dazu dienen, eine Stärkeaufschwemmung in einen Zuckersirup zu überführen.
Der Vorteil bei der Anwendung der Enzyme in unsolubilisierter Form durch das erfindunssgemäße Kuppeln an reaktive Teilchen
besteht darin, daß die Enzyme mit dem aufzuarbeitenden Material nicht vermischt werden. Die Teilchen werden in einer festgelegten
Stellung zurückgehalten oder sie werden in eine Schicht eingebettet, durch welche das umzusetzende Material durchläuft.
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Als weiteres Beispiel für eine enz'ymatische Umwandlung sei die Überführung von Schwarzlauge-Molassen in Alkohol genannt,
wobei an die erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen sowohl Invertase als Zymase gekuppelt werden, worauf die Molasse
darüberläuft. ·
Mit Hilfe der Erfindung kann man außerdem mehrere dieser verschiedenen antigenaktiven Substanzen gleichzeitig an die
Außenseite kuppeln, um Reagensteilchen mit mehrfacher Reaktivität herzustellen. So wurden beispielsweise menschliches-
und Rinder-^-Globulin gleichzeitig dazu benutzt, Reagensteilchen herzustellen, die dazu verwendet werden können, in biologischen
Proben beide Substanzen durch Verhinderung des Agglutinationstestes zu bestimmen. Auch Rinderserumalbumin,'
menschliches !^--Globulin und Rinder-^-Globulin wurden verwendet,
um dem erfindungsgemäß hergestellten unsolubilisierten , biologischen Reagens gleichzeitig mehrfache Reaktivität zu
verleihen.
Antikörper für diese verschiedenen Stoffe sind y~-Globulinmoleküle,
die derart modifiziert sind, daß sie Antigenrezeptor-stellen
für die Antigene aufweisen, deren immunologische Gegenstücke sie darstellen; aus diesem Grunde kann die Anwesenheit
von Antikörpern durch ihre Reaktion mit entweder ihrem entsprechenden Antigen oder· dem Antikörper zu dem ^-Globulin,
aus dem sie gebildet sind, nachgewiesen werden. Die hier erwähnten antigenen immunologischen Stoffe sind Stoffe, die,
wenn sie in das' Kreislaufsystem eines Tieres eingeführt werden,
Antikörper produzieren, die für diesen bestimmten antigenen Stoff spezifisch sind. Derartige antigene Stoffe sind
u.a. Serumprotein, wie /■-Globulin und Serumalbumin,oder Blutgruppensubstanzen
"A" und "B", von denen ein Test für die Blutgruppenermittlung gemacht werden kann,und ebenso die anderen
oben erwähnten Antigene.
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Der Ausdruck "immunologisches Gegenstück", wie er oben verwendet wurde, bezeichnet entweder ein Antigen oder einen
Antikörper, der spezifisch mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen reagiert.
Wie bereits erwähnt, können die reaktiven Teilchen mit einem Farbstoff oder Lack versehen werden, um die visuelle
Unterscheidung zu erleichtern, die das zum Schluß erhaltene unsolubilisierte biologische Reagens von dem Hintergrund abhebt.
Farbstoffe wie Hämatoxylin, Fuchsin und Kristallviolett
können für diesen Zweck verwendet werden. Eine andere zweckmäßige Vorbereitung für die Mikrobenzellen besteht darin, daß
man sie mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, A'ther oder dgl., wäscht, um etwa vorhandene Polysaccharid- oder
Wachsschichten zu entfernen, welche die Reaktion zwischen den Trägerteilchen und den Kupplungsmitteln stören könnten."
Die erfindungsgemäßen unsolubilisierten biologischen Rea-
gentien können als immunologische Indikatorteilchen verwendet
man
werden, indem/die reaktiven Teilchen mit spezifischen antigen-
werden, indem/die reaktiven Teilchen mit spezifischen antigen-
aktiven Substanzen umsetzt. Wenn das immunologische Gegenstück
die
zu dem an /.reaktiven Teilchen gekuppelten Stoff unmittelbar durch Verwendung der immunologischen Indikatorteilchen bestimmt werden soll, kann man den Versuch als direkten Agglutinationstest bezeichnen, der so durchgeführt wird, daß man die Indikatorteilchen mit einer Probe der Flüssigkeit vermischt, in der das immunologische Gegenstück vermutet wird und beobachtet, ob eine'Agglutinierung stattfindet. Das Auftreten einer Agglutinierung bedeutet dann die Anwesenheit des Stoffes, auf den getesbet wird, während bei seiner Abwesenheit keine Agglutinierung eintritt. Die Agglutinierungsversuche können durchgeführt werden durch Kuppeln eines Antigens an die er-
zu dem an /.reaktiven Teilchen gekuppelten Stoff unmittelbar durch Verwendung der immunologischen Indikatorteilchen bestimmt werden soll, kann man den Versuch als direkten Agglutinationstest bezeichnen, der so durchgeführt wird, daß man die Indikatorteilchen mit einer Probe der Flüssigkeit vermischt, in der das immunologische Gegenstück vermutet wird und beobachtet, ob eine'Agglutinierung stattfindet. Das Auftreten einer Agglutinierung bedeutet dann die Anwesenheit des Stoffes, auf den getesbet wird, während bei seiner Abwesenheit keine Agglutinierung eintritt. Die Agglutinierungsversuche können durchgeführt werden durch Kuppeln eines Antigens an die er-
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findungsgemäßen reaktiven .Teilchen, die dann unmittelbar verwendet
werden für den Test auf die Anwesenheit des immunologischen Gegenstückes in der gleichen Flüssigkeit.
