DD144561A5 - PROCESS FOR PREPARING THE ANTIBIOTIC BL580 DELTA - Google Patents

Description

199 80S199 80s

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums, mit der Bezeichnung EL5Q0S Λ mit der später angegebenen Formel.The invention relates to a process for the preparation of the new antibiotic, designated EL5Q0S Λ with the formula given later.

Die Wirkung dieses Neuen Antibiotikums als anticoccidiales Mittel· sowie seine chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden dieses von früher beschriebenen Antibiotika.The effect of this new antibiotic as an anticoccidial agent, as well as its chemical and physical properties, distinguishes this from previously described antibiotics.

Das Antibiotikum BL580 / A läßt sich durch die im folgenden angegebene Strukturformel beschreiben. Ein" alpha-Substituer liegt hiernach hinter der Papierebene und wird durch eine gestrichelte Linie (--——Bindung) bezeichnet, während ein ß-Substituent aus der Papierebene herausragt und durch eine keilartige Bindung (-*«^β8Bindung) bezeichnet wird.The antibiotic BL580 / A can be described by the structural formula given below. An alpha-substituent is after the paper plane and is denoted by a dashed line (---- bond), while a ß-substituent protrudes from the paper plane and by a wedge-like bond (- * «^ β8Bindung) is called.

"3 Ö": JÜN.-19 7 ΐ -Α-ΰ i 5 -S- i)"3 Ö": JÜN.-19 7 ΐ -Α-ΰ i 5 -S- i)

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen? . \: Characteristic of the known technical solutions? , \:

Das neue erfindungsgemäße Antibiotikum ist eine organische Carbonsäure und kann daher mit nichttoxischen pharmazeutisch unbedenklichen Kationen Salze bilden. Die Herstellung solcher Salze erfolgt durch Vermischen der freien Säure des Antibiotikums mit stöchiometrischen Mengen entsprechender Kationen, zweckmäßigerweise in einem neutralen Lösungsmittel. Hierzu geeignete Kationen sind die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- oder Ammoniumionen sowie Kationen organischer Amine, wie Tri (niederalkyl) aminkationen (beispielsweise Tri-^· äthylamin, Triethanolamin) oder Procain. Die kationischen Salze des Antibiotikums BL58O /\ sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, die sich in Wasser verhältnismäßig schlecht lösen, in den meisten üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan, Äther oder Benzol, jedoch löslich sind.The novel antibiotic according to the invention is an organic carboxylic acid and can therefore form salts with non-toxic pharmaceutically acceptable cations. The preparation of such salts is carried out by mixing the free acid of the antibiotic with stoichiometric amounts of appropriate cations, suitably in a neutral solvent. Cations suitable for this purpose are the sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium ions and also cations of organic amines, such as tri (lower alkyl) amine cations (for example trisubstituted ethylamine, triethanolamine) or procaine. The cationic salts of antibiotic BL58O / \ are generally crystalline solids which dissolve relatively poorly in water but are soluble in most common organic solvents such as methanol, ethyl acetate, acetone, chloroform, heptane, ether or benzene.

Ziel der,Erfindung: . ' . · . . Aim of, Invention:. '. ·. ,

Das neue Antibiotikum, dem die Bezeichnung BLSOOA₁ zugeordnet worden ist, entsteht während der Züchtung eines neuen Stamms von Streptomyces hygroscopicus unter gesteuerten Bedingungen, und dieser Stamm produziert ferner auchdie bekannten Antibiotik BL58Oalpha und BL58Oß (US-PS 3 812 249). Dieser neue Stamm ist eine durch Behandlung von S. hygroscopicus NRRL 5647 mit N-Methj N^l-nitro-N"-nitrosoguanidin abgeleitete Mutante. Eine lebende Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei dem Culture Collection Laboratory, Northern utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und in die dortige ständige Kultursammlung aufgenommen. Sie ist von dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 8180 frei erhältlich.The new antibiotic to which the designation BLSOOA _{1 has been} assigned arises during the breeding of a new strain of Streptomyces hygroscopicus under controlled conditions, and this strain also produces the known antibiotic BL58Oalpha and BL58Oß (USP 3,812,249). This new strain is a by treatment of S. hygroscopicus NRRL 5647 with N-Methj N ^l-nitro-N "-nitrosoguanidin derived mutant. A living culture of the novel microorganism Northern utilization Research and Development Division, United was at the Culture Collection Laboratory, States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, and is included in the permanent culture collection there, and is available there free of charge under accession number NRRL 8180.

Eine Bestimmung der physiologischen, morphologischen und Kulturmerkmale von NRRL 8180 nach Dr. H. D. Tresner, Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, ergibt, daß diese Merkmale im wesentlichen die gleichen sind wie diejenigen von NRRL 5647. Die allgemeine Beschreibung des Mikroorganismus aufgrund beobachteter diagnostischer Eigenschaften ist die gleiche wie sie für denA determination of the physiological, morphological and cultural characteristics of NRRL 8180 according to Dr. med. H.D. Tresner, Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, reveals that these features are substantially the same as those of NRRL 5647. The general description of the microorganism due to observed diagnostic properties is the same as that for the

Mikroorganismus NRRL 5647 in US-PS 3 812 249 veröffentlicht ist, wobei diese Beschreibung jedoch im folgenden der Einfachheit halber wiederholt wird.Microorganism NRRL 5647 is disclosed in US Pat. No. 3,812,249, but this description is repeated below for the sake of simplicity.

Die Ermittlung der Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale und morphologischen Merkmale des Mikroorganismus NRRL 8180 erfolgt hier nach den Methoden wie sie von Shirling und Gottlieb in Internat. Journ. of Syst. Bacteriol. J_6 , 313-340 (1966) näher beschrieben sind. Die unterstrichenen beschreibenden Farbangaben und die Farbplättchenbezeichnungen wurden nach Jacobsen et al. aus Color Harmony Manual, 3. Auflage (1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois, ermittelt. Die Beschreibungseinzelheiten finden sich in den folgenden Tabellen I bis IV.The determination of the cultural features, physiological features and morphological features of the microorganism NRRL 8180 is carried out here according to the methods as described by Shirling and Gottlieb in boarding school. Journ. of Syst. Bacteriol. J_6, 313-340 (1966). The underlined descriptive color data and the color plate designations were prepared according to Jacobsen et al. from Color Harmony Manual, 3rd Edition (1948), Container Corp. of America, Chicago, Illinois. The details of the description can be found in the following Tables I to IV.

Stärke des WachstumsStrength of growth "[ '"['

Gutes Wachstum auf Hefeextrakt-, Kuster-Haferflocken--, Tomatenpaste-, Hafermehl- und Kartoffel-Dextrose-Agar, mäßiges Wachstum auf Asparagin-Dextrose-Agar, Hickey und Tresner-Agar, anorganische Salze-Stärke-Agar sowie Bennett-Agar, schwaches Wachstum auf Czapek-Lösung-Agar.Good Growth on Yeast Extract, Kuster Oatmeal, Tomato Paste, Oatmeal and Potato Dextrose Agar, Moderate Growth on Asparagine Dextrose Agar, Hickey and Tresner Agar, Inorganic Salts Starch Agar and Bennett Agar, weak growth on Czapek Solution Agar.

Luftmycel · V" Aerial mycelium · V "

Das Luftmycel ist gelblich und wird in den Sporulationszonen gräulich, wobei seine Farbe von rehfarben (4 ig) zu biberfarben (4 Ii) zu aschfarben (5 fe) reicht, die Sporulationszonen werden bei älteren Kulturen schwarz und hygroskopisch.The aerial mycelium is yellowish and becomes greyish in the sporulation zones, its color ranging from fawn (4 ig) to beaver (4 li) to ash (5 fe), the sporulation zones becoming black and hygroscopic in older cultures.

Lösliche PigmenteSoluble pigments

Auf den meisten Medien keine löslichen Pigmente, auf Hefeextrakt-Bennett- und Kartoffel-Dextrose-Agär gelbliche lösliche Pigmente, die nur in geringen Mengen vorhanden sind.On most media, no soluble pigments, on yeast extract Bennett and potato dextrose agar yellowish soluble pigments which are present only in small amounts.

i; 11 λ η --ji; 11 λ η - j

Unterseitenfarbe . ' . \ ' / ... , ' " ..""' " ^{: ;} ' ;."-" ; / '; ;; -' -· ' ' ' ' . .'^: .' Base color . '. \ '/ ...,'"..""'"^:; '; - "-" ; / ';;; - '- ·''''. . ' ^: '

Im allgemeinen gelbliche Schattierungen auf den meistenIn general, yellowish shades on most

Medien. :'; '' ' ; · ..- , ' . ' -. " ' · :·^xn ·^: . : ' ;.- . . " ': :':.·' .. -. .Media. : ';'''; · ..-, '. '-. '' ·: · ^Xn · ^: .: ';.-..''::': · '.. -. ,

Verschiedene physiologische Reaktionen . Various physiological reactions .

Nitrate werden zu Nitriten reduziert, vollständige Gelatineverflüssigung, keine Bildung melanoider Pigmente auf Pepton-Eisen-Ägar, völlige Peptonisierung auf Purpurmilch innerhalb von 7 Tagen, Natriumchloridtoleranz im Wachstumsmedium = 7 %, jedoch <C1O %, Kohlenstoffverwertung nach Pridham und Gottlieb, J. Bacteriol. 5j5 ,107-114 (1948): Gute Verwertung von Adonit, d-Gäläctose, d-Fructose, d-Raffinose, Salicin, d-Xylose und Dextrose, schlechte oder keine Verwertung^von d-Melezitose, d-Melibiose, 1-Arabinose, i-Inosit, Lactose, .d-Mannit, l-Rhamnose, Saccharose und d-Trehalose.Nitrates are reduced to nitrites, complete gelatin liquefaction, no formation of melanoid pigments on peptone-iron agar, complete peptonization on purple milk within 7 days, sodium chloride tolerance in growth medium = 7%, but <C1O%, carbon utilization according to Pridham and Gottlieb, J. Bacteriol , 5j5, 107-114 (1948): Good utilization of adonite, d-glucoseose, d-fructose, d-raffinose, salicin, d-xylose and dextrose, poor or no recovery ^ of d-melezitose, d-melibiose, 1- Arabinose, i-inositol, lactose, .d-mannitol, l-rhamnose, sucrose and d-trehalose.

