DE1617951A1 - Process for the preparation of casugamein - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues duroh !Fermentation erfolgendes verfahren zur Herstellung eines wert-vollen Antibiotikums , das Kasugamycin genannt wird. Insbesondere bezieht sich sich auf ein unter aeroben Bedingungen verlaufendes Verfahren .zur Gewinnung dieses Antibiotikums in einer hohen Ausbeute, bei welchem Kasugamycin erzeugende Organismen in Medien gezüchtet werden, die pflanzliche öle, pflanzliche Fette, tierische Öle, tierische Fette, Fettsäuren oder Ester von Fettsäuren als hauptsächliche Kohlenstoffquelle enthalten.The invention relates to a new permanent fermentation process for the production of a valuable antibiotic called kasugamycin. In particular, refers to one that proceeds under aerobic conditions Method for obtaining this antibiotic in one high yield in which kasugamycin producing organisms are grown in media containing vegetable oils, vegetable Contain fats, animal oils, animal fats, fatty acids or esters of fatty acids as the main carbon source.

1 09 315/18881 09 315/1888

Kasugamycin ist ein Antibiotikum, das" von t^:iieaa«vc., O.cUui, Hashimoto, ouhara, Hamada und Tal:euchi (vergleiche Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101-103, 1965) entdeckt wurde* es wird in Eoria des salzsauren Salzes, G-, .Hp₁-OqIT^-HCl*H„0, kristallisiert, welches in V/asser löslich und in Methanol, Äthanol, Aceton, iLthylacetat, ^ther, Chloroform und Benzol iji v/esentlichen unlöslich ist. Dieses Salz zeigt zwischen 220 fliu und 400 mu keine maximale Absorption von ultraviolettem Licht und liefert mit einem Ninhydrin-Heagens in Pyridin eine positive Reaktion. Die 3akagu.ch.i-, iiolisch-, Elsonüiorgan-, !ehling, Tollens- und Eisen(lll) chlorid-Reaktionen verlaufen negativ. Sie Verbindung besitzt eine ile ent s drehung von [m*Jj) = 4· 120° (c = 1,6, HpO) , der Schmelzpunkt liegt bei 236 - 239 G (Zersetzung) , während die pK-_s/erte niedriger als 2, 7,1 und 10,6 sind. Kasugamycin kann ferner in Porm der freien Säure, G-, .HpcOqN^'HpO, zur Kristallisation gebracht werden und ist in dieser i'orni in Hasser löslich. Die Verbindung schmilzt bei 207 - 216° G unter Zersetzung und besitzt eine Drehung von jjCjp f 115° G (c = 1, H₂O). Die Struktur von Kasugamycin wurde von Suhara, ivlaeda, TJdiejsawa, Ohno (tetrahedron letters, Hr. 12, 1239-1244, 1966) untersucht und wie folgt gefunden:Kasugamycin is an antibiotic that was discovered "by t ^: iieaa" vc., O.cUui, Hashimoto, ouhara, Hamada and Tal: euchi (see Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101-103, 1965) * it is discovered in Eoria of the hydrochloric acid salt, G-, .Hp ₁ -OqIT ^ -HCl * H "0, which is soluble in water and essential in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, ether, chloroform and benzene This salt shows no maximum absorption of ultraviolet light between 220 fliu and 400 mu and gives a positive reaction with a ninhydrin heap in pyridine. and iron (III) chloride reactions are negative.The compound has an ile deformation of [m * Jj) = 4 · 120 ° (c = 1.6, HpO), the melting point is 236-239 G (decomposition ), while the pK _s / erte lower than 2, 7.1 and 10.6 are. kasugamycin may further Porm in the free acid, G, .HpcOqN ^ HPO, be brought to crystallization, and is soluble in haters in this i'orni. The compound melts at 207-216 ° G with decomposition and has a rotation of jjCjp f 115 ° G (c = 1, H ₂ O). The structure of kasugamycin was examined by Suhara, ivlaeda, TJdiejsawa, Ohno (tetrahedron letters, Hr. 12, 1239-1244, 1966) and found as follows:

7 5/1888 ©*O7 5/1888 © * O

CH_x OH OHCH _x OH OH

1 2 111 2 11

,09—0., 09-0.

HHHH

HH₂ HO OHHH ₂ HO OH

Der Diaminozucker ist 2, 3» 4, 6-tetradesoxy-2,4-diamino-D-Lnaniiose. Die glykosidische Bindung ist in der «rStellung. !•er rechte Seil ist D-inosit. Die Wasserstoff atojie in den Stellungen G-,, G , C und Gg in dem D-inosit sind axial, während die ',/asserstoffatojie in den Stellungen 0, und C₁-äquatorial sind.The diamino sugar is 2, 3 »4, 6-tetradeoxy-2,4-diamino-D-lnaniiosis. The glycosidic bond is in position. ! • the right rope is D-inositol. The hydrogen atoms in the positions G, G, C and Gg in the D-inositol are axial, while the hydrogen atoms in the positions 0 and C _{1 are} equatorial.