Die gleichen Indikatorteilchen können auch verwend.et werden
zum Nachweis eines Stoffes mit einer reaktiven Stelle entsprechend dem an die reaktiven Teilchen angegliederten immunologischen
Material; man testet in diesem Pail auf die Verhinderung einer Agglutinierung. Soll beispielsweise auf ein Antigen
getestet- werden, so setzt man eine gewisse Menge des diesem
Antigen entsprechenden Antikörpers dem Testmedium zu und zwar vor oder gleichzeitig mit den Indikatorteilchen, die in diesem
Falle aus an das betreffende Antigen gekuppelten reaktiven Teilchen bestehen. Enthält die untersuchte Flüssigkeit das
Antigen, so'reagiert dieses mit dem vorher oder gleichzeitig
zugesetzten Antikörper, so daß der Antikörper daran verhindert wird, mit dem Indikatorsystem zu agglutinieren. Die Agglutinierung,
die sonst eintreten würde, ist also bei Anwesenheit eines Antigens verhindert und die biologischen Reagentien bilden
eine Sedimentation in dem Versuchsgefäß.
Der AgglutinieruBgsteat bzw«, der'Test zur Verhinderung
der Agglutinierung kann mit den entsprechenden Indikatorteilchen durchgeführt werden, um die Anwesenheit entweder eines
Antikörpers oder eines Antigens in Flüssigkeitsproben nachzuweisen, d.h. die erfindungsgemäßen Indikatorteilchen können
sowohl zum Nachweis von Antigenen als von Antikörpern verwendet werden.
Der Agglutinierungstest und der Test, der auf.der Verhinderung
der Agglutinierung beruht, können normalerweise auf zweierlei Art durchgeführt werden. Die eine Methode ist bekannt
als "Glasstreifen-Agglutinierungsmethode" und die andere
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als "Mikrotitrator-Agglutinierungsmethode". Die erstere besteht
darin, daß man die Testreagentien und die Flüssigkeitsprobe auf einer ebenen Glasfläche vermischt und wird im allgemeinen nur
auf qualitativer Basis durchgeführt, um eine vorbestimmte Konzentration des Stoffes, auf den getestet wird, nachzuweisen.
Die letztere Methode wird so durchgeführt, daß man die Testreagentien für jeden Test in eine Reihe von flachen Vertiefungen
in der Oberfläche einer Platte aus Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material einbringt. Die lineare Anordnung
der Vertiefungen erlaubt eine reihenweise Verdünnung des für den betreffenden Agglutinierungs- bzw. Agglutinierungsverhinderungstest
angewendeten Antikörper.^» Diese reihenweise Verdünnung
wird so durchgeführt, daß man zuerst einen Tropfen eines Verdünnungsmittels in jede der Vertiefungen in der Reihe einbringt,
worauf man dann der ersten Vertiefung einen Tropfen einer Antikörperlösung mit einer ursprünglichen Verdünnung von
z.B. 1:5 zufügt, wozu man eine Schlinge oder eine kalibrierte Spirale verwendet, die genau einen Tropfen Flüssigkeit hält.
Nach dem Vermischen entnimmt man der ersten Vertiefung einen Tropfen Flussigkeii/imd vermischt sie mit dem Verdünnungsmittel
in der zweiten Vertiefung. Die Verdünnung in der ersten Vertiefung ist dann 1:10, diejenige in der zweiten Vertiefung
1:20. Dieser Prozeß der immer weitergehenden Verdünnung wird wiederholt, bis sämtliche Vertiefungen in der Reihe behandelt
sind, so daß man eine fortlaufende Reihe von Antikörperverdünnungen erhält, von denen die nachfolgende stets die Hälfte
des in der vorangehenden enthaltenen Materials enthält. Für den Agglutinierungstest bringt man nach Herstellung dsx reihenweisen
Verdünnungen in.jede Vertiefung einen Tropfen einer Suspension von erfindungsgemäßen Indikatorteilchen ein. Soll auf
Verhinderung der Agglutinierung getestet werden, so bringt man in jede Vertiefung eine gewisse Menge an ungebundenem Antigen
ein, die im allgemeinen einen Überschuß über die anwesende Men—
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ge an Antikörper darstellt und fügt erst dann das unsolubilisierte
"biologische Reagens zu. Sollen Proben von Körperflüssigkeiten getestet werden, so werden diese als das Antigen zugegeben,
und die reihenweisen Verdünnungen des Antikörpers werden so eingestellt, daß die Konzentration an Antikörper, die der
erwarteten Konzentration an nachzuweisendem Antigen etwa entspricht, im Mittelteil der Verdünnungsrreihe liegt. Dieses Vorgehen
gestattet eine Feststellung des Titers des Antigens in der Körperflüssigkeit und insofern eine halbquantitative Bestimmung
des Antigens.
