DE1493442A1 - Verfahren zur Herstellung von Alanin auf enzymatischem Wege - Google Patents

Description

! Υ/Κ PRANKFURT C* AI N).£. November 1965

Ajinomoto Co., Inc.
7, 1-chome, Takara-cho, Chuo-ku
Tokb, Japan.

Verfahren Bur Herstellung von Alanin auf enzymatischem Wege.

Die Erfindung bezieht sich auf ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von L Alanin auf enzymatischem Wege aus leicht zugänglichem Ausgangsmaterial, das sich einfacher und leichter durchführen lässt als vorbekannte Verfahren.

I~Alanin ist eine wichtige Aminosäure, die mannigfaltige Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie und in der Medizin gefunden hat. Es sind auch Verwendungsmöglichkeiten als Rohmaterial für die Produktion von synthetischen Fasern entdeckt worden. Die bislang bekannt gewordenen Verfahren zur Heratellung von L-Alanin umfassen bäspielsweis· die chemische I^Alaninsynthese, die über das rac.DL-Alanin geht, das dann in die optisch aktiven Isomere gespalten wird,und die enzymatisch· (fem.ntativ·) Method·, die auf der reduktion Aminierung oder Transaminl.rung der Brenztraubensäure beruht·

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Im Gegensatz hierzu betrifft die Erfindung die Herstellung von L-Alanin durch ß-Decarboxylierung der L-Asparaginsäure, wonach man einen Enzymlieferanten, wie das Kulturmedium von Pseudomonas Spezies Nr. 618 (ATCC 19121), deren Bakterienzellen oder daraus hergestellte zerkleinerte Substanzen und das Filtrat des Kulturmediums mit L-Asparaginsäure vermischt und die Reaktionsmischung bei etwa pH 4,5 bis 5»5 stehen lässt. Dabei bildet sich das L-A-lanin als Füge der Enzymreaktion..

Die Veröffentlichungen, die dieses Phänomen der Mikroorganismen betreffen: Mikrobiokhimiya ,14, 44 (1949) (Verwendung von Pseudomicrobacterium), Journal of bio<logicai chemistry 189« 571-576 (1951) (Verwendung von Clostridium verchi) und Biochemical Journal 68, 221-225 (1958) (Verwendung von Nocardia groberla), beziehen sich nur auf dine Methode, die auf der Berechnung des vom Warburg-Manometer gebildetem Gas und nicht auf der Bildung von L-Alanin beruht· Die Konzentration der zugesetzten

β ehr L-Asparaginsäure ist mit etwa o,1 %/niedrif , desgleichen die Menge des gebildeten a-Alanir^ die weniger als 5o mg/ loo ecm beträgt. Infolgedessen sind diese Veröffentlichungen nur für wissenschaftliche Untersuchungen von Interesse und liefern keine brauchbare Methode für die Produktion von L-Alanin in industriellen Masstab.

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Bei dem gemäss Erfindung benutzten Enzymlieferant handelt es sich um einen neu aufgefundenen Mikroorganismus mit stark ausgebildetem BeearboxyIierungsvermögen, der die Eigenschaft hat, L-Alanin schnell und in relativ hoher Konzentration im Reaktionsmedium zu bilden, wenn er in Form des Kulturmediums, dessen Bakterienzellen oder dessen Filtrat einer L-Asparaginsäure enthaltenden Flüssigkeit zugesetzt wird«

Dieser neue Mikroorganismus wurde im Boden gefunden und scheint einer Spezies des Genus Pseudomonas zuzuordnen zu sein» Ba keine bekannte Spezies aufzufinden ist, zu der dieser Mikroorganismus gehört, wird angenommen, dass es sich um eine neue Speeies handelt *

Der gemäss Erfindung benutzte Mikroorganismus ist Pseudomonas Spezies Hr. 618 (ATCG 19121) und hat folgende Charakter istische Eigenschaften:

Form und Beweglichkeit;

Stäbchen, ο,8 — 1,4 ϊ 1,8 μ» Es werden hohle Zellen beobachtet* Beweglich mit polaren Geiseln· Gram-negativ« Keine Sporenbildung.