MiferoitiörphologieMiferoitiörphologie

Aus dem Luftmycel wachsen sporentragende Elemente heraus, die in enggewickelten Spiralen mit mehreren Windungen enden. Die Sporen sind meistens isodiometrisch, zylindrisch und phalangiform und haben Abmessungen von 0,6 - 0,7 μΐη χ 0,7 .0,8-"μια. Die Sporen sind aufgrund einer elektronenmikroskopischen Untersuchung glatt. Die Sporenscheiden sind fein gerunzelt.From the aerial mycelium, spore-bearing elements emerge, ending in tightly wound spirals with several turns. The spores are mostly isodiometric, cylindrical and phalangiform and have dimensions of 0.6-0.7 μΐη χ 0.7 .0.8 μια The spores are smooth due to an electron microscopic examination.

Auf Basis der beobachteten allgemeinen Eigenschaften handelt es sich bei dem Mikroorganismus NRRL 8180 um einen Vertreter aus einer großen Gruppe von Streptomyceteri, dessen charakteristische Merkmale graue Sporen, spiralenförmige Sporenketten, glattwandige Sporen und das Fehlen von Melaninpigmenten sind.Based on the observed general characteristics, the microorganism NRRL 8180 is a member of a large group of Streptomyceteri whose characteristic features are gray spores, helical spore chains, smooth-walled spores, and the absence of melanin pigments.

Die hygroskopische Natur der Kultur zusammen mit allen ihren morphologischen und physiologischen Eigenschaften macht sie zu einem typischen Stamm von Streptomyces hygroscopicus, wie entsprechende Bestimmungen nach H. D. Tresner und E. J. Backus, "A Broadened Concept of the Characteristics of Streptomyces hygroscopicus", Appl. Microbiol. 4_ , 243-250 (1956) und H. D. Tresner, E. J. Backus und J. A. Hayes> "Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicus-like Complex", Appl. Microbiol. 15, 637-639 (1967) zeigen.The hygroscopic nature of the culture, along with all of its morphological and physiological properties, makes it a typical strain of Streptomyces hygroscopicus, as does the corresponding provisions of H. D. Tresner and E. J. Backus, "A Broadened Concept of the Characteristics of Streptomyces hygroscopicus", Appl. Microbiol. 4_, 243-250 (1956) and H.D. Tresner, E.J. Backus and J.A. Hayes> "Morphological Spore Types in the Streptomyces hygroscopicus-like Complex", Appl. Microbiol. 15, 637-639 (1967).

3 0. J U Nl 9 7 7 -1> 4 5 SIV B3 0. J U Nl 9 7 7 -1> 4 5 SIV B

T a b e 1 1 eT a b e 1 1 e

Kulturcharakteristiken von Streptomyces hygros^opicüg NRRL '818OCultural characteristics of Streptomyces hygros ^ opicuge NRRL '818O

Inkubationszeit: 14 TageIncubation period: 14 days

Temperatur·: 28 ^eCTemperature ·: 28 ^e C

Mediummedium

Ausmaß des WachstumsExtent of growth

Luftmyzel und/oder SporenAerial mycelium and / or spores

löslichessoluble

Pigmentpigment

UnterseitenfarbeBase color

BemerkungenRemarks

Czapek-Lösungs-AgarCzapek solution agar

gering Spur eines weißlichen Luftmyzels, keine Sporulationslight trace of a whitish air mycelium, no sporulation

keinesnone

farblos bis weißlichcolorless to whitish

Hefeextrakt-AgarYeast extract agar

gutWell

weißliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulationwhitish aerial mycelium that becomes fawn (4 ig) to beaver (4 li) in sporulation zones; strong sporulation

gelblich, geringyellowish, low

bambusfarben (2 fb)bamboo colors (2 fb)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonenblackish hygroscopic areas in central colony zones

Kuster-Haferflocken-AgarKuster oatmeal agar

gutWell

weißliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulationwhitish aerial mycelium that becomes fawn (4 ig) to beaver (4 li) in sporulation zones; strong sporulation

keinesnone

hellsenffarbenbright mustard

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen; gelbliches Exüdat in Randzonenblackish hygroscopic areas in central colony zones; yellowish exudate in margins

Asparagin-Dextrose-AgarAsparagine dextrose agar

mittelmäßigmediocre

weißliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen aschfarben (5 fe) bis rehfarben (4 ig) wird; mittelmäßige Sporulationwhitish aerial mycelium, which becomes ashes (5 fe) to fawn (4 ig) in sporulation zones; mediocre sporulation

keinesnone

bambusfarben (2 fb)bamboo colors (2 fb)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonenblackish hygroscopic areas in central colony zones

T a b e 1 I e · ΐ (Fortsetzung)T a b e 1 I e · ΐ (continued) Kulturcharakteristiken von Streptomyces hygroscopicuä NRRL 8180Cultural characteristics of Streptomyces hygroscopicua NRRL 8180

Inkubationszeit:Incubation period: 1.4 Tage1.4 days Ausmaß des WachstumsExtent of growth Luftmyzel und/oder SporenAerial mycelium and / or spores lösliches Pigmentsoluble pigment Unterseiten farbeBottom color Temperatur: 28Temperature: 28 °c° c Medium .Medium. BemerkungenRemarks

Hickey- und Tresner-Agar :Hickey and Tresner agar:

mittelmäßigmediocre

weißliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Spcrulationwhitish to yellowish aerial mycelium that becomes fawn (4 ig) to beaver (4 li) in sporulation zones; strong spcrulation

keines bambusfarben (2 fb)no bamboo color (2 fb)

ausgedehnte hygroskopische Flächen in zentralen Kqloniezonenextensive hygroscopic areas in central waterfront zones

anorganische Salze-Stärke-Agarinorganic salts-starch agar

mittelmäßigmediocre

weißliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben ( 4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; starke Sporulationwhitish to yellowish aerial mycelium that becomes fawn (4 ig) to beaver (4 li) in sporulation zones; strong sporulation

keines pastellgelb (1 db)no pastel yellow (1 db)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen -'..-. ' . _:.-:blackish hygroscopic areas in central colony zones -'..-. '. _: .-:

Tomatenpaste-Hafermehl-AgarTomato paste-oatmeal agar

gutWell

weißliches bis gelbliches Luftmyzel, das in Sporulationszonen rehfarben (4 ig) bis biberfarben (4 Ii) wird; sehr starke Sporulationwhitish to yellowish aerial mycelium that becomes fawn (4 ig) to beaver (4 li) in sporulation zones; very strong sporulation

keines gelb-none yellow

ahornfarben (3 ng)maple colored (3 ng)

ausgedehnte hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonen, gelbliches Exudat in Randzonenextensive hygroscopic areas in central colony zones, yellowish exudate in marginal zones

Bennet-AgarBennet Agar

mittelmäßigmediocre

weißliches Luftmyzel, das gelblich, in Sporulationszonen biber- gering farben (4 Ii) wird; starke Sporulationwhitish aerial mycelium, which becomes yellowish, becomes sparsely colored in sporulation zones (4 li); strong sporulation

bambusfarben (2 fb)bamboo colors (2 fb)

schwärzliche hygroskopische Flächen in zentralen Koloniezonenblackish hygroscopic areas in central colony zones

T a b e 1 le I (Fortsetzung)T a b e 1 le I (continued) Kulturcharakteristiken von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180Cultural characteristics of Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

Inkubationszeit:Incubation period: 14 Tage14 days Ausmaß des WachstumsExtent of growth Luftmyzel und/oder SporenAerial mycelium and / or spores lösliches Pigmentsoluble pigment Unterseiten- .. farbeBottom .. color Temperatur: 28 °<Temperature: 28 ° < Mediummedium .- . '. -. .-. . ^λ Bemerkungen.-. '. -. .-. , ^λ remarks

Kartoffel-Dextrose-AgarPotato dextrose agar

gut weißliches bis gelbliches Luftmycel, das in Sporulationszonen aschfärben (5 fe) bis rehfarben (4 ig) wird; mittelmäßige Sporulationgood whitish to yellowish aerial mycelium, which turns ash in sporulation zones (5 fe) to fawn (4 ig); mediocre sporulation

gelblich, geringyellowish, low

ge Ib-Ib

ahornfarben (3 ng)maple colored (3 ng)

schwärzliche hygro· skopische Flächen in zentralen Koloniezonenblackish hygroscopic areas in central colony zones

Tabelletable

IIII

Mikromorphologie von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180Micromorphology of Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

Mediummedium

Luftmyzel und/oder SporenstrukturenAir mycelium and / or spore structures

Sporenaussehenspores appearance

Sporengrößepore size

Sporenoberflächespore surface

Kuster-Haferflocken-AgarKuster oatmeal agar

aus dem Luftmyzel wachsen Sporen heraus, die Verzweigungen tragen, welche in dicht gewundenen Spiralen mit mehreren Gängen endenSpores emerge from the aerial mycelium, bearing ramifications that terminate in tightly wound spirals with multiple gears

die Sporen sind großteils isodiametrisch, zylindrisch, phalanxartigthe spores are mostly isodiametric, cylindrical, phalanx-like

0,6 bis 0,7 μΐη. χ·0.6 to 0.7 μηη. χ ·

0,7 bis 0,8 μπι0.7 to 0.8 μπι

aufgrund einer elektronenmikroskopischen Bestimmungen glatt; die Sporenscheiden sind fein gerunzeltsmooth due to electron microscopic determinations; the spore sheaths are finely wrinkled

Ts be Il θ in:Ts be Il θ in:

Verschiedene physiologische Reaktionen von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 Various physiological reactions of Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180

Mediummedium

organische Nitrat-Brühe organische Nitrat-Brühe Gelatine Peptori-Eisen-AgarOrganic Nitrate Broth Organic Nitrate Broth Gelatin Peptori Iron Agar

PurpurmilchPurple milk

Hefeextrakt-Agar plus (4, 7, 10 und 13 %) NaClYeast Extract Agar plus (4, 7, 10 and 13%) NaCl

Inkubation (28 ⁰C)Incubation (28 ^° C) WachsturasmengeWachsturasmenge 7 Tage7 days gutWell 14 Tage14 days gutWell 7 Tage7 days gutWell 24 bis 48 Stunden24 to 48 hours gutWell 7 Tage7 days gutWell 10 Tage10 days gutWell

physilogische Reaktionen Nitrate werden zu Nitriten reduziert Nitrate werden zu Nitriten reduziert vollständige Verflüssigung Physiological reactions Nitrates are reduced to Nitrites Nitrates are reduced to Nitrites Complete liquefaction

es werden keine melanoide Pigmente gebildetno melanoid pigments are formed

vollständige Pieptonisierungcomplete bleed

NaCl-Toleranz gleich oder über 7 %, jedoch unter 10 %NaCl tolerance equal to or above 7%, but below 10%

T a be 1 le IVT a be 1 le IV

Kohlenstoffverwertungsverhalten von Streptomyces hygroscopicusCarbon utilization behavior of Streptomyces hygroscopicus

NRRL 8180NRRL 8180

Inkubation: 1O Tage Temperatur: 28 °CIncubation: 10 days Temperature: 28 ° C

KohlenstoffquelleCarbon source

Adonitadonitol

1-Arabinose1-arabinose

Dextrandextran

d-Fruktosed-fructose

i-Inositi-inositol

Lactoselactose

d-MannitD-mannitol

d-Melezitosed-melezitose

d-Melibiosed-melibiose

d-Raffinosed-raffinose

1-Rhamnose1-rhamnose

Salicinsalicin

Sacharosesucrose

d-Trehalosed-Trehalose

d-XyloseD-xylose

Dextrosedextrose

Negative KontrolleNegative control

Verwertung*recycling *

³ ' .··. '.- 3 ^:: 0 0 0 1 ³ '. ··. '.- ^3: 0 0 0 1

· . - . ^r. .·. -. ^r . ,

3 03 0

'·' '3· 0 '·''3 · 0

3 03 0

*3 = gute Verwertung 2 = ausreichende Verwertung 1 = schlechte Verwertung O =n keine Verwertung* 3 = good recovery 2 = sufficient recovery 1 = poor recovery O = n no recovery

3O.JÜH, 1977^ ü-45SH8.3O.JH, 1977 ^ -45SH8.

