DE2062558A1 - Mittel zur Diagnose von primärem Leberkrebs und Verfahren zur Her stellung desselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel, welches sich zur klinischen Diagnose von primärem Leberkrebs (primärem Hepatom) eignet und diesen von Sbermetastase und anderen Leberkrankheiten zu unterscheiden vermag. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels.

Ss wurde im Jahre 1944 gefunden, daß das Serum von Rinderfetua eine cA 1-ßlobulinart enthält, welche als oifl-Fetoglobulih (Fetuin) bezeichnet wurde. (K.O. Pedersen, Nature 154, 575 (1944) .,Bs wurde sodann gefunden, daß diese spezielle Substanz ferner in den Seren der Fetus von anderen Tierspeeies vorkommt und daß es speoiesspezifisch ist. Dieser Entdeckung folgte die weitere Entdeckung_t daß die gleiche Substanz ebenfalls in dem Serum von menschlichem Fetus vorkommt\ GU ö# Bergstrand et al, J, Clin, & Lab, Invest. 8 174 (1956). Kürzlich konnte ferner durch immunologische fällungsreaktionen gezeigt werden, daß OC 1-Fetoglobulin in dem Serum von Patienten vorkommt, welche

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an primären Hepatomen (primärer Leberkrebs) leiden; Yu.S. - Tatarinov, Vop. Med. Khim, 11 (2) ,20 (1965) und andere.

Die vorliegende Erfindung ist das Ergebnis einer jahrelangen intensiven Forschung bezüglich der biochemischen Mechanismen dieser Krebsgeschwulste. Es -konnte sichergestellt werden, daß der Metabolismus von an Krebs erkrankten Menschen dem Metabo-. Iismu3 von menschlichem I\etus analog ist und daß ot 1-Fetoglobulin in enger Beziehung zu primärem Leberkrebs (primäres Hepatom) steht. Unsere Bemühungen haben sich sodann darauf konzentriert, ein für klinische Zwecke geeignetes diagnostisches k Mittel zur Erkennung derartiger Krebserkrankungen zu schaffen.

Diese Bemühungen wurden dadurch entlohnt, daß es schließlieh gelang, eine schnelle und äußerst genaue Methode zur Diagnose und zur quantitativen Bestimmung von derartigen Krebskrankheiten zu schaffen. Diese Diagnose erfordert nicht den Einsatz von komplizierten chemischen Operationen, sie ist daher billig und erfordert nur einfaches Gerät.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein diagnostisches Mittel zu schaffen, welches sich spezifisch und empfindlich zur Diagnose von Leberkrebs (primärem Hepatom) eignet, eine zuverlässige quantitaive Bestimmung erlaubt und nur in sehr ge- W ringem Maße zu zweifelhaften positiven Ergebnissen führt $ sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses diagnostischen Mittels.

Ein wesentlicher Teil der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung von Anti- oM-Fetoglabulin, d.h. einem Antikörper, welcher durch Immunisieren von Tieren mit einem Antigen hergestellt werden kann, welches sich von dem irtl-I?etaglobulin von Asaitea oder von dem Serum eines Patienten mit primärem Leberkrebs oder von Fetalserum ableitet. Dieses Anti-tXl-Fetoglobulin wird in

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Giner feinverteilton verfestigten Zubereitung angewandt, welche erhalten wird, indem man Anti- ocl-Itetoglobulin zusammen mit einem Trägermaterial auflöst und das Ganze sodann koagulieren läßt. Eine andere Zubereitung kann erhalten werden, indem man das Anti-o( 1-Fetoglobulin an einem Trägermaterial absorbiert und das Ganze sodann in einem Dispersionsmedium dispergiert.

Ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von reinem Anti- o£ 1-Peto_ globulin. Dieses Verfahren besteht darin, daß man zunächst Ascites oder ein Serum von einem Patienten, welcher an Leberkrebs erkrankt ist oder das Serum von menschlichem Fetus dazu verwendet, ein Tier zu immunisieren. Sodann wird von diesem Tier eine Blutprobe genommen. Von dieser Blutprobe wird das Serum abgetrennt und das Antiserum wird mit normalem menschlichem Serum absorbiert oder mit einem unlöslichen Immunoadsorbens, welches erhalten wird, indem man normales menschliches Serum mit z.B. Glutaraldehyd behandelt. Alternativ kann das Serum oder Ascites zunächst durch gewöhnliche proteinfraktionierung gereinigt werden und die erhaltene oCl-Fefcoglobulinfraktion wird dazu verwendet, ein Tier zu immunisieren. Sodann wird eine Blutprobe von dem Tier genommen und das Serum abgetrennt.

Ein weiterer wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von reinem «X.l-Petoglobulin, welches darin besteht, daß Ascitee oder das Serum eines an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten gegen Aorinol diaiysiert wird. Sodann wird das Dialysat gefällt und durch Proteinfraktionierung gereinigt.

Es wurde gwar zunächst versucht, die Gegenwart oder die Abwesenheit von otl-Fetoglobulin zur Diagnose von Leberkrebs heranzuziehen. Bis zu diesem Tage wurde jedoch auf dieser Basis kein

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■befriedigendes diagnostisches Mittel gefunden. Zur Zeit werden Immuhodiffusionstechniken und Immunoelektrophoretische Techniken, welche an sich bei vielen immunodiagnostischen Anwendungen brauchbar sind, analog angewandt. Bei der Immunodiffusion unterscheidet man die einfache Diffusionstechnik und die doppelte Diffusionstechnik. Die einfache Diffusionstechnik ist eine diagnostische Methode, bei welcher ein Röhrchen, welches das Antigen, den Antikörper und das Diffusionsmedium in Form von drei unterschiedlichen Schichten enthält, eine Fällungszone liefert, welche in der mittleren Schicht liegt, die aus dem Diffusionsmedium besteht. Die Höhe dieser Fällungszone ent-

k spricht dem optimalen Antigen-*· Antikörperverhältnis und dieses Niveau als diagnostisches Maß verwendet» Diese Technik ist im allgemeinen als Oudinsches Verfahren bekannt. Die Doppeldiffusionstechnik ist unter dem Namen Ouchterlonysches Verfahren bekannt geworden. Bei diesem Verfahren wird der Antikörper in eine zentrale Vertiefung eingebracht und das Antigen wird in einer Vielzahl von Satellitenvertiefungen platziert. Diese Vertiefungen werden in einer Agarschicht oder in einer Agarplatte vorgenommen. Sodann erscheint ein Präzipitationsring, dessen Position dem optimalen Antigen*- Antikörperverhältnis entspricht, welches für den Fall der einfachen Diffusionstechnik oben beschrieben wurde. Dieser Präzipitationsring wird für diagnostische Zwecke verwendet. Die Oudin'sehe Methode, bei welcher ein

) Präzipitationsring in einer Höhe gebildet wird, welche von den Diffusio&skoeffizienten und Konzentrationen von Antigen und Antikörper abhängt, ist besonders vorteilhaft bei der quantitativen Bestimmung des Antigens» Andererseits eignet sieh die Ouchterlony¹ sehe Methode mehr daau₉ zwischen verschiedenen Antlgenen zu unterscheiden.

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Die Immunoelektrophorese ist eine Kombination der gewöhnlichen Elektrophorese un der oben erwähnten Immumodiffusionsmethode. Wenn der Antikörper parallel zur Wanderungsrichtung des Antigens platziert wird, welches linear fraktioniert wurde, so entwickelt sich ein Präzipitationsring in einer Position, welche dem optimalen Verhältnis entspricht, das oben erwähnt wurde» Dieser Präzipitationsring wird als diagnostisches Maß verwendet. Diese Methode hat eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit.

Die beschriebenen diagnostischen Methoden wurden jedoch nicht spezifisch zur erfindungsgemäß angestrebten Diagnose von Leberkrebs entwickelt. Obwohl sie grundsätzlich anwendbar sind, haben sie doch mehrere Nachteile, unter welchen eine große Anzahl von zweifelhaften positiven Ergebnissen, teuere Apparaturen und komplizierte zeitaufwendige Prozeduren besonders erwähnt seien, welche mit derartigen Diagnosen zufälligerweise oder grundsätzlicherweise einhergehen. Somit war es wunschenwert, eine spezifischere und einfachere Methode zu schaffen, sodaß eine große Zahl von Patienten innerhalb einer kurzen Zeit diagnostiziert werden können.