kreisförmig, glatt, vollständig, erhaben, glänzend, schwach gelblichbraun, undurchsichtig (opalescent), butterartig (butyrous)

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Glutamatagarkolonien:

kreisförmig, glatt, vollständig, flach bis erhaben,

schwach gelblichgrau, durchsichtig, butterartig tähragarschrägschnitte (slant)t massiges Wachstum, fadenförmig (filiform), flach,

glänzend, schwach braun Nährmedium:

schwaches Häutchen, stark trüb Glut amatmedium;

schwaches Häutchen, stark trüb Keine Bildung von löslichem Pigment» Nährgelatinestich; Verflüssigung B.P.C.Milch; alkalisch, nach 4o Tagen leicht peptoni-

siert«

Nitrit wird aus Nitrat in Nitrat-Medium und Succinat-nitratmedium gebildet*

Nitratre spiration: negativ Schwefelwasserstoff: gebildet Statkehydrolyse t keine

Indol: nicht gebildet

M.R.Test: negativ

V-P-Test: negativ

Gas- und Säurebildung aus Kohlenhydraten:

Gas oder Säure werden aus Glycerin, Xylose, Glucose, Saccharose, Lactose und Stärke An Peptonmedien nicht gebildet«

Gas- und Säurebildung bei der Hugh-Lif son-Methode t

Gas oder Säure werden weder avrob noch anaerob aus Glucose Lactose gebildet»

*) Glutamatagarschrägschnitte: massiges Wachstum, fadenförmig, flach, glänzend, schwach gelblichgrau. 909845/1721

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Glucose,Gluconat, Succinat, m-Hydroxybenzoat, p-Hydroxy« benzoat, Frotocatechuat und Gentisat werden als einzige Kohlenstofflieferanten mit ammoniakalischem Stickstoff benutzt, jedoch Gitrat, Benzoat, Salicylat und Anthranilat werden nicht benutzt·

Optimale Wachstumstemperatur;

2o - 3o°C, ««hwaches Wachstum bei 37⁹G, kein Wachstum bei

42°0 Optimaler pH-Bereich für das Wachstum:

zwischen pH 5»o und 9>o, kein Wachstum bei pH 4,ο Katalaaet positiv Aerob Fundortt Boden·

angegebenen charakteristischen Eigenschaften sind ähnlich denen, die in Bergey"e Manual of Determinativ· Bacteriology, 9· Ausgabe, für Pseudomonas desmolytica oder Pseudomonas dacunhae angegeben sind« Die Fseudomonas Spezies Nr* 618 (ATCC 19121) unterscheidet eich jedoch von diesen beiden Spezies bezüglich der Verflüssigung von Gelatine o*d BPC-Miloh.

Pseudomonas Spezies Nr«618 (ATCC 19121) zeigt auch eine Alanin-Raoemiase-Aktivitätj auf Grund deren das bei der B-Decarboxylierung der L-Asparaginsäure gebildete L-Alanin in dem Beaktionemedium nach und-»- nach in die raoemische Modifikation umgewandelt wird· Untersuchungen igber die optimalen Be-

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dingungen für die Alanin-Racemiase-Aktivität und die L-Asparaginsäure-ß-Decarboxylase-Aktivität ergaben, dass der optimale pH-Wert für die Alanin-Hacemiase-Aktivität bei 8,0 und "für die L-Asparaginsäure-ß-Decarboxylase-Aktivität bei etwa 5»o liegt·

sine
jgelung

Tabelle 1 zeigt das Ergebnis einer Untersuchung, die zur Ermittlung des günstigsten pH-Wertes, mit dem sowohl die Alanin-Racemiase-Aktivität als auch die L-Alanin-!*roduktion gesteuert wird, durchgeführt wurde*

