Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin
Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung eines nützlichen Antibioticums, genannt Kasugamycin, durch Fermentation. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Kasugamycin bildende Arten von Organismen unter aeroben Bedingungen in der Flüssigkeit in Medien mit einer lEohlenstoffquelle, die mindestens zum grössten Teil in Form von Fettsäuren oder deren Estern vorliegt, kultiviert werden, bis das Medium mit einer wesentlichen Menge von Kasugamycin angereichert ist.
Kasugamycin ist ein Antibioticum, das durch Umezawa, Okami, Hashimoto, Suhara, Hamada und Takeuchi entdeckt wurde (Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101-103. 1965) und das als salzsaures Salz kristallisiert ist, C1fiH2, O, lN3. HCI. H2O, das in Wasser löslich ist, praktisch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylace- tat, Äther, Chloroform und Benzol, kein Absorptionsmaximum von ultraviolettem Licht von 220 mF bis 400 m zeigt, eine positive Reaktion mit Ninhydrin Reagens in Pyridin gibt und negative Reaktionen auf Sakaguchi.
Molisch, Elson-Morgan, Fehling, Tollens und Eisenchlorid ergibt, Rechtsdrehung von [o = + 1200 (c 1.6, H2O) zeigt, bei 236-2390C unter-Zersetzung schmilzt und pKI Werte (niederer als 2, 7.1, 10.6) ergibt.
Kasugamycin kristallisiert in der säurefreien Form als C1lH.,., O !, NS. H2O, das wasserlöslich ist und bei 207-2160C unter Zersetzung schmilzt und [01]2D + 1150 (c 1, H2O) aufweist.
Die chemische Struktur des Kasugamycin wurde von Suhara, Maeda, Umezawa, Ohno (Tetrahedron Letters, Nr. 12, 1239-1244, 1966) als die folgende nachgewiesen:
EMI1.1
Der Diaminozucker ist 2, 3, 4, 6-Tetradesoxy-2,4-diamino-D-mannose. Die Glykosidbindung ist eine oc-Bin- dung. Der rechte Teil ist D-Inositol. Die Wasserstoffe bei Cl, C2, C, C6 im D-Inisitol sind axial und die Wasserstoffatome bei C4 und C sind parallaktisch.
Kasugamycin hemmt Piricularia oryzae, die den Reisbrand hervorruft, und verschiedene Bakterien, besonders Pseudomonas, und hat geringe Toxizität für Menschen, Tiere, Fische und Pflanzen. Dieses Antibioticum kommt auf den Markt zur Verhütung von Reisbrand und kann auch als chemotherapeutisches Mittel gegen Infektionen von Pseudomonas bei Menschen angewendet werden.
Durch die vorliegende Erfindung werden nun ein Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin mit hoher Ausbeute beschafft durch die Kultur von Kasugamycin bildenden Organismen in Medien, die Fettsäuren oder Ester von Fettsäuren als Hauptquellen für Kohlenstoff, z.B. Pflanzenöle, Pflanzenfette, tierische Öle, tierische Fette, enthalten. Als Stickstoffquelle kann dem Medium jede stickstoffhaltige Nährsubstanz zugesetzt werden, die nicht hemmend auf die Kasugamycin bildenden Organismen wirkt oder die Bildung von Kasugamycin hindert. Im allgemeinen enthalten die Medien anorganische Salze, die zum Wachstum der Kasugamycin bildenden Organismen notwendig sind und welche die Bildung von Kasugamycin stimulieren.
Substanzen, wie gemahlene Sojabohnensamen, gemahlene Erdnussamen u. dgl., welche sowohl Stickstoffquellen sind als auch Öle oder Fette enthalten, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Erfinder haben die Monosporenkulturen von Streptomyces kasugaensis ATCC Nr. 15714 und Nr.
15715. mit und ohne Behandlung mit Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen oder Mutationsmitteln wiederholt und Kulturen im Fermentationsmedium mit hohen Ausbeuten an Kasugamycin erhalten. In allen Organismen wurde gefunden, dass Pflanzenöle, Pflanzenfette, tierische Fette oder tierische Öle Kohlenstoffquellen sind, die sich für das Wachstum der Organismen und die Bildung von Kasugamycin eignen.
Experimentelle Methoden
1. Prüfung von Kasugamycin: Pseudomonas fluorescens wird geimpft in Schrägagar, bestehend aus 0,2% Natriumglutamat, 0,2% K3HPOt, 0,1% MgC12. 6H20.
