AUSGANGSSITUATION DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für
die Herstellung eines Reagens zur Messung von Endotoxin
unter Verwendung einer extrahierten Lösung von
Hämatozytenlysat (Amöbozytenlysat) von Königskrabben (nachfolgend
abgekürzt als "AL-Lösung") als ein Ausgangsmaterial.
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Endotoxine (nachfolgend abgekürzt als "ET") sind
hauptsächlich in Zellwänden von Gram-negativen Bakterien
vorkommende und als Pyrogene bekannte Lipopolysaccharide.
Die Messung der ET-Konzentration in einer Probe ist daher
eine der wichtigen Messungen auf den Gebieten der Medizin,
Pharmazie und Mikrobiologie.
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Gegenwärtig wird als ein Verfahren zur ET-Messung wegen
seiner Einfachheit, Zweckmäßigkeit und geringen Kosten
vielfach der sogenannte Limulustest eingesetzt, bei dem das
Phänomen genutzt wird, daß AL-Lösung durch ET unter Bildung
eines Gelkoagulates aktiviert wird.
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Es wurde jedoch festgestellt, daß AL-Lösung nicht nur
mit ET reagiert, sondern auch mit carboxymethyliertem β-1,3-
Glucan (Kakinuma et al., Biochem. Biophys. Research
Communication, 101(2), 434-439 (1981)). Es wurde
nachgewiesen, daß dieses Phänomen durch die Reaktion eines in AL-
Lösung vorhandenen Faktors (nachfolgend abgekürzt als "GL-
sensitiver Faktor") hervorgerufen wird, der mit β-1,3-Glucan
(nachfolgend abgekiirzt als "GL") reagiert, um die
Koagulation mit GL oder eines Derivats davon auszulösen
(Bacterial Endotoxin, veröffentlicht bei Verlag Chemie, 365-
382, 1984).
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Die meisten kommerziell verfügbaren Reagentien für den
Limulustest reagieren daher nicht nur mit ET sondern auch
mit GL, so daß es mit den Limulustest schwierig ist
einzuschätzen, welches von dem ET, GL bzw. eine Mischung von
ihnen in einer Probe vorliegt. Die Spezifität derartiger
Reagentien für den Limulustest ist daher ein Problem.
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Zur Lösung dieses Problems wurde ein Verfahren zur
Herstellung eines für ET spezifischen Reagens durch
Entfernen des GL-sensitiven Faktors aus der AL-Lösung
veröffentlicht. (JP-A-58-13516 und 59-27828, Kokai
(Offenlegung)). Alle die darin offenbarten Verfahren erfordern
jedoch ein sehr aufwendiges Vorgehen bei der Behandlung der
AL-Lösung, beispielsweise durch ein Verfahren der
Gelfiltration oder ein chromatographisches Verfahren unter
Verwendung eines Trägers mit darauf aufgebrachtem Heparin
oder Dextransulfat, um die Al-Lösung zu einer Fraktion eines
vorkoagulierenden Enzyms, einer Fraktion eines GL-sensitiven
Faktors und einer Fraktion eines Faktors (nachfolgend
abgekürzt als "ET-sensitiver Faktor") abzutrennen, der mit
ET zur Auslösung der Koagulation reagiert, um den GL-
sensitiven Faktor zu entfernen. Um daher zu verhindern, daß
die AL-Lösung oder die daraus erhaltenen Fraktionen während
der Trennverfahren durch ET verunreinigt werden, benötigt
man beispielsweise Einrichtungen, die ausschließlich für die
Ausführung dieser Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus
sind die vorgenannten Verfahren weiterhin insofern von
Nachteil, daß die einzelnen Fraktionen wieder gründlich
gemischt werden müssen, um ein für ET spezifisches Reagens
zu erhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung wurde unter Berücksichtigung
derartiger Bedingungen ausgeführt und soll ein einfaches und
wirksames Verfahren zur Entfernung des Abscheidung Faktors
gewähren, um ein auf ET-spezifisches Reagens zu erhalten,
indem AL-Lösung als Ausgangsmaterial verwendet wird.