Herstellung der erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen reaktiven Teilchen und der unsolubilisierten biologischen Reagentien
umfaßt verschiedene Reaktionsstufen, die vorzugsweise alle
bei Raumtemperatur in einem gepufferten flüssigen Medium durchgeführt werden. Die Trägerteilchen werden in dem flüssigen
Medium derart dispergiert, daß die Suspension eine Konzentration von 1 bis 10 $ hat. Die Träeerteilchen werden dann bei
Raumtemperatur (20 bis 25 C) so lange mit dem "ersten Kupplungsmittel
umgesetzt, daß eine Reaktion stattfindet, was gewöhnlich in weniger als 1 Stunde· der Fall ist. D.ie so behandelten Trägerteilchen
werden dann mit dem ersten Überzugsmaterial versehen, indem^'dieses Material einem flüssigen Medium zusetzt, in welchem
die wie oben vorbehandelten reaktiven.Teilchen suspendiert sind. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur durchgeführt und
dauert weniger als 1 Stunde. Diese beiden Stufen, das Umsetzen mit einem Kupplungsmittel und dann mit dem Überzugsmaterial,
können mit Erfolg beliebig oft wiederholt werden, um Teilchen von bestimmter Größe und bestimmtem Gewicht herzustellen, wie
sie für einen speziellen Anwendungszweck geeignet sind. 7/enn die gewünschte Größe und das gewünschte Gewicht erreicht sind,
können die Teilchen reaktiv gemacht werden, indem man sie mit
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einem zweiten Kupplungsmittel behandelt, was auf die oben für das erste Kupplungsmittel beschriebene Weise geschehen kann,
worauf die Teilchen dann unmittelbar mit einer der oben erwähnten^biologischen
Substanzen umgesetzt werden können.Die Umsetzung mit der betreffenden biologischen Substanz wird ebenfalls
bei Raumtemperatur im flüssigen Medium durchgeführt.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Kupplungsmittel sind
im allgemeinen reaktionsfähig genug, um die notwendige Kupplungszeit
bei Raumtemperatur auf 10 bis 3O-Minuten herabzusetzen.
Bevorzugte Durchfüh'rungsform.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Trägerteilchen sind Mikrobenzellen,
da sie mit Hilfe von bekannten Kulturverfahren leicht erhältlich sind. Unter den Kupplungsmitteln kann keines
als besonders bevorzugt bezeichnet werden, jedoch kann -Bi3-diazobenzidin
(BDB) im Zusammenwirken mit allen hier erwähnten Überzugsstoffen und biologischen Substanzen verwendet werden.
Das bevorzugte eiweißartige Material zur Bildung des Überzuges über die Trägerteilchen ist Rinderserumalbumin.
Die bevorzugten reaktiven Teilchen erhält man dann so, daß man Mikrobenzellen mit nicht-pathogenen Eigenschaften, wie
E. coli, züchtet, die Zellen .isoliert und sie bei Raumtemperatur
in einem flüssigen Medium mit BDB umsetzt. Die behandelten Trägerteilchen können dann mit Rinderserumalbumin (BSA) überzogen
werden, indem man sie in einem flüssigen Medium bei Raumtemperatur etwa 15 Minuten damit behandelt.
Die überzogenen Trägerteilchen können dann durch neuerliches Aufbringen von BDB wieder reaktiv gemacht werden. Die
so hergestellten reaktiven Teilchen können unmittelbar mit
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.einer der oben erwähnten biologischen Substanzen zu immunologischen
Indikatorteilchen oder enzymatisch en Umsetzungsreagen·»
tien umgesetzt werden.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung«, Mit dem Ausdruck "Salzlösung." ist
eine physiologische Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,85 i° bezeichnet.
Beispiel 1 '
10 ml einer 2,5 $igen Suspension von formalinisierten
E. coli-Zellen wurden dreimal in Salzlösung gewaschen. Nach der
letzten Zentrifugierung wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen und 0,25 ml der dichtgepackten Zellen in 6 ml Phosphatpuffer, pH 7,33» suspendiert. Dann wurden 5 ml Rinderserumalbumin
(BSA) in Salzlösung (40 mg/5 ml) zugefügt. Zu der Sus-.pension wurden 20 ml Bisdiazobenzidin, Verdünnung 1:5, in Phosphatpuffer
und Salzlösung, pH 7,3» zugegeben und das Gemisch 20 min bei Raumtemperatur im rotierenden Schüttelgerät behandelt.