0,01% FeSO4.7H2O, 2% Saccharose, 0,2% Hefeextrakt, 0,50/, Pepton und 1,2% Agar (pH 6,8), und während 24 Stunden bei 270C incubiert. Aus diesem Schrägagar wird eine Drahtöse voll Impfstoff in eine Brühe, die 1% Glukose enthält, eingeimpft und während 24 Stunden bei 270C incubiert. 10 ccm eines Mediums, bestehend aus 0,5% Glukose, 0,5 Pepton und 2% Agar, werden in einer Petrischale (9 cm Durchmesser) ausgebreitet und überschichtet mit der Keimschicht, die aus 5 ccm des selben Mediums durch Impfen mit der obigen Kulturbrühe bei einer Konzentration von 0,5cm, hergestellt wurde.
Versuchsmuster enthaltende Scheiben (8 cm Durchmesser) werden bei 270C während 17-17 Stunden incubiert. Das Muster und das Standardprodukt (reines Kasugamycinhydrochlorid) werden mit einem Phosphatpuffer auf pH 7.0 verdünnt. Kasugamycin zeigt in der Regel einen Inhibitionsdurchmesser von ungefähr 22 mm bei 400 mcg/ml.
2. Schüttelkultur: Diese wurde in Kolben von 500 ccm Inhalt auf einer Wechselschüttelmaschine (Schwingungsweite von 8 cm bei 150 Stössen/Minute) oder in Erlenmayerkolben von 500 ccm Inhalt auf einer rotierenden Schüttelmaschine (200 U.p.m.) hergestellt.
3. Identifizierung von Kasugamycin: Das Kasugamycin im Filtrat der Kultur wird an einem Kationenaustauch-Harz, das Sulfosäure als die aktive Gruppe enthält, die als H+ oder NH4+ Typus verwendet wird, adsorbiert, und das adsorbierte Kasugamycin wird mit verdünntem wässerigem Ammoniak ausgewaschen und nach Neutralisation mit verdünnter HCI und darauffolgender Konzentration wird es mit Äthanol ausgefällt und getrocknet.
Das Pulver wird der Hochspannungs-Elektrophorese bei 3 000 V/40 cm im Vergleich mit reinem Kasugamycin unterworfen. Wenn notwendig wird es in Form des Hydrochlorids aus Wasser unter Zusatz von Äthanol umkristallisiert.
Verschiedene Kohlenstoffquellen wurden zu einem Medium, bestehend aus 2,5% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% K2HPO4, MgSO4.7H2O 0,05%, zugesetzt und die Ausbeute an Kasugamycin in verschiedenen Medien geprüft. Siebzig ccm jedes Mediums wurde je in einen Kolben gebracht und auf einer Wechselschüttelmaschine schüttel-kultiviert. Das Medium wurde bei 1 200C während 15 Minuten sterilisiert. Eine Sporensuspension einer Kultur von Streptomyces kasugaensis wurde eingeimpft. In allen Fällen wurde die höchste Ausbeute am 6. oder 7.
Tag erhalten, und es ergaben sich die folgenden Resultate: 1360 mcg/ml mit 3,0% Maltose, 1400 mcg/ml mit 1,0% Sojabohnenöl, 2240 mcg/ml mit 2,0(r, Sojabohnenöl, 2120 mcg/ml mit 3,00/, Sojabohnen öl. Somit ist Sojabohnenöl als Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Kasugamycin der Maltose nicht unterlegen, sondern eher überlegen. Verunreinigungen in der Maltose verringern oft die Ausbeute an Kasugamycin und deshalb ist in der Praxis Sojabohnenöl der Maltose für die Produktion sehr überlegen. Maltose und Glycerin waren als die besten Kohlenstoffquellen für die Produktion bekannt.
Unter Verwendung des gleichen Grundmediums, wie weiter oben beschrieben, wurden 2% verschiedener Öle oder Fette zugegeben und die gleiche Kultur von Streptomyces kasugaensis wurde schüttel-kultiviert. Darnach wurden die folgenden höchsten Ausbeuten erhalten: 2400 mcg/ccm mit Kokosnussöl, 2750 mcg/ccm mit Erdnussöl, 1800 mcg/ccm mit Olivenöl, 2500 mcg/ccm mit Sojabohnenöl, 2300 mcg/ccm mit Leinsamenöl, 2400 mcg/ccm mit Rapssamenöl, 2350 mcg/ccm mit Baumwollsamenöl, 2500 mcg/ccm mit Walfischtran, 2400 mcg/ccm mit Schweinefett, 2300 mcg/ccm mit Butter.
In den weiter oben beschriebenen Versuchen wurde Sojabohnenmehl als Pulver verwendet, aus dem öle und Fette entfernt worden waren. Wenn ein Material, das als Stickstoffquelle verwendet wird, Öl oder Fette enthält, dann können die öle oder Fette im Material mit oder ohne Zusatz von ölen für die Produktion verwendet werden. Öle oder Fette in Materialien, wie Sojabohnensamen, Erdnussamen, Baumwollsamen u. dgl. können als Kohlenstoffquellen für Kasugamycin erzeugende Arten und die Herstellung von Kasugamycin verwendet werden.