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Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren für die
Herstellung eines Reagens zum Messen von Endotoxin, welches
umfaßt:
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kurzzeitiges Inkontaktbringen einer extrahierten Lösung
von Königskrabben-Hämatozytlysat mit mindestens einem
Behandlungsmittel, ausgwählt aus: (a) einem eine β-1,3-
glucosidische Bindung enthaltenden wasserunlöslichen
Polysaccharid, (b) einem eine β-1,3-glucosidische Bindung
enthaltenden wasserunlöslichen Polysaccharidderivat, (c)
einem Polysaccharid, das eine β-1,3-glucosidische Bindung
enthält und an einem wasserunlöslichen Träger fixiert ist,
und (d) einem Polysaccharidderivat, das eine β-1,3-
glucosidische Bindung enthält und an einem wasserunlöslichen
Träger fixiert ist, und
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Befreien der extrahierten Lösung des Königskrabben-
Hämatozytlysats von den genannten Behandlungsmitteln (a) bis
(d).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Es zeigen:
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Fig. 1 Eichkurven für Endotoxin, die im
Referenzbeispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden,
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Fig. 2 eine Eichkurve für Curdlan, die im
Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde,
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Fig. 3 eine Eichkurve für Endotoxin, die im
Referenzbeispiel 3 erhalten wurde,
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Fig. 4 eine Eichkurve für Curdlan, die im
Referenzbeispiel 3 erhalten wurde.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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In der vorliegenden Patentbeschreibung werden die
folgenden Abkürzungen verwendet:
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ET: Endotoxin
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AL-Lösung: eine extrahierte Lösung von
Hämatozytenlysat aus Königskrabben
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GL: β-1,3-Glucan
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GL-sensitiver Faktor: ein in AL-Lösung vorliegender
Faktor, der mit GL unter Auslösung der Koagulation
reagiert
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ET-sensitiver Faktor: ein in AL-Lösung vorliegender
Faktor, der mit ET unter Auslösung der Koagulation
reagiert
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GLNSPS: eine β-1,3-glucosidische Bindung enthaltendes
wasserunlösliches Polysaccharid
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GLPS: eine β-1,3-glucosidische Bindung enthaltendes
Polysaccharid
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LAL: ein gefriergetrocknetes Produkt von AL-
Lösung, die von zur Gattung Limulus gehörenden
Königskrabben gewonnen wird
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CT-LAL-Lösung: ein in Beispiel 1 erhaltenes und für ET
spezifisches Reagens
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ZT-LAL-Lösung: ein in Beispiel 2 erhaltenes und für ET
spezifisches Reagens
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Tg: eine für die Herabsetzung der Durchlässigkeit um 5
% erforderliche Zeit
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unbehandelte LAL-Lösung: eine LAL-Lösung, die durch
Auflösen von LAL der gleichen Charge wie in
Beispiel 1 in 5 ml destilliertem Wasser zur
Injektion hergestellt wird.
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Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben eingehend
ein Verfahren zur leichten und wirksamen Herstellung eines
für ET spezifischen (d.h. für die ET-Messung verwendbaren)
Reagens unter Verwendung einer AL-Lösung als ein
Ausgangsmaterial untersucht und als Ergebnis festgestellt,
daß ein mit ET spezifisch reagierendes Reagens mühelos
dadurch erhalten werden kann, daß AL-Lösung mit mindestens
einem der folgenden Polysaccharide in Kontakt gebracht wird,
welche in der Art von GL gebundene Glucoserückstände
aufweisen, von denen bekannt ist, daß sie AL-Lösung
koagulieren: und zwar (a) eine β-1,3-glucosiciische Bindung
enthaltendes wasserunlösliches Polysaccharid (nachfolgend
abgekiirzt als "GLNSPS") und/oder (b) eine β-1,3-
glucosidische Bindung enthaltendes wasserunlösliches
Polysaccharidderivat (nachfolgend wird eine β-1,3-
glucosidische Bindung enthaltendes Polysaccharid abgekürzt
als "GLPS") oder - (c) und (d) - GLPS und/oder deren auf
einem unlöslichen Träger fixierte Derivate, beispielsweise
durch Zusatz einer großen Menge des GLNSPS und/oder des
wasserunlöslichen Derivats von GLPS oder dem GLPS und/oder
dessen auf einem wasserunlöslichen Träger fixierte Derivate
zu der AL-Lösung, wonach daraus die AL-Lösung abgetrennt
wird. Damit wurde die vorliegende Erfindung ausgeführt.