Die Zellen nahmen während dieser Zeit eine bräunliche Färbung an. Der Ansatz wurde dann zentrifugiert und in einer
Salzlösung mit 0,6 <fo BSA resuspendiert, worauf man das ganze
nochmals'15 min bei Raumtemperatur reagieren ließ. Nach dreimaligem
Waschen mit Salzlösung wurden die überzogenen Trägerteilchen gelagert.
Die gemäß Beispiel 1 überzogenen Trägerteilchen wurden mit Hilfe eines Carbodiimides mit einer biologischen Substanz,
menschlichem Choriongonadotropin (HCG) gekuppelt.
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0,25 ml der dicht gepackten, mit BSA überzogenen Trägerteilchen
wurden einmal mit Salzlösung gewaschen und dann mit 2 ml HCG mit einem Gehalt von 10 mg/ml vermischt. Der Zellensuspension
wurde eine Lösung von 0,2 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
in 0,5 ml Tetrahydrofuran und 1 ml Y/asser zugefügt und der Ansatz bei Raumtemperatur etwa 18 h unter fortgesetztem
Schütteln inkubiert. Dann wurden die Zellen nacheinander dreimal mit je 20 ml 0,01 η Natriumcarbonat, dreimal mit je 0,01
η HCl und dreimal mit je 30 ml destilliertem Wasser gewaschen, um sie von dem überschüssigen Kupplungsmittel zu befreien«
Zum Schluß wurden die Zellen noch zweimal mit 0,6 $>
BSA in Salzlösung gewaschen und in Kochsalzlösung zu einer 4 $igen
Zellensuspension resuspendiert. Das Produkt besteht aua E.coli-Trägerteilchen,
überzogen mit BSA und trägt an seiner Außenseite das menschliche Choriongonadotropin, das über das Carbodiimid
als Kupplungsmittel an den BSA-Überzug gekuppelt ist. Dieses biologische Reagens wurde gegen Kaninchenantiserum für
HCG und mit normalem Kaninchenserum getestet, wobei sowohl die Glasstreifen- als auch die Mikrotetrator-Agglutinierungsmethode
angewandt wurden. Die Resultate zeigten, daß das gebildete ■ Reagens gegenüber HCG hoch sensitiv und spezifisch war, ohne
daß eine nicht-spezifische Agglutinierung auftrat.
Beispiel 2 wurde unter Verwendung des gleichen Oarbodiimid-Kupplungsmittels
wiederholt, wobei jedoch das HCG ersetzt war durch 2 ml einer Lösung mit 40 mg Insulin bzw0 2 ml einer
Lösung von menschlichem Serumalbumin (HSA), die 10 mg des Antigens enthielt. Diese biologischen Reagentien wurden beide auf
gleiche Art gegen Kaninchenantxserum und gegen normales Kaninchenserum getestet, wobei man die gleichen guten Resultate wie
oben erhielt.
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Die mit einem Überzug versehenen Trägerteilchen nach Beispiel 1 wurden durch Zugabe von Woodwards Reagens L nach
vorausgehender Succiniliierungsbehandlung reaktionsfähig gemacht. Die reaktiven Teilchen wurden dann getrennt mit HSA
und Insulin gekuppelt.
0,25 ml der dichtgepackten, mit BSA überzogenen Trägerte'ilchen
wurden zentrifugiert und dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurden die Teilchen mit 20 ml einer
0,1 'folgen wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat vermischt,
3 mg Bernsteinsäureanhydrid zugefügt und die Suspension über Eacht bei 4°C geschüttelt. Die Zellen wurden dann dreimal mit
destilliertem Wasser gewaschen, in 5 ml destilliertem Wasser
resuspendiert und mit 10 Mikroliter Triäthylamin vermischt.
Dem Gemisch wurden 17 mg Woodwards Reagens L (N-tert-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat)
zugefügt, worauf nach 10 min die zu kuppelnde biologische Substanz zugegeben wurde.
Als erste Kupplung wurden 10 mg HSA in 2 ml Salzlösung zugegeben, das Gemisch über Macht bei 25 C geschüttelt, dreimal
mit destilliertem Wasser gewaschen und in 5 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Zur Durchführung des Testes auf
Agglutinierung bzw. auf Verhinderung der Agglutinierung wurde d_as biologische Reagens in .Salzlösung mit 0,6 <?o BSA resuspendiert.
Die oben beschriebene Kupplung wurde als zweite Kupplung wiederholt, wobei 2 ml einer 0,2 ?öis;en Lösung von Insulin in
Salzlösung zu der Suspension der reaktiven Teilchen zugegeben wurden.