3 .asu^aaiycin inhibiert tiricularia oryzae, welche den üeisbrand verursachen, sov/ie verschiedene Bakterien, insbesondere Pseudoüionas, und zeigt gegenüber Menschen, Tieren, Fischen und Iflanzen eine geringe Toxizität. Dieses Antibiotikum wird zur verhütung des Seisbrandes (rice blast) auf den i^arkt gebracht und wiräjaußerdeiii als Cheaotherapeutikum gegen Pseudojionas-lniektionen beiü /Menschen verwendet.3 .asu ^ aaiycin inhibits tiricularia oryzae, which causes ice blight cause so / ie various bacteria, in particular Pseudoüionas, and shows towards people, animals, fish and plants have low toxicity. This antibiotic is used to prevent rice blast on the i ^ arkt brought and wiräjaußerdeiii as a cheaotherapeutic against Pseudojionas instructions used in humans.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein verfahren sur Herstellung von jlasugadiycin in hohen Ausbeuten durch Suchtv:ng von kasugamycin erzeugenden Organismen in ..leaien, die pflanzliche öle, rilviaslic/a-e i^Tette, tierische öle, tierische jfette, j'ettsöuren. oder Sster von fettsäuren als hauptsächliche Kohlen-The present invention provides a method for the production of jlasugadiycin in high yields by addiction of kasugamycin-producing organisms in .. leaien, the vegetable oils, rilviaslic / ae i ^T ette, animal oils, animal fats, j'ett acids. or Sster of fatty acids as the main carbon

⁸⁸⁸⁸⁸⁸

stoffquelle enthalten, geschaffen. Zu dem Medium kann als Stickstoffquelle irgendein Stickstoff enthaltendes Nähroiaterial, welches nicht den Kasugamycin erzeugenden Stamm und die G-ewinnung von Kasugamycin inhibiert, zugegeben werden. Die Medien enthalten anorganische Salze, äie zum ",■/achsen des Kasugamycin erzeugenden Stammes erforderlich sind und die Produktion von Kasugamycin stimulieren. Bin .laterial, wie beispielsweise vermahlener Sojabohnensamen, vermahlener Srdnuiisamen oder dergleichen, das sowohl die Stickstoffquelle als auch CIe oder Fette enthält, kann ferner erfindun-rsgemäß verwendet werden. Erfindungsgemäß wurde die Einsporenzüchtung von utreptomyces kasugaensis ATOG Hr. I5714 und 15715 mit oder ohne Behandlung mit ultravioletten Strahlen, Röntgenstral: en oder mutagenen Mitteln zur Erzielung von Kulturen durchgeführt, wobei eine hohe Ausbeute an Kasugamycin in dem Fermentationsmedium erzielt wird. Es hat sich herausgestellt, daß pflanzliche Öle, pflanzliche Fette, tierische Fette oder tierische öle als Kohlenstoffquellen zum Wachsen der Organismen und zur Gewinnung von Kasugamycin geeignet sind.source of material included, created. The medium can be sent as Nitrogen source any nitrogen-containing sewing material, which does not inhibit the kasugamycin producing strain and the recovery of kasugamycin was added will. The media contain inorganic salts, aie for ", Axes of the kasugamycin producing strain required and stimulate the production of kasugamycin. Am. Material, such as ground soybean seeds, ground pulp seeds or the like, which contain both the Contains nitrogen source as well as CIe or fats can also be used according to the invention. According to the invention became the single spore breeding of Utreptomyces kasugaensis ATOG Mr. I5714 and 15715 with or without treatment with ultraviolet rays, x-rays or mutagenic Means for obtaining cultures carried out with a high yield of kasugamycin in the fermentation medium is achieved. It has been found that vegetable oils, vegetable fats, animal fats or animal oils are suitable as carbon sources for the growth of the organisms and for the production of kasugamycin.

Experimentelle Methoden:Experimental methods:

1. Wertbestimmung von Kasugamycin: Iseutomonas fluorescens wird auf ein Schrägagar auf geimpft, das aus 0,2 $ Hatriumglutamat, 0,2 % K₂HPO₄, 0,1 96 MgOl₂* 6H^O, 0,01 /O FeS0,«7H₂0, 2,0 $> Rohrzucker, 0,2 fö Hährhefe, 0,5-7* iepton und 1,2 /0 1. Determination of the value of kasugamycin: Iseutomonas fluorescens is inoculated on an agar slant made of 0.2 % sodium glutamate, 0.2% K ₂ HPO ₄ , 0.1 96 MgOl ₂ * 6H ^ O, 0.01 / O FeSO, «7H ₂ 0, $ 2.0> cane sugar, 0.2 fö high yeast, 0.5-7 * iepton and 1.2 / 0

10 ί /188810 ί / 1888

BADBATH

Agar (pH 6,8) besteht, und bei 27° G 24 Standen lang inkubiert. Aus diesem Schrägagar wird das Impfmaterial in eine Fleischbrühe eingeimpft, die 1 '/o Glukose enthält, und 24 stunden lang bei 27 G inkubiert. Dann werden 10 ecm eines Mediums, das aus 0,5 fo Glukose, 0,5 ^c/° Pepton'und 2,0 "ß> Agar besteht, in eine Petri-Schale (Durchmesser 9 cm) gegeben und mit der Züchtungsschicht iiberschichtet, die aus 5 ecm des gleichen ilediums hergestellt wurde, welches mit der vorstehenden Kulturbrühe mit einer Konzentration von 0,5 '-/ο beimpft worden war, Scheiben mit einem Durchmesser von 8 cm, die eine Testprobe enthalten, werden 17 - 18 Stunden lang bei 27 C inkubiert. Die Probe und der Standard (reines Kasugamycinhydrochlorid) werden mit eineaj Ihosphatpuffer mit einem pH-'</ert von 7>ö verdünnt. Kasugamycin zeigt gewöhnlich bei 400 mcg/ml eine Heaamung mit einem Durchmesser von ungefähr 22 mm.Agar (pH 6.8) and incubated at 27 ° G for 24 stalls. The inoculum is inoculated from this agar slant into a meat broth containing 1 / o glucose and incubated at 27 G for 24 hours. Then, 10 cc are a medium fo of 0.5 glucose, 0.5 ^c / ° Pepton'und 2.0 "ß> agar is given (9 cm diameter) in a Petri dish and iiberschichtet with the cultivation layer, which was prepared from 5 ecm of the same iledium, which had been inoculated with the above culture broth at a concentration of 0.5 '- / ο , disks with a diameter of 8 cm, which contain a test sample, are 17-18 hours at Incubated 27 C. The sample and the standard (pure kasugamycin hydrochloride) are diluted with a phosphate buffer with a pH of 7. Kasugamycin usually shows a temperature at 400 mcg / ml with a diameter of about 22 mm.