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Als das in der vorliegenden Erfindung verwendbare
GLNSPS und GLPS kann ohne besondere Einschränkung jedes GLPS
oder dessen Derivat verwendet werden, die in AL-Lösung
unlöslich sind. Spezieller umfassen bevorzugte Beispiele von
GLNSPS wasserunlösliche Polysaccharide, die ausgewählt
werden aus allgemein als GLPS bekannte Polysaccharide, z.B.
natürliche Polysaccharide, die aus verschiedenen Bakterien
erhalten werden (z.B. die Gattung Alcaligenes und die
Gattung Agrobacterium), Hefen (z.B. die Gattung
Saccharomyces) und Pilze (z.B. ein Shiitake (Cortinellus
Shiitake), Schizophyrum communis und Coriolus verisicolor),
spezielle Beispiele für die natürlichen Polysaccharide
umfassen Curdlan, Pachyman, Sclerotan, Lentinan,
Schizophyllan und Coriolan, Speicher-Polysaccharide von
Algen, z.B. Braunalgen, Euglena und Diatomeen, wobei
spezielle Beispiele der Speicher-Polysaccharide Laminaran
und Paramilon umfassen und bevorzugte Beispiele der
wasserunlöslichen Derivate von GLPS wasserunlösliche
Derivate umfassen, die dadurch erhalten wurden, daß man
diese natürlichen oder Speicher-Polysaccharide durch
Behandlung, wie beispielsweise Erhitzen, in Wasser unlöslich
macht, sowie wasserunlösliche Derivate, die dadurch erhalten
werden, daß man mindestens eine Gruppe, ausgewählt aus einer
Ethylgruppe, einer Butylgruppe, usw., in die natürlichen
oder Speicher-Polysaccharide entsprechend einem
konventionellen Verfahren einführt, wie es beispielsweise in
Munio Kotake "Daiyukikagaku" Bd. 19, 7. Ausg. Asakura
Shoten, 10. Mai 1967, S. 70-101, beschrieben wurde. Diese
wasserunlöslichen Polysaccharide und ihre wasserunlöslichen
Derivate können einzeln oder in Verbindung von zwei oder
mehreren von ihnen verwendet werden.
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In der vorliegenden Erfindung muß nicht betont werden,
daß die vorgenannten GLPS und ihre Derivate, die auf einem
geeigneten unlöslichen Träger fixiert sind, ähnlich wie die
GLNSPS und die wasserunlöslichen Derivate des GLPS verwendet
werden können. Für den unlöslichen Träger, der zur
Immobilisierung des GLPS oder dessen Derivate verwendet
wurde, kann jeder unlösliche Träger eingesetzt werden, der
normalerweise in der Affinitätschromatographie verwendet
wird, wie beispielsweise Cellulose, Agarose, Dextran,
Polyacrylamide und poröses Glas. Unter ihnen wird Agarose
besonders bevorzugt. Spezielle Beispiele für in der
vorliegenden Erfindung verwendbare handelsübliche unlösliche
Träger umfassen Träger vom Agarosetyp, wie beispielsweise
Sepharose (Handelsbezeichnung, hergestellt von der Pharmacia
Fine Chemicals) und Biogel A (Handelsbezeichnung,
hergestellt von der Bio-Rad Laboratories) Träger vom Dextrantyp,
wie beispielsweise Sephadex (Handelsbezeichnung, hergestellt
von der Pharmacia Fine Chemicals) und Sephacryl
(Handelsbezeichnung, hergestellt von der Pharmacia Fine Chemicals),
sowie Träger vom Polyacrylamidtyp, wie beispielsweise
Enzafix P (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
und Biogel P (Handelsbezeichnung, hergestellt von der Bio-
Rad Laboratories). Der unlösliche Träger ist nicht auf diese
handelsüblichen Träger beschränkt. Um GLPS oder ein Derivat
davon an diesen unlöslichen Trägern zu binden, muß der
unlösliche Träger selbstverständlich aktiviert werden.