In einem Versuch, der nach der gleichen Methode wie oben beschrieben durchgeführt wurde, wurde durch das Impfen eines Mediums, das 6,0 gemahlene Sojabohnensamen, 0,05 K2HPO4, 0.1% NaC1, 0,05% MgSO4.7H2O enthielt, mit einer Kasugamycin bildenden Art 2720 rncg/ccm Kasugamycin mit einer siebentägigen Schüttelkultur erzeugt. 2460 mcg/ccm Kasugamycin wurden in 7 Tagen in der Kultur erzeugt in einem Medium, das an Stelle von gemahlenen Sojabohnensamen 8,0% gemahlene Erdnussamen enthielt.
Öle und Fette sind verwendbare Kohlenstoffquellen zur Produktion von Kasugamycin auch in Medien, die andere Stickstoffquellen als Sojabohnenmehl enthalten.
Medien, die Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Molken oder anorganischen Stickstoff als Stickstoffquellen enthalten, ergeben hohe Ausbeuten an Kasugamycin. Nicht nur Pflanzenöle, Pflanzenfette, tierische Öle oder tierische Fette sondern auch Fettsäuren und deren Ester sind geeignete Kohlenstoffquellen zur Produktion von Kasugamycin.
In Versuchen, die nach der oben beschriebenen Methode durchgeführt wurden, mit der Ausnahme der Verwendung von anderen Subkulturen von Streptomyces kasugaensis, wurde die folgende Produktion von Kasugamycin erhalten in Medien, die 2,00/, Fettsäure oder deren Ester enthielten: 1050 mcg/ccm mit Palmitinsäure, 1200 mcg/ccm mit Stearinsäure, 320 mcg/ccm mit Glyceroltristearat, 3100 mcg/ccm mit Glyceroltrioleat, 910 mcg/ ccm mit Methylpalmitat, 1800 mcg/ccm mit Methyloleat, 1840 mcg/ ccm mit Äthyloleat, 1800 mcg/ccm mit Butyloleat, 320 mcg/ccm mit 2,00/, Glycerin und 880 mcg/ccm mit 3,0au Maltose. Somit wird nicht nur Glycerin sondern auch Fettsäuren, die Hydrolysenprodukte von Ölen oder Fetten sind, zur Produktion von Kasugamycin gebraucht.
Die produktivste Art, die erhalten wurde erzeugte 10 000 mcg/ml Kasugamycin in einem Medium, bestehend aus 6,00/, Sojabohnenöl und 5,0 Sojabohnenmehl (der ursprüngliche pH wurde auf 6,5 eingestellt), in der Schüttelkultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Herstellungsverfahren für Kasugamycin und umfasst das Kultivieren einer kasugamycinbildenden Art in Medien, die unter aerobischen Bedingungen Glyceride, Fettsäuren oder Fettsäureester als Hauptkohlenstoffquellen enthalten. Diese Verbindungen können am Anfang der Fermentation zugesetzt werden oder deren Zusatz kann aufgeteilt im Laufe der Fermentation erfolgen. Die Gesamtmenge der verwendeten Öle oder Fette ist im allgemeinen nicht weniger als 2,0% des Mediums. Die optimale Menge ist bedingt durch die Art der Kulturorganismen, der Fermentationsbedingungen, wie Belüftung, andere Nährstoffe und Temperatur.
Es wurde wohl durch die vorlie gende Erfindung gefunden, dass Pflanzenöle, Pflanzen fette, tierische Öle, tierische Fette sowie allgemein Fett säuren und fettsaure Ester geeignete Hauptkohlenstoffquellen zur Produktion von Kasugamycin sind, jedoch ist diese Erfindung nicht auf die unten beschriebenen
Beispiele beschränkt.
Beispiel I
70 ml eines Mediums, das 0,3% Hefeextrakt, 0,40/,
Pepton, 0, 1% K2HPO4, 0,1% NaC1, 0,05 MgSO4,.7H2O, 0,02% FeSO4.7H5O und 0, 50 Sojabohnenöl enthält, wur den in einen 500-ccm-Kolben gebracht und während 20
Minuten bei 120"C sterilisiert. Die Menge einer vollen Öse einer Mischung von Myzel und Sporen von Strep tomyces kasugaensis auf einer Schrägagar-Kultur wurde in 5 Kolben, die das sterilisierte Medium enthielten, ein geimpft und auf einer Wechselschüttelmaschine bei 28
300C schüttel-kultiviert.