805805

Die Produktion des Antibiotikums BL58O/\ ist selbstverständlich nicht auf diesen besonderen Mikroorganismus oder die Organismen beschränkt, die völlig dem oben beschriebenen Wachstumsverhalten und den angeführten mikroskopischen Eigenschaften für NRRL 8180 genügen. Zur Erfindung gehört daher auch der Einsatz von Mutanten, die aus dem Mikroorganismus NRRL 8180 durch verschiedene Mittel gebildet werden, wie beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost, Aktinophage oder dergleichen.Of course, the production of the antibiotic BL58O / \ is not limited to this particular microorganism or organisms that fully satisfy the growth behavior and microscopic properties for NRRL 8180 described above. The invention therefore also includes the use of mutants formed from the microorganism NRRL 8180 by various means, such as X-irradiation, ultraviolet irradiation, nitrogen mustard, actinophage or the like.

Das Antibiotikum BL58O/\ ist ein äußerst wirksamer Wirkstoff zur Bekämpfung von Coccxdienxnfektionen bei warmblütigen Tieren. Das Antibiotikum BL58O f\ ist darüber hinaus auch wesentlich weniger toxisch als das Antibiotikum BL58Oalpha (dessen Struktur in NL-KPS 74 02 938 angegeben ist. Die Wirksamkeif des Antibiotikums BLSSOA₁ als Mittel gegen Coccidiosis wird anhand der folgenden in-vivo-Untersuchungen gezeigt, für die das im folgenden genannt Geflügelfutter verwendet wird:The antibiotic BL58O / \ is an extremely effective agent for controlling coccoxia infections in warm-blooded animals. The antibiotic BL58O f \ is also significantly less toxic than the antibiotic BL58Oalpha (its structure in NL-KPS 74 02 938 shall also be provided. The Wirksamkeif the antibiotic BLSSOA ₁ as an agent against coccidiosis in vivo studies is shown by the following for which the poultry feed referred to below is used:

Vitamin-Aminosäure-Vorgemisch 0,5 %Vitamin amino acid premix 0.5%

Spurenmineralien 0,1 %Trace minerals 0.1%

Natriumchlorid 0,3 %Sodium chloride 0.3%

Dicalciumphosphat '..,[ .'-.; 1,2 %Dicalcium phosphate '.., [.'-; 1.2%

gemahlener Kalkstein 0;5 %ground limestone 0; 5%

stabilisiertes Fett 4,0 %stabilized fat 4.0%

. entwässerte Luzerne (17 % Protein) 2,0 %, dehydrated alfalfa (17% protein) 2.0%

Maisglutenmehl (41 % Protein) 5,0 %Corn gluten meal (41% protein) 5.0%

Menhadenfischmehl (60 % Protein) 5,0 %Menhadenfish flour (60% protein) 5.0%

Söjabohnenmehl (44 % Protein) 30,0 %Soybean meal (44% protein) 30.0%

;.".' gemahlener gelber Mais, Feinstoffe auf 100 %  ;.. '' ground yellow corn, fines to 100%

Das in obiger Geflügelfuttermxschung angegebene Vitamin-Aminbsäure-Vorgemisch wird aus folgender Formulierung hergestellt. Dif Mengenangaben beziehen sich auf Einheiten pro Kilogramm Geflügel- ^futter/ · .·. ".. :"" .·" ; '. . .·. . . . >· · .- -. ' ·^Λ'::'^ ' ' ' '.- '' . " ,The vitamin-amino acid premix indicated in the above poultry feed supplement is prepared from the following formulation. Dif quantities refer to units per kilogram of poultry feed / · · ·. "..:""." · ";'. , . ·. , , , > · · .- -. '· ^Λ ' :: '^ ''''.-''.",

ί!!Μ ΙΌ'7 7"' [. ι: ' r ί ί !! Μ ΙΌ'7 7 '' [. ι: 'r ί

805805

Butyliertes Hydroxytoluol ' ; 125 mgButylated hydroxytoluene '; 125 mg

dl-Methionin 500 mgdl-methionine 500 mg

Vitamin A ; ₀ :: 3300 I.E.Vitamin A ; ₀ :: 3300 IE

Vitamin D₃ ^: V; V \,';;^v:'V\·:V1100 I.C.E.Vitamin D ₃ ^: V; V \, ';; ^v: V: V1100 ICE

Riboflavin 4,4 mgRiboflavin 4.4 mg

Vitamin E ; V ^ /; . :; -V^ 2,2 I.E.Vitamin E; V ^ /; , :; -V ^ 2.2 I.E.

Niacin . . ' 27,5 mgNiacin. , '27.5 mg

Pantothensäure : 8,8 mgPantothenic acid: 8.8 mg

Cholinchlorid 500 mgCholine chloride 500 mg

Folsäure 1,43 mgFolic acid 1.43 mg

Menadionnatriumbisulfat . 1,1 mgMenadione sodium bisulfate. 1.1 mg

Vitamin B₁₂11 mcgVitamin B ₁₂ 11 mcg

gemahlener gelber Mais, Feinstoffe auf 5 gmground yellow corn, fines to 5 gm

Mischcoccidieninfektiönen von Eimeria tenella und Eimeria acervulinaMixed coccidia infectious of Eimeria tenella and Eimeria acervulina

Ein Mischinokulum aus 5000 sporulierten Oozyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl Oozyten von Eimeria tenella, so daß sich bei unbehandelten Kontrollen eine Mortalität von 85 bis 100 % ergibt, gibt man Gruppen aus sieben Tage alten Küken durch direkte Inokulation in den Kropf. Während der gesamten Versuchsdauer können die Küken nach Belieben Geflügelfutter fressen und Wasser trinken. 2 Tage nach erfolgter Inokulation bietet man den verschiedenen Kükengruppen des Versuchs ein wirkstoffhaltiges Futter an, das aus dem Geflügelfutter und mehreren Dosen des Antibiotikums BL58O/\ zusammengesetzt ist. 10 Tage nach erfolgter Inokulation werden die Untersuchungen beendet. Die Tiere werden gewogen und getötet, worauf man ihren Intestinaltrakt auf Schädigungen untersucht. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle V hervor. Die Ergebnisse zeigen, daß die Verabreichung von 125 ppm oder 250 ppm Antibiotikum ΒΏ58θ/\ zusammen mit dem Futter an infizierte Küken ein 100-prozentiges Überleben dieser infizierten Küken ergibt. Ferner geht aus den Versuchsdaten hervor, daßA mixed inoculum of 5000 sporulated oocytes of Eimeria acervulina and a sufficient number of Eimeria tenella oocytes to give mortality of 85 to 100% in untreated controls is given to groups of seven day old chicks by direct inoculation into the crop. Throughout the trial, the chicks can eat poultry feed and drink water at will. Two days after the inoculation has been carried out, various chick groups of the experiment are given a medicated feed composed of the poultry feed and several doses of the antibiotic BL58O / \. 10 days after the inoculation has been completed, the examinations are terminated. The animals are weighed and killed, after which their intestinal tract is examined for damage. The results obtained in this experiment are shown in the following Table V. The results show that the administration of 125 ppm or 250 ppm antibiotic ΒΏ58θ / \ together with the diet to infected chicks gives 100% survival of these infected chicks. Furthermore, the experimental data show that

IMK! 107 7 _ i! VrIMK! 107 7 _ i! Vr

-· 15 -- · 15 -

iff 805iff 805

man durch Verabreichung von 30 ppm oder 60 ppm Antibiotikum BLSeo/s^ an infizierte Küken zusammen mit dem Futter eine ganz starke Unterdrückung der durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina hervorgerufenen Schädigungen erhält.administration of 30 ppm or 60 ppm of antibiotic BLSeo / s ^ to infected chicks together with the feed gives a very strong suppression of the damage caused by Eimeria tenella and Eimeria acervulina.

,Vii , Vii

Tabelle VTable V

Konzentration, anConcentration, on

BL58O/NJ, im Futter, Anzahl der % überlebende ppm Versuchstiere Tiere % Tiere mit verringerten Schädigungen Eimeria tenella Eimeria acervulinaBL58O / NJ, in feed, number of% surviving ppm animals animals % animals with reduced lesions Eimeria tenella Eimeria acervulina

1717

250250

100 100100 100

100100

125125

6060

3030

24 2524 25

100 91,6 60 100 46100 91.6 60 100 46

100100

100100

- •Φβ -- • Φβ -

Mischcoccidieninfektion von Eimeria tenella, Eimeria acervulina,Mixed coccidia infection of Eimeria tenella, Eimeria acervulina,

Eimeria necatrix, Eimeria brünetti und Eimeria maximaEimeria necatrix, Eimeria brünetti and Eimeria maxima

Ein handelsübliches Vaccin (Coccivac D, Sterwin Laboratories/ Opalika, Alabama), das ein Gemisch aus wenigstens fünf Arten von Eimeria coccidia enthält, verabreicht man Küken in einer gegenüb der normalen Immunisierungsdosis 70-fachen Menge. Das Vaccin gib man Gruppen aus sieben Tage alten Küken durch direkte Inokulatio in den Kropf aller Tiere. Die Tiere haben während der gesamten Versuchsdauer freien Zugang zu Wasser und dem oben genannten Geflügelfutter. Zwei Tage nach erfolgter Inokulation bietet man de verschiedenen Kükengruppen des Versuchs wirkstoffhaltiges Futter an, das aus dem Geflügelfutter und mehreren Dosen Antibiotikum ΒΙιδδΟ^ besteht. 10 Tage nach Inokulation werden die Untersuchen gen beendet, wobei man die Tiere wiegt, tötet und ihre Intestinaltrakte auf Schädigungen bzw. Verletzungen hin untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestell Die Ergebnisse zeigen, daß eine Verabreichung von 120 ppm Antibii tikum BL58O/\ an infizierte Küken zusammen mit dem Futter zu einem 100-prozentigen Überleben der infizierten Küken führt. Ferne: ergibt sich bei dieser Wirkstoffkonzentration auch eine ziemlich starke Unterdrückung von Schädigungen oder Verletzungen, die dur< Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria *) brunetti und Eimeria maxima hervorgerufen werden. A commercial vaccine (Coccivac D, Sterwin Laboratories / Opalika, Alabama) containing a mixture of at least five species of Eimeria coccidia is administered to chicks 70 times the normal immunization dose. The vaccine is given to groups of seven-day-old chicks by direct inoculatio in the goiter of all animals. The animals have free access to water and the above-mentioned poultry feed throughout the duration of the experiment. Two days after the inoculation has been carried out, various chick groups of the experiment have been given active ingredient-containing feed consisting of poultry feed and several doses of antibiotic ΒΙιδδΟ ^. Ten days after inoculation, the investigations are stopped, where the animals are weighed, killed and their intestinal tract examined for damage or injury. The results obtained are summarized in Table VI. The results show that administration of 120 ppm of antibiotic BL58O / \ to infected chicks along with the diet results in 100% survival of the infected chicks. At a distance: at this concentration of active substance there is also a fairly strong suppression of damage or injury caused by Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria *) brunetti and Eimeria maxima.