Obgleich eine Methode zum Aktivieren des unlöslichen Trägers
zahlreiche Verfahren umfaßt und nicht entscheidend ist, kann
ein geeignetes Verfahren an einem Beispiel veranschaulicht
werden, das z.B. die Aktivierung unter Verwendung von
Epichlorhydrin umfaßt.
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Als die in der vorliegenden Erfindung verwendbare AL-
Lösung kann ohne besondere Einschränkung jede exemplifiziert
werden, solange sie aus Hämatozyten von Königskrabben
extrahiert wird, die zur Gattung Limulus, Tachypheus oder
Carcinoscorpius gehören und unter Koagulation mit ET
reagieren. Selbstverständlich ist die Verwendung von AL-
Lösung möglich, die aus gefriergetrockneten Produkten von
AL-Lösungen hergestellt wird, welche kommerziell
beispielsweise bei Associates of Cape Cod Inc. (ACC), HAEMACHEM,
Inc., und Whittaker Bioproducts, Inc., verfügbar sind.
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Als ein Verfahren zur Erlangung eines auf ET
spezifischen Reagens kann nach dem Herstellungsprozeß der
vorliegenden Erfindung ohne besondere Einschränkung jedes
Verfahren exemplifiziert werden, bei welchem nach dem
Inkontaktbringen von AL-Lösung mit (a) GLNSPS und/oder (b)
einem wasserunlöslichen Derivat von GLPS und/oder mit (c)
auf einem wasserunlöslichen Träger fixiertem GLPS und/oder
(d) einem Derivat von auf einem wasserunlöslichen Träger
fixierten GLPS die vorgenannten (a) bis (d), d.h. das GLNSPS
und/oder das wasserunlösliche Derivat von GLPS und/oder das
GLPS und/oder das auf dem wasserunlöslichen Träger fixierte
Derivat davon, aus der AL-Lösung entfernt werden kann.
Beispielsweise kann ein Verfahren exemplifiziert werden,
welches umfaßt Zugabe von entweder (a) GLNSPS und/oder (b)
einem wasserunlöslichen Derivat von GLPS und/oder (c) einem
auf einem wasserunlöslichen Träger fixierten GLPS und/oder
(d) einem Derivat von auf einem wasserunlöslichen Träger
fixierten GLPS zur Lösung, um diese mit der AL-Lösung in
Kontakt zu bringen und danach die vorgenannten (a) bis (d)
zu entfernen, d.h. das GLNSPS und/oder das wasserunlösliche
Derivat von GLPS und/oder das GLPS und/oder das auf einem
unlöslichen Träger fixierte Derivat davon, und zwar durch
Filtration, Zentrifugieren, usw.; sowie ein Verfahren,
welches umfaßt: Behandeln von AL-Lösung mit einer Säule, die
gefüllt ist mit (a) GLNSPS und/oder (b) einem
wasserunlöslichen Derivat von GLPS und/oder (c) auf einem
wasserunlöslichen Träger fixierten GLPS und/oder (d) einem Derivat
von auf einem wasserunlöslichen Träger fixierten GLPS.
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In dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung
ist die Menge von entweder dem GLNSPS und/oder dem
wasserunlöslichen Derivat von GLPS und/oder dem GLPS
und/oder dem auf einem wasserunlöslichen Träger fixierten
Derivat davon, die mit AL-Lösung in Kontakt gebracht wird,
normalerweise so groß, daß die Menge von GL und/oder dessen
Derivat, die in dem GLNSPS und/oder dem wasserunlöslichen
Derivat von GLPS und/oder dem GLPS und/oder dem auf einem
unlöslichen Träger fixierten Derivat davon, die zu der AL-
Lösung zugegeben wird, bezogen auf die AL-Lösung 0,1
Gew./Vol.% oder mehr beträgt. Als pH-Wert zum Zeitpunkt des
Inkontaktbringens von AL-Lösung mit entweder GLNSPS und/oder
einem wasserunlöslichen Derivat von GLPS und/oder mit GLPS
und/oder einem auf einem wasserunlöslichen Träger fixierten
Derivat davon kann jeder pH-Wert eingesetzt werden, solange
er nicht den ET-sensitiven Faktor in der AL-Lösung und
Faktoren inaktiviert, die an der durch die Reaktion von ET
mit dem ET-sensitiven Faktor hervorgerufenen
Koagulationsreaktion teilnehmen, obgleich ein pH-Wert im Bereich von 6
- 8 in der Regel bevorzugt eingesetzt wird. Als die Temperatur
zum Zeitpunkt des Inkontaktbringens kann jede Temperatur
angewendet werden, solange sie nicht den ET-sensitiven
Faktor in der AL-Lösung und die Faktoren inanktiviert, die
an der durch die Reaktion von ET mit dem ET-sensitiven
Faktor hervorgerufenen Koagulationsreaktion teilnehmen,
obgleich in der Regel eine Temperatur von 0 ºC bis 40 ºC,
bevorzugt 0 ºC bis 10 ºC, eingesetzt wird.