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Gemäß Beispiel 1 wurden überzogene Trägerteilchen hergestellt, wobei jedoch diesmal 10 mg BSA in 25 ml Salzlösung
und 10'tnl Bisdiazobenzidin, im Verhältnis von 1:5 in mit
Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,3) gelöst, verwendet
wurden. Die erhaltenen Teilchen wurden wie folgt als Trägerteilchen weiterverwendet: Die überzogenen Teilchen wurden in Phosphatpuffer, pH 7,3 bis 7,4, resuspendiert, worauf die
folgenden Salzlösungen von antigenaktiven Substanzen zu einzelnen Ansätzen zugegeben wurden: Pferde-^-globülin-i00 Au
(Antitoxineinheiten) und 200 Au in 2,5 ml Salzlösung; ein
Gemisch aus menschlichem· ^-Globulin - 20 mg in 2,5 ml Salzlösung und Rinder-^-globulin in 2,5 ml Salzlösung; menschliches Serum, 1 ml in 1,5 ml Salzlösung und menschliches
Plasma, 1 ml in 1,5 ml Salzlösung. Als nächstes wurden 10 ml BDB in einer Verdünnung von 1:80 in Phosphatpuffer, ,pH 7,3
bis 7,4, zu jedem Ansatz zugegeben und das resultierende Gemisch 20 bis 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt, um das
BDB mit den Trägerteilchen zu reaktiven Teilchen umzusetzen
und das Kuppeln der biologischen Substanzen an die reaktiven Teilchen über BDB zu bewirken. Die biologischen Reagentien
würden dann einzeln mit Salzlösung gewaschen und in Salzlösung, die für einige der Ansätze 1 fo normales Kaninchenserum (URS) bzw. 0,6 io BSA enthielt, resuspendiert.
Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,3) gelöst, verwendet
wurden. Die erhaltenen Teilchen wurden wie folgt als Trägerteilchen weiterverwendet: Die überzogenen Teilchen wurden in Phosphatpuffer, pH 7,3 bis 7,4, resuspendiert, worauf die
folgenden Salzlösungen von antigenaktiven Substanzen zu einzelnen Ansätzen zugegeben wurden: Pferde-^-globülin-i00 Au
(Antitoxineinheiten) und 200 Au in 2,5 ml Salzlösung; ein
Gemisch aus menschlichem· ^-Globulin - 20 mg in 2,5 ml Salzlösung und Rinder-^-globulin in 2,5 ml Salzlösung; menschliches Serum, 1 ml in 1,5 ml Salzlösung und menschliches
Plasma, 1 ml in 1,5 ml Salzlösung. Als nächstes wurden 10 ml BDB in einer Verdünnung von 1:80 in Phosphatpuffer, ,pH 7,3
bis 7,4, zu jedem Ansatz zugegeben und das resultierende Gemisch 20 bis 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt, um das
BDB mit den Trägerteilchen zu reaktiven Teilchen umzusetzen
und das Kuppeln der biologischen Substanzen an die reaktiven Teilchen über BDB zu bewirken. Die biologischen Reagentien
würden dann einzeln mit Salzlösung gewaschen und in Salzlösung, die für einige der Ansätze 1 fo normales Kaninchenserum (URS) bzw. 0,6 io BSA enthielt, resuspendiert.
Die so hergestellten biologischen Reagentien wurden dann für Tests auf Agglutinierung bzw. Agglutinierungsverhinderung
mit Hilfe der Mikrotitratortechnik benutzt. Die Resultate
zeigten, daß die Reagentien zum spezifischen Nachweis der
entsprechenden Antigene und ihrer Antikörper benutzt werden
konnten. Es wurden für diese Reagentien Sedimentationszeiten von etwa 6 bis 8 h beobachtet, während bei aus unbeschichteten E. Coli-Trägerteilchen hergestellten Reagentien Sedimentationszeiten von 12 bis 18 h die Regel sind.
zeigten, daß die Reagentien zum spezifischen Nachweis der
entsprechenden Antigene und ihrer Antikörper benutzt werden
konnten. Es wurden für diese Reagentien Sedimentationszeiten von etwa 6 bis 8 h beobachtet, während bei aus unbeschichteten E. Coli-Trägerteilchen hergestellten Reagentien Sedimentationszeiten von 12 bis 18 h die Regel sind.
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Es wurden Trägerteilchen hergestellt mit zwei primären Überzügen, einem ersten "aus BSA und einem zweiten aus menschlichem
y— Globulin, die dann mit einem Antigen, Rinder-yglobulin,
gekuppelt wurden. Der erste Überzug wurde gemäß Beispiel 1 aufgebracht, wobei jedoch 5 ml einer 2,5 ^igen Suspension
von formalinisierten E. coli-Zellen, 10 mg BSA'in
2,5 ml Salzlösung und 10 ml BDB, im Verhältnis von 1:5 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung verdünnt. (pH 7,3 bis 7,4),
verwendet wurden. . ■ ■ ·
Als nächstes wurden zu 0,125 ml der dichtgepackten Zellen
20 mg menschliches /--Globulin in 2,5 ml Salzlösung zugefügt,
worauf noch 10 ml BDB, im Verhältnis von 1:80 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung verdünnt, zugegeben wurden; das Gemisch
wurde 20 min bei Raumtemperatur auf eine rotierende Schüttelvorrichtung gesetzt. Dann wurde das ganze zentrifugiert
und die Zellen in Salzlösung resuspendiert, worauf sie 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen wurden, um weiter
zu reagieren. Die zweifach beschichteten Trägerteilchen wurden dann dreimal mit Salzlösung gewaschen,und es wurden ihnen
20 mg Rinder-2Γ-globulin in 2,5 ml Salzlösung zugefügt, worauf
noch 10 ml BDB, im Verhältnis von 1:160 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung, zugegeben wurden. Das Gemisch wurde
20 min bei Raumtemperatur auf eine rotierende Schütteleinrichtung gesetzt und dann zentrifugiert und wie oben behandelt,
um eine weitere Reaktion vor sich gehen zu lassen.