Die von uns vorgenommenen Untersuchungen stellen einen Versuch dar, die zahlreichen Nachteile der bisher bekannten Methoden zu überwinden. Sie führten zu folgendem Ergebnis. Wenn man Anti-0^1-Fetoglobulin zusammen mit einem Trägermaterial auflöst und' dieser Lösung sodann Gelegenheit gibt, in einem dispergieren Zustand zu Erstarren oder wenn man das Anti- ,11-Fetoglobulin an einem Trägermaterial absorbiert und als solches in einem Dispersionsmedium dispergiert anwendet, so erhält man ein diagnostisches Mittel, welches direkt auf Aszites oder auf Serum von Patienten angewandt werden kann. Irgendwelche komplizierte Prozeduren können unterbleiben. Es ist ferner gelungen, ein diagnostisches Mittel herzustellen, welches selbst nach einer längeren Lagerungozeit stabil bleibt und welches in äußerst geringem Maße dazu neigt, zweifelhafte positive Resultate zu ergeben. Darüber-

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hinaus ist das erflndungsgemäße Mittel äußerst gut dazu geeignet,- einen sicheren Test für primären Leberkrebs (primäres , Hepatom) zu liefern. Die vorliegende Erfindung stellt den Gulminationspünkt der beschriebenen langwierigen Untersuchungen und Entwicklungen dar.

Zunächst soll im folgenden die Herstellung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels beschrieben werden, wobei der Antikörper Anti- ü<l--]?etoglobulin zusammen mit einem Trägermaterial aufgelöst wird und die lösung sodann im diffusen Zustand zum Erstarren gebracht wird. Somit wird dieses spezielle diagnostische Mi ttel hergestellt, indem man das Antigen &L l-JPetoglobulin dazu verwendet, ein Tier zu immunisieren, worauf das erhaltene Antiserum zusammen mit einem Trägermaterial aufgelöst wird und wobei ein Zusatz von oberflächenaktiven Mitteln, von "Farbstoffen und von Stabilisierungsstoffen erwünscht ist. Sodann wird das Ganze im diffusen Zustand zur Verfestigung gebracht. Das erfindungsgemäß angewandte Trägermaterial hat einen hohen Diffusionskoeffizient im viskosen Zustand und zur leichteren diagnostischen Erkennbarkeit ein gewisses Maß an Klarheit oder optischer Reinheit. Medien dieses Typs sind z.B. Agar, Dextrin, Stärke, pektin und andere Polysaccharide sowie verschiedene Protein, inel. Gelatine oder dgl. Bevorzugt sind Agar, synthetisches Polyacrylamidgel und Stärke. Das oberflächenaktive Mittel wird bei dem erfindungs-

™ gemäßen Verfahren dazu verwendet, den Prozentsatz an zweifelhaften positiven Ergebnissen herabzusetzen, welche bei klinischen Anwendungen auf Hypercholesterinsera zurückzuführen sind. Als oberflächenaktive Mittel kommen anionische oberflächenaktive Mittel in Frage, wie z.B, Natriumoleat, Natriumlaurylsulfat, Natriumoctylsulfat, N&triumstearylsulfat, Natriumalkylbenzolsulfonat, Natriumdialkylaulfosuccinat und so weiter, sowie kationische oberflächenaktive Mittel, wie z.B. Dodecylaminazetat, Benzyldimethylalkylainmonium-halogenid, Cetylpyridiniumhalogenid usw. und schließlich nichtionische oberflächenaktive Mittel wie z.B.

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f ensäureester, lOlyox.väthylen-häherer Alkohol-ätL, J₀Iy athyxen-alkylaryläthPlJ

Polyoxyäthylen-ri.lnuaöl-

^ _{Saponln> Iaurooholsäure}

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ve. Mitteln _slnd ϊο^οχ^Ι^^ («yp,, _welohe »!cationic „J,

Zur Erleichterung der Diagnose kann ein Farbstoff zugesetzt wer-

Ti tmnn to ToluWinWau, BriUiant-

BTto, iriiiiauttiau sei, klciaöilau,

Amid schwarz 1OB Ponceau 3R dienen. Unter diesen Farbstoffen sind Patentblau und Trypanblau besonders vorteilhaft. Als Stabilisierungsmittel können verschiedene phenolische Verbindungen, wie z.B. Kresol, Chlorthymol, Thymol, Paraoxybenzoesäurragter usw. verwendet werden, sowie quecksilberorganische Verbindungen, wie z.B. Thimerosal, Phenyl-Quecksilber-Azetat, Phenyl-Quecksilber-Borat usw., Chlorbutanol und andere Alkohole, Natriumazid und dgl* Im folgenden wird die vorliegende Erfindung im einzelnen beschrieben.

Zunächst wird zum Zwecke der Stabilisierung des diagnostischen Mittels eine Pufferlösung mit vorbestimmtem pH-Wert und vorbestimmter Ionenstärke fertiggestellt. Als Pufferlösung verwendet man vorzugsweise einen !Eris-Höl-puffer oder einen Glycin-Natriumchloridpuffer, obwohl Citratpuffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer und Barbituratpuffer ebenfalls verwendet v/erden können. Was die Konzentration dieser Pufferlösungen angeht, so wird der Bereich von schwach sauer bis schwach alkalisch ausgewählt, d.h. der Bereich zwischen pH 6,5 und pH 8,5. Deroptimale pH-Wert liegt irgendwo zwischen pH 7,2 und pH 8,2. 33ie oben genannte Pufferlösung wird in einem Behälter bei einer Temperatur von vorzugsweise 50° bis.56° C gehalten und das Trägermaterial wird in dieser lösung aufgelöst. Es ist bevorzugt, daß das Trägermaterial bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 15 Gew/V-^ zugegeben wird.

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Auf der anderen Seite wird das Antiserum, welches nach den oben beschriebenen Methoden isoliert wurde, in den gleichen Buffer aufgelöst, bis eine Endkonzentration von 1 bis 10 Gew/?-$ erhalten wird» Bie so erhaltene Lösung wird der $rägermaterial-P uff er lösung zugeiaischt, worauf das oberflächenaktive Mittel, und der Farbstoff* bis zu einer Endkonzentration von 0,01 bis 0,20 Gew/V-fS bzw. 0,001 bis 0,005 Gew/v-f£ zugesetzt werden. Falls das oberflächenaktive Mittel TaurochiLsäure ist, so sollte die Endkonzentration 0,2 bis 0,5 Gew/V-f£ betragen. Zu dieser Mischung wird n®& das Stabilisierungsmittel gegeben und zwar bis einer Sndkonzentration von 0*1 Gew/v-?£. Mach genügender . Durchmischung der Lösung wird ein bestimmter JUiteil dieser Mi-" schung in ein geeignetes Gefäß gegossen, ik welchem es bis zur Verfestigung stehen gelassen wird. Sodann wird die ahgeatreb'te Immunodiffusionsplatte hergestellt, indem man Vertiefungen in dem verfestigten Gemisch ausbildet, von dem aus das Testserum diffundieren kann· Selbstverständlich kann das beschriebene Verfahren in der einen oder anderen Weise modifiziert werden.

Das Gefäß, in welches das erfindungsgemäße diagnostische Mittel eingefüllt und eingelagert wird, muß vollkommen transparent sein und zur Verhinderung einer Verdampfung von feuchtigkeit hermetisch abgeschlossen sein. Barüberhinaus sollte die Konstruktion dieses Gefäßes eine leichte Handhabbarkeit ermöglichen. Als befriedigendes Gefäß wird ein farbloses, transpartentea Plastikgefäß angesehen, bei welchem das diagnostische Mittel bis zu einer Höhe von 2 mm reicht. Nachdem die vorgenannten Maßnahmen getroffen sind, kann die Diagnose und die quantitative Bestimmung erfindungsgemäß mit großer Leichtigkeit, Schnelligkeit una Genauigkeit durchgeführt werden* ¹KeMa. man nun. das Serum einer Testperson auf der oben erwähnten Immunodiffüsionsplatte äiffundieren läßt, so bildet eich im Falle der Anwesenheit von antigenea proteinen ein spezifischer Präaipitatlonsring aus· Mit diesem Test kö'nnei somit

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leicht Fälle von primärem Leberkrebs festgestellt werden. Der Bereich des Präzipitationsrings ist proportional der Menge an ,Antigen-Protein und somit kann die Menge an Antigen durch bloßes Bestimmen des Durchmessers des Ringes festgestelltwerden. Jegliches primäres Hepatom kann somit leicht festgestellt werden, indem man drei verschiedene Serumzubereitungen verwendetι Das Rohserum, ein zehnfaches Serum und ein hundertfaches Serum.