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Konzentration anConcentration

ΒΙι58Ο/\^ im Futter, Anzahl der % überlebende % Tiere mit verringerten Schädigungen ΒΙι58Ο / \ ^ in feed,% of% surviving% animals with reduced damage

ppm Versuchstiere Tiere tenella acervulina necatrix brunetti maximappm experimental animals animals tenella acervulina necatrix brunetti maxima

0 15 0 0 .... Ό' . /. 60 0 200 15 0 0 .... Ό '. /. 60 0 20

120 15 100 100 100 100 100 100120 15 100 100 100 100 100 100

60 15 100 40 93 100 48 8060 15 100 40 93 100 48 80

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Fermentationsverfahren . \ ^^; : . : ^ r Fermentation process . \ ^ ^; :. : ^ r

Die Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 kann in einer großen Zahl verschiedener flüssiger Kulturmedien durchgeführt werden. Zur Bildung dieses Antiotikums BLSSO/S^ geeignete Medien enthalten eine assimilierbare Kohlenstoff quelle ,z.B. Stärke, Zucker, Melasse oder Glycerin, eine assimilierbar Stickstoffquelle, z.B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren oder Maisquellwasser, sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Magnesium., Calcium, Ammoniumsulfat, Carbonat, Phosphat und Chlorid. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän und Kupfer, liegen als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums vor. Die Belüftung in Tanks und Kolben erfolgt durch Durchleiten steriler Luft durch das gärende Medium oder Aufblasen von steriler Luft auf die Oberfläche des Mediums. Außerdem wird in Tanks durch mechanische Mittel für Bewegung gesorgt. Je nach Bedarf kann ein Entschäumer zugesetzt werden, beispielsweise 1 % Octadecanol in Lardöl.Cultivation of the microorganism Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 can be carried out in a large number of different liquid culture media. Suitable media for forming this anti-blocker BLSSO / S ^ include an assimilable carbon source, e.g. Starch, sugar, molasses or glycerol, an assimilable nitrogen source, e.g. Protein, protein hydrolyzate, polypeptides, amino acids or corn steep liquor, and inorganic anions and cations such as potassium, magnesium., Calcium, ammonium sulfate, carbonate, phosphate and chloride. Trace elements, such as boron, molybdenum and copper, are present as impurities of other components of the medium. Aeration in tanks and flasks is accomplished by passing sterile air through the fermenting medium or inflating sterile air onto the surface of the medium. In addition, tanks provide movement by mechanical means. Depending on requirements, a defoamer may be added, for example 1% octadecanol in Lardöl.

InokulumherstellungInoculum ^;;

Ein Schüttelkolbeninokulum von Streptomyces hygroscopicus NRRL wird durch Beimpfen von 100 ml sterilem flüssigem Medium in 500 Kolben mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen einer Schrägagarkultur hergestellt. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise folgendes:A shake flask inoculum from Streptomyces hygroscopicus NRRL is prepared by inoculating 100 ml of sterile liquid medium into 500 flasks with scraped or washed spore slants of a slant culture. A suitable medium is, for example:

Sojabohnenmehl 1,0 %Soybean meal 1.0%

Glucose 2,0 %Glucose 2.0%

Maisquellwasser 0/5 %Corn steep liquor 0/5%

;:. ; ' ' ';.' ; -/'..CaCp₃-' ' ' '. / . ;^{; :} .^: ' · , ' ' '.- 0,3' % ' ".' ^:. " ' Wasser . auf 100 %;. ; ''';.'; - / '.. CaCp ₃ -''''./.;^{; :} . ^: ',''' .- 0.3 ' % '".' ^: '' Water. to 100%

Die Kolben werden bei einer Temperatur von 25 bis 29 ⁰C, vor-^; zugsweise 28 ⁰C, unter kräftiger Bewegung auf einem Rotationsschüttler 48 bia 96 Stunden inkubiert.The flasks are at a temperature of 25 to 29 ⁰ C, forward ^; preferably 28 ⁰ C, incubated with vigorous agitation on a rotary shaker 48 bia 96 hours.

Zwei Mengen von jeweils 100 ml dieses Inokulums verwendet man dann zurBeimpfung von 12 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem 20 Liter fassenden Kolben. Dieses Inokulum wird unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C, inkubiert.Two 100 ml portions of this inoculum are then used to inoculate 12 liters of the same sterile medium in a 20 liter flask. This inoculum is incubated with agitation and aeration with sterile air for 36 to 64 hours at 25 to 29 ⁰ C, preferably 28 ⁰ C.

Mit dem in dieser Weise erhaltenen Inokulum beimpft man dann 300 Liter des gleichen sterilen Mediums in einem Fermentationstank. Dieses Inokulum inkubiert man unter Bewegung und Belüftung mit steriler Luft 36 bis 64 Stunden bei 25 bis 29 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C.With the inoculum obtained in this way, then inoculated 300 liters of the same sterile medium in a fermentation tank. This inoculum is incubated with agitation and aeration with sterile air for 36 to 64 hours at 25 to 29 ⁰ C, preferably 28 ⁰ C.

Mit dem dabei erhaltenen Inokulum beimpft man dann einen 4000 Liter fassenden Fermentationstank, der 3000 Liter eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthält: *The inoculum obtained in this way is then used to inoculate a 4000-liter fermentation tank containing 3000 liters of a sterile medium of the following composition:

Maisquellwasser 0,5 %Corn steep liquor 0.5%

. :.· Sojabohnenmehl . 1,0 % ., : · Soybean meal. 1.0%.

Maisstärke 4,0 %Cornstarch 4.0%

. CaCO₃ 0,1 %, CaCO ₃ 0.1%

Wasser " auf 100 %Water "to 100%

Das obige'Medium fermentiert man 100 bis 200 Stunden bei einer Temperatur von 27 bis 32 ⁰C unter Bewegung mit einem Rührer und Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 0,4 bis 0,8 Liter Luft pro Liter Medium pro Minute. Normalerweise setzt man auch einen Entschäumer zu, beispielsweise Hodag" FD82, und zwar in einer Menge von etwa 1,3 Liter pro 1000 Liter Medium.The above medium is fermented for 100 to 200 hours at a temperature of 27 to 32 ⁰ C under agitation with a stirrer and aeration at a rate of 0.4 to 0.8 liters of air per liter of medium per minute. Normally, it is also a defoamer, for example, Hodag "FD82, in an amount of about 1.3 liters per 1000 liters of medium.

Reinigungsverfahrencleaning process

Nach beendeter Fermentation vereinigt man die das Antibiotikum BL58O/\^enthaltende Fermentationsmaische mit etwa der Hälfte ihres Volumens an Äthylacetat und rührt das Ganze dann 2 bisAfter completion of the fermentation, the fermentation mash containing the antibiotic BL58O / \ ^ is combined with about half of its volume of ethyl acetate and the whole is then stirred 2 to

3 0.JUN-1977 ^G 4 5Sl)83 june-1977 ^ G 4 5sl) 8

,3 Stunden. Sodann gibt man etwa 8 % Diatomeenerde zu und filtrie das Gemisch durch eine Platten— und Rahmen-Filterpresse. Der FiI,3 hours. Add about 8% of diatomaceous earth and filter the mixture through a plate and frame filter press. The FiI

: terkuchen wird auf der Presse mit Äthylacetat gewaschen. Die Äthylacetatextrakte werden gesammelt und in einer Destillationsvorrichtung zu einem Sirup konzentriert. .: cake is washed on the press with ethyl acetate. The ethyl acetate extracts are collected and concentrated in a distillation apparatus to a syrup. ,

Der auf diese Weise erhaltene Sirup wird mit einer gegenüber seinem Volumen zweifachen Menge Heptan gewaschen und dann über Nacht bei 4 ⁰C aufgehoben. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und zu einem gummiartigen Rückstand eingeengt.The syrup obtained in this way is washed with twice its volume in volume heptane and then stored at 4 ⁰ C overnight. The supernatant liquid is decanted and concentrated to a gummy residue.

Das gummiartige Konzentrat behandelt man mit 10. Liter Methanol, worauf man das Ganze mehrere Stunden unter Verwendung von Trocke eis kühlt. Anschließend filtriert man das Gemisch durch eine Sinterglasnutsche, auf der sich eine Schicht Diatomeenerde befin det_r wobei man mit kaltem Methanol wäscht. Die Methanollösung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft.The gummy concentrate is treated with 10 liters of methanol, after which it is cooled for several hours using Trocke ice. Subsequently, the mixture was filtered through a sintered glass funnel, on which a layer of diatomaceous earth befin det _R where is washed with cold methanol. The methanol solution is evaporated to dryness under vacuum.