Während des Schüttelkultivierens wurden viermal, nach je 24 Stunden 0,5% Sojabohnenöl zugesetzt. Sodann betrug die mittlere Menge Kasugamycin in den 5 Kolben 2880 mcg/ccm. Die Brühen aus den 5
Kolben wurde zusammengebracht und filtriert. Es wurden
280 ccm Filtrat erhalten, welches 2900 mcg/ccm Kasug amycin enthielt. Dieses Filtrat wurde durch eine Säule von 1 cm Durchmesser, die 50 ccm Schwefelsäure-Harz in NH4+-Form enthielt. gelassen. Darnach wurden 500 ml
Wasser und darauffolgend 0,5 n NH4OH durchgelassen und 32 ccm Eluat, das Aktivität zeigte, wurde erhalten.
Dieses wurde mit 1 N HC1 neutralisiert und nach Kon zentrieren und Trocknen im Varkuum wurden 2,1 g eines leicht bräunlichen Pulvers erhalten. Dieses enthielt 540 mg
Kasugamycin, und die Hochspannungs-Elektrophorese zeigte, dass es als antimicrobische Substanz nur Kasug amycin enthielt.
Beispiel 2
Durch dasselbe Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrie ben. wurde die gleiche Art während 48 Stunden schüttel kultiviert in einem Medium, das 2,5% Sojabohnenmehl (das Fett wurde entfernt), 0,1% K5HPO4, 0.3% NaC1, 0,04% ZnSO4.5H2O, 0,3% Glukose und 1.5% Sojaboh nenöl enthielt.
75 ccm der so erhaltenen Impf-Nährlösung wurde mit 10 Liter eines Mediums, bestehend aus 2,5%
Sojabohnenmehl (das Fett wurde entfernt), 0.1% K2HPO, 0,05% MgSO4.7H2O. 2.2% gereinigter Walfischtran, 0,02% Silikonharz als Antischaummittel (der Anfangs pH wurde auf 6.8 eingestellt), versetzt, während 25 Minu ten bei 1200C in einem 20-Liter-Fermentiergefäss sterili sjert. - Die Fermentation fand unter Rühren, 300 U.p.m., mit 10 Liter Luft pro Minute, bei 280C statt.
Nach 96
Stunden hatten sich 2350 mcg/ccm Kasugamycin gebil det. 300 ccm wurden von diesem Medium weggenommen und das Kasugamycin nach dem oben beschriebenen Ver fahren extrahiert und es wurden 2,1 g eines Pulvers er halten, das 415 mg Kasugamycin enthielt. Dieses Pulver wurde in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule (lcm Durchmesser) gelassen, die 50 ml Schwe felsäureharz (Amberlite XE-100) des Ht-Typus enthielt, und nach dem Durchfluss von 500 ccm Wasser wurde das adsorbierte Kasugamycin mit 1 n HC1 ausgewaschen.
23 ccm des Eluates, das antimikrobische Aktivität zeigte, wurde mit einem Anionenaustauschharz (Amberlite IRA
411) auf pH 5,0 eingestellt, im Vakuum auf 5 ccm konzentriert und 50 ccm Äthanol zugesetzt. Sodann kristalli sierte Kasugamycinhydrochlorid, 210 g (Cl4H2JOgN3HCl H-.O)aus.
Beispiel 3
Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde eine Kasugamycin bildende Art in einem Fermentiergefäss kultiviert. Das Medium im Fermentiergefäss enthielt 3,0% Hefeextrakt, 0,10/, NaC1, 0,1% K < HPO4, 0,050/, MgSO4.7H2O. 2,0% Specköl. Nach 92 Stunden hatte sich 2860 mcg/ccm Kasugamycin gebildet.
Beispiel 4
Ein Liter eines Mediums, enthaltend 4,00/, Sojabohnenöl, 5,00/, Sojabohnenmehl. 1,0% Glukose, 0,1% K2HPO4, wurde in einen 5-Liter-Erlenmayerkolben gegeben und während 20 Minuten bei 1 200C sterilisiert. Sporen einer Kultur von Streptomyces kasugaensis wurden cingeimpft und während 48 Stunden bei 27-280C auf einer rotierenden Schüttelmaschine schüttel-kultiviert. Der Anfangs-pH des Mediums wurde auf 6,5 eingestellt. Die so erhaltene Brühe wurde in 1200 Liter eins Mediums in einem 2000 Liter fassenden rostfreien Fermentiergefäss eingeimpft. Das Medium enthielt 4,00/, Sojabohnenöl.
5,0 Sojabohnenmehl, 0,10/, K5HPO4. Der Anfangs-pH wurde auf 6,3 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 280C unter Rühren, 200 U.p.m., und unter einer Belüfu tung mit 400 Litern Luft pro Minute während 24 Stunden durchgeführt. Die so erhaltene Brühe wurde in 15 000 Liter eines Mediums in einem 25000 Liter fassenden Kohlenstoffstahl-Fermentierbehälter eingeimpft. Dieses Medium enthielt: 5.0% Sojabohnenöl, 7,0% Sojabohnenmehl, 0,1% K2HPO4. Der Anfangs-pH betrug 6,3-6,4.