2. Schüttelkultur: Sie wird in Kolben mit einem Inhalt von 500 ecm auf einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine (Amplitude 8 cm bei 150 Hin- und Herbewegungen pro Minute) oder in Erleneyer-Kolben mit einem Inhalt von 500 ecm auf einer Dreh-Schüttelmaschine (200 Upm) durchgeführt .2. Shaking culture: it is placed in flasks with a content of 500 ecm on a reciprocating shaker (Amplitude 8 cm with 150 reciprocations per minute) or in Erleneyer flasks with a capacity of 500 ecm carried out on a rotary shaker (200 rpm) .

3. Identifizierung von Kasugamycin: Kasugamycin in dem Kulturfiltrat wird an einem Kationenaustauscherharz adsorbiert, das Sulfonsäure als aktive G-ruppe enthält, die3. Identification of Kasugamycin: Kasugamycin in the Culture filtrate is adsorbed on a cation exchange resin, that contains sulfonic acid as an active group, the

1 0 £ : ι 5 / l 8 8 81 0 £: ι 5 / l 8 8 8

als H'- oder NEL -Typ verwendet wird·- das adsorbierte Kasugamycin wird mit verdünntem wäßrigem Ammoniak elaiert und nach der Heutralisation mit verdünnter HGl und erfolgter Konzentration in it Xthanol ausgefällt und getrocknet. Das Pulver wird einer Elektrophorese mit hoher Spannung unterzogen, wobei gleichzeitig zu /ergleichszwecken reines Kasugamycin bei 3 000 V/40 cm behandelt wird. Erforderlichenfalls wird es in ]?orm seines Hydro Chlorids aus '.fässer durch Zugabe von iithanol umkristallisiert.used as H'- or NEL -type · - the adsorbed kasugamycin is eluted with dilute aqueous ammonia and after neutralization with dilute HGl and done Concentration in it Xthanol precipitated and dried. That Powder is electrophoresed with high voltage, while at the same time pure Kasugamycin is treated at 3,000 V / 40 cm. If necessary, it is taken from drums in the form of its hydrochloride recrystallized by adding iithanol.

Verschiedene Kohlenstoffquellen werden einea> sZediua zugesetzt, das aus 2,5 $ Sojabohnenmehl, 0,3 ^:!- i atriuuichlorid, 0,1 yi> K₂HPOx und 0,05 $ MgSO.-7HgO besteht, worauf die Easugaüiycin-Ausbeute in den verschiedenen bedien bestimmt wird. 70 ecm eines jeden Mediums werden in jeweils einen Kolben gegeben und unter Schütteln mittels einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine gezüchtet. Das JLedium wird 15 Minuten lang bei 120 C sterilisiert, üine Sporensuspension einer Zultur von Streptomyces kasug-aensis wird aufgeimpft, lach 6 oder 7 Tagen wird die höchste Ausbeute in allen Fällen bestimmt, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden: 1360 mcg/ml mit 3,0 f> Maltose, 1400 meg/ml aiit 1,0 Bojabohnenöl, 2240 mcg/ml mit 2,0 ß> 3oöabohnenöl,und 2120 rucg/ml mit 3»0 ,Ό ijojabohnenöl. .ian sieht also, daß das dojabohnenöl gegenüber Jaltose als Kohlenstoff quelle zur Herstellung von Kasugamycin nicht unterlegen, sonder überlegen ist. Verunreinigungen der Maltose vermindern oft die AusbeuteVarious carbon sources are Onea> sZediua added consisting of 2.5 $ soybean meal, ^0.3: - i atriuuichlorid, 0.1 yi> K ₂ HPOx and 0.05 $ MgSO.-7HgO exists, whereupon the yield in Easugaüiycin the various controls. 70 cc of each medium is placed in a flask and cultured with shaking by means of a reciprocating shaker. The medium is sterilized for 15 minutes at 120 C, a spore suspension of a culture of Streptomyces kasug-aensis is inoculated, after 6 or 7 days the highest yield is determined in all cases, the following results being obtained: 1360 mcg / ml with 3, 0 f> maltose, 1400 meg / ml with 1.0 boybean oil, 2240 mcg / ml with 2.0 ß> 3oöabeanöl, and 2120 rucg / ml with 3 »0 , Ό ijoybean oil. Ian sees that doja oil is not inferior to yaltose as a carbon source for the production of kasugamycin, but rather superior. Impurities in the maltose often reduce the yield