Dieses biologische Reagens war verwendbar für immunologische Tests auf Rinder-T"-globulin und seinen Antikörper.,
Mit Hilfe der obisren Methode wurde ein ebenso beschichtetes Trägerteilchen hergestellt, wobei die folgenden Primärschichten
verwendet wurden: BSA, BSA und menschliches f- -
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Globulin. Das mit diesem dreifach beschichteten' Trägerteilchen
gekuppelte Antigen war menschliches-v--Globulin.
Vier Ansätze von je 2 ml eitfer 2,5 $igen Suspension von
formalinisiertem E. coli wurden dreimal mit Salzlösung gewaschen. Nach der letzten Zentrifugierung wurde die überstehende
Flüssigkeit verworfen und die dichtgepackten Zellen in 1 ml eines Natrium-Kalium-Phosphat-Puffers vom pH 8,4 re~
suspendiert. Als nächstes wurden die in Tabelle 1 angegebenen Kupplungsmittel in der dort zu ersehenden Menge, gelöst
in 2 tigern Aceton, der Suspension der Trägerteilchen zugesetzt
und das ganze gemischt und 1/2 h bei 37°C inkubiert, zentrifugiert und in 1 ml des obieren Puffers vom pH 8,4 resuspendiert.
Dann wurden die in Tabelle I aufgeführten Eiweißstoffe in den dort angegebenen Mengen in 0,25 ml des pH 8,4-Puffers
zugesetzt und das ganze vermischt, 1 h bei 37°C inkubiert, zentrifugiert, dreimal mit je 5 ml Phosphat-Kochsalzlösung
(pH 7,2) gewaschen und in 1,5 ml mit Phosphat gepufferter
Salzlösung resuspendiert. Zu der Suspension wurden die-in ■Tabelle I aufgeführten Antigen-Wirkstoffe in den dort angegebenen
Mengen in 1,5 ml Salzlösung zugegeben und noch 5 ml BDB in einer Verdünnung von 1:80 in mit Phosphat gepufferter
Salzlösung (pH 7,3 bis 7,4) zugefügt, worauf das ganze 20 min bei Raumtemperatur auf eine rotierende Schütteleinrichtung
gesetzt wurde, um das jeweilige biologische Reagens zu bilden. Die Reagentien wurden durch Zentrifugieren isoliert, dreimal mit Salzlösung gewaschen und zum Gebrauch in Salzlösung
resuspendiert.
24 -
909839/ Uli
1A-35 822
Kupplungs mittel |
' 25/Ug " | Tabelle I | Antigen-Y/irk- stoff |
|
Ansatz Kr. |
DNDFB,* | 50/Ug | Eiweiß stoff |
BSA, 5 mg |
1 | DNDFB, | ' 25/Ug | Rinder-"f -globu lin, 5 mg |
Rind er- j~ -globulin, . 2,5 mg |
2 | FNPS,** | 50/Ug | BSA, TO mg | BSA, 5 mg |
3 | FNPS,' | Rinder-/"- -globu lin, 5 mg |
Rinder-y-globulin, 2,5 mg |
|
4 | BSA, 10 mg | |||
- 1,3-Dinitro-4,6-dinitrobenzol
- ρ,ρ·-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfon
Die so erhaltenen Reagentien wurden mit Erfolg für immunologische Tests auf die Anwesenheit der Antigen-Wirkstoffe und
ihrer Antikörper benutzt.
2 ml einer 2,5 $igen Suspension von formalinisierten
E. coli-Zellen in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS)
vom pH 7,2 bis 7,4 wurden vermischt mit 2,5 mg Rinder-^r-globulin
in 3 ml PBS. Als nächstes wurden dem Gemisch 100 mg 1-Ä"thyl-3(3-dimethylaminoprppyl)-carbodiimid-Hydrochlorid, gelöst
in 5 ml Salzlösung, zugefügt und das ganze 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die beschichteten Trägerteilchen
wurden dann dreimal mit je 10 ml PBS mit einem Gehalt an 1 5^-igem. .normalem Kaninchenserum gewaschen und resuspenc&ert
in 1,5 ml Salzlösung mit einem Gehalt an 1 <fo NRS.
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Die beschichteten Trägerteilchen wurden dann nochmals mit Phosphatpuffer vom pH 8,4 gewaschen und in 1,5 ml des Puffers
resuspendiert, worauf ihnen 5 mg BSA, suspendiert in 1,5 ml Salzlösung und 5 ml BDB, verdünnt im Verhältnis von 1:80 in
Phosphat-Salzlösung (pH 7,2 bis 7,4),zugemischt wurden. Das
ganze wurde dann gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt. Es erwies sich als brauchbares immunologisches Reagens.