Die Fermentation wurde bei 280C unter Rühren, 150 U.p.m., und unter Belüftung mit 5000 Litern Luft/Minute durchgeführt. Nach 20 Stunden stieg der pH auf 7,8 an und wurde durch Zusatz von Phosphorsäure auf 6,5 zurückgestellt. Diese Einstellung des pH wurde auch nach 25 und 29 Stunden vorgenommen. Nach 96 Stunden hatte sich 2300 mcg/ccm Kasugamycin gebildet, der pH betrug 7,2. Nach 160 Stunden waren 5900 mcg/ccm Kasugamyein gebildet und der pH betrug 5,0. Nach 220 Stunden hatten sich 7900 mcg/ccm Kasugamycin gebildet und der pH war 5,3.
Die Fermentation wurde abgebrochen und der pH wurde mit Schwefelsäure auf 5,0 eingestellt, dann wurde unter Zugabe von 100 kg Diatomeenerde filtriert. Der Kuchen wurde mit Wasser ausgewaschen und das Waschwasser dem Filtrat zugesetzt. Dadurch wurden 30000 Liter einer Flüssigkeit erhalten. die 111 kg Kasugamycin enthielt. Diese wurde durch eine Säule (2,5 m Durchmes ser), die 5000 Liter Schwefelsäureharz (Amberlite XE100) vom Na+-Typus enthielt, durchgelassen. Sodann wurde 0,5 n NaOH durchfliessen gelassen. Das erste Eluat (4000 Liter), das Kasugamycin enthielt, war neutral, das zweite Eluat war alkalisch und wurde mit Car boxylharz vom H+-Typus (IRC-50) neutralisiert.
Die vereinigten Eluate wurden mit Schwefelsäure auf pH 5,0 eingestellt, in einem Filmverdampfer auf 500 Liter konzentriert und das Konzentrat sprühgetrocknet. Dadurch wurden 198 kg Pulver gewonnen, die 83 kg Kasugamycin enthielten. Dieses Pulver war für landwirtschaftliche Zwecke gut verwendbar. 500 g dieses Pulvers wurden in 3500 ccm Wasser (destilliert) aufgelöst und die Lösung durch eine Säule, die 1500 ccm eines Anionenaustausch Harzes vom OH--Typus (Amberlite IRA-401) enthielt, durchgelassen. Das Wasser wurde durchgelassen und die Lösung, die Aktivität zeigte, wurde mit Salzsäure auf pH 5,0 gestellt. Nach dem Konzentrieren unter 2 Liter etwa zeigten sich Kristalle. Das Konzentrieren wurde bis zu 400 ml fortgesetzt und nach dem Abkühlen wurden die Kristalle abfiltriert. Dadurch wurde 155 g kristallines Kasugamycinhydrochlorid erhalten.
Process for the manufacture of kasugamycin
This invention relates to a new process for the production of a useful antibiotic called kasugamycin by fermentation. The method according to the invention is characterized in that kasugamycin-forming types of organisms are cultivated under aerobic conditions in the liquid in media with a carbon source, at least for the most part in the form of fatty acids or their esters, until the medium contains a substantial amount of Kasugamycin is fortified.
Kasugamycin is an antibiotic discovered by Umezawa, Okami, Hashimoto, Suhara, Hamada and Takeuchi (Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101-103. 1965) and which is crystallized as the hydrochloric acid salt, C1fiH2, O, lN3. HCI. H2O, which is soluble in water, practically insoluble in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, ether, chloroform and benzene, shows no maximum absorption of ultraviolet light from 220 mF to 400 m, gives a positive reaction with ninhydrin reagent in pyridine and negative reactions to Sakaguchi.
Molisch, Elson-Morgan, Fehling, Tollens and ferric chloride gives, clockwise rotation of [o = + 1200 (c 1.6, H2O) shows, at 236-2390C it melts under-decomposition and gives pKI values (lower than 2, 7.1, 10.6).
Kasugamycin crystallizes in the acid-free form as C1lH.,., O!, NS. H2O, which is water-soluble and melts at 207-2160C with decomposition and has [01] 2D + 1150 (c 1, H2O).
The chemical structure of kasugamycin has been established by Suhara, Maeda, Umezawa, Ohno (Tetrahedron Letters, No. 12, 1239-1244, 1966) as the following:
EMI1.1
The diamino sugar is 2, 3, 4, 6-tetradeoxy-2,4-diamino-D-mannose. The glycoside bond is an oc bond. The right part is D-inositol. The hydrogens at Cl, C2, C, C6 in D-inisitol are axial and the hydrogen atoms at C4 and C are parallactic.