1 0 ? ■ S / 1 8 8 8 _BAD1 0? ■ S / 1 8 8 8 _BA D

aa. kasugamycin, so daB aus praktischen. Gründen Sojabohnenöl .^egenüber Maltose sur Herstellung weit überlegen ist. Maltose oder G-lyzerin ist als beste Kohlenstoffquelle fur die Herstellung bekannt geworden. Unter Verwendung des gleichen G-rundmediums, v.-elehes vorstehend beschrieben wird, werden verschiedene CIe oder Fette in einer iäenge von 2,0 fo zugesetzt und die gleiche i_ultur von Streptomyces kasugaensis unter Schütteln gezüchtet. Anschließend werden folgende jiaxiJiale Ausbeuten ermittelt: 24Q0 rncg/ccm mit Kokosnußöl, 275C .ncg/ccjj mit Erdnußöl, 1300 mcg/ccm mit Olivenöl, 25OO meg/ecm mit bojabohnenöl, 2300 mcg/ccm mit leinsameH- Ql, 24CC meg/cc_; Jiit Hapsöl, 2350 mcg/ccm mit Eaumwollsaiüenöl, 2050 aieg/ccm mit ¥alöl, 2400 mcg/ccm mit Schweinefett.und 23CC mcg/ccm mit Butter. Bei den vorstehend beschriebenen /ersuchen wird ein Sojabohnenmehl in Pulverform verwendet, au β -welchem öle und Fette entfernt worden sind. Snthält ein als Stickstoffquelle verwendetes raaterial Öle oder jj'ette, dann können die Öle oder. Fette in diesem Material zur Herstellung mit oder ohne Zugabe von ölen nutzbar gemacht werden, öle oder Fette in Materialien, wie beispielsweise Sojabohnensamen, Erdnußsamen, Baumwollsamen oder- dergleichen, können als Kohlenstoffquelle für die Herstellung von Ijäsugamyeinstämmen und zur Herstellung von Kasugamycin verwendet werden. Bei einem ähnlichen Versuch, wie er vorstehend beschrieben wird, wird ein Kasugamycin erzeugender Stamm in ein Medium eingeimpft, das 6,0 Φ vermahlenen Sojabolinensamen, 0,05 i» K₂ ¹^⁰A* 0,1 $ HaGl undaa. kasugamycin, so that from practical. Grounds soybean oil. ^ Is far superior to maltose for its production. Maltose or glycerine has become known as the best source of carbon for manufacturing. Using the same basic medium as described above, different CI or fats are added in an amount of 2.0 fo and the same culture of Streptomyces kasugaensis is grown with shaking. The following jiaxial yields are then determined: 24Q0 rncg / ccm with coconut oil, 275C .ncg / ccjj with peanut oil, 1300 mcg / ccm with olive oil, 25OO meg / ecm with boybean oil, 2300 mcg / ccm with linseed HQl, 24CC meg / cc_; Jiit haps oil, 2350 mcg / ccm with cotton sauté oil, 2050 aieg / ccm with ¥ alöl, 2400 mcg / ccm with pork fat and 23CC mcg / ccm with butter. In the above-described / requests, a soybean meal in powder form is used, from which oils and fats have been removed. If a material used as a nitrogen source contains oils or jj'ette, then the oils or. Fats in this material are made available for production with or without the addition of oils, oils or fats in materials such as soybean seeds, peanut seeds, cottonseed or the like can be used as a carbon source for the production of ijäsugamyein strains and for the production of kasugamycin. In an experiment similar to that described above, a kasugamycin producing strain is inoculated into a medium containing 6.0 Φ ground soybean seeds, 0.05 i » K ₂ ¹ ^ ⁰ A * 0.1 $ HaGl and

• " 10· 0/I888 °• "10 * 0 / I888 °

:Λ;ΐ·.: ■..:■-·-,...,.,: BADORiGINAL: Λ; ΐ · .: ■ ..: ■ - · -, ...,.,: BADORiGINAL

0,05 fo MgSO*·7HpO enthält; auf diese "/eise werden 2720 mcg/ccm Kasugamycin nach. 7-tägigem, unter Schütteln erfolgendem Züchten gewonnen, kasugamycin wird ferner nach 7-tägiger Züchtungsdauer in einem Medium, das 8,0 % vermahlenen Erdnußsamen anstelle des vermahlenen Sojabohnensauiens'-enthält, in einer Ausbeute von 2460 mcg/ccm erhalten.Contains 0.05 fo MgSO * · 7HpO; in this way, 2720 mcg / cc of kasugamycin are obtained after 7 days of cultivation with shaking, kasugamycin is furthermore obtained after 7 days of cultivation in a medium which contains 8.0 % ground peanut seeds instead of the ground soybean sow. obtained in a yield of 2460 mcg / ccm.

Öle oder Fette sind Kohlenstoffquellen, die zur Herstellung von Kasugamycin auch in solchen Medien geeignet sind, die andere Stickstoffquellen außer Sojabohnenmehl enthalten. Es werden hohe Easugamycinausbeuten in Medien erzielt, die Nährhefe, Fleischextrakt, Pepton, Molke oder anorganischen Stickstoff als Stickstoffquelle enthalten. liicL' n-^r pflanzliche öle, pflanzliche Fette, tierische öle oder tierische Fette, sondern auch Fettsäuren oder deren Ester sind als Kohlenstoffquellen zur Herstellung von Kasugamycin geeignet. Kach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise werden Versuche durchgeführt, bei denen eine verschiedene Unterkultur von Streptomyces kasugaensis verwendet wird; es werden folgende Kasugamycinausbeuten in Medien erhalten, die 2,0 f> Fettsäure oder Fettsäureester enthalten: 1050 mcg/ccm mit Palmitinsäure, 1200 meg/cem mit Stearinsäure, 320 mcg/ccm mit frlyzerintristearat, 3100 mcg/ccm mit G-lyzerintrioleat, 910 mcg/ccm mit Methylpalmitat, 180C mcg/ccm mit Methyloleat, 1840 mcg/ccm mit Äthyloleat, 1800 mcg/ccm mit Eutyloleat, 320 mcg/ccm mit 2,0 fo G-lyzerin und 880 mcg/ccm mit 3,C >» Maltose. Ss sindOils or fats are sources of carbon that are suitable for the production of kasugamycin even in media containing nitrogen sources other than soybean meal. High yields of easugamycin are achieved in media that contain nutritional yeast, meat extract, peptone, whey or inorganic nitrogen as a nitrogen source. liicL'n- ^ r vegetable oils, vegetable fats, animal oils or animal fats, but also fatty acids or their esters are suitable as carbon sources for the production of kasugamycin. Following the procedure described above, experiments are carried out in which a different subculture of Streptomyces kasugaensis is used; there are obtained the following Kasugamycinausbeuten in media containing 2.0 f> fatty acid or fatty acid ester 1050 mcg / cc with palmitic acid, 1200 meg / cc with stearic acid, 320 mcg / cc with frlyzerintristearat, 3100 mcg / cc with G-lyzerintrioleat, 910 mcg / ccm with methyl palmitate, 180C mcg / ccm with methyl oleate, 1840 mcg / ccm with ethyl oleate, 1800 mcg / ccm with eutyl oleate, 320 mcg / ccm with 2.0 fo G-lycerin and 880 mcg / ccm with 3, C> » Maltose. Ss are