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Die Form, in der GLNSPS, ein wasserunlösliches Derivat
von GLPS oder GLPS und/oder ein an einem unlöslichen Träger
fixiertes Derivat davon zur AL-Lösung zugesetzt oder in eine
Säule zur Behandlung von AL-Lösung eingefüllt werden, ist
nicht entscheidend. Beispielsweise können GLNSPS, ein
wasserunlösliches Derivat von GLPS oder GLPS und/oder ein an
einem wasserunlöslichen Träger fixiertes Derivat davon
entweder verwendet werden, wie sie sind, oder nach einer
Bearbeitung in einer geeigneten Form, beispielsweise nachdem
sie zu Kügelchen im Fall der Verwendung von Curdlan als GLPS
durch das in der JP-A-52-50352, Kokai (Offenlegung)
offenbarte Verfahren bearbeitet wurden.
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Endotoxin kann entsprechend einem konventionellen
Meßverfahren für Endotoxin unter Verwendung des so
hergestellten Reagens gemessen werden. Weitere Reagentien können
in geeigneter Form in Übereinstimmung mit Reagentien gewählt
werden, die in einem konventionellen Verfahren zur Messung
von Endotoxin verwenden werden. Ins Detail gehend, kann
Endotoxin folgendermaßen gemessen werden:
(i) Gel-Koagulationsmethode:
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Diese Methode umfaßt das Mischen des Reagens mit einer
Probe, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer
Temperatur von 0 ºC bis 40 ºC, bevorzugt 25 ºC bis 40 ºC,
für eine vorbestimmte Zeit und mit bloßem Auge Bewerten, ob
durch die Koagulation ein Gel erzeugt wurde oder nicht.
(II) Turbidimetrische Endpunktmethode:
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Diese Methode umfaßt das Mischen des Reagens mit einer
Probe, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer
Temperatur von 0 ºC bis 40 ºC, bevorzugt 25 ºC bis 40 ºC,
für eine vorbestimmte Zeit und Messen einer Trübung infolge
von Koagulation unter Verwendung eines Koagulometers, eines
Nephelometers, eines Spektrophotometers o.dgl.
(iii) Methode der kinetischen Turbidimetrie:
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Diese Methode umfaßt das Mischen des Reagens mit einer
Probe, Inkubieren der resultierenden Mischung bei einer
Temperatur von 0 ºC bis 40 ºC, bevorzugt 25 ºC bis 40 ºC,
für eine vorbestimmte Zeit und Messen einer für eine
Trübungsänderung infolge der Koagulation erforderlichen
Zeit, um einen bestimmten Wert oder ein Verhältnis der
Trübungsänderung unter Verwendung eines Koagulometers, eines
Nephelometers, eines Spektrometers o.dgl. zu erreichen.
(iv) Farberzeugende Methode:
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Diese Methode umfaßt das Mischen des Reagens mit einer
Probe und einem synthetischen Substrat, wie beispielsweise
Boc-Val-Leu-Gly-Arg-p-Nitroanilin, Boc-Val-Leu-Gly-Arg-[(4-
N-Ethyl-N-2-hydroxyethyl)aminoanilin], der Protease, welche
durch die Reaktion einer Komponente der AL-Lösung mit
Endotoxin aktiviert wird, Inkubieren der resultierenden
Mischung bei einer Temperatur von 0 ºC bis 40 ºC, bevorzugt
25 ºC bis 40 ºC, für eine vorbestimmte Zeit, sodann im
Bedarfsfall Zusetzen eines Abstoppmittels für die
Proteasereaktion und Messen einer vom synthetischen Substrat
durch Proteaseaktivität freigesetzten Substanz auf
kolorimetrischem Wege o.dgl. Der Anwendungsbereich ist auf
diese Verfahren nicht beschränkt.
