DE1445828C - N-(7,2-Thienylacetamidoceph-3-em-3ylmethyl)-pyridinium-4-carboxylat und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Das N-iT^'-Thienylacetamidoceph-S-em-S-ylmethy^-pyridinium-^carboxylat der Formel I

/ V

-Β

—CO—NH

weist ein gutes antibiotisches Spektrum sowohl gegen grampositive als auch gegen gramnegative Organismen, eine gute Widerstandsfähigkeit gegen den Angriff durch Penicillase erzeugende Staphylococcen, eine gute In-vivo-Stabilität und eine sehr gute Wasserlöslichkeit auf. Sie besitzt ein breites In-vivo-Wirkungsspektrum, und zu den empfindlichen Organismen gehören Staph. aureus (einschließlich der penicillinresistenten Stämme), Streptococcus pneumoniae, Strept. pyogenes, Strept. viridans, Corynebacterium diphtheriae, Neisseria catarrhalis und N. gonorrhoeas, Clostridium septicum. Cl. welchii, E. coli, Salmonella typhi, Styphimurium, S. paratyphi, verschiedene Shigella-Arten, Proteus mirabilis, H. pertussis, Leptospira icterohaemorrhagiae, L. pomona und L. canicola. Es ergab sich auch, daß sie gegen Staphylococcenpenicillinase sehr beständig ist, einen hohen Serumspiegel in vivo aufrechterhält und eine. viel größere In-vivo-Stabilität aufweist als die entsprechende Verbindung der Formel III (wie durch hohe Urinspiegel bewiesen wird) und auch eine bessere Löslichkeit in Wasser (etwa 20% Gewicht/Gewicht bei etwa 2O⁰C) zeigt.

N - (7,2' - Thieny lacetamidoceph - 3 - em - 3 - y lmethyl)-pyridinium-4-carboxylat besitzt bei Labortieren eine niedrige akute Organtoxizität. Die intravenösen und subkutanen DL₅₀-Werte, an Mäusen bestimmt, sind 1,3 und 8,5 g/kg, und die subkutane DL₅₀ bei Ratten beträgt 5,5 g/kg.

Einzelne intramuskulär verabreichte Dosen erzeugten keine Anzeichen für eine allgemeine oder lokale Toxizität bei Verabreichung an Kaninchen (0,2 g/kg), Katzen (0,2 oder 1 g/kg), Hunde (0,1,0,2 oder 0,5 g/kg) und Affen (0,2 g/kg) und Mäuse, Ratten und Katzen nahmen Oraldosen von 15,3 bzw. 0,1 g/kg auf, ohne irgendwelche Begleiterscheinungen. Histologische Untersuchungen der Injektionsstellen zeigten, daß die Verbindung weniger Schäden verursachte als Natriumpenicillin G. Bei Kaninchen, Mäusen, Meerschweinchen, Affen und Ratten, denen die Verbindung

CH₂ — CO — NH

oder ein wasserlösliches Salz derselben, wie das Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz, mit wäßrigem Pyridin bei einem pH-Wert von 6 bis 7 in Gegenwart von Ν,Ν-Dimethylformamid oder Aceton umgesetzt.

Die Reaktionsdauer hängt von der angewendeten Temperatur ab, läßt sich jedoch durch einen Vorversuch bestimmen.

in Einzelinjektionen von 50, 200, 200, 200 bzw. 1000 mg/kg verabreicht wurde, zeigten sich keine Anzeichen von Nephrotoxizität. Nierenfunktionstests an anästhetisierten Katzen, welche die Verbindung durch intravenöse Injektion verabreicht erhielten, zeigten, daß die Substanz einfach durch Glomerularfiltration ausgeschieden wurde und daß sie keine Wirkung auf den Nierenplasmafluß, die Klarheit des Harns oder die Fähigkeit zur Reabsorption von Glucose hat. Subakute Toxizitätsversuche an Mäusen, Ratten, Kaninchen und Katzen bestätigten die sehr geringe Toxizität der Verbindung.

Die Verbindung wird dadurch hergestellt, daß in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel

II

L-CH₇OCOCH,

CO,H

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Thienylacetylgruppe bedeutet, oder ein wasserlösliches Salz derselben mit 1 bis 10 Mol Pyridin in Wasser, das gegebenenfalls ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält, bei 15 bis 70° C und einem pH-Wert von 5 bis 8 umgesetzt, und, falls R ein Wasserstoffatom bedeutet, die erhaltene Verbindung mit dem Chlorid, Bromid oder gemischten Anhydrid der 2-Thienylessigsäure in einem gegebenenfalls Wasser enthaltenden organischen Lösungsmittel oder in wäßriger Lösung bei 0 bis 25° C und einem pH-Wert von 5 bis 7, gegebenenfalls in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, umgesetzt wird.

Bei einer bevorzugten Ausführüngsform der Erfindung wird eine Verbindung der Formel III

CH₇OCOCH,

III

65 CO₂H

Falls notwendig, sollte der pH-Wert der Lösung auf den gewünschten Wert durch Zusatz eines Puffers, wie Ammoniumacetat oder bei Verwendung eines Alkalisalzes der Verbindung der allgemeinen Formel III, durch Zugabe von z. B. Essigsäure, eingestellt werden.