10f ,/1RPB BAD ORlQINAU10f, / 1RPB BAD ORlQINAU

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also nicht nur Glyzerin, sondern auch Fettsäuren, die Hydrolyseprodukte von Ölen oder betten darstellen, zur Herstellung von Kasugamycin geeignet. Der produktivste Stamm, der erhalten werden kann, erzeugt bei einem unter Schütteln durchgeführten Züchtungsverfahren 10 000 -mcg/ml Kasugamycin in eineai xiedium, das aus 6,0 Jo Sojabohnenö'l und 5,0 f> SojabOhnenoiehl (der anfängliche pH-Viert wird auf 6,5 eingestellt) besteht.So not only glycerine, but also fatty acids, which are hydrolysis products of oils or beds, are suitable for the production of kasugamycin. The most productive strain can be obtained, produced in an experiment conducted under shaking culture method -mcg 10,000 / ml in kasugamycin eineai xiedium selected from 6,0 Jo Sojabohnenö'l and 5.0 f> SojabOhnenoiehl (the initial pH Fourth is set to 6.5).

Die vorliegende Erfindung betrifft das Herstellungsverfahren von Kasugamycin sowie ein Züchtungsverfahren eines Kasugamycin produzierenden Stammes unter aeroben Bedingungen in Ifedien, die G-lyzeride sowie Fettsäuren oder deren Ester als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Sie können zu Beginn der Fermentation oder schrittweise während der Fermentation zugegeben werden. Die Gesamtmenge an verwendeten Ölen oder Fetten liegt im allgemeinen nicht unter 2,0 $, bezogen auf das Medium. Die optimale Menge hängt von dem Stamm und den Fermentationsbedingungen, beispielsweise der Lüftung, anderen Nährmitteln sowie der Temperatur, ab. Da es sich herausgestellt hai, daß erfindungsgemäß pflanzliche Öle, pflanzliche Fette, tierische Öle, tierische Fette, Fettsäuren sowie Fettsäureester für die Kasugamycinproduktion als Kohlenstoffquellen geeignet sind, wird die Erfindung nicht durch die nachstehend beschriebenen Beispiele begrenzt. The present invention relates to the production method of kasugamycin and a method of culturing a kasugamycin-producing strain under aerobic conditions in media which contain glycerides and fatty acids or their esters as the main carbon source. They can be added at the beginning of the fermentation or gradually during the fermentation. The total amount of oils or fats used is generally not less than $ 2.0, based on the medium. The optimal amount depends on the strain and fermentation conditions such as ventilation, other nutrients and temperature. Since it has been found that vegetable oils, vegetable fats, animal oils, animal fats, fatty acids and fatty acid esters are suitable as carbon sources for kasugamycin production according to the invention, the invention is not limited by the examples described below.