Da das erfindungögemäße diagnostische Mittel es ermöglicht, das Antigen quantitativ zu bestimmen, so gelingt damit leicht die Feststellung, in welchem fortgeschrittenen Stadium sich das primäre Hepatom oder der primäre Leberkrebs befindet.

Die folgende Beschreibung bezieht sich aui' die Ausführung der vorliegenden Erfindung, bei der das Anti-o(1-fetoglobulin, welches den Antikörper darstellt, auf einem Trägermaterial adsorbiert wird, welches sodann in einem Dispersionsmedium dispergiert

wird.

Zur Herstellung dieses diagnostischem Mittels wird Anti- o( 1-Fötoglobulin zuerst an einem Trägermaterial adsorbiert, welches sodann in einem Dispersionsmedium dispergiert wird. Das erfindungsgemäß verwendete Trägermaterial kann ein herkömmliches Adsorbens sein oder ein lononaustauscherharz. Es kommen unter anderem AIuminiumsilikat-Adoorbentien, wie z.B. Kaolin, Bentonit, Diatomeenerde, saurer Ton usw. in Frage. Ferner können Magnesium-AIuminium-Silikat-Adüorbentien Verwendetwerden, wie z.B. Beagumj sowie Kieselsäureanhydrid, Acrylharzadsorbentien, Polystyrollatex, Polyvinyltoluol-Latex., Bioglass (hergestellt von Muromachi Chemical Industries, Ltd.), Ionenaustauscherharze, z.B. Amberlite IRA 411, IEA 93, IR 45, IR 4 B, IRA 68 und IRD 50 (Rohm & Haas Company und Dowux 44. (Dow Chemical Go.). Da die Art des verwendeten TrüFermaterialR die Adsorption und die StabilitatseIgenrch-'ftfjn des diagnostischen Mittels beeinflußen, int es bevorzugt, ein Adsorptionsmittel zu verwenden, welchen gleichförmige Korngröße und sphärische Korngeutalt aufweist. Vorzugsweise sollte

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der Durchmesser der Körnchen bei 0,5 bis 3 Micron liegen.

Um das Anti- cxi1-Fetoglobulin erfindungsgemäß an dem Trägermaterial zv adsorbieren, muß das Trägermaterial zunächst in einer geeigneten Pufferlösung dispergiert werden, worauf sodann zu der erhaltenen Dispersion das Antiserum gegeben wird. Sodann wird sorgfältig durchgeschüttelt.

Für die Zwecke vorliegender Erfindung eignen sich verschiedene Pufferlösungen. Z.B. Tris-HCl-Puffer und Natrium chi or id-Aruinosäurepuffer und Barbituratpuffer, sowie Gitratpuffer, Phosphatpuffer und Boratpuffer. Es ist bevorzugt, daß das Trägermaterial in genügender Menge zugegeben wird, sodaß eine Endkonzentration von 0,2 bis 5 Gew/V-$ erreicht wird. Die Menge an zugegebenem Antiserum hängt von der Konzentration des Anti-t>(1-Fetoglobulins ab. Im allgemeinen wird das Antiserum zunächst in der genannten Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 10 Yol-°/o aufgelöst. Falls gereinigter Antikörper angewandt wird, so wird derselbe in der Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 1 Vol.-io aufgelöst und diese Lösung wird zu dem oben beschriebenen, das Trägermaterial enthaltenden Puffer gegeben, worauf genügend durchgeschüttelt wird.

Auf diese Weise wird das Anti-<X 1-Fetoglobulin, welches in dem Antiserum enthalten ist, an dem Trägermaterial adsorbiert, sodaß sich eine Anti- o( 1-fetoglobulin-Trägerinaterial-Kombinantion ergibt. Diese Anti- 0^1-Fetoglobuiin-Trägermaterial-Kombination wird sodann abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren und z.B. mit der gleichen Püfferlösung ausgewaschen. Sodann wird dieser Komplex in einem Dispersionsmedxüm dispergiert. Als Dispersionsmedium wird vorzugsweise eine der oben Erwähnten Pufferlösungen verwendet. Bei der Auswahl des Dispersionsmittels muß darauf geächtet werden j daß eine gleichförmige Dispersion von AnW-o^i-ü^iögiobuiin-Trägermateriai-Kömpiex erreicht wird und daß das Anti- ö<*1-Feto~

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globulin in einem stabilen adsorbierten Zustand gehalten wird_o

Als Dispergiermittel wird vorzugsweise Albumin, Pepton, Gelatine, Agar, Saponin, Argininsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polyphosphprsäure, Serum oder dgl. angewandt. Heben diesen Dispergiermitteln können verschiedene oberflächenaktive Mittel angewandt werden. Ein ausreichender Effekt wird erzielt, wenn man ein solches Mittel in einer Menge von 0,1 bis 1 Gew/v-$ anwendet.

Um die Diagnose zu erleichtern, kann ein Farbstoff dem diagnostischen Mittel einverleibt werden. Als Farbstoffe kommen die oben erwähnten Farbstoffe in Frage. Insbesondere erzielt man befriedigende Ergebnisse mit patentblau und Trypanblau.

Da das erfindungsgemäße diagnostische Mittel über längere Zeiträume gelagert werden muß, ist es vorteilhaft, eine geringe Menge eines stabilisierenden und haltbarmachenden Mittels zuzusetzen. Als solches Mittel kommen die bereits oben genannten Agentien in

Frage.

Es muß bemerkt werden, daß der Anti- öt.l-Fetoglobulin-Irägermaterial-Komplex bis zu einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 Gew/V-ji dispergiert werden sollte und daß die Dispersion in letzter Stufe auf einen pH-Wert von -6,5 bis 8,5 und vorzugsweise 8,2 bis 8,5 eingestellt werden sollte*

Das so erhaltene diagnostische Mittel ist dem oben erwähnten diagnostischen Mittel überlegen, d»h. dem Mittel, welches duroh Auflösen des gleichen Antiserums zusammen mit einem Srägerisateriöl und nachfolgendes Erstarren lassen im diffusen Zustand erhalten wird, insbesondere erlaubt das vorliegende diagnostische Mittel eine Diagnose innerhalb einer sehr kurzen Zeit. Beide erfindungsgemäße Typen von diagnostischen Mitteln können in ihrer Empfindlichkeit für die Bestimmung von Krankheiten wesentlich gesteigert werden, sodaß falsche positive Ergebnisse weitgehend ausbleiben

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und sodaß eine große quantitative Zuverlässigkeit erzielt wird. Zu diesem Zweck ist es erforderlich, ein möglichst reines Anti-oCl-Fetoglobulin zu verwenden. Um dies zu erreichen, ist es erforderlich, so weit wie möglich, Verunreinigungen aus Aszites oder aus dem Serum von an primärem Leberkrebs {primärem Hepatom) erkrankten Patienten oder aus Fetalserum zu entfernen.

Die folgenden Betrachtungen gelten in erster Linie für den Pail, daß Aszites oder das Serum von an primären Leberkrebs erkrankten Patienten oder Fetalserum dazu verwendet wird, um ein Tier zu immunisieren, welchem sodann Blut abgenommen wird, von dem das Serum abgetrennt wird, worauf das erhaltene Antiserum in normalem menschlichen Serum aufgenommen wird.

Bei diesem Verfahren wird Aszites oder das von einem an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten erhalten Serum oder Fetusserum z.B. zu der gleichen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung gegeben. Sodann folgt eine Zugabe einer gleichen Menge von Freund'sehern Adjuvans (hergestellt von Difco). Nach dem Emulgieren wird das System dazu verwendet, ein Tier zu immunisieren. Es kann z.B. ein Hase, ein Pferd oder ein Ochse hierzu verwendet werden. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem diese Lösung einem Kaninchen subcutan in den Fußbällen injiziert wird. Dies3 Injektionen werden von Zeit zu Zeit wiederholt und nachdem eine genügende Zunahme des Antikörpertiters festgestellt ist, wird dem Tier das Blut entnommen und das Serum wird abgetrennt. Das erhaltene Antiserum wird in normalem menschlichem Serum aufgenommen oder in dem oben erwähnten unlöslichen Immunoabsorbens, wobei ein spezifisches Antiserum erhalten wird.