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In dem Meßverfahren kann als pH-Wert zum Zeitpunkt der
Messung jeder pH-Wert eingesetzt werden, solange er die
Faktoren nicht inaktiviert, die mit Endotoxin in AL-Lösung
unter Herbeiführung einer Koagulationsreaktion reagieren,
obgleich im allgemeinen ein pH-Wert im Bereich von 6 bis 8
bevorzugt eingesetzt wird. Als die Temperatur zum Zeitpunkt
der Messung kann jede Temperatur angewendet werden, solange
sie nicht die Faktoren inaktiviert, die mit Endotoxin in AL-
Lösung unter Herbeiführung einer Koagulationsreaktion
reagieren, obgleich im allgemeinen eine Temperatur von 0 ºC
bis 40 ºC, bevorzugt 25 ºC bis 40 ºC, eingesetzt wird.
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Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren auf ET-
spezifische Reagens kann durch Gefrieren oder
Gefriertrocknen stabil gelagert werden, so daß es bei
Herstellung in einer großen Menge nach diesen Verfahren
gelagert werden kann.
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Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden
Beispiele konkret veranschaulicht, ohne auf diese beschränkt
zu sein.
Beispiel 1
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Herstellung eines Reagens unter Verwendung von Curdlan
Zu 1 g Curdlan (verfügbar bei Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.) wurden 100 ml destilliertes Wasser zur
Infektion zugesetzt und die resultierende Mischung durch ein
sterilisiertes Glasfilter filtriert. Die vorgenannte
Prozedur wurde 5 mal wiederholt und etwa 10 mg des so
erhaltenen Curdlans in etwa 10 ml destilliertem Wasser zur
Injektion suspendiert. Die resultierende Suspension wurde
durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 um
filtriert. Ein gefriergetrocknetes Produkt einer AL-Lösung
von zur Gattung Limulus gehörenden Königskrabben
(nachfolgend wird das gefriergetrocknete Produkt abgekürzt als
"LAL"; verfügbar bei ACC; Gelbildungsempfindlichkeit 0,5
EU/ml ("EU" .... Endotoxineinheit); zur Auflösung in 5 ml)
aufgelöst in 5 ml destilliertem Wasser zur Injektion und die
resultierende LAL-Lösung durch das Filter mit dem daran
haftenden Curdlan filtriert, um ein auf ET-spezifisches
gewünschtes Reagens (nachfolgend abgekürzt als "CT-LAL-
Lösung") zu erhalten.
Beispiel 2
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Herstellung eines Reagens unter Verwendung von Zymosan
Zu 1 g Zymosan (verfügbar bei Sigma Chem. Co.,
Ltd.) wurden 100 ml destilliertes Wasser zur Injektion
zugesetzt und die resultierende Mischung durch ein
sterilisiertes Glasfilter filtriert. Die vorgenannte
Prozedur wurde 10x wiederholt und etwa 10 mg des so
erhaltenen Zymosans in einer LAL-Lösung suspendiert, die
durch Auflösen von LAL (verfügbar bei ACC;
Gelbildungsempfindlichkeit 0,5 EU/ml; zur Auflösung in 5 ml)
in 5 ml destilliertem Wasser zur Injektion erhalten wurde.
Die resultierende Suspension wurde durch ein Membranfilter
mit einer Porengröße von 0,45 um filtriert, um ein auf ET-
spezifisches gewünschtes Reagens (nachfolgend abgekürzt als
"ZT-LAL-Lösung") zu erhalten.
Referenzbeispiel 1
(Proben)
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Die folgenden Curdlanlösungen und ET-Lösungen wurden
als Proben verwendet.
Curdlanlösungen
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Es wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen von
Curdlan mit einer nicht nachweisbaren Menge von ET
(verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einer
50 mMol ET-freien wäßrigen Natriumhydroxidlösung zu einer
Konzentration von 5 mg/ml und geeignetem Verdünnen der
resultierenden Lösung mit destilliertem Wasser zur Injektion
hergestellt wurden.