Gemäß Beispiel 1 wurden beschichtete Trägerteilchen hergestellt, wozu 5 ml formalinisierte E. coli-Zellen, 1,25 ml Salzlösung
mit 5 mg Rinder-/"-globulin und 10 ml BDB, verdünnt im
Verhältnis von 1:40 mit Phosphat-Salzlösung (pH 7,2 bis 7,4), verwendet wurden. Auf den Teilchen wurde dann ein äußerer Überzug
aus Rinder-y-globulin angebracht, wozu eine zweistufige BDB-Kupplungsmethode angewandt wurde, bei welcher die beschich-'teten
Teilchen mit 5 ml BDB, verdünnt im Verhältnis von 1:80 in Phosphat-Salzlösung, bei Raumtemperatur 20 min reagierten. Die
resultierenden reaktiven Teilchen wurden mit Salzlösung gewaschen, . worauf ihnen 5 mg Rinder- y-globulin in 1,25 ml Salzlösung
zugefügt wurde. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 18 h unter fortgesetztem Schütteln in Gang gehalten, worauf die
Weiterbehandlung gemäß Beispiel 5 erfolgte.
Diese zweistufige Kupplungsmethode führt dazu, daß die reaktiven Teilchen unter Verwendung von BDB separat gebildet
werden, ohne daß.die biologische Substanz anwesend ist.
Mit Hilfe der in einigen der obigen Beispiele ausgeführten Methode wurden eine Anzahl von beschichteten Teilchen hergestellt,
die zur Herstellung von biologischen Reagentien des hier beschriebenen Typs verwendet wurden„ In Tabelle II sind die
- 26 9098 3.9/142 2 "' ;: *'
1A-35 822
verwendeten Trägerteilchen,.Kupplungsmittel und Eiweißstoffe
aufgeführt einschließlich ihrer Mengen in den folgenden Lösungsmitteln: für die Trägerteilchen - Salzlösung; für BDB - mit
Phosphat gepufferte Salzlösung, pH 7,2 bis 7,4; für die Carbodiimide - Tetrahydrofuran; für Woodwards Reagens - Behandlung
und Verdünnungsmittel gemäß Beispiel 4; für die Eiweißstoffe Salzlösung.
Trägerteilchen
ml einer 2,5
Suspension
ml einer 2,5
Suspension
Kupplungsmittel, Art und Menge Eiweißstoffe, Art und Menge
E. coli
Lactobacillus
lei'chmannii
lei'chmannii
Bacillus pumilus'
DCC Carbodiimid 0,2 g in 0,5 ml
Woodwards Reagens L 17 mg
Woodwards Reagens L 17 mg
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
Merler -Carbodiimid, 0,05 mg in 5 ml
BDB 20 ml in Verdünnung 1:5
BDB 20 ml,1 Verdünnung 1:5
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
Woodwards Reagens L 17 mg menschl.Serumalbumin,
10 mg in 2 ml
menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml
Pferde-)^ -globulin, 400 Au in 2 ml
menschl.Serumalbumin, 3 mg in 5 ml
Pferde-,)" -globulin, 200 Au in 5 ml
menschl;Serumalbumin, 10, 20, 40 und 80 mg in 1 ml
BSA 40 mg in 5 ml
Pferde- jr-globulin,
200 Au in 5 ml
menschl.Serumalbumin ; 3 mg in 5 ml
Pferde->~-globulin, 200 Au in 5 ml
menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml
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Trägerteilchen
ml einer
2,5 ^-Suspension
Kupplungsmittel, Art und Menge
Eiweißstoffe, Art und Menge
Bacillus subtilis
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
BDB 20 ml', Verdünnung 1:5
BDB 20 ml, Verdünnung 1:5
DCC*-Carbodiimid 0,2 g in 0,5 ml
menschl.Serumalbumin, 3 mg in 5 ml
Pferde- .^-globulin 200 Au in 5 ml
menschl.Serumalbumin, 3 mg in 5 ml
Pf erde-y- -globulin 200 Au in 5 ml
menschl.Serumalbumin, 10 mg in 2 ml
DGC-Carbodiimid ist NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid
und Merler-Carbodiimid ist 1-Cyclobexyl-3(2-morpholinyl-(4)-äthylcarbodiimid)-Metho-p-toluol-
sulfonat.
Die beschichteten Trägerteilchen können sämtliche mit den aufgeführten Kupplungsmitteln verwendet werden, um reaktive
Teilchen herzustellen, die ihrerseits verwendet werden können, um eine große Reihe biologischer Substanzen zu desolubilisieren
und Reagentien daraus herzustellen.