Dieses Antiserum soll für die erfindungsgemäße Anwendung einen recht hohen Gehalt an Anti-oi1-Fetoglobulin haben, damit die Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode der fragliehen Krankheit erhöht wird, und damit die Häufigkeit von falschen Positiver-

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gebnissen herabgesetzt -wird. Es werden daher bessere Ergebnisse erzielt, wenn das obige Antiserum zunächst gereinigt wird, z.B. durch Franktionierung mit Ammoniumsulfat.

Da Aszites oder Fetusserum neben dem oCl-Fetoglobulin eine große Zahl von anderen Serumproteinen enthält, wie z.B. Albumin, V*"-Globulin usw. so werden beim Immunisieren von Tieren mit Aszites oder dem Serum neben dem Anti - o£l-J?ötoglobulin verschiedene andere Antikörper gebildet, welche den verschiedenen Serumproteinen entsprechen. Es ist daher erforderlich, dieses Antiserum in einer großen Menge menschlichem Serum zu absorbieren. Das in dieser Stufe erhaltene Anti-oCl-Fetoglobulin hat bereits einen hohen Beinheitsgrad und kann direkt zusammen mit dem Trägermaterial aufgelöst werden oder alternativ in einem Dispersionsmedium dispergiert werden, nachdem es an einen Träger adsorbiert wurde, sodaß ein befriedigendes diagnostisches Mittel erhalten wird.

Vorzugsweise wird jedoch das Antiserum nach der Absorption noch weiter gereinigt. Die folgende Beschreibung bezieht sich auf den Fall, daß Aszites oder das Serum eines an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten oder Petusserum zunächst durch Proteinfraktionierung gereinigt wird, wobei die erhaltene οι1-Fetoglobulinfraktion dazu verwendet wird, ein Tier zu immunisieren, welchem das Blut entnommen wird, gefolgt von einer Abtrennung des Serums aus der aufgefangenen Blutprobe. Daher wird Aszites oder das Serum eines an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten oder Fetusüerum zunächst mit herkömmlichen Serumproteinfrakbionatechniken gereinigt, Unter den bekannten Fraktioniertechniken seien insbesondere Oohn· s Fraktioniermethode, Spiro'-a modifizierte Methode, die Ammoniumsulfutfraktionierung (Aussalzung), die Gelfiltration, die Säulenchrornatography, die iaoelektris-che Frariktioriierung, die Elektrophorese, die Membranftitration und dgl. genannt. Diese Teolmiken können entweder alloine oder in Kombination angewandt werden.

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Sodann wird die erhaltene oQ-Fetoglobulinfraktion z.B. in der gleichen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst, worauf man Freund¹ s vollständiges Adjivants (Difco) zusetzt, um die Emulgierung herbeizuführen. Sodann werden Tiere mit dieser Emulsion immunisiert. Als Tiere kommen z.B. Kaninchen* Ziegen, Rinder und Pferde in Frage. Besonders bevorzugt sind Kaninchen, in deren Fußballen die Emulsion subcutan injiziert wird. Die Injektionen werden in geeigneten Intervallen wiederholt, wobei ständige die Zunahme des Antikörpertiters überprüft wird, wenn der Antikörpertiter einen maximalen Wert angenommen hat, so wird Ohrvene punktiert und es wird an jedem 2. Tag eine Blutprobe entnommen. Der Antikörptertiter erreicht seinen * maximalen Wert nach etwa 1 bis 2 Wochen nach der Injektion. Sodann wird das Serum abgetrennt und in einer kleinen Menge nornalen menschlichen Serums oder dessen Gel aufgenommen, um das erwünschte Anti- tjLl-Fetoglobulin zu erhalten.

Nach dem beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist lediglich eine geringe Menge normalen menschlichen Serums erforderlich, um das Anti serum aufzunehmen. "Nenn z.B. das Serum nicht gepeinigt wurde, so ist es erforderlich, eine Menge normalen menschlichen Serums zu verwenden, welche mindestens gleich der Antiserummenge ist. Demgegenüber kommen bei dem eben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren nur lediglich 0,1 bis 0,35 Teile normalen mensch- h liehen Serums auf ein Teil Antiserum. Darüberhinaus ist der Antikörpertiter des nach diesem Verfahren erhaltenen Antiserums zwei bis achtmal so groß, wie der Antikörpertiter von rohem Antiserum. Der Titer wird gegen ein standardisiertesAntigen bestimmt.

Mit Hilfe der beschriebenen Reinigungsmethoden kann ein hohes Maß an Reinigung erzielt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren int außerdem frei von Nachteilen, welche bisher unvermeidbar erschienen. Die Verwendung einer großen Menge menachlichen Blutoeruma war z.B. nicht nur in kommerzieller Hinsicht nachteilig, sie führte darüberhinauB auch au einer Herabsetzung des Anti-

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körper titer s, was auf ein Mitreißen des bei der Fällung zurückzufürhen ist. Darüberhinaus waren diese bisherigen Verfahren nicht dazu geeignet, die Schwierigkeit der Adsorption von Anti-o(2-Macroglobulin und analoger Substanzen zu vermeiden. Die vorliegende Erfindung gestattet es jedoch, ein hochreines Antiserum zu erhalten, wobei nur eine äußerst geringe Menge normalen menschlichen Serums erforderlich ist. Darüberhinaus besteht im wesentlichen keine Verunreinigung mit Anti-öl2-Marcoglobulin und analogen Proteinen. Ein weiterer wesentlicher Effekt beruht darauf, daß der AntikÖrpertiter des erfindungsgemäßen erhaltenen Antiserums weit höher liegt, als der bisher erzielbare AntikÖrpertiter. Das so herstellbare Antiod1-Fetoglobulinserum wird sodann entweder zusammen mit einem Trägermaterial in einer pufferlösung aufgelöst oder es wird an einem Trägermaterial absorbiert und sodann in einem Dispersionsmedium dispergiert. Auf diese Weise ist ein ausgezeichnetes diagnostisches Mittel erhältlich.

Durch Verwendung des derart erhaltenen Anti— eO-Fetoglobulins werden die diagnostischen Bedürfnisse vollkommen befriedigt,

Wenn jedoch ein ungewöhnlich hochgereinigtes diagnostisches Mittel z.B. fürwissenschaftliche Zwecke benötigt wird, so ffluß man das oCi-Petoglobulin bis zu einem extrem großen Heinheitsgrad reinigen. Erfindungsgemäß wurden solche Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem <j{1 -Fetoglobulin geschaffen.

Bei der im folgenden beschriebenen Reinigungstechnik wird Aszites oder das Serum eines an einem primären Hepatom erkrankten Patienten oder das Serum von menschlichem Fetus gegen Acrinol dialyr.iert und das von dem Dialysat erhaltene Präzipitat wird durch Proteinfraktionierung gereinigt.

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Aszites oder das Serum eines an einem primären Hepatom erkrankten Patienten oder menschliches Fetusserum wird mit ?/asser auf das 3 Ms 5-fache des ursprünglichen Volumens v.erdünnt und gegen einewässrige Lösung von 0,1 bis 0,01 Gew./Vol-jC Acrinol dialysiert. Es ist sehr vorteilhaft, die Dialyse gegen Acrinol durchzuführen, wobei das Serum oder Aszites als innere Phase während etwa 24 Stunden behandelt wird.