Sodann bereitet man eine Chromatographiesäule vor, die Aktivkohl in einer Menge von etwa 1 Liter Kohle pro 50 g Beschickung enthält. Der getrocknete Rückstand wird in Methylenchlorid in einer Menge von 40 g pro Liter gelöst und auf die Säule gegeben. Das Methylenchlorideluat wird als.eine einzige Fraktion gesammelt und zur Trockne eingedampft. Den dabei erhaltenen'Rückstand vermischt man dann mit Methanol und lagert das Ganze anschließen in einem Kühlraum mit Trockeneis, um die Temperatur 15 Minuten auf -10 ⁰C zu reduzieren. Nach 15 Minuten filtriert man das verfestigte öl ab und engt das methanollösliche Material unter Vakuum zur Trockne ein, wodurch man zu einem öl gelangt.A chromatographic column is then prepared which contains activated charcoal in an amount of about 1 liter of coal per 50 grams of feed. The dried residue is dissolved in methylene chloride in an amount of 40 g per liter and added to the column. The methylene chloride product is collected as a single fraction and evaporated to dryness. The erhaltenen'Rückstand thereby is then mixed with methanol and stored in a refrigerator connect with dry ice to reduce the temperature for 15 minutes at -10 ⁰ C the whole. After 15 minutes, the solidified oil is filtered off and the methanol-soluble material is evaporated to dryness under vacuum to give an oil.

Dieses öl löst man dann in einer minimalen Menge Metyhlenchlorid worauf man Silicagel zugibt, das Ganze zur Trockne einengt und schließlich auf eine Trockensilicagelsäule aufgibt.· Die Entwicklung der Säule erfolgt zuerst mit 10 % Äthylacetat in Benzol und anschließend mit 20 % Äthylacetat in Benzol. Anschließend läßt man die Säule ablaufen. Die Säule wird inThis oil is then dissolved in a minimal amount of methylene chloride followed by silica gel, concentrated to dryness and finally applied to a dry silica gel column. The column is first developed with 10% ethyl acetate in benzene and then with 20% ethyl acetate in benzene. Then allowed to drain the column. The column will be in

.1.1

10 gleiche Teile (einschließlich der Beschickung) eingeteilt. Kernproben werden über die Länge der gesamten Säule bei Rf-Werten von 0,05, 0,15, 0,25, 0,35 usw. entfernt und mit einem entsprechenden Volumen eines Gemisches aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) eluiert. An Stellen, an denen das Antibiotikum überlappt, sammelt man an jedem 1/8 einer Rf-Einheit eine Kernprobe. Die Stelle, an der das Antibiotikum kommt, ermittelt man durch dünnschichtchromatographische Untersuchung der Kerneluate unter Verwendung handelsüblicher Dünnschichtchromatogrammplatten (Silplate-22 von Brinkmann Instrument Co., . Westbury, New York 11590). Die Detektion der jeweiligen Zonen erfolgt durch Verkohlung in Gegenwart von Schwefelsäure.10 equal parts (including the feed) divided. Core samples are removed over the length of the entire column at Rf values of 0.05, 0.15, 0.25, 0.35, etc., and with an appropriate volume of a mixture of ethyl acetate, methylene chloride and methanol (2: 2: 1 ) elutes. At sites where the antibiotic overlaps, a core sample is collected on every 1/8 of an Rf unit. The site where the antibiotic comes is determined by thin-layer chromatographic analysis of the nuclear eluates using commercially available thin-layer chromatogram plates (Silplate-22 from Brinkmann Instrument Co., Westbury, New York 11590). The detection of the respective zones is carried out by charring in the presence of sulfuric acid.

Diejenige Sektion der Säule, die ein Material mit Rf-Werten von 0,11 bis 0,35 enthält, wird aus der Säule herausgeschnitten und in einem Gemisch aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1, auf Volumen bezogen) aufgeschlämmt. Das dabei erhaltene • Gemisch wird filtriert, mit weiterem Lösungsmittelgemisch gewaschen und dann unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Der hierbei anfallende Rückstand wird in tert.-Butanol gelöst, worauf man das Ganze filtriert und gefriertrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu einem flockigen Feststoff. . ; _; The column section containing a material having Rf values of 0.11 to 0.35 is cut out of the column and slurried in a mixture of ethyl acetate, methylene chloride and methanol (2: 2: 1, by volume). The resulting mixture is filtered, washed with further solvent mixture and then concentrated to dryness in vacuo. The resulting residue is dissolved in tert-butanol, after which the whole is filtered and freeze-dried. In this way one arrives at a flaky solid. , ; _;

) Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:75:37, auf Volumen bezogen) stellt man ein.Zweiphasensystem her. Mit der unteren Phase dieses Systems vermischt man dann eine bestimmte Sorte Diatomeenerde (Celatom von Eagle-Picher Industries, Cincinnati, Ohio) in einer Menge von 800 g auf 600 ml untere Phase und bepackt mit diesem Gemisch anschließend in gewissen Anteilen eine Säule (Durchmesser 7,5 cm). Als Säulenbeschickung verwendet man ein Gemisch aus Diatomeenerde, unterer Phase und lyophilisiertem Produkt (40 g:30 ml:13,8 g). Die Ent-By mixing n-heptane, methanol, ethyl acetate and water (3000: 1500: 75: 37, by volume) one prepares a two-phase system. The lower phase of this system is then mixed with a certain grade of diatomaceous earth (Celatom from Eagle-Picher Industries, Cincinnati, Ohio) in an amount of 800 g to 600 ml lower phase and then a portion of this mixture (diameter 7) is added in certain proportions , 5 cm). The column feed used is a mixture of diatomaceous earth, lower phase and lyophilized product (40 g: 30 ml: 13.8 g). The decision

ihm 1Q7 7him 1Q7 7

- 23 -- 23 -

Wicklung der beschickten Säule erfolgt unter Verwendung von 'unterer Phase, wobei man Fraktionen von 25 ml auffängt. Zur Detektion der wirkstoffhaltigen Fraktionen unterzieht man ausgewählte Fraktionen einer dünnschicntchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von Gelplatten, wobei man mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat (1:1) als Entwicklungsmittel arbeitet und die eigentliche Detaktion durch Verkohlung vornimmt. Die Fraktionen 90 bis 150 werden vereinigt und eingedampft, wodurch man das Antibiotikum EL58O/\ erhält. Aus.führutigsbeispiel: . . . . , ^{: ;} . , Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. . " · . · , .'.. ν ν· - ' ' ' v ' .' .'·:, '.' ν.-;'. ,Coiling of the charged column is carried out using 'lower phase, collecting fractions of 25 ml. For the detection of the active substance-containing fractions, selected fractions are subjected to a thin-layer chromatographic analysis using gel plates, using a mixture of chloroform and ethyl acetate (1: 1) as developing agent and carrying out the actual detection by charring. Fractions 90 to 150 are combined and evaporated to give the antibiotic EL58O / \. Example:. , , , , ^:; , The invention will be further elucidated by the following examples. , "·. ·,. '.. ν ν · -''' v '.''':,'.'ν.-;'.,

B ei s pi el 1Example 1

Herstellung des InokulumsProduction of the inoculum

•Ein beispielhaftes Medium, das zur Züchtung des Inokulums der ersten Stufe verwendet wird, wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:An exemplary medium used to grow the first stage inoculum is prepared from the following components:

Sojabohnenmehl 1,0 gSoybean meal 1.0 g

Glucose 2,0 gGlucose 2.0 g

Maisquellwasser 0,5 g .Corn steep liquor 0.5 g.

CaCO₃ 0,3 gCaCO ₃ 0.3 g

Wasser auf 100 mlWater to 100 ml

Unter Verwendung abgewaschener oder abgekratzter Sporen aus einei Agarschräge von Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180 beimpft man dann zwei 500 ml Kolben, die jeweils 100 ml des obigen Mediums in sterilisierter Form enthalten. Die Kolben werden anschließend auf einen Rotationsschüttler gegeben und kräftig 72 Stunden bei. einer Temperatur von 28 ⁰C durchmischt.Using spiked or scraped spores from an Agar slope of Streptomyces hygroscopicus NRRL 8180, then inoculate two 500 ml flasks each containing 100 ml of the above medium in sterilized form. The flasks are then placed on a rotary shaker and vigorously at 72 hours. a temperature of 28 ⁰ C mixed.

Das in obiger Weise gebildete Kolbeninokulum überträgt man dann i einen 19 Liter Glaskolben, der 12 Liter des gleichen sterilen Med ums enthält. Dieses zweite Inokulum wird mit steriler Luft belüftThe piston inoculum formed in the above manner is then transferred to a 19 liter glass flask containing 12 liters of the same sterile medium. This second inoculum is aerated with sterile air

:.. ' '\··: -".- ^:: ; % '-.· " ' ' ') η ViIiM-Un'7'/ . n ...'. ^ <*--(\V ^: ' · : .. '' \ ··: - ".- ^:: ;% '-. ·"''') Η ViIiM-Un'7 '/. n ... '. ^ <* - (\ V ^: '·

während man es 48 Stunden bei einer Temperatur von 28 ⁰C.wachsen läßt. .' . V^V. .'..-^;;7 "'';/.. _; ' '. ' ' '., ' ·':' . ^: ' ' · ' '·while it can be 48 hours at a temperature of 28 ⁰ C.wachsen. . ' , V ^ V. .'..- ^; 7 '''; / .. _; ' '. '''.,'·':'. ^: ''·''·

Das in obiger Weise hergestellte zweite Inokulum überträgt man hierauf in einen 380 Liter fassenden Fermentationstank, der 300 Liter des gleichen sterilen Mediums enthält. Die Belüftung dieses dritten Inokulums erfolgt mit steriler Luft in einer Menge von 1 Liter Luft pro Liter Medium pro Minute, wobei man das Ganze mit einem Rührer unter einer Geschwindigkeit von 173 Umdrehungen pro Minute rührt. Man läßt.den Ansatz 48 Stunden bei 28 ⁰C wachsen. Der pH-Wert beträgt zu dieser Zeit 6,9 "bis'.7,0. -. ^: ; / Λ ^: " . : ' ... ..':. :. . . '. ' .·'.· '/ ; 'The second inoculum prepared in the above manner is then transferred to a 380 liter fermentation tank containing 300 liters of the same sterile medium. The aeration of this third inoculum is done with sterile air in an amount of 1 liter of air per liter of medium per minute while stirring with a stirrer at a rate of 173 revolutions per minute. One approach läßt.den grow for 48 hours at 28 ⁰ C. The pH at this time is 6.9 "to '7.0. - ^.: / Λ ^: ". : '... ..' :. :. , , '. '. ·'. · '/ ; '

B e i s ρ i e 1 2 :B e i s ρ i e 1 2:

Fermentationfermentation

Zur Herstellung eines Fermentationsmediums geht man von folgenden Bestandteilen aus:The preparation of a fermentation medium is based on the following constituents:

Maisquellwasser 0,5gCorn steep water 0,5g

Sojabohnenmehl 1,0 gSoybean meal 1.0 g

χ Maisstärke 4,0gχ cornstarch 4.0g

CaCO₃ . 0,1 gCaCO ₃ . 0.1 g

Wasser auf 100 mlWater to 100 ml

3000 Liter eines Fermentationsmediums der obigen Formulierung, sterilisiert man in einem 4000 Liter fassenden Tank 60 Minuten bei 120 ⁰C. Nach erfolgter Sterilisation hat das Medium einen pH-Wert von 6,4 bis 6,5. Im Anschluß daran inokuliert man dieses Medium mit 300 Liter des nach Beispiel 1 hergestellten dritten Inokulums. Die Fermentation wird bei 28 bis 3O ⁰C durchgeführt, wobei man als Entschäumer 4,0 Liter Hodag FD82 verwendet. Der Ansatz wird mit.0,6 Liter steriler Luft pro Liter Maische und pro Minute belüftet. Die Maische rührt man mit einem unter einer3000 liters of a fermentation medium of the above formulation, sterilized in a 4000 liter tank for 60 minutes at 120 ⁰ C. After sterilization, the medium has a pH of 6.4 to 6.5. Subsequently, this medium is inoculated with 300 liters of the third inoculum prepared according to Example 1. The fermentation is conducted at 28 to 3O ⁰ C to obtain 4.0 liters of Hodag FD82 as a defoaming agent is used. The batch is aerated with 0.6 liters of sterile air per liter of mash and per minute. The mash is stirred with one under one

111M 10 1 7 . ',: '. 7,L ti 111M 10 1 7. ',:'. 7, L ti

Geschwindigkeit von 150 Umdrehungen pro Minute laufenden Rührer. Nach insgesamt 138,5 Stunden langer Fermentation wird die Maisch geerntet.' ,. λ. ' ·..-..'. '. . " .. ' ·.. y^;--y.. '....:: . ./ >.'.Vv ν \ /-.. ^:'··.·^:'Speed of 150 revolutions per minute running stirrer. After a total of 138.5 hours of fermentation, the mash is harvested. . λ. '· ..- ..'. '. , '..' · .. y ^; --y .. '.... ::. ./>.'. Vv ν \ / - .. ^: '··. · ^: '

VV -V'- ' . " ;·... B e 1 s ρ i e 1 ''3 'V [. ' "'' .. '' '' . ' . .^; " / . VV -V'- '. "... B e 1 s ρ ie 1 '' 3 'V [.'"'' .. ''''.'. , ^; "/. Isolierung und ReinigungInsulation and cleaning

2550 Liter der.nach Beispiel 2 hergestellten fermentierten Maisc die einen pH-Wert von 7,4 hat, vereinigt man mit 1275 Liter Äthy acetat und rührt das Ganze dann 2,5 Stunden. Im Anschluß daran gibt man 8 Gewichtsprozent Diatomeenerde zu. Das so erhaltene Gemisch filtriert man hierauf in mehreren Anteilen unter Rühren durch ein paar Rahmenpressen. Die Wasser-Äthylacetat-Filtrate werden vereinigt, wodurch man insgesamt 3250 Liter Material erhä das man dann zur Schichtentrennung stehen läßt. Auf diese Weise ergeben sich 1000 Liter Äthylacetatextrakt. Nach Filtrieren einer jeden Teilmenge des Gemisches aus Maische, Äthylacetat und Diatomeenerde durch die entsprechende Presse wäscht man den auf der Presse vorhandenen Filterkuchen jeweils mit Äthylacetat. Die Athylacetatwaschflüssigkeiten werden vereinigt und abgetrennt, wodurch man zu 535 Liter Äthylacetatwaschflüssigkeit gelangt. Die obigen 1000 Liter Äthylacetatextrakt'und 535 Liter Äthylacetatwaschflüssigkeit werden vereinigt und dann in einer 1515 Liter fassenden Destilliervorrichtung auf 225 Liter konzentriert. Diese 225 Liter Material konzentriert man dann in einer 190 Liter fassenden Destilliervorrichtung weiter auf ein Volumen von 20 Liter. Im Anschluß daran konzentriert man diese 20 Liter Material in einer Glasdestilliervorrichtung weiter, wodurch man zu einem Sirup gelangt.2550 liters of fermented cornc produced according to Example 2, which has a pH of 7.4, are combined with 1275 liters of ethyl acetate and the whole is then stirred for 2.5 hours. Thereafter, 8 percent by weight of diatomaceous earth is added. The resulting mixture is then filtered in several portions with stirring by a few frame presses. The water-ethyl acetate filtrates are combined, whereby a total of 3250 liters of material erhä then let stand for delamination. This results in 1000 liters of ethyl acetate extract. After filtering each subset of the mixture of mash, ethyl acetate and diatomaceous earth through the appropriate press, the filter cake present on the press is washed in each case with ethyl acetate. The ethyl acetate washings are combined and separated to give 535 liters of ethyl acetate wash. The above 1000 liters of ethyl acetate extract and 535 liters of ethyl acetate wash liquor are combined and then concentrated to 225 liters in a 1515 liter distiller. This 225 liter material is then concentrated in a 190 liter distilling device further to a volume of 20 liters. Following this, one concentrates this 20 liters of material in a glass still, resulting in a syrup.

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Der in obiger Weise erhaltene Sirup wird 48 Stunden bei 4 ⁰C aufgehoben und anschließend mit der zweifachen Volumenmenge Heptan gerührt. Das Gemisch läßt man hierauf über Nacht bei 4 ⁰C stehen. Die überstehende Flüssigkeit wird sodann dekantiert und anschließend zu einem gummiartigen Rückstand konzentriert.The syrup obtained in the above manner is stored for 48 hours at 4 ⁰ C and then stirred with twice the volume amount of heptane. The mixture is allowed to stand at 4 ⁰ C overnight. The supernatant is then decanted and then concentrated to a gummy residue.

Den gummiartigen Rückstand versetzt man mit .10 Liter Methanol/ worauf man das Gemisch unter Verwendung von Trockeneis mehrere Stunden kühlt. Anschließend wird das Gemisch durch eine Sinterglasnutsche, die eine Schicht aus Diatomeenerde enthält, filtriert, wobei man mit kaltem Methanol nachwäscht. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man zu 1353,,5 g Rückstand gelangt. . '. ' '. ' '. . . '. ·, . : . ·. ' ./' .- .The gummy residue is mixed with .10 liters of methanol and the mixture is cooled for several hours using dry ice. The mixture is then filtered through a sintered glass funnel containing a layer of diatomaceous earth, followed by washing with cold methanol. The combined filtrate and washings are then evaporated to dryness under vacuum to yield 1353. 5 g of residue. , '. ''. ''. , , '. ·,. :. ·. './' .-.

Den in obiger Weise erhaltenen Rückstand (1353,5 g) löst man derart in Methylenchlorid, daß sich eine Konzentration von •40 g pro Liter ergibt. Im Anschluß daran bepackt man eine Chromatographiersäule mit 27,07 Liter Kohlegranulat mit einer Korngröße von 0,83 χ 0,44. Sodann führt man die obige Methylenchloridlösung unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 375 bis 400 ml pro Minute durch diese Säule. Das Methylenchlorideluat wird in Form einer einzigen Fraktion aufgefangen und zur Trockne eingedampft, wodurch man 153 g Rückstand erhält. Den Rückstand vermischt man gründlich mit 8 bis 9 Liter Methanol. Das dabei erhaltene Gemisch kühlt man dann in einem Kühlraum unter Verwendung von Trockeneis auf -10 ⁰C ab und hält es 15 Minuten bei -10 ⁰C. Das hierbei anfallende verfestigte öl wird abfiltriert, und das Methanolfiltrat konzentriert man unter Vakuum zur Trockne, wodurch man zu 781,4 g eines Öls gelangt.The residue obtained in the above manner (1353.5 g) is dissolved in methylene chloride in such a way that results in a concentration of • 40 g per liter. Subsequently, a chromatographic column with 27.07 liters of carbon granules with a particle size of 0.83 χ 0.44 is packed. The above methylene chloride solution is then passed through this column at a flow rate of 375 to 400 ml per minute. The Methylenchlorideluat is collected in the form of a single fraction and evaporated to dryness to give 153 g of residue. The residue is thoroughly mixed with 8 to 9 liters of methanol. The resulting mixture is then cooled in a cold room using dry ice to -10 ⁰ C and holding it for 15 minutes at -10 ⁰ C. The resulting solidified oil is filtered off, and the methanol filtrate is concentrated under vacuum to dryness, whereby you get to 781.4 g of an oil.

Zur Herstellung einer trocken bepackten Chromatographiersäule gibt man 4 kg Silicagel in eine Kunststoffsäule mit einem Umfang von 30,5 cm. 200 g des obigen Öls löst man anschließend in einer minimalen Menge Methylenchlorid. Sodann gibt man hierzuTo prepare a dry-packed chromatography column, add 4 kg of silica gel to a plastic column having a circumference of 30.5 cm. 200 g of the above oil are then dissolved in a minimum amount of methylene chloride. Then you give this