Die beschichteten Trägerteilchen können lyophilisiert werden, damit sie trocken gelagert werden können. Man verfährt zur
Lyophilisierung wie folgt:
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5 ml einer 2,5 $igen Suspension von formalinisierten
E. coli-Zellen wurden dreimal mit Salzlösung gewaschen, in 3 nil
einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung vom pH 7t2 bis 7,4
resuspendiert und 2,5 mg HCG (2590 I.TJ./mg), gelöst in 2,5 ml Salzlösung, zugefügt. Als nächstes wurden 10 ml BDB, verdünnt
im Verhältnis 1s 5 in mit Phosphat gepufferter Salzlösung vom
pH 7,2 his 7,4, zugegeben und das ganze 20 min rotierend geschüttelt
und einmal mit Salzlösung und zweimal mit einer Salzlösung, die 0,6 fo BSA enthielt, gewaschen.· Die Zellenkonzentra—
tion wurde nach dem nachfolgenden Zentrifugieren durch Zusatz
von Salzlösung mit 0,6 $ BSA und 6 $ Sucrose auf 3 bis 4 % eingestellt.
Das Gemisch wurde in einzelnen Tropfen auf Glasplättchen aufgebracht und in Mengen von 0,5 bis 1,0 ml in Glasampullen
eingeschlossen und 24 bis 48 h bei -40 bis -51 C unter Vakuum von weniger als 150/U Quecksilber lyophilisiert. Die'
Glasampullen wurden unter Vakuum verschlossen und bei niedri- _gem Feuchtigkeitsgehalt gelagert. Die so getrockneten beschichteten
Teilchen sind unbestimmte Zeit haltbar.
909839/1422
Claims (1)
- Patentansprüche1. Zur Herstellung von unsolubilisierten biologischen Reagentien geeignete reaktive Teilchen, die zur unmittelbaren chemischen Anlagerung an biologische Substanzen befähigt sind, gekennzeichnet durch ein festes Träger- oder Kernteilchen mit eiweißartiger Oberfläche und einem oder mehreren Überzügen aus Eiweißstoffen, wobei die Schichten am Kern und untereinander durch eine mit Hilfe von Kupplungsmittlern erzeugte Kovalenzbindung festgehalten werden und ein dem äußersten Überzug beigefügtes weiteres Kupplungsmittel das beschichtete Teilchen zur Anlagerung an die betreffende biologische Substanz durch Kovalenzbindung befähigt.2ο Reaktive Teilchen nach Anspruch 1, dadurch g e -kerir; zeichnetdaß als Träger- oder Kernteilchenrote Blutkörperchen, Mikrobenzellen oder Teilchen mit einer Gel'atineoberflache vorhanden sind.3. Reaktive Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Trägerteilchen einen größten Durchmesser von etwa 10 Mikron haben.4. Reaktive Teilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die eiweißartigen Überzugsschichten aus Albuminen oder \U-Globulinen bestehen.0 9 8 39/1422- % - 1A-35 8225. Reaktive Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als Kupplungsmittel eine oder mehrere der folgenden Verbindungen vorhanden ist bzw. sind: Bisdiazobenzidin, Bisdiazobenzidindisulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, DifluordinitrodiphenyTsulfon, ein Carbodiimide Toluoldiisocyanat, Gyanursäurechlorid, Dichlor-s-triazin, F-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat, ein Dialdehyd, ein </ ,ß-ungesättigter Aldehyd.6. Reaktives Teilchen nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeich-net , daß das dem äußersten Überzug beigefügte Kupplungsmittel, das die Anlagerung an die betreffende biologische Substanz ermöglicht, Bisdiazobenzidin ist.7. Reaktive Teilchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß ihre Gröi3e dazu ausreicht, Agglutinierungen zu bilden, wenn die Teilchen nach Kuppeln an eine immunologische Substanz in Kontakt mit dem Gegenstück dieser Substanz gebracht werden.8. Verfahren zur Herstellung der reaktiven Teilchen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennze-ichnet , daß man Träger- oder Kerntejlchen mit eiweißartiger Oberfläche in ein flüssiges Medium einbringt und mit Hilfe eines ersten Kupplungsmittels an die Teilchen derart einen Eiweißstoff kuppelt, daß sich auf dem einzelnen Teilchen eine eiweißartige Überzugsschicht ausbildet, worauf man den so beschichteten Teilchen ein zweites Kupplungsmittel zufügt, das sie zur Anlagerung an die betreffende biologische Substanz durch Kovalenzbindung befähigt.909839/ U22-^- 1A-35 8229. Verfahren nach Anspruch 8., dadurch gekennzeichnet , daß man Träger- oder Kernteilchen mit einem größten Durchmesser von etwa 10 Mikron verwendet.10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9» dadurch gekennzeichnet , daß man auf den Trägerteilchen vor Zugabe des zweiten Kupplungsmittels mehrere Überzugsschiühten aus Eiweißstoffen erzeugt.11. Verfahren nach einem" der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß man als Trägerteilchen rote Blutkörperehen, Mikrobenzellen oder Teilchen mit einer Geiatinoberflache verwendet.12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß man als Eiweißstoffe Albumine oder y--Globuline verwendet.909839/1422
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