Sodann wird, die Acrinollösung zentrifugiert oder anderweitig zur Gewinnung des Sediments behandelt. Dieses Sediment stellt eine einigermaßen reine Form^von -X 1-Fetoglobulin dar. Trotzdem " enthält -"ieses Sediment noch geringe Mengen von Verunreinigungen, wie z.B. Albumin. Es kann daher durch die herkömmlichen Reinigungstechniken der proteinfraktionierung gereinigt werden, wobei ein noch reineres 0( 1-Fetoglobulin anfällt,, Unter den herkömmlichen Reinigungsmethoden durch Proteinfraktionierung sei die Ammoniumsulfatfraktionierung, die Dialyse, die Säufenchromatographie, die Membranfiltration und die isoelektrische Fraktionierung genannt, welche entweder alleine oder falls erforderlich oder erwünscht, in Kombination angewandt werden können. Die besten Ergebnisse werden mit folgendem Verfahren erzielt:

Zunächst wird das oben erwähnte Sediment z.B. in einer physiolo- ψ gischen Kochsalzlösung aufgelöst oder in einer Pufferlösung und der unlösliche Rückstand wird entfernt. Diese Lösung wird sodann gegen eine Pufferlösung dialysiert. (lonenstärke: 0,03 bis 0,04 M und pH 4,5 bis 5,5) Als Pufferlösung kann man z.B. einen Acetatpuffer, ein Tris-HCl-Salzpuffer, einen Natriumchlorid-Glycinpuffer, einen Barbituratpuffer, einen Gitratpuffer, einen Phosphatpuffer oder einen Boratpuffer verwenden. Sodann wird das Dialysat auf eine Carboxymethyl-Zellulosesäule gegeben (Ionenstärke: 0,03 bis 0,04 mj pH 4,5 bis 5,5). Man eluiert sodann in einem Bereich, welcher bei 0,03 bis 0,04 M beginnt und bei 0,2 M aufhört. Auf diese Weise wird das gewünschte c< 1-Fetoglobulin von der Säule

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eluiert, beginnend bei etwa 0,055 M. Die erhaltenen Fraktionen werden vereinigt und das reine \1--Fetoglobulin wird isoliert. Außer mit Garboxymethyl-Zellulose kann diese Säulenchromatographie auoh mit anderen Materialien durchgeführt werden, wie z.B. mit DEAE-Zellulose, TEAE-Zellulöse und dgl. Diese Bäulenchromatographie wird vorzugsweise wiederholt durchgeführt, z.B. zweimal oder mehrmals. Dabei sollte vorzugsweise mindestens eine der chromatographischen Behandlungen an Carboxymethyl-Zellulose durchgeführt werden.

Da die genannten Verfahren zu einem im wesentlichen reinen Fetoglobulin führen, welches fast vollständig frei von verunreinigendem Protein ist, ist dieses Verfahren das geeignetste Antigenreinigungsverfahren und es eignet sich aus den folgenden Gründen insbesondere gut zur Herstellung eines extrem reinen diagnostischen Mittels gemäß vorliegender Erfindung, welches insbesondere für wissenschaftliche Forschungen geeignet ist. Es ist äußerst erwünscht, daß das zur Herstellung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels verwendete o(.1-Fetoglobulin eine große Reinheit hat.

Wenn gU-Fetoglobulin mit einer recht großen Menge an Verunreinigungen als Ausgangsmaterial verwendet wird, so ist es notwendig, die diesen Verunreinigungen entsprechenden Antikörper im Laufe der Herstellung des diagnostischen Mittels zu entfernen. Diese Entfernung erfordert komplizierte Verfahren und bedingt eine erbebliche Beeinträchtigung der Produktausbeute.

Die folgenden Methoden eignen sich zum Isolieren und Reinigen von oU-Fetoglobulinj

1) Borgstrand und Csar verwendeten Fetusserum als Ausgangsmater i?;.l und fraktionier ten dasselbe elektrophoretisch» Sie fanden utt-Fetc^lobulin an einer fjtelle, welche mit der Position von Albumin zusammenfällt, V, ie berichteten, daß sie eine leiohte Differenz im Molekulargewicht festste Il ten, wobei die Ultra-

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zentriiugentechnik angewandt wurde. (Scand. J. Clin. & Lab. Invest., Band 9, Seite 277 (1957).

2.) David et al schickten TJmbilicalserum zweimal durch eine Kolonne mit Sephadex G-200 und eluierten mit einer wässrigen lösung von 0,1 M Natriumchlorid. Es wurde berichtet, daß das Konzentrationsmaximum des ^1~]?etoglobulins mit den Konzentrat ionsmaxima von Transferrin und Albumin zusammenfällt $ (J. din.Invest., 45 (1966).

3,) Hirai et al adsorbierten Fetusserum ar einer Säule von DEAE-Zellulose (pH 5,5; 0,02 M) und eluierten gegen 0,2 M, wobei ) dLi-Fetoglobulin als Schulter des Albuminpeaks eluiert wurde. Diese Fraktion wurde sodann an einer Säule von CM-Zellulose adsorbiert (pH 4»8 und 0,02 M) und eine Eluierung wurde gegen 0,5 M durchgeführt. Als Ergebnis wurden drei Maxima festgestellt, deren drittes sich als ^L 1-Fetoglobulin herausstellte. Die letztere "Hälfte dieses Maximums wurde wiederum chromatographiert, wobei ein einziges οΠ-Fetoglobulinmaximum erhalten wurde. (Berichtet vor der Society of Electrophoretic Researchers, 1. Oktober 1969).

Alle diese Arbeiten liefern jedoch nichts weiter als die Bestätigung für die Existenz des cfÜ-Fetoglobulins oder die Erzeuk gung von öCl-Fetoglobulin in unreiner Form. Diese bekannten Methoden führten nicht hochreinen oU-Petoglobulinpräparaten.

Das öLi-Petoglobulin muß jedoch eine besonders hohe Reinheit aufweisen, da die Reinheit des Präparats einen wesentlichen Einfluß auf die Genauigkeit dea diagnostischen Verfahrens unter Verwendung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels hat. Dies gilt Insbesondere für den Fall, daß das li-i-Fetoglobulin bei wissenschaftlichen Untersuchungen zur Diagnose von primären Hepatomen herangezogen wird.

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arm»>m- · . ■ ^t _ > - ί · ,ι.

Im Hinblick auf die dargestellte Situation wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um zu einem hochreinen Xi-Fetoglobulin zu gelangen, Insbesondere wurde nach einem Verfahren gesucht, um das verunreinigende Albumin möglichst vollständig und auf billige Weise zu entfernen. Diese Untersuchungen führten ochließlich zu dem Ergebnis, daß ein hochreines flÜ-Fetoglobulin dadurch erhalten werden kann, wenn man zunächst ö(1-Fetoglobulin enthaltende Sera oder andere Medien gegen Acrinol dialysiert. Rodann wird das Dialysat nach herkömmlichen Reinigungsmethoden unter Proteinfraktionierung gereinigt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde ein äußerst brachbares Verfahren zur Hernteilung von hochreinem ^1-Fetoglobulin geliefert, welches ohne komplizierte Verfahrensschritte durchgeführt werden kann. Im folgenden werden klinische Daten angegeben, welche sich auf die Anwendung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels beziehen.

In der Tabelle 1 sind klinische Ergebnisse zusammengestellt, welche bei der Anwendung deB erfindungsgemäßen diagnostischen Mittels erhalten wurden, wobei ein Trägermaterial angewandt wurde. Es wurden insgesamt 63 Fälle untersucht. Die meisten dieser Fälle wurden am National Cancers Center Hospital diagnostiziert, wobei es sich sowohl um stationäre Patienten als auch um ambulante Patienten handelte. Diese Gruppe zerfiel in eine Untergruppe von 12 Fällen von primärem Leberkrebs (11 dieser Fälle wurden durch Gewebsdiagnose festgestellt)j eine Gruppe von 15 Fällen metastatischen Leberkrebses} eine Gruppe von 15 Fällen von Leberzirrhose ; eine Gruppe von 22 Fällen von Hepatitis und schließlich eine Gruppe von einem Fall von Hepatoangioma. In der Tabelle 2 sind sowohl die quantitativen Ergebnisse der positiven Antigentests zusammengestellt, welche bei dem ausgewählten Personenkreis einen Präzipitationsring lieferten, als auch die Ergebnisse, welche mit der herkömmlichen diagnostischen Technik erzielt wurden.

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Tabelle	Krankheit	1	Zahl der posi tiven Ergebnis se
Primäres Hepatocarcinom Metastatisches Hepatocarcinom Hepatozirrhose Hepatitis Hepatoangiom	Zahl äer diag nostizierten lalle	11 0 0 0 0
12 15 15 22 1

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21 -

Tabelle 2

Initialen des Alter Geschlecht Antigen , Herkömmliche

Patienten (ü/ml)*** Methode **

Y.Y. 23 m 1.600 +

!>:.T. 65 w 9

S.W. 60 w 11 +

58 m 150 +

8 m 15.000 *) + ,

1»050 + ro

12 m 1.000 +

65 m 2.826 + '

19 m 5

62 ei 300 +

62 m 1.300 +

3 m 130 +

Es wurde Aszites verwendet; im übrigen wurde Serum verwendet. Ouchterlony'sehe Methode.
U/ml =0,3 JVmI.

η = männlich; ^σ

ν,' = weiblich; ^

ι ¹^⁰

_»	-Γ. S.
O CD	S.H.
OO
to cn	*U · υ φ
	ΎΎ- 1TtT ii.· K ·
to	E.A.
to	K.K.
	S.I.
	S.Y.

Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß in allen jenen Fällen, wo das erfindungsgemäße diagnostische Mittel positive Ergebnisse lieferte, die herkömmliche diagnostische Methode nicht ZUT Identifizierung der Krankheit führte, falls der Antigentiter geringer 10 ii/ml war.

Wenn zur Diagnose von primärem Leberkrebs das erfindungsgemäße diagnostische Mittel mit Trägermaterial angewandt wird, so führt die folgende einfache Prozedur innerhalb einer kurzen Zeitdauer zu einer sicheren Diagnose der Krankheit. Ein Tropfen ^ des diagnostischen Mittels wird auf einen Glasträger gegeben, v/o eine frische Probe von Serum mit dem diagnostischen Mittel durchmischt wird. Falls nun der Patient an primärem Leberkrebs leidet, so findet während der Durchmischung eine spezifische Agglutinationsreaktion statt. Wie aus den klinischen Daten der folgenden Tabelle 3 ersichtlich ist, zeigt ein Vergleich dieses diagnostischen Mittels und des vorher beschriebenen diagnostischen Mittels unter Anwendung eines Trägermaterials, daß alle Fälle von primärem Leberkrebs ein positives Ergebnis liefern, unabhängig davon, ob Serum oder Aszites verwendet wird.

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T_abelle "5

Trägerine thode

Initialen des	Probe Erfindungsg.	Durchmesser	Verdünnungsfaktor	l
Patienten	Verfahren	der Bande, mm
M.S.	Serum ++	6,0	X8	VÜ I
S.Y.	Serum >++	5,7	X8	1
CY.	Serum +	4,0	Originalserum
Y.S.	Serum +	4,2	Originalserum
K.N.	Serum ++	6,2	X8
K.Y.	Serum +	4,0	Originalserum
A.S.	Serum ++	7,3	X8
Ή. S.	Serum ++	6,0	X8
E.S.	Aszites +++	12,3	X8
S.Y.	Aszites ++	7,5	X8
Gesunder Mensch	Serum	0,0

Die obigen Daten wurden am National Cancers Center erhalten.

- = negativ; + = schwach positiv; ++ = Positiv und +++ = stark positiv.

lsi CD

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Herstellung des diagnostischem Mittels (verfestigtes Substrat). Beispiel 1

Zu einem Tris-HGl-Puffer (pH 7,2) wird Agar mit einem für immunologische Zwecke geeigneten Reinheitsgrad bis zu einer Endkonzentration von 1,5 fo gegeben und die Mischung wird erhitzt, sodaß sich das Agar vollständig auflöst. Sodann wird die Lösung bie einer Temperatur von 55° C stehen gelassen. In einem getrennten Ansatz wird nun Kaninchenantiserum in 0,35 Teilen normalen menschlichen Serums absorbiert, bis es eine Endkonzentration von 3Vol/?£ erreicht. Diese Serummischung wird sodann mit dem Agarsubstrat vermischt. Ferner werden Tween 80, Batentblau und Fatriumazid in Mengen zugegeben, welche den Endkonzentrationen von 0,-01 fo bzw. 0,001 $ bzw. 0,1 i° entsprechen. Nachdem diese Zusätze gleichmäßig verteilt sind, wird das System bis zu einer Tiefe von 1 mm in einen vorgewärmten Behälter gegeben. Nach dem Verfestigen oder Erstarren des Systems werden Vertiefungen von 3mm Durchmesser in vorbestimmten Intervallen vorgesehen. Die so erhaltene immunologische Agarplatte ist verwendungsfähig.

Beispiel 2

Zu einem Natriumchlorid-Glycin-Puffer (pH 8,2) wird Agar mit einem für immumologische Zwecke genügenden Reinheitsgrad bis zu einer Endkonzentration von 1,0 Gew./Vol.-$ gegeben. Sodann wird auf 50° C aufgeheizt. In einem getrennten Ansatz wird Pferde-Antieerum bis zu einer Endkonzentration von 4 Gew./Vol.-$ zu der gleichen Pufferlösung gegeben, worauf auch diese Lösung auf 50° C aufgeheizt wird. Die beiden Lösungen werden miteinander vermischt und Natriumtaurocholat wird bis einer Endkonzentration von 0,3 ^ zugegeben. Ferner werden Trypanblau und Chlorbutanol bis zu einer Endkonzentration von 0,002 $ bzw. 0,3 $> hinzugefügt.

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Fach der gleichmäßigen Veiteilung dieser Zusätze wird das System in einen Behälter gegossen. Nach dem Erstarren des Systems werden Vertiefungen eingearbeitet. Auf diese Weise wird ein immunologische Agarplatte erhalten.

Beispiele 5 -7

natriumchlorid wird zu einem Tris- oder Aminosäure-Puffer gegeben (pH 6,5 bis 8,5), sodaß eine isotonische Lösung erhalten wird. Die in der Tabelle 4 angegebenen Zusätze werden bis zu den ebenfalls angemerkten Endkonzentrationen hinzugegeben.

- 26 -

109Ι26/1Θ19

•VI -

Tabelle 4

Beispiel Substrat Endkonzen- Eetz-Ho. tration mittel

Endkanz, Farbstoff

Endkonz. Kons er Tie- Endkonz-s $> rungs st off ?S

Synthet.

polyacryl-

amid-gel

1,5

Hatriumoleat 0,1 Brilliant- 0,002 grün

Thymol 0,1

Pektin 1,3 Alkyltrimethyl- 0,05 Patentblau 0,001 Phenylqueek- 0,02 ammonium-bro- . silberacetat

mid

Dextrin 1,5 Polyoxyäthylen- 0,1

anhydrosorbit-

monolaurat Alcianblau 0,003

Uatriumni- 0,1 ' tr id

Stärke 1,0

' Agar

1.2 Saponin

Natrium-

iayristyl-

sulfat 0,03 Trypanblau 0,001

Phenylqueek- 0,01 silberbor at

0,15 Brilliantblau

0,004 Thimerosal 0,01

§ 3

Herstellung des diagnostischen Mittels (mit Trägermaterial dispergiort).

Beispiel 8

1,5g von gestoßenem, gereinigtem Amberlite IR 45 der Korngröße

1 bis 3jU> werden in 10 ml einer Natriumchlorid-Glycin-Pufferlösung (pH 8,2) diepergiert. Sodann wird die optimale Menge an Anti- λ1-Fetoglobulinserum zugegeben. Das System wird bei 4° C

2 Stunden geschüttelt, wobei das Anti- οι 1-Fetoglobulin an dem Trägermaterial adsorbiert wird. Sodann wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Das Sediment, welches aus mit Anti-tX 1-Fetoglobulin beladenem Amberlite IR 45 besteht, wird zweimal aentrifugiert, wobei jeweils die gleiche Pufferlösung wie oben verwendetwird, zu welcher 0,3 Gew./Vol.-$ Albumin und 0,1 Gew./Volr·^ Natriumazid gegeben wurden. Nach diesen Auswaschoperationen wird das mit Anti- o( 1-Petoglobulin beladene Trägermaterial in etwa 90 ml der gleichen Pufferlösung dispergiert und auf einen pH-Wert von genau 8,2 gebracht. Ein zusätzliches Volumen des gleichen Puffers wird hinzugegeben, sodaß das Gesamtvolumen den .Vert von 100 ml erreicht.

Beispiel 9

1,5g gestoßenes, gereinigtes Amberlite IRA 411 der Korngröße bis 3 & werden in 5 ml Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,2) dispergiert, worauf die optimale Menge von fraktioniertem, Anti-p^1-Fetoglobulin sowie 0,01 g Patentblau zugegeben werden. Das System wird sodann 2 Stunden bei 4° G geschüttelt, wobei das Anti-t* 1-Fetoglobulin adsorbiert wird.

Das System wird zentrifugiert und das anfallende, mif Anti-Feto-.globulin beladene Amberlit IRA 411 wird zweimal zentrifugiert, wobei die gleiche Pufferlösung wie oben verwendet wird, wobei dieser jedoch 0,5 Gew./Vol.-# normales Kaninchenserum und 0,1 Gew./Vol.-^ IJatriumazid zugesetzt wurden. Nach dem Auswaschen wird das Sediment in etwa 90 ml der gleichen Pufferlösung wie

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BAD OFUQlNAL

oben dispergiert und auf einen pH-Wert von genau 8,5 gebracht." Bin zusätzliches Volumen des gleichen Puffers wird dazu verwendet, um das Gesamtvolumen der Dispersion auf 100 ml zu. bringen.