Tabelle 1

pH-Wert de» gebilde- restli- Holaus- gebil- D-AIa- Bemerkun-

Reaktions— tes Ge- ehe Aspa- beute detes nin gen

mediums samt- ragin- Alanin D-AIa- Gessant-

Alanin säure Aspara- nin alanin KJnsäuB

8,o 9,o

1,3o

(gTlööäcm} 2,24 26

t^Tooccatf

o,31 24

i-Rege-

ireh
^n HGl

5,o 5,5

6,5 7,5

o,o3

68

o,oj5

o,o3

62

ο ,42

i-Rege-

irch
ristal-Lne L-iparaginiure

5,o

5,5

6,5

5,6o

2,8o

51

o,o6

5,o5

3.25

ο ,43

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COPY ORIGINAL INSPECTED

zur pH-Regelung zugesetzte L-Aspi raginsäur menge:
9.ο %

zur pH-Re ge lung zu gesetzte L-Asparaginsäure· menge:
1o %

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Bemerkungen:

Zusammensetzung des Saatkulturmediums:

2 % Fleischextrakt

2.% Polypepton
o,3 % Oelsäure
o,5 % Aethanol
o,5 % Bohnenffil
o,5 % L-Asparaginsäure

Der pH-Wert wurde mit flüssigem Ammoniak auf 6,ο eingestellte

Reaktionsbedingungen:

Ansätze von je 3o ecm Medium wurden in 5oo ccm-Kolben gegeben, die danach 5 Minuten bei 11o°G sterilisiert und dann mit Pseudomonas Spezies Nr. 618 (VJ¹CG 19121) beimpft wurden, die zuvor auf einer Boufl-lon-Agar-Schrägschnitte gewachsen waren«» Die Kultivierung wurde 15 Stunden bei 31⁰G unter Schütteln durchgeführt. Dann versetzte man das erhaltene Kulturmedium mit 7,5 % des Ammoniumsalzes der L-Asparaginsäure und führte die gH- Regelung in der in Tabelle 1 angegebenen Weise durch· Die Reaktion wurde 5o Stunden bei 31⁰G unter Schütteln durchgeführte

Bestimmungsmethoden:

Zur Bestimmung von L-Asparaginsäure wurde die Bioversuchsmethode unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides angewandte

a-Alanin wurde mit Hilfe der Bioversuchsmethode unter Verwendung von Leuconostoc citrovorum. bestimmt»

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copy

ORIGINAL INSPECTED

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D-Alanin wurde mit Hilfe der manometrischen Methode von Warburg unter Verwendung· von D-Aminosäure-Oxydase aus Schafenieren bestimmt·

Pa ein Teil der L-Asparaginsäure in dem Reaktionsmedium gewöhnlich, im Salzzustand vorliegt, schlag« mit fortschreit3ndem L-Asparaginsäureverbrauch durch die ß-Decarboxylierung der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit nach der alkalischen Seite um· Mit dieser Aenderung des pH-Wertes wird aber das Fortschreiten derß-Deearboxylierungsreaktion gehindert und die Umwandlung des L-Alanins in D-Alanin durch Alanin-Racemiase sehr stark beschleunigt· Infolgedessen muss man durch Zusatz saurer Neutralisationsmittel den pH-Wert bei etwa 5|O halten, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen und die Racemisierung zu verhindern« Diese Fakten zeigen, dass die pH-Rege lung bei dem Verfahren gemäss Erfindung unerlässlich ist.

Als Enzymlieferant können gemäss Erfindung nicht nur die kultivierten Bakterienzellen, daraus hergestellte zerkleinerte Substanzen oder das Filtrat des Mediums verwendet werden, sondern auch das Kulturmedium selbst* Dies ist für die industriell· Produktion von L-Alanin von grosses Vorteil*

Für die Kultivierung der weiter oben beschriebenen Pseudomonas Species Nr. 618 (ATCG 19121) können Medien sonst konventionell·!· Zusammensetzung benutzt werden· Sie nüssen einen assiailierbar«xi

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Kohlenstofflieferanten, einen assimilierbaren Stickstofflieferanten und in geringen Mengen die üblichen Nährstoffe enthalten·