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

Beispiel 1example 1

70 iDl eines Mediums, das 0,3 # ITährhefe, 0,4 'f> Pepton, C,l >o K₂HPO₄, 0,1 fo NaCl, 0,05 "ß> MgS0₄'7H₂0, 0,02 £ I^le30₄»7H₂0 and 0,5 /·ο Sojabohnenöl enthält, werden in einen Kolben mit einem Inhalt von 500 com gegeben and 20 j&inuten lang bei 120° G sterilisiert. Eine Mischung ("loopful amount") aus Myzel und Sporen von Streptoaiyces kasugaensis auf einer üchrägagarkultur wird in 5 Kolben eingeimpft, die das sterilisierte Medium enthalten und unter Schütteln mittels einer sich hin und her bewegenden Schottelinaschine bei 28-30 G gezüchtet. Während der unter Schütteln erfolgenden Züchtung werden alle 24 Stunden viermal 0,5 :'' Sojabohnen öl zugesetzt. Die durchschnittliche Menge an Kasugamycin in den 5 Kolben beträgt 2880 mcg/ccni. Die Brühen in den 5 Kolben werden vereinigt und filtriert, wobei 280 ccüj Mitrat erhalten werden, das 2900 incg/ccm Kasugamycin enthält. Das Filtrat wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 ein geleitet, welche 50 ecm Ächwefelsäures Harz in der ΝΗ*_ -Porm enthält, Nach der Durchschickung von 500 ml Wasser werden 0,5 n NH₄OH durchlaufen gelassen, wobei in einer Menge von 32 ecm ein Bluat erhalten wird, welches Aktivität besitzt. Es wird mit 1 η HCl neutralisiert und liefert nach der Konzentrierung im Vakuum und nach dem Irocknen 2,1 g eines hellbraunen Pulvers. Es enthält 540 mg Kasugamycin; die Hochspannungs-Elektrophorese zeigt, daß ea nur Kasugamycin als antimikrobielie Substanz enthält.70 iDl of a medium containing 0.3 # I nutrient yeast, 0.4 'f> peptone, C, l> o K ₂ HPO ₄ , 0.1 fo NaCl, 0.05 "ß> MgS0 ₄ ' 7H ₂ 0, 0 , 02 £ I ^l e30 ₄ »7H ₂ 0 and 0.5 / · ο contains soybean oil, are placed in a flask with a content of 500 com and sterilized for 20 years at 120 ° G. A mixture (" loopful amount ") from mycelium and spores of Streptoaiyces kasugaensis on a slant agar culture is inoculated into 5 flasks containing the sterilized medium and grown with shaking by means of a reciprocating Schottelin machine at 28-30 G. During the shaking culture, four times every 24 hours 0.5: "soybean oil added. The average amount of kasugamycin in the 5 flasks is 2880 mcg / ccni. The broths in the 5 flasks are combined and filtered to obtain 280 ccuj of mitrat containing 2900 incg / cc of kasugamycin The filtrate is passed through a column with a diameter of 1, which contains 50 ecm of sulfuric acid Contains resin in the ΝΗ * _ form. After 500 ml of water have been _{passed through, 0.5N NH 4} OH is allowed to flow through, whereby a blood which has activity is obtained in an amount of 32 ecm. It is neutralized with 1 η HCl and, after concentration in vacuo and after drying, yields 2.1 g of a light brown powder. It contains 540 mg of kasugamycin; the high-voltage electrophoresis shows that ea contains only kasugamycin as an antimicrobial substance.

10 £ ; 1 5 / 1 8 8 8£ 10; 1 5/1 8 8 8

Beispiel 2Example 2

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird derselbe Stamm unter Schütteln 48 Stunden lang in einem Medium gezüchtet, das 2,5 i° Sojabohnenmehl (das Fett ist entfernt), 0,1 -£ EJPC₄, 0,3 1° ITaCl, 0,04 i> ZnSO₄/5H₂Q, 0,3 f° G-lukose und 1,5 fj So^abohnenöl enthält. 75 ecm der auf diese Weise erhaltenen Brühe werden in 10 1 Medium eingeimpft, das aus 2,5 ~ß> Sojabohnenjaehl (das Fett ist entfernt), 0,1 $ KpHPO,," 0,05 £ MgSO₄*7H₂0, 2,2 -fö gereinigtem Walöl und 0,02 ?6 Silikonharz als Antischaummittel (der anfängliche pH-Wert wird auf 6,8 eingestellt) enthält, worauf 25 Minuten lang in einem Fermentationsgefäß mit einem Inhalt von 20 1 bei 120° C sterilisiert wird. Die Fermentation erfolgt unter Rühren (300 UpJi), wobei 10 1 Luft/Minute bei einer Temperatur von- 28 0 "durchgeleitet werden. Mach 96 Stunden werden 2350 mcg/cciii Kasugamycin erhalten. 300 ecm des Mediums werden entnommen, worauf das Kasugamycin nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise extrahiert wird· auf diese Weise werden 2,1 g eines Pulvers erhalten, das 415 mg Kasugamycin enthält. Dieses Pulver wird in ICO ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm durchlaufen gelassen, die 50 ml eines schwefelsauren Harzes (Afflberlite XE-IOO) in der H -Form enthält, worauf 50 ecm /fässer durchgeschickt werden. Das adsorbierte Kasugamycin wird mit 1 η .-ICl eluiert. 23 ecm des Eluats mit antimikrobieller Aktivität werden mittels eines AniohenaustauscherharzesFollowing the procedure described in Example 1, the same strain is cultured with shaking for 48 hours in a medium containing 2.5 i ° soybean meal (the fat is removed), 0.1 - £ EJPC ₄ 0.3 1 ° ITaCl, 0 , 04 i> ZnSO ₄ / 5H ₂ Q, 0.3 f ° G-lucose and 1.5 fj So ^ abohnenöl contains. 75 ecm of the broth obtained in this way are inoculated into 10 1 medium, which consists of 2.5 ~ soybean flour (the fat has been removed), 0.1 $ KpHPO ,, "0.05 £ MgSO ₄ * 7H ₂ 0, 2.2 -fö purified whale oil and 0.02? 6 silicone resin as an antifoam agent (the initial pH is adjusted to 6.8), followed by sterilization for 25 minutes in a fermentation vessel with a content of 20 l at 120 ° C The fermentation takes place with stirring (300 rpm), with 10 l air / minute being passed through at a temperature of −28 °. After 96 hours, 2350 mcg / cciii of kasugamycin is obtained. 300 cc of the medium are removed and the kasugamycin is extracted according to the procedure described above. In this way 2.1 g of a powder containing 415 mg of kasugamycin are obtained. This powder is dissolved in ICO ml of distilled water and passed through a column with a diameter of 1 cm containing 50 ml of a sulfuric acid resin (Afflberlite XE-IOO) in the H form, whereupon 50 ecm / barrels are sent through. The adsorbed kasugamycin is eluted with 1η ICl. 23 ecm of the eluate with antimicrobial activity are obtained by means of an anion exchange resin