Beispiel 10

0,25 g Polystyrollatex der Korngröße 0,8/i werden in 8 ml Natriumchlorid-Phosphatpuffer (pH 8,5) dispergiert, ?\/orauf eine optimale Menge Anti- c* 1-Fetoglobulinserum zugegeben verden. Das System wird sodann 1 Stunde bei 37° C geschüttelt, wobei das Anti-o41-Fetoglobulin an dem Trägermaterial adsorbiert wird. _fc Sodann wird das System zentrifugiert und der erhaltene, mit Anti-(^ 1-Fetoglobulin beladene Latex wird zweimal zentrifugiert, wobei die gleiche Pufferlösung wie oben verwendet wird, welcher 0,1 Gew./Vol.-$ Natriumazid zugesetzt wurden. Nach dem Auswaschen wird der mit Anti-pd-Fetoglobulin beladene Latex in etwa 90 ml der gleichen Pufferlösung wie oben dispergiert und die Dispersion wird auf einen pH von 8,5 gebracht. Das Gesamtvolumen der Dispersion wird mit zusätzlichem Puffer auf 100 ml gebracht.

Beispiel 11

Kaolin wird gereinigt und durch Fraktionierte Fällung auf eine Teilchengröße von 1 bis 3M gebracht. 2 g dieses Kaolins werden in 10 ml Natriumchlorid-Borat-Puffer dispergiert. Sodann wird eine optimale Menge Anti- oO-Fetoglobulin hinzugegeben, sowie 0,01 g Brilliantblau FGF. Das System wird 2 Stunden bei 4° G geschüttelt, wobei das Anti-pi1-Fetoglobulin an Kaolin adsorbiert wird. Der Anti-oli-Fetoglobulin-Kaolin-Komplex wird zweimal mit der gleichen Pufferlösung wie oben gewaschen, welche allerdings 0,5 Gew./Vol.-^ Tween 80 und 0,01 Gew./Vol„-# Thimerosal enthält. Ferner werden zu diesem System etwa 90 ml der gleichen Pufferlösung gegeben, sodaß sich der pH-Wert des Systems auf 6,5 ein~ stellt. Schließlich wird eine zusätzliche Eenge dieser Pufferlösung dazu verwendet, das Gesamtvolumen des Systems auf 100 ml zu bringen.

109826/1819 ^{: {}

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Herstellung von Anti-p^i-D'etoglobulin Beispiel 12

1 Gewichtsteil des Serums eines an primärem Leberkrebs leidenden Patienten wird zu 2 Gewichtsteilen einer 0,03 M Lösung von Zinkazetat gegeben. Das Ganze wird sodann in Äthanol aufgelöst. Die 28 Yol.-fo-lgß Äthanolische Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,4 eingestellt und sodann 14 Stunden bei -5° G stehengelassen. Die Losung wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird weiter verarbeitet. Eine 0,02 M Lösung von Bariumazetat wird zu diener überstehenden Flüssigkeit gegeben und die Mischung wird auf eine 25 Vol.-$-ige äthanolische Lösung gebracht, welche auf einen pH von 6,7 eingestellt wird. Die Lösung wird sodann 2 Stunden bei -5° 0 stehengelassen und am Ende dieser Zeltdauer zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird sodann auf eine 40 VoI₀- ^σ/ο~Ige Uthanolisehe Lösung gebracht, welche wiederum 2 Stunden bei -5° 0 stehengelassen wird. Sodann wird die Lösung zentrifugiert und die überstehende Lösung wird auf eine 40 Vol.-$-ige äthanolische Lösung gebracht, welche schließlich 14 Stunden bei -10° G stehengelassen wird. Am Ende dieser Zeitdauer wird das erhaltene Präsipitat isoliert. Das Fräzipitat wird in einer Lösung von Natriumcitrat aufgelöst, und die Gesaintlösung wird bei 4° G gegen Wasser während 2 Tagen dialysiert. Am Ende dieser Zeitdauer wird das Dialysat zur Isolierung des Antigens lyophilisiert (Gefriertrocknung) .

Eine vorbestimmte Menge dieses Antigens wird dazu verwundet, Kaninchen nit dor Methode des vollständigen Adjuvann zu immunisieren und wenn der Antigentlter den erwünschten .Yert erreicht hat, wird den- Kaninchen Blut entnommen, von dem daa Serum abgetrennt wirf], 3u dienern Herum werden 0,2 Volunenteilo normalen menschlichen .'terurrn; gegeben und d Lo ,Uachun;- wird .sodann 1 Stunde lang be.i 37° C ut'ihongeluuijen und ;;odann nochmals bei 4° 0 über Nacht ytohon; filatuuin. Die oben erwfhnte Prozedur wird nun wiederholt, wobei ,itifioch anstelle de.; rnenaohlichen Serums Immunoadsorbens

109826/1819 __5o

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verwendet wird.

Das Immunoadsorbens wird in folgender Weise hergestellt?

',0 ml normalen menschlichen Serums werden mit einer Azetatpafferlösung auf einen pH von 5,5 gebracht. Sodann werden 1,0 ml Glutaraldehyd hinzugegeben und das Ganze wird 3 Stunden stehengelassen. Fach der Zugabe einer Phosphat-Pufferlösung wird zentrifugiert und der Niederschlag isoliert.

Der Niederschlag wird mehrmals mit der obigen Pufferlösung gewaschen und in der gleichen Pufferlösung suspendiert.

Beispiel 13

Zu einem Teil des Serums eines Patienten werden 1 Teil 0,1 M Natriumchlorid-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) gegeben, worauf allmählich .2 Teile einer gesättigten wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat unter Rühren zugegeben werden,Dabei bildet sich ein Niederschlag. Das System wird über Nacht bei.4° C stehengelassen und am nächsten Morgen mit 8000 Umdrehungen/Minute während 20 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird während einiger Tage bei 4° 0 gegen Wasser dialysiert. Am Ende dieser Zeitdauer wird das Dialysat zur Gewinnung des erwünschten Antigens lyophilisiert.

Dieses Antigen wird dazu verwendet Ziegen zu immunisieren, worauf die gleiche Behandlung wie bei Beispiel 12 erfolgt. Das so erhaltene Antiserum wird mit 0,35 Volumteilen normalen menschlichen Serums durchmischt und es wird das erwünschte Anti- X1-Petoglobulinserum erhalten.

BeiBpieI 14

Eine probe von 5 ml Ascites eines an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten wird auf eine Säule von Sephadex G-200 (3 x 100 cm) gegeben und sodann wird mit einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung

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(pH 8,0) rait einer Geschwindigkeit von 20 "bis 25 ml/h eluiert. Die dem /'-Globulin entsprechende Fraktion (zweiter Peak) und die dem Albumin entsprechende Fraktion (dritter Peak) werden nach der Ouchterlony'sehen Methode bestimmt, um die oU-Fetoglobnlinfraction festzustellen. Diese wird gesammelt. Sie wird gegen Wasser als externe Phase bei 4° C während einiger Tage dialysiert und das Dialysat wird bei Unterdruck konzentriert. Dabei wird ein Kollodiumbeutel oder ein Kollodiumschlauch verwendet.

Das erhaltene Antigen wird dazu verwendet, Kaninchen zu immunisieren, wonach eine Behandlung ähnlich der in Beispiel 12 beschriebenen erfolgt. Das erhaltene Antiserum wird in 0,2 Volumenteilen von normalem menschlichem Serum absorbiert, wobei das erwünschte Anti- c^i-Fetoflobulinserum erhalten wird.

Beispiel 15

Das gemäß den vorhergehenden Beispielen erhaltene Antigen wird weiter mittels der isoelektrischen Fraktionierung oder der isoelcktri chen Fokussierung gereinigt. Dabei läßt man das Antigen über eine Rohraucker-Gradientensäule laufen, welche 0,5 YoI.-fo Trägeramphol:-t mit einem pH von 3 bis 10 enthält. Dabei wird die Säub auf 4° C gehalten. Es wird während 2 Tagen eine Spannung von 700 Volt angelegt. Nach der Trennung werden die Fraktionen von pH 4,2 bis 4,5 abgetrennt vereinigt und bei 4° 0 während einiger Tage dialysiert, wobei Wasser als äußere Flüssigkeit verwendet wird. Das Dialysat wird sodann bei Unterdruck unter Verwendung eines Kollodiumbeutels oder-schlauchs zur Gewinnung des erwünschten Antigens konzentriert.