W η ιιΐΛί 'Π η 1 ,,_ ι; V '" ^ (V SiW η ιιΐΛί 'Π η 1 ,, _ ι; V '"^ (V Si

-27-199-27-199

300 g Silicagel, vermischt das Ganze gründlich und engt das so erhaltene. Gemisch hierauf unter Vakuum zur Trockne ein. Das dabei erhaltene getrocknete Gemisch wird auf die Säule aufge- , geben, wobei man das obere Ende der Säule mit einer bestimmten Menge Seesand versieht/ um so eine Durchmischung.des Betts während der Elution zu unterbinden. Die Kunststoffsäule stellt man in eine Glasschale als Träger und Unterlage. Die Säule wird mit 12 Liter 10-prozentigem Äthylacetat in Benzol eluiert. Man läßt die Säule trockenlaufen, worauf man sie mit 7,6 Liter 20-prozentigem Äthylacetat in Benzol eluiert. Nach Auffangen entsprechender Fraktionen läßt man die Säule trockenlaufen. Die Säule wird dann mit Stickstoff gespült. Die Ermittlung der antibiotischen Aktivität erfolgt durch Untersuchung entsprechender Fraktionen unter Verwendung von Streptococcus pyogenes NY5. Die Säule wird in 10 gleiche Teile (unter Einschluß der Säulenbeschickung) unterteilt. Über die Länge der gesamten Säule werden Kernproben bei Rf-Werten von 0,05, 0,15, 0,25, 0,35 ... etc. entnommen. An denjenigen Stellen, an denen sich dieantibiotischen Banden überlappen, werden Proben bei jedem 1/8 einer Rf-Einheit gesammelt. Jede Kernprobe verdünnt man mit 10 ml eines Gemischs aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) und untersucht die Proben dünnschichtchromatographisch unter Verwendung eines Gemisches aus Äthylacetat und Chloroform (1:1), wobei man jeweils Proben mit 30 ml verwendet und die Detektion unter Verkohlung mit Schwefelsäure durchführt. Die Sektion der Säule mit Rf-Werten von 0,11 bis 0,35 wird entfernt und in einem Gemisch aus Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol (2:2:1) aufgeschlämmt. Das Gemisch wird filtriert und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gewaschen, worauf man das erhaltene Material unter Vakuum zur Trockne eindampft. Der Rückstand wird in tert.-Butanol gelöst, und durch anschließendes Filtrieren und Lyophilisieren des dabei erhaltenen Materials gelangt man zu 26,7 g Produkt. Durch Vermischen von n-Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:1500:75:37, auf Volumen bezogen) stellt man ein Zweiphasensystem her. Mit 600 ml der300 g of silica gel, mix thoroughly and concentrate the resulting. Mix to dryness under vacuum. The resulting dried mixture is applied to the column, providing the upper end of the column with a certain amount of sea sand / so as to prevent mixing of the bed during the elution. The plastic column is placed in a glass bowl as a carrier and pad. The column is eluted with 12 liters of 10% ethyl acetate in benzene. The column is allowed to dry and then eluted with 7.6 liters of 20% ethyl acetate in benzene. After collecting appropriate fractions, the column is allowed to dry. The column is then purged with nitrogen. Antibiotic activity is determined by assaying appropriate fractions using Streptococcus pyogenes NY5. The column is divided into 10 equal parts (including the column feed). Core samples are taken over the length of the entire column at Rf values of 0.05, 0.15, 0.25, 0.35, etc. At those sites where the antibiotic bands overlap, samples are collected at every 1/8 of an Rf unit. Each core sample is diluted with 10 ml of a mixture of ethyl acetate, methylene chloride and methanol (2: 2: 1) and analyzed by thin-layer chromatography using a mixture of ethyl acetate and chloroform (1: 1), each using 30 ml samples and the detection is carried out under charring with sulfuric acid. The section of the column with Rf values of 0.11 to 0.35 is removed and slurried in a mixture of ethyl acetate, methylene chloride and methanol (2: 2: 1). The mixture is filtered and washed with the same solvent mixture, after which the resulting material is evaporated to dryness under vacuum. The residue is dissolved in tert-butanol, and by subsequent filtration and lyophilization of the material thus obtained, 26.7 g of product are obtained. By mixing n-heptane, methanol, ethyl acetate and water (3000: 1500: 75: 37 by volume), a two-phase system is prepared. With 600 ml of

unteren Phase dieses Lösunsmittelsystems vermischt man hierauf 800 g säuregewaschene Diatomeenerde und bepackt mit diesem Gemisch anschließend in Teilmengen eine 125 cm³ Glassäule. Die Beschickung, die 40 g Diatomeenerde, 30 ml untere Phase und 13,8 g des obigen lyophilisierten Materials enthält, wird in Form eines Gemisches aufgegeben. Die beschickte Säule entwickelt man mit der oberen Phase des Lösungsmittelsystems, und es werden 25 ml Fraktionen gesammelt. Die Ermittlung der Lage der gewünschten Verbindung erfolgt durch Untersuchung entsprechender Fraktionsproben in der oben beschriebenen Weise durch Dünnschichtchromatographie. Die Fraktionen 90 bis 150 werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man als Produkt 2,75 g Antibiotikum BL580/X₁ erhält, das vorwiegend als Natriumsalz vorliegt.800 g of acid-washed diatomaceous earth are then mixed on the lower phase of this solvent system and then packed in portions with a 125 cm ³ glass column with this mixture. The feed containing 40 g of diatomaceous earth, 30 ml of lower phase and 13.8 g of the above lyophilized material is added in the form of a mixture. The charged column is developed with the upper phase of the solvent system and 25 ml fractions are collected. The determination of the position of the desired compound is carried out by analyzing appropriate fraction samples in the manner described above by thin layer chromatography. Fractions 90 to 150 are combined and lyophilized to give, as product, 2.75 g of antibiotic BL580 / X ₁ which is predominantly sodium salt.

B e i s ρ i e 1 4B e i s ρ i e 1 4

Herstellung und Isolierung des Antibiotikums BL58O/\" in Form der freien Säure _; : Preparation and isolation of the antibiotic BL58O / \ "in the free acid _form;

Nach den in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren wird das Natriumteilsalz des Antibiotikums BLSSOA₁ hergestellt und isoliert. Durch Vermischen von Heptan, Methanol, Äthylacetat und Wasser (3000:15OO:8O:40 Volumenteile) stellt man dann ein Zweiphasensystem her. Anschließend bepackt man eine Glassäule mit einem Gemisch aus 8OO g Diatomeenerde und 600 ml der unteren Phase des obigen Systems. Die Aufgabe der Beschickung erfolgt in Form eines Gemisches aus 28 g Diatomeenerde, 21 ml unterer Phase und 10,9 g Natriumteilsalz des Antibiotikums BL58O/\. Die Säule wird unter Verwendung der oberen Phase entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 90 mlFollowing the procedures described in Examples 1 to 3, the sodium partial salt of the antibiotic BLSSOA _{1 is} prepared and isolated. By mixing heptane, methanol, ethyl acetate and water (3000: 15OO: 8O: 40 parts by volume) then produces a two-phase system. Subsequently, a glass column is packed with a mixture of 8OO g diatomaceous earth and 600 ml of the lower phase of the above system. The task of the feed takes place in the form of a mixture of 28 g diatomaceous earth, 21 ml lower phase and 10.9 g sodium salt of the antibiotic BL58O / \. The column is developed using the upper phase. There are fractions with a volume of 90 ml

(R)(R)

gesammelt. Ausgewählte Fraktionen werden über Silplate F-22 chromatographiert, wobei man als Entwicklungsmittel ein Gemisch aus Äthylacetat und Chloroform verwendet und die eigentliche Detektion des Antibiotikums BL58O/\ durch Verkohlung durchführt. Die Fraktionen 29 bis 39, die das Antibiotikum BL58O/\ enthalten,collected. Selected fractions are chromatographed on Silplate F-22 using a mixture of ethyl acetate and chloroform as the developing agent and the actual detection of the antibiotic BL58O / \ by charring. Fractions 29-39 containing the antibiotic BL58O / \,

- 29 - 1 - 29 - 1

werden vereinigt und zur Entfernung des Lösungsmittels eingedamf Durch Lösen des dabei erhaltenen Rückstands in tert.-Butanol unc , nachfolgendes Lyophilisieren der auf diese Weise gewonnenen Löst gelangt man zu 4,79 g Material.are combined and evaporated to remove the solvent by dissolving the resulting residue in tert-butanol unc, subsequent lyophilization of the solubility obtained in this way leads to 4.79 g of material.

800 mg dieses lyophilisierten Materials rührt man in 300 ml eines Zweiphasensystems aus Wasser, Äther und Petroläther (2:1:1). Der pH-Wert der Lösung wird unter Rühren unter. Verwendung von Inormaler Chlorwasserstoff säure auf 2,5 eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt und dreimal mit einem gleichen Volumen Wasser gewaschen. Der Lösungsmittelextrakt wird dann unter "'-)J Vakuum zu einem Rückstand eingeengt. Durch anschließendes Lösen des Rückstnads in terti-Butanol und nachfolgendes Lyophilisieren der dabei erhaltenen Lösung gelangt man zu 657 mg Antibiotikum in Form der freien Säure.800 mg of this lyophilized material are stirred in 300 ml of a two-phase system of water, ether and petroleum ether (2: 1: 1). The pH of the solution is under stirring. Use of Inormal Hydrogen Chloride acid adjusted to 2.5. The organic phase is separated and washed three times with an equal volume of water. The solvent extract is then "'- concentrated) J vacuo to a residue By subsequently releasing the Rückstnads in tertiary-butanol, and subsequent lyophilization of the solution thus obtained leads to 657 mg of antibiotic in the form of the free acid..

Die freie Säure des Antibiotikums BL58O/\^ ergibt in einer mikro-• analytischen Untersuchung folgende Analysenwerte: C =61,10, . H= 8,9, Ascfc.e = 0. Die freie Säure hat einen spezifischen Drehwert Valpha/p⁵ = +21° +1° (c =0,9 in Methanol).The free acid of the antibiotic BL58O / \ ^ gives the following analysis values in a microanalytical investigation: C = 61.10,. H = 8.9, Ascfc.e = 0. The free acid has a specific spin Valpha / p ⁵ = + 21 ° + 1 ° (c = 0.9 in methanol).

Die freie Säure des Antibiotikums BL58O/\ zeigt im Infrarotberei des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden WelleThe free acid of the antibiotic BL58O / \ shows in the infrared spectrum of the spectrum characteristic absorptions at the next wave

,--. \ längen: 2,95; 5,88; 8,35; 8,60; 9,00; 9,12; 9,43; 9,62; 10,05 un-. Length: 2.95; 5.88; 8.35; 8.60; 9.00; 9.12; 9.43; 9.62; 10.05 and

Ein Infrarotabsorptionsspektrum der freien Säure des Antibiotikums BLSSO/S^ in Form eines KBr-Preßlings geht aus Figur 4 der Zeichnung hervor.An infrared absorption spectrum of the free acid of the antibiotic BLSSO / S ^ in the form of a KBr pellet is shown in Figure 4 of the drawing.

Ein PMR-Spektrum der freien Säure des Antibiotikums BL580/\ wird in Figur 5 der Zeichnung gezeigt.A PMR spectrum of the free acid of the antibiotic BL580 / \ is shown in Figure 5 of the drawing.

Ein C-NMR-Spektrum der freien Säure des Antibiotikums BL58O/\ ist in Figur 6 der Zeichnung angegeben.A C-NMR spectrum of the free acid of the antibiotic BL58O / \ is given in Figure 6 of the drawing.

ν Γι -'1.1IM Wl "/ 1 /I.¹ > ΰ C ην Γι -'1.1IM WI "/ 1 / I. ^1> C ΰ η

" ·' ..-; V :' '.:./''.: ·"" . ^:'^;· ·' : ^; Be is ρ i el 5 -^:; _r\ . ^v . ...; -;- / ;, ' ' V- -.. .Herstellung des. Natriumsalzes, des. Antibiotikums. BL58OA,· ^':;; Be is ρ i el 5 ^-:;' · '..- V'^':./''".:·.."' _R \ ^v ..., -.. ; - /;, '' V- - .. Preparation of the sodium salt, the antibiotic.