10: S/18 8810: S / 18 88

BAD CRiGiNALBAD CRiGiNAL

(Amberlite IüA-411) auf einen p.^TI-"iert von 5,0 eingestellt und unter vakuuai auf 5 ecm konzentriert, worauf 50 ecm iithanol zugesetzt werden. Auf diese ,/eibe kristallisieren 21ü mg Kasugaiuycinhydrochlorid ((Amberlite IüA-411) to a p. ^T I adjusted from 5.0 and concentrated under vacuum to 5 ecm, whereupon 50 ecm iithanol are added. On this, 21 mg kasugaiuycin hydrochloride crystallize

Beispiel Example

I-iach der in Beispiel 2 be&chriebenen Arbeitsweise wird ein Kasugamycin produzierender .Staaui in eint-oj i'ermentationsgefäß gezüchtet.· Das Medium in dem ifermentationsgefäß enthält 3*0 £ ITahrhefe, C,l £ HaGl₁ 0_rl £ E₂HPO₄, C,.05 ?° ^UO₄ und 2,C ;o öcteeinefett-ül. Kach 92 Standen werden 2860 ccai ITasugamycin erlialten«I-iach the be in Example 2 MODEL SPEEDLIMITS operation is grown, a kasugamycin-producing .Staaui in one-oj i'ermentationsgefäß. · The medium in which contains ifermentationsgefäß 3 * 0 £ ITahrhefe, C, l £ hagl ₁ 0 _r l £ E ₂ HPO ₄ , C, .05 ? ° ^ UO ₄ and 2, C; o octeeinefett-ül. Up to 92 levels, 2860 ccai ITasugamycin will be obtained «

Beispiel 4Example 4

1 1 eines .Jedluais, das 4»0 fo 80jaiohneiiöl, 5,0 fo Sojaboiinendiehl_r 1,0 i* &lufcose und 0,1 j& K₂HPO₄ enthält,, wird in einen Erlenoiyer-Kolben mit einem Inhalt von 5 1 gegeben und 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert. Sporen einer Kultur von Streptöittyces kasugaensis werden eingeimpft, worauf unter Schüttein mittels einer Drehschüttelmaschine 48 Stunden lang bei 27. - 28° ö gezüchtet wird. Der anfängliche pH-,/ert des1 liter of a .Jedluais, the 4 »0 fo 80jaiohneiiöl, 5.0 fo soyaboiinendiehl _r 1.0 i * & lufcose and 0.1 j & K ₂ HPO ₄ , is placed in an Erlenoi flask with a content of 5 liters and sterilized at 120 ° C for 20 minutes. Spores from a culture of Streptoittyces kasugaensis are inoculated, followed by cultivation under shaking using a rotary shaker for 48 hours at 27-28 °. The initial pH -, / ert des

v/ird auf 6,5 eingestellt« Die auf diese //eise erhaltene Brühe wird in 1200 1 eines Mediums eingeimpft, das sich in.einem aus rostfreiem otahl bestehenden Fei-mentationsgefäß mit einem. Inhalt von 2000 1 befindet. Das ..vledium enthält 4*0 /0 So jaboiinenöl, 5,0 'P 00jabolinenmehl und C,l >5 KpHI^;0 . *v / is set to 6.5. The broth obtained in this way is inoculated into 1200 liters of a medium which is in a stainless steel celebration vessel with a. Content of 2000 1 is located. The ..vledium contains 4 * 0/0 So jaboiinenöl, 5,0 'P 00jabolinenmehl and C l> 5 ^KpHI; 0. *

BADBATH

Der anfängliche pH-.7er t wird auf 6,3 eingestellt. Die ]?erjientation wird bei 23° 0 unter führen (200 Upm) und unter Ourchleiten von 400 1 Luft/uLLnute 24 Stunden lang durchgeführt. Die auf diese V/eise erhaltene Brühe värd in 15 OCC eines iiediums einf-eijipft, das sich in einem Perinentationsgefäß aus Kohlenstoffstahl mit einem fassungsvermögen von 25 OCO 1 befindet. Das Medium enthält 5,0 fr Sojabohnenöl, 7,0 ^:Ja Sojabohnenjiehl und 0,1 -ß> KpHPO.. Der anfängliche pH-Wert beträgt 6,3 - 6,4· Die Seraientation wird unter Rühren (150 Upm) und unter Durchleiten von 5 000 1 Luft/Minute bei 28° G durchgeführt. !lach 20 Stunden steigt der pH-.Tert auf 7,8 and wird anschließend durch Zugabe \ron Phosphorsäure auf 6,5 eingestellt. Diese Einstellung des pH-Wertes wird außerdem nach 25 und 29 Stunden durchgeführt. .lach-96 Stunden werden 2300 mcg/ccm Kasugamycin erhalten, der pH-Wert beträgt 7,2. Mach 160 Stunden fallen 5900 mcg/ccm Kasugamycin bei einem -pH-V/ert von 5,0 an. liach 220 Stunden beträgt die Menge des erhalt'enesi Kasugamycins 7900 mcg/ccm (der pH-Wert beträgt 5,3)*^D£e Fermentation wird abgestoppt und der pH mittels Schwefelsäure auf 5»0 eingestellt; dann wird unter Zusatz von 100 kg Diatomeenerde filtriert. Der Kuchen wird mit Wasser gewaschen, worauf das Waschwasser dem Filtrat zugesetzt wird· 30 000 1 Flüssigkeit, die 111 kg Kasugamycin enthalten, werden auf diese ?feise gewonnen. Die Flüssigkeit wird durch eine Säule mit einem Durohmesser von 2,5 m, die 5000 1 schwefelsaures Harz (Amberlite XE-IOO) in Na^-formThe initial pH -7 is adjusted to 6.3. The expansion is carried out at 23 ° C. under flow (200 rpm) and while passing through 400 1 of air / μl for 24 hours. The broth obtained in this way is poured into 15 OCC of an iiedium which is located in a perinentation vessel made of carbon steel with a capacity of 25 OCO 1. The medium contains 5.0 for soybean oil, ^7.0: Yes Sojabohnenjiehl and 0.1 -beta> KpHPO .. The initial pH is 6.3 to 6.4 · The Seraientation stirring (150 rpm) and under Passing 5,000 liters of air / minute at 28 ° G. After 20 hours the pH rises to 7.8 and is then adjusted to 6.5 by adding phosphoric acid. This adjustment of the pH is also carried out after 25 and 29 hours. 2300 mcg / ccm kasugamycin are obtained for a minimum of 96 hours, the pH is 7.2. After 160 hours there are 5900 mcg / ccm kasugamycin with a pH value of 5.0. After 220 hours the amount of kasugamycin obtained is 7900 mcg / ccm (the pH is 5.3). The fermentation is stopped and the pH is adjusted to 50 using sulfuric acid; then it is filtered with the addition of 100 kg of diatomaceous earth. The cake is washed with water, after which the washing water is added to the filtrate. 30,000 liters of liquid containing 111 kg of kasugamycin are recovered in this way. The liquid is passed through a column with a Durohmesser of 2.5 m, the 5000 1 sulfuric acid resin (Amberlite XE-IOO) in Na ^ form