Dieses Antigen wird dazu verwendet, Kaninchen zu immunisieren, welche in der gleichen Weise wie in Beispiel 12 behandelt werden. Das erhaltene Antiserum wird in. 0,1 Volumenteilen normalen menschlichen Serums absorbiert, wobei das gewünschte reine Anti- -Fotoglobulinserum erhalten wird.

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BAD ORlGlNM.

Darstellung von (^1-Fetoglobulin Beispiel 16

Eine 50 ml Probe von Aszites eines an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten wird auf das vierfache des ursprünglichen Volumens mit Wasser verdünnt und die verdünnte probe wird gegen 5 1 einer 0,1 Gew./Vol.-$ Lösung von Akrynol während 24 Stunden dialysiert. Die Akrynollösung wird bei 4000 upm zentrifugiert und das Sediment wird unter Schütteln in 50 ml'physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wird ein 2. Mal bei 4000 upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gegen eine Azetatpufferlösung (lonenstärke 0,04, pH 5,0) dialysiert und das Dialysat wird auf eine Säule von Carboxyraethylcellulose (pH 5,0, lonenstärke 0,04) gegeben, welche bis 0,2 M eluiert wird» Da £*J-Fetoglobulin bei etwa 0,055 M zu Eluieren beginnt, wird diese Fraktion abgetrennt. Dieses Verfahren wird zwimal wiederholt, wobei man eine einzige ^1-Fetoglobulinfraktion erhält.

jährend der σΟ-Fetoglobulintiter bei dem ursprünglichen Aszites 3146 IT/ml (50 ml) beträgt, so liegt Endtiter von 600 U/ml (200 ml) vor, was einer Ausbeute von 70 Gew./Vol.-fo entspricht. Die ursprüngliche Menge an Albumin beträgt 7,623 mg/ml.(50 ml). Es ist jedoch unmöglich, auch nur geringste Spuren von Albumin bei der letzten Stufe mit einer Immunoplatte festzustellen.

Beispiel 17

Eine 50 ml Probe von Aszites eines an .Leberkrebs erkrankten Patienten wird mit Wasser auf das vierfache des ursprünglichen Volumens verdünnt und gegen 5 1 einer 0,05 Gew./Vol.-^ Lösung von Akrynol während 24 Stunden dialysiert. Das Dialysat wird bei 3000 upm zentrifugiert und das Sediment wird unter Schütteln in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wird ein zweitesmal bei 3000 upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gegen Tris-HCl-Pufi'er dialysiert (0,03 M, pH 4,5) und

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das "T)IaIysat' wird auf eine Säule von DEAE-Cellulose gegeben (pH 4,5, Ionenstärke 0,04). Diese Säule wird "bis u,2 M eluiert. Das Eluat wird in ähnlicher Weise mit einer CM-Oellulosesäule behandelt, wobei man eine einzige ad-Fetoglobulinfraktion erhält.

Während der oCi-Fetoglobulintiter des ursprünglichen Aszites 2500 u/ml (50 ml) beträft, so beobachtet man einen Endtiter von 400 u/ml (180 ml). Dies entspricht einer Ausbeute von Gew.-/Vol.-^.

Während die ursprüngliche Menge Albumin 7,915 mg/ml (50 ml) beträgt, so ist es unmöglich, im letzten Stadium mittels der Immunoplatte eine Verunreinigung durch Albumin festzustellen.

- Ansprüche -

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Claims (14)

PATENTANSPRÜCHE

1.) Mittel zur Diagnose von primärem Leberkrebs, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Anti- (XJ-Fetoglobulin.

2.) Mittel nach Anspruch 1, da du¹ roh gekennzeichnet, daß das Anti- yt, 1-Fetoglobulin in feinverteilter-Form in einem erstarrten Substrat vorliegt, vorzugsweise gemeinsam mit einem oberflächenaktiven Mittel und einem Farbstoff und einem Konservierungsmittel.

3.) Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat ein Polysaccharid, vorzugsweise Agar, Dextrin, Stärke oder Pektin, oder ein Protein, vorzugsweise ein synthetisches Polyacrylamidgel ist.

4.) Mittel nach einem der Ansprüche 2 oder 3> d a d u r c h: :. gekennzeichnet , daß das oberflächenaktive Mittel Saponin, Polyoxy-äthylen-anhydrosorb-it-monolaurat,. Natriumoleat, Taurocholsäure öder Tween 80 ist.

5») Mittel nach einem der Ansprüche 2 bis 4» gekennzeichnet durch einen Gehalt von 1 bis 10 Gew./Vol.-$ des " Anti-t>^1-Fetoglobulins von 1 bis 15 (Jew,./Völ,-fo des Substrats

und gegebenenfalls durch einen Gehalt von 0,01 bis 0,2 Gew./ YoI.-fo oberflächenaktives Mittel, 0,001 bis 0,005" Gew ./Vol.-^ Farbstoff und 0,1 Gew./YoI,-?ί Konservierungsmittel,

6.) Mittel nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß. das Anti-,^ 1-Fet oglobulin an einem Trägermaterial * absorbiert ist, welches in einem Dispersionsmedium dispergiert ist, vorzugsweise gemeinsam mit einem Farbstoff und einem

Konservierungsmittel. ■ ■

■f*. ^c ~

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- ■£■-

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7.) Mittel nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η se ichnet , daß das Trägermaterial ein Adsorbtionsmittel, vorzugsweise Polystyrollatex oder Kaolin, oder ein Ionenaustauscher, vorzugsweise ein Styrolharz mit -IJHp und =KH als aktive Gruppen oder mit -U (Alkyl)p-Alkylol als aktive Gruppen ist und vorzugsweise im wesentlichen aus sphärischen Teilchen mit 0,5 - Ί)Μ- Durchmesser besteht.

8.) Mittel nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Dispersionsmedium eine Pufferlösung, vorzugsweise mit einem Natriumchlorid-Glycinpui'fer, einem Tris-HCl-Salzpuffer, einem Matriumchlorid-Phosphatpuffer oder einem Uatriumchlorid-Boratpuffer ist, welche gegebenenfalls ein Dispergiermittel, vorzugsweise Arginin enthält.

9.) Mittel nach einem der Ansprüche 6 bis 8, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 0,5 "bis 5 Gew./Vol.-^ Anti- oO-Fetoglobulin-Trägermaterial-Komplex und gegebenenfalls von 0,01 bis 0_t2 Gew./Vol.-# farbstoff und von 0,001 bis 0,005 Gew./Vol.-# Konservierungsmittel.

10.) Mittel nach einem der Ansprüche 2 bis 9» dadurch gekennzeichnet , daß der Farbstoff aus Patentblau, Trypanblau, Brilliantblau PCF, Brilliantgrün oder Alcianblau besteht und daß das Konservierungsmittel Hatriumazid, Chlorbutanol, Thymol, Phenylquecksilberacetat oder Thimerosal ist.

11.) Verfahren zur Herstellung des daignostischen Mittels nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Anti-^I-Fetoglobulin zusammen mit dem Substrat und gegebenenfalls mit dem oberflächenaktiven Mittel, dem Farbstoff und dem Konservierungsmittel aufgelöst wird und zum Erstarren gebracht wird. '

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12.) Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Mittels nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Anti- :X1-Fetoglobulin an dem Trägermaterial adsorbiert wird, worauf das beladene Trägermaterial gegebenenfalls zusammen mit einem Farbstoff und einem Konservierungsmittel in dem Dispersionsmedium dispergiert wird.

13.) Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Mittels nach * einem der Ansprüche -1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Anti- oU-Fetoglobulin als Antikörper im Tierversuch durch Impfen mit Ascite's oder Serum eines an primärem Leberkrebs erkrankten Patienten gewonnen wird, wobei das Antikörperserum in normalem menschlichem. Serum oder in Immunoadsorbens aufgenommen wird.

14.) Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch eine vorherige Reinigung des Ascites oder des Serums durch Dialyse, vorzugsweise gegen Acrinol der Konzentration 0,1 bis 0,01 G-ew./Vol-^ und/oder durch Proteinfraktionierung, vorzugsweise durch Oohn¹ s Fraktionierung, Spiro's modifizierte Methode, Ammoniumsulfatfraktionierung, ψ . Gelfiltration, Säulenchromatrographie, isoelektrische Fraktionierung, Elektrophorese und Membranfiltration.

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