Beispiele für Kohlenstofflieferanten sind: Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melassen, aber auch Glycerin· Organische Säuren, wie Essig_T, Fumar-, Aepfel-, Milch-, a-Ketoglutar-, Glueon-, Brenztraubenä· und Citronensäure, können zusätzlich als Kohlenstoff lief eranten benutzt werden· Ihre Konzentration Ib Kulturmedium beträgt gewöhnlich 1 bis 5 Gew.% (Glucose äquivalent)·

Stickstoff kann in Form von Ammoniumsalzen anorganischer oder organischer Säuren, wie der Salz-, Phosphor-, Salpeter-, Essig- und Milchsäure, als Harnstoff sowie als Ammoniak in wässriger Lösung oder in gasförmigem Zustand zugeführt werden. Aminosäuren, organische Basen sowie sonstige Stickstoff enthaltende Materialien können assimiliert werden· Die Konzentration la Kulturmedium beträgt gewöhnlich o,3 wf 1,5 0«w«% (Stickstoffäquivalent)·

Es ist auch nützlich, zusätzlich anorganische Nährstoff· zu benutzen, die wesentliche anorganische Ionen, vom Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, ferrosulfat, Natriumchlorid und Oaloiumcarbonat enthalten, sowie organisch· Wuchsstoff·, dl· dl· Auebeut· und dl· Bildungsgeeohwindlgkeit des !^Alanine erhöhen, wi# Aminosäuren (ganz allgemein), Biotin,

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. -Ιο-Vitamine und Fettsäuren· Diese Verbindungen können dem Kulturmedium auch in Form von Substanzen zugesetzt werden, die den Wirkstoff unter den Kulfcivierungsbedingungen liefern, wie Fleischextrakt, Pep ton, Hefeextrakt, Maisquellejasser, Magermilch, Chlorellaextrakt, Sojabohnenp*roteinhydrolysat und verschiedene andere Extrakte pflanzlicher und tierischer Gewebe, die als solche gut bekannt sind· Eine genaue Menge der !-Asparaginsäure wird oft (offen) dem Medium zugesetzt·

Ee wurde weiterhin gefunden, dass das Wachstum der Fseudomonas Spezies Nr* 618 (ATCQ 19121) besonders begünstigt wird, wenn das Medium hauptsächlich Ajieki (Handelsname für Sojabohnenproteinhydrolysat) und niederen Alkohol oder niederes Glycol enthält♦

In Tabelle 2 sind die mit solchen Medien erhaltenen Versuchs-•rgebnisee angegeben»

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-ⁱ¹~ H 9 34 k

Tabelle

Beziehung zwischen dem verwendeten Kohlenstofflieferanten und dem Wachstum dea eingesetzten Mikroorganismus

Kohlenstofflieferant Wachstum nach einer Kultivie rung von 24 Stunden ■ _: (-log T)

J.	(g/1oo ecm)	o,12o
Glucose	1	o,12o
It	4	ot1oo
Fructose	1	0,118
Maltose	1	o,105
Saccharose	1	o,1oo
Xylose	1	Ο.123
Methanol	o,5	o,13o
Aethanol	o,5	o,3o5
	1,o	Ο.415
η	1,5	o,245
η	2,o	o,12o
n-Propanol	o,5	o,25o
n-Butanol	O.5	o,28o
Aethy1englycol	o,5	o,295
Glycerin	o,5	o,3oo
Bemerkungen:
Zusammensetzung	des Mediums:

o,o4 % MgSO₄ . 7 H₂O 2 ppm Fe⁺⁺ 2 ppm Mn⁺* 2oo γ/l Vitamin B₁ HCl 2o γ/l Biotin o,5 % L-Asparaginsäure

5 ml/1oo ecm AJieki (Sojabohnenproteinhydrolysat) sowie einer der in der Tabelle angegebenen Kohlenatofflieferanten·

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2) Kultivierungsbedingungen:

Das Medium der angegebenen Zusammensetzung wurde mit KGG auf pH 6,5 eingestellt, 5 ecm Ansätze der Lösungen in groase Testrohre gegeben und 5 Minuten mit Dampf bei 11o°C steriliä siert. Danach wurde Pseudomonas Spezies No.618 (AT6C 19121) 24 Stunden bei 31^eO unter Schütteln kultiviert,

3) Der Alkohol und das Glycol sollten getrennt sterilisiert werden.