10 9 3 15/1888 ^Bm 10 9 3 15/1888 ^Bm

" ^U" 16179B1" ^U " 16179B1

enthält, durchlaufen gelassen. Danach werden C,5 η HaOiI nachgeschickt. Ein erstes, Kasugamycin enthaltendes Sluat (4000 1) ist neutral, während das zweite Eluat alkalisch ist und mit Carboxylharz in der H -For.β (IRG-50) neutralisiert wird. Das vereinigte Eluat v/ird mittels ,Schwefelsäure auf einen pH von 5,0 eingestellt. Es wird mittels eines Filtaverdaiiipfers auf 500 1 konzentriert, worauf die konzentrierte lösung unter Verwendung eines Sprühtrockners getrocknet wird. Auf diese "./eise werden 198 kg eines Pulvers erhalten, das 83 kg Kasugamycin enthält. Dieses Pulver ist für eine Verwendung in der Landwirtschaft geeignet. 500 g dieses Pulvers werden in 3500 ecm destilliertem Wasser gelöst, worauf die Lösung durch eine Säule geschickt wird, die I5OO ecm eines Anionenaustauscherharzes (Amfeerlite IHA-401) in der 0H""-]?orm enthält. Anschließen/! wird Y/asser durchgeleitet. Die eine Aktivität aufweisende Lösung wird mittels Salzsäure auf einen pH-'iiert von 5,0 eingestellt. Wird sie auf weniger als ungefähr 2 1 konzentriert, dann erscheinen Kristalle. Die Konzentration wird bis zu 400 ml fortgesetzt, worauf nach dem Abkühlen Kristalle durch Filtration abgetrennt werden konnten. Auf diese ,/eise werden 155 g kristallines Easugamycinhydrochlorid erhalten.contains, passed through. Thereafter, C, 5 η HaOiI forwarded. A first sluat containing kasugamycin (4000 1) is neutral, while the second eluate is alkaline and neutralized with carboxyl resin in the H -For.β (IRG-50) will. The combined eluate is adjusted to a pH of 5.0 using sulfuric acid. It is by means of of a Filtaverdaiiipfers concentrated to 500 1, whereupon the concentrated solution is dried using a spray dryer. In this way, 198 kg of a powder are added obtained containing 83 kg of kasugamycin. This powder is suitable for use in agriculture. 500 g this powder is dissolved in 3500 ecm of distilled water, whereupon the solution is passed through a column containing 150 ecm of an anion exchange resin (Amfeerlite IHA-401) in the 0H "" -]? Orm. Connect/! becomes Y / ater passed through. The solution exhibiting activity is adjusted to a pH of 5.0 using hydrochloric acid. If it is concentrated to less than about 2 liters, crystals will appear. The concentration will be up to 400 ml continued, followed by cooling crystals by filtration could be separated. In this way, 155 g crystalline easugamycin hydrochloride obtained.

101815/1880101815/1880

ePeP

Claims (1)

I- at ent anB;;-ruc:h; I at en t at B ; ; -ruc: h; /erfahren"zur Herstellung· von Kasugamycin, dadurch geiLennaeichnet, daß ein Kasugamycin produzierender Stamm unter subiflersen aeroben Seein_: un; en in j,*edien_r die pflanzliche Lie, pflanzliche !fette* tieribciie CIe, tierische Fette, jj*ettsauren oder iettBv'ureester .:^jls Hauptkohlenstoffquellen enthalten, solange ^e^. ic.roet wird, bit· eine wesentliche/ "experience for the preparation · of kasugamycin, characterized geiLennaeichnet that a kasugamycin-producing strain under subiflersen aerobic _Seein: un; s in j * edien _r crop, Lie, vegetable fats * tieribciie CIe, animal fats, jj * acidic ett or iettBv'ureester.: ^j ls contain main sources of carbon as long as ^ e ^. ic.roet is bit · an essential in de·.] iJ.ediu.rn enthalten ist. 'in de ·.] iJ.ediu.rn is included. ' ΙΟΓ ' vüMüoe BAD ORIGINALΙΟΓ 'vüMüoe BAD ORIGINAL