Kasugamycin inhibits Piricularia oryzae, which causes rice blight, and various bacteria, especially Pseudomonas, and has low toxicity to humans, animals, fish and plants. This antibiotic comes on the market to prevent rice blight and can also be used as a chemotherapeutic agent against infections of Pseudomonas in humans.
The present invention now provides a method for producing kasugamycin in high yield by culturing kasugamycin producing organisms in media containing fatty acids or esters of fatty acids as the main sources of carbon, e.g. Contain vegetable oils, vegetable fats, animal oils, animal fats. Any nitrogen-containing nutrient substance which does not have an inhibitory effect on the kasugamycin-producing organisms or which prevents the formation of kasugamycin can be added to the medium as a nitrogen source. In general, the media contain inorganic salts which are necessary for the growth of kasugamycin-producing organisms and which stimulate the production of kasugamycin.
Substances such as ground soybean seeds, ground peanut seeds and the like The like, which are both nitrogen sources and contain oils or fats, can be used in the present invention. The inventors have obtained the monospore cultures of Streptomyces kasugaensis ATCC No. 15714 and No.
15715. repeated with and without treatment with ultraviolet rays, X-rays or mutant agents and cultures obtained in fermentation medium with high yields of kasugamycin. In all organisms it has been found that vegetable oils, vegetable fats, animal fats or animal oils are carbon sources that are suitable for the growth of the organisms and the formation of kasugamycin.
Experimental methods
1. Testing of kasugamycin: Pseudomonas fluorescens is inoculated in an agar slant consisting of 0.2% sodium glutamate, 0.2% K3HPOt, 0.1% MgC12. 6H20.
0.01% FeSO4.7H2O, 2% sucrose, 0.2% yeast extract, 0.50%, peptone and 1.2% agar (pH 6.8), and incubated for 24 hours at 270C. A wire loop full of vaccine is inoculated from this agar slant into a broth containing 1% glucose and incubated at 270 ° C. for 24 hours. 10 cc of a medium, consisting of 0.5% glucose, 0.5 peptone and 2% agar, are spread out in a Petri dish (9 cm diameter) and covered with the germinal layer, which is made from 5 cc of the same medium by inoculating with the above Culture broth at a concentration of 0.5 cm.
Discs containing test specimens (8 cm diameter) are incubated at 270 ° C. for 17-17 hours. The sample and the standard product (pure kasugamycin hydrochloride) are diluted to pH 7.0 with a phosphate buffer. Kasugamycin typically shows an inhibition diameter of about 22 mm at 400 mcg / ml.
2. Shaking culture: This was produced in flasks with a capacity of 500 ccm on an interchangeable shaker (oscillation range of 8 cm at 150 impacts / minute) or in Erlenmayer flasks with a capacity of 500 ccm on a rotating shaker (200 rpm).
3. Identification of kasugamycin: The kasugamycin in the filtrate of the culture is adsorbed on a cation exchange resin containing sulfonic acid as the active group, which is used as H + or NH4 + type, and the adsorbed kasugamycin is washed out with dilute aqueous ammonia and after Neutralization with dilute HCl and subsequent concentration, it is precipitated with ethanol and dried.
The powder is subjected to high voltage electrophoresis at 3,000 V / 40 cm in comparison with pure kasugamycin. If necessary, it is recrystallized in the form of the hydrochloride from water with the addition of ethanol.
Various carbon sources were added to a medium consisting of 2.5% soybean meal, 0.3% sodium chloride, 0.1% K2HPO4, MgSO4.7H2O 0.05%, and the yield of kasugamycin was checked in various media. Seventy cc of each medium was placed in a flask and shake-cultivated on an interchangeable shaker. The medium was sterilized at 1200C for 15 minutes. A spore suspension of a culture of Streptomyces kasugaensis was inoculated. In all cases the highest yield was on the 6th or 7th
Day and the following results were obtained: 1360 mcg / ml with 3.0% maltose, 1400 mcg / ml with 1.0% soybean oil, 2240 mcg / ml with 2.0 (r, soybean oil, 2120 mcg / ml with 3.00 /, soybean oil. Thus, soybean oil as a carbon source for the production of kasugamycin is not inferior to maltose, but rather superior. Impurities in the maltose often reduce the yield of kasugamycin and so in practice soybean oil is very much maltose for production Maltose and glycerin were known to be the best sources of carbon for production.
Using the same basic medium as described above, 2% different oils or fats were added and the same culture of Streptomyces kasugaensis was shake-cultured. The following highest yields were obtained: 2400 mcg / ccm with coconut oil, 2750 mcg / ccm with peanut oil, 1800 mcg / ccm with olive oil, 2500 mcg / ccm with soybean oil, 2300 mcg / ccm with flaxseed oil, 2400 mcg / ccm with rapeseed oil, 2350 mcg / ccm with cottonseed oil, 2500 mcg / ccm with whale oil, 2400 mcg / ccm with pork fat, 2300 mcg / ccm with butter.