Die freie Säure von BL58O/Y (1 g) löst man in 300 ml eines Gemisches aus Äther und Petroläther (1:1). Diese Lösung gibt man dann zur Bildung eines Zweiphasensystems zu 200 ml Wasser. Anschließend stellt man den pH-Wert der Lösung unter Rühren durch Zusatz von 0/1 normaler Natriumhydroxidlösung auf 10,0 ein, worauf man die organische Phase abtrennt und unter Vakuum zu einem Rückstand eindampft. Der Rückstand wird in 10 ml Äther gelöst, und die Lösung versetzt man mit 20 ml Petroläther (Siedebereich 30 bis 70 ⁰C). Spdann impft man die erhaltene Lösung mit einem Kristall des Natriumsalzes von BLSeo/s^ an und läßt sie hierauf langsam bei einer Temperatur von 4 ⁰C verdampfen, bis sich ein kristalliner Feststoff bildet. Die Kristalle werden auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet, wodurch man zu 323 mg Natriumsalz von BL58O/\ gelangt. ..The free acid of BL58O / Y (1 g) is dissolved in 300 ml of a mixture of ether and petroleum ether (1: 1). This solution is then added to 200 ml of water to form a two-phase system. The pH of the solution is then adjusted to 10.0 with stirring by addition of 0/1 normal sodium hydroxide solution, whereupon the organic phase is separated off and evaporated under vacuum to give a residue. The residue is dissolved in 10 ml of ether, and the solution is mixed with 20 ml of petroleum ether (boiling range 30 to 70 ⁰ C). Then the solution obtained is seeded with a crystal of the sodium salt of BLSeO / s ^ and allowed to slowly evaporate at a temperature of 4 ⁰ C until a crystalline solid forms. The crystals are collected on a filter, washed with cold petroleum ether and dried in air to give 323 mg of BL58O / \ sodium salt. ..

Dieses Natriumsalz des Antibiotikums BL58O/V schmilzt bei 157 bis 161 °C und hat folgende Elementaranalyse: C = 60,99; H = 8,47; Na = 1,95: /alpha/^⁵ = +6° +1 ° (c = 1,153 in Methanol) . Das Natriumsalz von BL58O/\^ zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen: 6, 27, 7,28, 9,0, 9,13, 9,23, 9,48 und 10,60 μ.This sodium salt of the antibiotic BL58O / V melts at 157 to 161 ° C and has the following elemental analysis: C = 60.99; H = 8.47; Na = 1.95: / alpha / ^ ⁵ = + 6 ° +1 ° (c = 1.153 in methanol). The sodium salt of BL58O / \ ^ exhibits characteristic absorptions in the infrared range of the spectrum at the following wavelengths: 6, 27, 7.28, 9.0, 9.13, 9.23, 9.48 and 10.60 μ.

Ein Infrarotabsorptionsspektrum des Natriumsalzes von BL58O/\ in Form eines KBr-Preßli.ngs geht aus Figur j der ZeichnungAn infrared absorption spectrum of the sodium salt of BL58O / 1 in the form of a KBr press is shown in Figure j of the drawing

Ein ¹³C-NMR-Spektrum des Natriumsalzes von BL58O/\ ist in Figur 2 der Zeichnung angegeben. .A ¹³ C-NMR spectrum of the sodium salt of BL58O / \ is given in Figure 2 of the drawing. ,

Ein PMR-Spektrum des Natriumsalzes von B"LS%0/\ ist in Figur 3 der Zeichnung gezeigt.A PMR spectrum of the sodium salt of B "LS% O / \ is shown in Figure 3 of the drawing.

' ,:·\ .: -.' '..:' . '·' .'[' : : -.-' B ei s ρ i e 1 ' 6 ..^: , /-." -' . ^;:;.<·';.-..··^: .^:'^;-.- ' ' ' Herstellung und Isolierung des p-Bromphenacylesters. von BL58O/\',: · \.: -.''..:'.'·' . '[' :: -.- 'B ei s ρ ie 1' 6 .. ^: , / -. " - '. ^;:; <<''.- .. ·· ^: . ^: '^; -.- ''' Preparation and isolation of the p-bromophenacyl ester from BL58O / \

Das Natriumteilsalz des Antibiotikums BLSSO/^ wird nach dem Ver fahren der Beispiele 1 bis 3 hergestellt und isoliert. 1 g dieses Natriumsalzes von BLSSO/^, 834 mg p-Bromphenacylbromid, 600 mg Lithiumcarbonat und 20 ml trockenes Dimethylformamid gib man in einen Kolben und läßt das Ganze darin 16 Stunden bei einer Temperatur von 37 ⁰G reagieren. Sodann gibt man 4 Volumina Chloroform zu und filtriert die hierdurch entstandene Suspension. Das Filtrat wird zur Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu einem sirupartigen Rückstand gelangt. Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Heptan, Äthylacetat, Methanol und Wasser (2000:25:1000:17) stellt man hierauf eine Verteilungssäule mit Diatomeenerde her. Es wird mit 120 g Diatomeenerde und 90 ml unterer Phase des obigen Lösungsmittelsystems für die Säule gearbeitet. Auf die Säule gibt man dann ein Gemisch aus dem obigen sirupartigen Rückstand, 12 g Diatomeenerde und 9 ml unterer Phase. Die Säule wird mit der oberen Phase entwickelt. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml gesammelt. Die Ermittlung der Lage der Aktivität in den Fraktionen erfolgt durch Dünnschichtchromatographie. Die Fraktionen 22 bis 41 werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Methanol gelöst, worauf man die Lösung filtriert. Das Filtrat wird auf einem Dampfbad erwärmt und mit 10 ml Wasser versetzt, worauf man das Gemisch langsam auf 4 °C abkühlen läßt. Die dabei anfallenden Kristalle werden gesammelt, wodurch man zu 566 mg p-Bromphenacylester von BL58O/\ gelangt.The sodium salt of the antibiotic BLSSO / ^ is prepared by the method of Examples 1 to 3 and isolated. 1 g of this sodium salt of BLSSO / 4, 834 mg of p-bromophenacyl bromide, 600 mg of lithium carbonate and 20 ml of dry dimethylformamide are added to a flask and allowed to react for 16 hours at a temperature of 37 ⁰ G. Then, 4 volumes of chloroform are added and the resulting suspension is filtered. The filtrate is evaporated under vacuum to remove the solvent, resulting in a syrupy residue. Using a solvent system of heptane, ethyl acetate, methanol and water (2000: 25: 1000: 17), prepare a distribution column with diatomaceous earth. It is worked with 120 g of diatomaceous earth and 90 ml lower phase of the above solvent system for the column. To the column is then added a mixture of the above syrupy residue, 12 g of diatomaceous earth and 9 ml of lower phase. The column is developed with the upper phase. Fractions of 10 ml each are collected. The determination of the position of the activity in the fractions is carried out by thin layer chromatography. Fractions 22 to 41 are combined and concentrated under vacuum to a residue. The residue is dissolved in 50 ml of methanol, whereupon the solution is filtered. The filtrate is heated on a steam bath and treated with 10 ml of water, whereupon the mixture is allowed to cool slowly to 4 ° C. Any resultant crystals are collected, so as to obtain 566 mg of p-Bromphenacylester of BL58O / \.

Eine mikroänalytische Untersuchung des p-Bromphenacylesters von BL58O/V ergibt folgende Analysenwerte: C =58,80; H= 7,80;A microanalytical study of the p-bromophenacyl ester of BL58O / V gives the following analytical values: C = 58.80; H = 7.80;

^{: ; :} '' ' 25 Br =8,64. Der Ester hat einen spezifischen Drehwert /alpha/ ^{:; :} '' 25 Br = 8.64. The ester has a specific rotation value / alpha /

= +63°'· '+ 2° (CHCl₃ bei 0,51 %) .= + 63 ° '''+ 2 ° (CHCl ₃ at 0.51%).

199199

Der p-Bromphenacylester von BLSeoA^ zeigt im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen: 2,95; 5,88; 6,30; 8,20; 8,45; 8,60; 9,00; 9,15 (breit); 9,37 (breit); 9,62; 10,06 und 10,37.The p-bromophenacyl ester of BLSeoA ^ shows in the infrared region of the spectrum characteristic absorptions at the following wavelengths: 2.95; 5.88; 6.30; 8.20; 8.45; 8.60; 9.00; 9.15 (broad); 9.37 (broad); 9.62; 10.06 and 10.37.

Der p-Bromphenacylester von BL580/\-Monohydrat hat einer Bestimmung durch Röntgenbeugung zufolge ein Molekulargewicht vonThe p-bromophenacyl ester of BL580 / \ monohydrate has a molecular weight, as determined by X-ray diffraction

: '-'V /. 1114 + 0,3. %. ;' ' . · , /.;. . . ' ' . / ;: / _;::_:\'- / ;'.^;-. :.-V-. - : '-'V /. 1114 + 0.3. %. ; ''. ·, /.; , , ''. /;: / _{; :::} \ '- /;'. ^; -. : .- V. -

Ein Infrarotabsorptionsspektrum des p-Bromphenacylesters von λ BL85O/\, in Form eines KBr-Preßlings geht aus Figur 7 der Zeichnung hervor. . / · ":'.' 'An infrared absorption spectrum of the p-bromophenacyl ester of λ BL85O / 1 in the form of a KBr pellet is shown in Figure 7 of the drawings. , / · ": '.' '

Ein Ultraviolettabsorptionsspektrum des p-Bromphenacylesters von BLSSOA₁ in Form einer Lösung in Methanol mit einer Konzentration von 33,84 Mikrogramm pro Milliliter Lösungsmittel ist in Figur 8 der Zeichnung gezeigt.An ultraviolet absorption spectrum of the p-bromophenacyl ester of BLSSOA ₁ in the form of a solution in methanol at a concentration of 33.84 micrograms per milliliter of solvent is shown in Figure 8 of the drawing.

Ein PMR-Spektrum des p-Bromphenacylesters von BL58O/\ ist in Figur 9 der Zeichnung angegeben.A PMR spectrum of the p-bromophenacyl ester of BL58O / \ is given in Figure 9 of the drawing.

Claims (1)

E R FIND U NGS A NS P RU C H FINDING NGS A NS P RU CH Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BL580 Z\ mit der FormelProcess for the preparation of the antibiotic BL580 Z \ with the formula rc-—rc-- ac— ac und der pharmazeutisch unbedenklichen kationischen Salze hiervon, d ad u rc h g e k e η η ζ ei c h η e t, daß man Streptomyces hygroscopicüs NRRL 8180 in einem wäßrigem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Bedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität in diesem Medium züchtet und anschließend aus diesem Medium das Antibiotikum BL580 / \ gewinnt.and the pharmaceutically acceptable cationic salts thereof, which comprises subjecting Streptomyces hygroscopicüs NRRL 8180 to an aqueous nutrient medium containing assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic salts, submerged under aerobic conditions up to Forming a significant antibiotic activity in this medium and then from this medium the antibiotic BL580 / \ wins. Hlerzu-SL^Saifea ZiHlerzu-SL ^ Saifea Zi