4) Ajieki ist der Handelsname für Sojabohnenproteinhydrolysat und der Gesamtstickstoff beträgt 2,2 g/l, der Extrakt 21 g/ 1oo ecm und NaCl 18 g/l·

Da Ajieki (Handelsname für Sojabohnenproteinhydrolysat) viele der für das Wachstum der Mikroorganismen notwendigen Stoffe enthält, macht es den Zusatz von anorganischen Ionen, Vitaminen, Stickstofflieferanten etc· überflüssig· Tabelle 2 zeigt, dass in einem Medium mit Ajieki und niederem Alkohol oder niederem Glycol nicht nur das Wachstum der Mikroorganismen merklich zunimmt, sondern mit der Zunahme des Wachstum* auch die Menge der von den Mikroorganismen produzierten ß-Decarboxylaae erhöht wird«

Durch den Zusatz von niederem Alkohol, wie Methanol, Aethanol, n-Prpjanol und n-Butanol, sowie von niederem Glycol, wie Aethylenglycol und Glycerin, wird das Wachstum der Mikroorganismen begünstigt«

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H PA 4 2 -13-

Ajieki wird zwwckmässig in einer MengeVon etwa 5 ccm/1oo ecm eingesetzt· Beste Ergebnisse werden erzielt) wenn man ausserdem noch 1 % Aethanol benutzt·

Die Kultivierung der gemäss Erfindung eingesetzten Mirkoorganismen wird unter aeroben Bedingungen bei Belüften und Rohren im Temperaturbereich von 24 bis 37*0 durchgeführt· Ist das benötigte Enzym in genügender Menge produziert, wird die Kultivierung gewöhnlich abgebrochen· Die Kultivierungsdauer beträgt gewöhnlich 12 bis 48 Stunden· Das so erhaltene Kulturmedium kann ohne weitere Behandlung als Enzymlieferant zur Produktion von L-Alanin benutzt werden. Ausserdem können gemäss Erfindung als Enzymliefer ent die von dem Kulturmedium abgetrennten Zellen oder daraus hergestellte zerkleinerte Substanzen sowie das Filtrat des Kulturmediums verwendet werden·

Zur Durchführung der Enzymreaktion, der ß-Decarboxylierung der L-Asparaginsäure zu L-Alanin vermischt man den Enzymlieferanten * unter Rühren mit der L-Asparaginsäure und hält den pH-Wert des Reaktionsmediums auf etwa 5,o· Die Reaktion wird oft(flffen) unter Belüftung und unter Rühren durchgeführt, um die Kohlendioxydbildung au begünstigen·

Die L-Asparaglnsäure, die als Bubstrat der Reaktion gemäss Erfindung benutzt wird, wird als freie Säure oder als Salz, z.B. das des Ammoniums, Natriums, Kaliums etc, zugesetzt·

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Die L-Asparaginsäure sollte im in der angegebenen Weise erhaltenen Kulturmedium in einer Konzentration von vorzugsweise mehr als 1 % - auf die Reaktionsflüssigkeit gezogen -vorhanden sein. Gewöhnlich werden 1 bis 2o % E-Asparaginsäure eingesetzt· Die £ür L-Asparaginsäure muss nicht als L-Aspa— raginsäure in reiner Form, sie kann auch in Form ve» L-Asparaginsäure enthaltender Stoffe, wie Kulturmedien, die man bei der fermentativen L-Asparaginsäureproduktion erhält, benutzt werden· DL-Asparaginsäure und Mischungen von D-Asparaginsäure und L-Asparaginsäure sind auch brauchbar·

Sie L-Asparaginsäure wird hauptsächlich als Substrat der Reaktion gemäss Erfindung benutzt· Wird sie in Form der freien Säure zugeführt, trägt sie auch zur Regelung des pH-Wertes bei·