In the experiments described above, soybean meal was used as a powder from which oils and fats had been removed. If a material that is used as a nitrogen source contains oil or fats, then the oils or fats in the material can be used for production with or without the addition of oils. Oils or fats in materials such as soybean seeds, peanut seeds, cottonseed and the like. The like can be used as carbon sources for kasugamycin producing species and kasugamycin production.
In an experiment carried out by the same method as described above, by inoculating a medium containing 6.0 ground soybean seeds, 0.05 K2HPO4, 0.1% NaCl, 0.05% MgSO4.7H2O, with a kasugamycin forming type 2720 rncg / cc kasugamycin produced with a seven-day shaking culture. 2460 mcg / cc kasugamycin was produced in 7 days in the culture in a medium containing 8.0% ground peanut seeds instead of ground soybean seeds.
Oils and fats are useful carbon sources for the production of kasugamycin even in media containing nitrogen sources other than soybean meal.
Media containing yeast extract, meat extract, peptone, whey or inorganic nitrogen as nitrogen sources give high yields of kasugamycin. Not only vegetable oils, vegetable fats, animal oils or animal fats but also fatty acids and their esters are suitable carbon sources for the production of kasugamycin.
In experiments carried out according to the method described above, with the exception of the use of other subcultures of Streptomyces kasugaensis, the following production of kasugamycin was obtained in media containing 2.00 mcg / ccm, fatty acid or its ester: 1050 mcg / ccm with palmitic acid, 1200 mcg / ccm with stearic acid, 320 mcg / ccm with glycerol tristearate, 3100 mcg / ccm with glycerol trioleate, 910 mcg / ccm with methyl palmitate, 1800 mcg / ccm with methyl oleate, 1840 mcg / ccm with ethyl oleate, 1800 mcg / ccm Butyl oleate, 320 mcg / ccm with 2.00 /, glycerine and 880 mcg / ccm with 3.0au maltose. Thus, not only glycerine but also fatty acids, which are hydrolysis products of oils or fats, are used for the production of kasugamycin.
The most productive species that was obtained produced 10,000 mcg / ml of kasugamycin in a medium consisting of 6.00% soybean oil and 5.0 soybean meal (the initial pH was adjusted to 6.5) in the shake culture.
The present invention relates to the manufacturing method for kasugamycin and comprises culturing a kasugamycin-producing species in media containing glycerides, fatty acids or fatty acid esters as main carbon sources under aerobic conditions. These compounds can be added at the beginning of the fermentation or their addition can be split up over the course of the fermentation. The total amount of oils or fats used is generally not less than 2.0% of the medium. The optimal amount depends on the type of culture organisms, the fermentation conditions such as aeration, other nutrients and temperature.
It has been found through the present invention that vegetable oils, vegetable fats, animal oils, animal fats and generally fatty acids and fatty acid esters are suitable major sources of carbon for the production of kasugamycin, however this invention is not limited to those described below
Examples limited.
Example I.
70 ml of a medium containing 0.3% yeast extract, 0.40 /,
Peptone, 0.1% K2HPO4, 0.1% NaCl, 0.05 MgSO4, .7H2O, 0.02% FeSO4.7H5O and 0.50 soybean oil were placed in a 500 cc flask and kept for 20
Sterilized minutes at 120 ° C. The amount of a full loop of a mixture of mycelium and spores of Strep tomyces kasugaensis on an agar slant was inoculated into 5 flasks containing the sterilized medium and placed on an alternating shaker at 28
300C shake-cultured.
During the shake cultivation, 0.5% soybean oil was added four times every 24 hours. The mean amount of kasugamycin in the five flasks was then 2880 mcg / ccm. The broths from the 5th
Flask was brought together and filtered. There were
280 cc of filtrate was obtained which contained 2900 mcg / cc of Kasug amycin. This filtrate was passed through a column 1 cm in diameter containing 50 cc of sulfuric acid resin in NH4 + form. calmly. Then 500 ml
Water and then 0.5N NH4OH were passed and 32 cc of eluate showing activity was obtained.
This was neutralized with 1N HCl and after concentrating and drying in vacuo, 2.1 g of a slightly brownish powder were obtained. This contained 540 mg
Kasugamycin, and high voltage electrophoresis showed that it contained only kasug amycin as an antimicrobial substance.
Example 2
By the same procedure as described in Example 1. the same species was cultured for 48 hours in a medium containing 2.5% soybean meal (the fat was removed), 0.1% K5HPO4, 0.3% NaC1, 0.04% ZnSO4.5H2O, 0.3% glucose and shaking Contained 1.5% soybean oil.