ET-Lösungen
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Es wurden Lösungen verwendet, die durch Auflösen von
Escherichia coli als Endotoxin-Vergleichsstandard (ein vom
Stamm E. coli UKT-B abgeleitetes Lipopolysaccharid,
verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd., jede Ampulle
enthält das Lipopolysaccharid in einer Menge entsprechend
500 ng des FDA-Vergleichsstandard-Endotoxins EC-2, zur
Auflösung in 5 ml) in 5 ml destilliertem Wasser zur
Injektion und geeignetem Verdünnen der resultierenden Lösung
mit destilliertem Wasser zur Injektion hergestellt wurden.
(Meßverfahren)
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Es wurden zu 0,1 ml der in Beispiel 1 hergestellten CT-
LAL-Lösung 0,1 ml jeder Probe zugesetzt und nach
ausreichendem Mischen eine zum Herabsetzen der Durchlässigkeit auf
5 % (nachfolgend abgekürzt als "Tg") erforderliche Zeit bei
37 ºC mit Hilfe eines Toxinometers ET-201 (hergestellt von
der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gemessen.
(Ergebnisse)
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Eine in Fig. 1 mit -O- gezeigte Eichkurve wurde durch
Auftragen des Logarithmus des Tg-Werts auf der Ordinate in
Abhängigkeit von den Logarithmen der einzelnen ET-
Konzentrationen auf der Abszisse erhalten. Bei Verwendung
von Curdlanlösungen als Proben wurde die Durchlässigkeit der
Probe innerhalb von 80 Minuten für keine der
Curdlankonzentrationen auf 5 % herabgesetzt (Daten sind nicht gezeigt).
Vergleichsbeispiel 1
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Es wurde die Messung an den gleichen Proben
durchgeführt wie in dem Referenzbeispiel 1, und zwar mit dem
gleichen Meßverfahren wie in Referenzbeispiel 1 mit der
Ausnahme, daß anstelle der in Referenzbeispiel 1 verwendeten
CT-LAL-Lösung eine durch Auflösen von LAL der gleichen
Charge wie in Beispiel 1 in 5 ml destilliertem Wasser zur
Injektion (nachfolgend abgekürzt als "unbehandelte LAL-
Lösung") hergestellte LAL-Lösung verwendet wurde.
(Ergebnisse)
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Eine in Fig. 1 mit - - gezeigte Eichkurve wurde durch
Auftragen des Logarithmus des Tg-Werts auf der Ordinate in
Abhängigkeit von den Logarithmen der einzelnen
ET-Konzentrationen auf der Abszisse erhalten. Eine in Fig. 2 mit
gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen des Logarithmus des
Tg-Werts auf der Ordinate in Abhängigkeit von den
Logarithmen der einzelnen Curdlankonzentrationen auf der
Abszisse erhalten.
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Wie aus Fig. 1 ersichtlich, konnte, wenn die ET-
Lösungen als Proben verwendet wurden, eine Eichkurve mit
einer guten Linearität durch Verwendung entweder der CT-LAL-
Lösung oder der unbehandelten LAL-Lösung als Reagens zum
Messen von ET erhalten werden.
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Wie aus Fig. 2 ersichtlich, reagiert unbehandelte LAL-
Lösung auch mit den Curdlanlösungen, um eine Eichkurve mit
einer guten Linearität zu ergeben.
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Wie aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich, kann
entnommen werden, daß ein auf ET-spezifisches Reagens durch
Behandeln von AL-Lösung entsprechend dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhalten werden kann.
Referenzbeispiel 2
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In Tabelle 1 werden die Ergebnisse der mit dem gleichen
Meßverfahren wie in Referenzbeispiel 1 ausgeführten Messung
dargestellt, wobei die in Referenzbeispiel 1 (Probe 1)
hergestellte Probe mit 1,5 EU/ml Endotoxin und eine Mischung
gleicher Mengen der Probe mit 20 ng/ml Curdlan und der Probe
mit 3,0 EU/ml Endotoxin verwendet wurden, welche in
Referenzbeispiel 1 (Probe 2) hergestellt wurde.