Die pH-Regelung der ReaJrtclonsflüssigkeit ist sehr wichtig, da sie in engem Zusammenhang mit der Reaktionsgeschwindigkeit, Reaktionsdauer, Ausbeute und Bildung des D-Alanins steh«· Es ist daher unmöglich, ohne Regelung der Wasserstoffionenkonzentration im leaktionsmedium maximale Ausbeuten an L-Alanin bei hoher Reaktionsgeschwindigkeit zu erhalten· Vorzugsweise wird in einem Reaktionsmedium mit einem pHfWert von etwa 5_fo gearbeitet« Zu diesen Zweck können eine oder mehrere anorganische Säure, wie die Salz- und die Schwefelsäure, und organische Säuren, inabesondere die L-Asparaginsäure, dem Reaktionsmediua von Zeit zu Zelt zugegeben werden* Die Reaktionsdauer beträgt zweckmässig 1 bia 3 Tage. Zur Erzielung bester Ergebnisse wird die

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Temperatur des Mediums während der Reaktion zwischen 24 und 258C gehalten· Gewöhnlich werden o,5 bis 15 g/1oo ecm !»-Alanin gebildet, tfas von der zugeführten L-Asparaginsäure abhängt·

Die Isolierung von L-Alanin aus der ReaktionsflÜBsigkeit erfolgt nach bekannten Methoden·

Das Verfahren der Erfindung soll durch die folgenden Beispiele erläutert, hierauf jedoch nicht beschränkt werden»

Beispiel 1

Es wurde ein Saatkulturmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

2 % Fleischextrakt

2 % Polypepton ο,5 % !.ethanol ο ,5 % Bohnenöl ο,3 % Oelaäure o_t5 % L-Asparaginmäure.

Der pH-Wert des so hergestellten Mediums wurde mit flüssigem Ammoniak auf 6,ο eingestellt« 5o ccm-Ansätze der Lösung in 5oo ccm-Bchüttelkolben gegeben und 1o Minuten im Kolben bei 115°C sterilisiert.

Pseudomonas Spezies Nr. 618 (ATCC 19121), die zuvor auf einer Bouillftnagarschrägschnitte kultiviert worden wax, wurde bei 31°C in dea erhaltenen Medium 15 Stunden unter Schütteln der Kultivierung unterworfen·

800 ecm des erhaltenen Kulturmediums wurden in 1 1 dee . -Reaktionsbehälters gegossen·

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Zur Durchführung der Reaktion setzte man der Lösung von Zeit zu Zeit 152 g kristalline L-A.sparaginsäure bei 37°C unter Rühren zu bis 4o Stunden nach Heaktionsbeginn und hielt dann den pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit mit 12 η Schwefelsäure zwischen pH 4,7 und 2,5, bis die Reaktion beendet war· Sie Reaktion dauerte insgesamt 48 Stunden.

Sie Re akt ions lösung enthielt dann 0,05 g/100 ecm !/-Asparaginsäure (bestimmt mit Hilfe der Methode des Bioversuche unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides) und 1o,82 g/1oo ecm α-Alanin (bestimmt mit Hilfe der Methode des Bioversuchs unter Verwendung von Leuconostoc citrovorum)« Sie in dem α-Alanin enthaltene Menge D-Alanin betrug ο,18 g/ I00 ecm (bestimmt mit Hilfe der manometrischen Methode von Warburg unter Verwendung von D-Aminosäureoxydase aus Sch af sni ere)·

Infolgedessen waren in molarer Ausbeute 96 % der eingesetzten L-Asparaginsäure in L-Alanin übergeführt worden«

Bach Abtrennen der Bakterienzellen vom Reaktionsaediu» (800 ecm) liess man die Lösung durch Ionenaustauscherharz (Amberlite IR-45) hindurchfliesaen, engte dae klare Filtrat i.V. auf 150 ecm ein und fügte 15o ecm wasserfreies Aethanol hinzu. Man erhielt 56,ο g kristallines rohes L-Alanin·