75 ccm of the inoculated nutrient solution thus obtained was mixed with 10 liters of a medium consisting of 2.5%
Soybean meal (the fat removed), 0.1% K2HPO, 0.05% MgSO4.7H2O. 2.2% purified whale oil, 0.02% silicone resin as antifoam agent (the initial pH was adjusted to 6.8), added, while it is sterilized for 25 minutes at 1200C in a 20 liter fermentation vessel. - The fermentation took place with stirring, 300 r.p.m., with 10 liters of air per minute, at 280C.
After 96
Hours, 2350 mcg / ccm kasugamycin had formed. 300 cc were removed from this medium and the kasugamycin was extracted by the method described above and 2.1 g of a powder was obtained which contained 415 mg of kasugamycin. This powder was dissolved in 100 ml of distilled water and passed through a column (1 cm in diameter) containing 50 ml of Ht-type sulfuric acid resin (Amberlite XE-100), and after 500 cc of water had passed through, the adsorbed kasugamycin was 1 n HC1 washed out.
23 cc of the eluate showing antimicrobial activity was washed with an anion exchange resin (Amberlite IRA
411) adjusted to pH 5.0, concentrated in vacuo to 5 cc and added 50 cc of ethanol. Kasugamycin hydrochloride, 210 g (Cl4H2JOgN3HCl H-.O) then crystallized out.
Example 3
According to the method described in Example 2, a kasugamycin-producing species was cultivated in a fermentation vessel. The medium in the fermentation vessel contained 3.0% yeast extract, 0.10 /, NaCl, 0.1% K <HPO4, 0.050 /, MgSO4.7H2O. 2.0% bacon oil. After 92 hours, 2860 mcg / cc of kasugamycin had formed.
Example 4
One liter of a medium containing 4.00 /, soybean oil, 5.00 /, soybean meal. 1.0% glucose, 0.1% K2HPO4, was placed in a 5-liter Erlenmayer flask and sterilized at 1200C for 20 minutes. Spores from a culture of Streptomyces kasugaensis were inoculated and shake-cultivated for 48 hours at 27-280 ° C. on a rotary shaker. The initial pH of the medium was adjusted to 6.5. The broth thus obtained was inoculated into 1200 liters of a medium in a 2000 liter stainless fermentation vessel. The medium contained 4.00 ½ soybean oil.
5.0 soybean meal, 0.10 /, K5HPO4. The initial pH was adjusted to 6.3. The fermentation was carried out at 280C with stirring, 200 r.p.m., and under aeration with 400 liters of air per minute for 24 hours. The resulting broth was inoculated into 15,000 liters of a medium in a 25,000 liter carbon steel fermentation vessel. This medium contained: 5.0% soybean oil, 7.0% soybean meal, 0.1% K2HPO4. The initial pH was 6.3-6.4.
The fermentation was carried out at 280C with stirring, 150 r.p.m., and with aeration at 5000 liters air / minute. After 20 hours the pH rose to 7.8 and was reset to 6.5 by adding phosphoric acid. This adjustment of the pH was also made after 25 and 29 hours. After 96 hours, 2300 mcg / ccm kasugamycin had formed, the pH was 7.2. After 160 hours, 5900 mcg / cc of casugamyein had been formed and the pH was 5.0. After 220 hours, 7900 mcg / cc of kasugamycin had formed and the pH was 5.3.
The fermentation was stopped and the pH was adjusted to 5.0 with sulfuric acid, then it was filtered with the addition of 100 kg of diatomaceous earth. The cake was washed out with water and the washing water was added to the filtrate. Thereby, 30,000 liters of a liquid was obtained. which contained 111 kg of kasugamycin. This was passed through a column (2.5 m in diameter) containing 5000 liters of sulfuric acid resin (Amberlite XE100) of the Na + type. 0.5N NaOH was then allowed to flow through. The first eluate (4000 liters), which contained kasugamycin, was neutral, the second eluate was alkaline and was neutralized with carboxyl resin of the H + type (IRC-50).
The combined eluates were adjusted to pH 5.0 with sulfuric acid, concentrated to 500 liters in a film evaporator and the concentrate was spray-dried. 198 kg of powder containing 83 kg of kasugamycin were obtained in this way. This powder was very useful for agricultural purposes. 500 g of this powder were dissolved in 3500 cc of water (distilled) and the solution was passed through a column containing 1500 cc of an anion exchange resin of the OH type (Amberlite IRA-401). The water was allowed to pass and the solution which showed activity was adjusted to pH 5.0 with hydrochloric acid. After concentrating below 2 liters, for example, crystals appeared. Concentration was continued up to 400 ml and after cooling the crystals were filtered off. Thereby 155 g of crystalline kasugamycin hydrochloride was obtained.