Vergleichsbeispiel 2
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In Tabelle 1 werden ebenfalls die Ergebnisse der für
die gleichen Proben wie in Referenzbeispiel 2 und mit dem
gleichen Meßverfahren wie in Referenzbeispiel 2 ausgeführten
Messung mit der Ausnahme gezeigt, daß anstelle der im
Referenzbeispiel 2 verwendeten CT-LAL-Lösung die gleiche
unbehandelte LAL-Lösung wie in Beispiel 1 verwendet wurde.
Tabelle 1
Probe
Referenzbeispiel
Vergleichsbeispiel
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Wie aus den in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen
ersichtlich, kann entnommen werden, daß bei Verwendung der
CT-LAL-Lösung als Reagens zum Messen von ET ein Tg-Wert für
die sowohl ET als auch Curdlan enthaltende Probe erhalten
wird, der im wesentlichen gleich dem für die ET-Lösung
erhaltenen ist, wodurch nachgewiesen wird, daß die CT-LAL-
Lösung nicht mit Curdlan reagiert. Ebenfalls ist
ersichtlich, daß bei Durchführung der Messung unter
Verwendung der unbehandelten LAL-Lösung als ein Reagens zum
Messen für ET der Tg-Wert durch Zusatz von Curdlan zur ET-
Lösung stark herabgesetzt wird, was darauf hinweist, daß die
unbehandelte LAL-Lösung sowohl mit ET als auch Curdlan
reagiert.
Referenzbeispiel 3
(Proben)
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Das gleiche wie in Referenzbeispiel 1.
(Reagens zum Messen)
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Durch Zusatz von 1 ml von 0,45 Mol
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure-Puffer (pH 7,5) und 1 ml
einer Substratlösung (die 1,02 mMol Boc-Val-Leu-Gly-Arg-[(4-
N-Ethyl-N-2-hydroxyethyl)aminoanilin (hergestellt von der
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,25 mMol
Diethylanilin und 0,12 Mol Magnesiumchlorid] zu 1 ml der in
Beispiel 2 erhaltenen ZT-LAL-Lösung wurde ein Reagens zum
Messen hergestellt.
(Meßverfahren)
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Zu 0,2 ml des Reagens zum Messen wurden 0,1 ml von
jeder Probe zugesetzt und nachfolgend ausreichend gemischt.
Die Mischung wurde bei 37 ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach
der Inkubation wurde die Reaktion durch Zusatz von 1 ml
einer Lösung eines Abstoppmittels für die Reaktion, das 0,17
% Natriummetaperiodat und 0,25 % Natriumlaurylsulfat (SDS)
enthielt, abgestoppt und sodann die Extinktion der
Reaktionslösung bei 730 nm gemessen.
(Ergebnisse)
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Eine in Fig. 3 gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen
der Extinktion auf der Ordinate in Abhängigkeit von den
einzelnen ET-Konzentrationen auf der Abszisse erhalten. Eine
in Fig. 4 gezeigte Eichkurve wurde durch Auftragen der
Extinktion auf der Ordinate in Abhängigkeit von den
einzelnen Curdlankonzentrationen auf der Abszisse erhalten.
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Wie aus Fig. 3 und 4 ersichtlich, reagierte die nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene ZT-LAL-Lösung mit
ET und ergab eine Eichrelation mit einer guten Linearität,
wobei sie jedoch bei keiner Konzentration mit Curdlan
reagierte.
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Bei Durchführung der Messung unter Verwendung einer
Mischung gleicher Mengen der Probe mit 20 ng/ml Curdlan und
der Probe mit 1,0 EU/ml ET betrug die Extinktion der
Reaktionslösung bei 730 nm 0,458, welche die gleiche wie
diejenige war, die für die Probe mit 0,5 EU/ml ET allein
gemessen wurde (0,450).
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Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, kann entnommen
werden, daß die ZT-LAL-Lösung nicht mit Curdlan reagiert,
jedoch lediglich von ET aktiviert wird.
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Wie vorstehend beschrieben, gewährt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren, mit dem die Herstellung eines
Reagens zum Messen von ET leicht und wirksam unter
Verwendung von AL-Lösung als Ausgangsmaterial ohne irgendein
spezielles Verfahren möglich ist, wie beispielsweise
Fraktionierung und Rekombination von Komponenten in der AL-
Lösung. Damit stellt die vorliegende Erfindung einen
wesentlichen Beitrag zum Stand der Technik dar.