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Beiapiel 2

Es wurde ein Kulturmedium aus 5 ccm/ioo ecm AJieki, das

1o Hinuten mit Dampf bei 115°C sterilisiert wurde, und 1 % Aethanol, das getrennt sterilisiert wurde, hergestellt und mit flüssigem Ammoniak der pH-Wert auf 6,ο eingestellt* 5>o ccm-Ansätze der Lösung gab man in 5oo ecm Schüttelkolben, die zuvor durch Trockenerhitzen steri«lisiert worden waren·

Fseudomonaa Spezies 618 (ATCC 19121), das zuvor auf Bouillonagarschrägschnitte kultiviert worden war, wurde dann 24 Stunden bei 31°C im Medium unter Schütteln kultiviert·

8oo ecm des erhaltenen Kulturmediums wurde in 1 1 des Reaktionsbehälterβ gegossen·

Bei Durchführung der Reaktion setzte man der Lösung 2oo g L-Asparaginsäure von Zeit zu Zeit bei 37°C unter Rühren bis 43 Stunden nach Reaktionsbeginn zu und stellte den pH-Wert ' der Reaktionellüamigkeit mit 12 η Schwefelsäure auf 4,7 bis 5,ο ein, bis die Reaktion beendet war, Die gesamte Reaktionsdauer betrug 46 Stunden· Die Reaktionslösung enthielt o,14 g/ 1oo ecm L-Asparaginsäure (bestimmt mit Hilfe der Methode des Bioversuchs unter Anwendung von Leuconostoc meeenteroides) und 16,6 g/1oo ecm L-Alanin (bestimmt mit Hilfe der Methode des Bioversuchs unter Anwendung von Leuconoatoc citrovorum)· Die Menge des in dem a-Alanln enthaltenen D-Alanins betrug o,15 g/ 1oo ecm (bestimmt mit Hilfe der manometrischen Methode nach Warburg unter Verwendung von D-Aminosäureoxydase aus Schafs- - niere)· Infolgedessen waren in molarer Ausbeute 98,2 % Asparaginsäure in L-Alanin übergeführt worden«

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Die Bakterienzellen wurden von der Reaktionslösung (800 ecm) abgetrennt, danach die Lösung durch ein Ionenaustauscherharz (Amberlite IE-45) hindurchgeführt, das erhaltene klare Filtrat im Vakuum auf 15o ecm eingeengt und mit 15o ecm wasserfreiem Aethanol versetzt. Es wurden 87»o g kristallines rohes L-Alanin erhalten·

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Claims (4)

U93U2 -19- Pat en baneprüche

1) Verfahren zur Herstellung von L-Alanin auf enzymatischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass Pseudomonas Spezies Nr· 618 (ATGC 19121) mit einer wässrigen Lösung von L-Asparaginsäure oder deren Salzen vermischt, in der Mischung ein pH-Wert im Bereich von etwa 4,5 bis 5,5 aufrecht erhalten und das gebildete L-Alanin aus der Mischung in an sich pblicher Weise isoliert wird·

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine» alt Pseudomonas Spezies Nr. 618 (ATGC 19121) beimpften Kulturmedium L-Asparaginsäure zugesetzt, in der erhaltenen Reaktionsmischung unter aeroben und stationären Bedingungen bei etwa 24 bis 45°C unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes im Bereich von etwa 4,5 bis 5»5 die Inkubation durchgeführt und das gebildete L-Alanin aus der Reaktionsmischung in an sich bekannter Weise isoliert wird«

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

dass die Kultivierung der Pseudomonas Spezies Nr.618 (ATGC 19121) in einem Medium durchgeführt wird, das als Kohlenstofflieferanten Sojabohnenhydrolysat und/oder niederen Alkohol, wie Methanol, Aethanol, n-Propanol, n-Butanol und/oder niederes Glycol, wie Aethylenglycol oder Glycerin enthält.

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudomonas Spezies Nr. 618 (ATCC 19121) in Form eines Kulturmediums, einer Suspension lebender Zellen, behandelter Zellen, eines Bohextraktes, eines Enzympräparateβ oder eines zellfreien Extraktes verwendet wird«

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