Das Reaktionsprodukt läßt sich aus der Reaktionsmischung, die z. B. nicht umgesetzte Verbindung der

Formel 111 und andere Substanzen enthalten kann, durch übliche Verfahren abtrennen, zu denen Kristallisation, Elektrophorese, Papierchromatographie oder Behandlung mit einem Ionenaustauschharz gehören.

Ein bequemes Verfahren besteht darin, überschüssiges Pyridin mit der Verbindung der Formel III in Wasser umzusetzen, bis man eine optimale Ausbeute an der gewünschten Verbindung I erzielt hat. Überschüssiges Pyridin und ein Teil der nicht umgesetzten Verbindung III werden dann mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methylenchlorid, extrahiert, und die restliche Lösung wird durch ein Anionenaustauscherharz, z. B. in Form des Acetats, percoliert, um alle Verbindungen mit freier Carboxylgruppe und den Rest der nicht umgesetzten Verbindung III zu entfernen. Die restliche Lösung wird dann konzentriert, z. B, in einem Rotationsverdampfer, und gefriergetrocknet. Der Rückstand kann dann aus einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Methanol, kristallisiert oder durch Fällung gereinigt werden, z. B. aus methanolischer Lösung durch Zusatz von Aceton.

Die Verbindungen der oben angegebenen Formel III werden durch Umsetzung von 7-Aminocephalosporansäure mit dem Chlorid, Bromid oder gemischten Anhydrid der 2-Thienylessigsäure, welch letzteres sich von einem Alkylhalogenformiat ableitet, hergestellt. Die Acylierung läßt sich bequem in wäßrigem Medium ausführen, z. B. in einem wäßrigen wassermischbaren Keton, wie Aceton, oder wäßrigem Tetrahydrofuran, vorzugsweise auch in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, z. B. Natriumbicarbonat. Der pH-Wert wird während der Reaktion bei 5 bis 7 gehalten und die Temperatur zwischen 0 und 25° C. Die Acylierung kann auch in einem organischen Lösungsmittelmedium, z. B. Essigsäureäthylester, ausgeführt werden, wobei z. B. einfach unter Rückfluß erhitzt wird.

In den folgenden Beispielen betrifft die Ultraviolettabsorption Lösungen in Wasser oder wäßrigem Phosphatpuffer von pH 6,0. Die Schmelzpunkte der Verbindungen wurden in Capillarröhrchen gemessen. -1°

Die Papierchromatographie wurde auf Whatman Nr. 1-Papier, gepuffert mit 0,1 m-Natriumacetat pH 5, ausgeführt. Als Lösungsmittelsystem wurde Essigester/n-Butanol/0,1 m-Natriumacetat 8:1:8 verwendet. Die Chromatographie wurde absteigend durchgeführt.

Die Elektrophorese wurde auf Whatman 3 MM-Papieren bei einem Gradienten von 30 Volt pro Zentimeter ausgeführt. Verwendete Pufferlösungen:

a) pH 1,9: Essigsäure/Ameisensäure/Aceton/Wasser 84:17:105:495;

b) pH 7: 0,05 m-Dinatriumhydrogenphosphat (pH-Wert mit Phosphorsäure eingestellt).

Die Fraktionen auf den Papierchromatogrammen und Elektrophoretogrammen wurden bei Bestrahlung der Papiere mit UV-Licht als dunkle Flecken aufgefunden. Zwitterionen liefen als Basen in der Elektrophorese bei pH 1,9, wurden jedoch bei pH.7 nicht bewegt.

Beispiel 1

a) 7,2'-Thienylacetamidocephalosporansäure

5,00 g durch ein Sieb von etwa 0,15 mm lichter Maschenweite gesiebte 7-Aminocephalosporansäure wurden in 200 ml siedendem Essigester suspendiert, und 4,42 g (1,5 Äquivalente) 2-Thienylacetylchlorid (C a g η i a η t. Bull. soc. chim. France, 1949, 847) in 20 ml Essigester wurden zugegeben. Die Mischung wurde 40 Minuten unter Rückfluß erhitzt, dann abgekühlt und nitriert. Zum Filtrat wurden 5,03 ml Anilin zugesetzt, nach einer Stunde wurde die Mischung einmal mit 150 ml, zweimal mit 100 ml und einmal mit 50 ml 3%iger Natriumbicarbonatlösung extrahiert, und die alkalischen Extrakte wurden dreimal mit je 100 ml Essigester gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 1,2 angesäuert und zweimal mit je 150 ml Essigester extrahiert. Der Essigesterextrakt wurde viermal mit 40 ml Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein niederes Volumen eingeengt. Es schieden sich 2,5 g rohe 7,2'-Thienylacetamidocephalosporansäure ab, die abfiltriert wurden. Eindampfung des Filtrats ergab weitere 2,68 g (71%) des Produktes, die durch Kristallisation aus Essigester und dann aus wäßrigem Aceton gereinigt wurden. F. 156 bis 157° C (Zersetzung). ;.„_mx 237 m(j.(f = 14400), 261 ηΐμ (f = 8 900); [a]₀ = +84⁰C (c = 0,5 in Dioxan); Das Natriumsalz vom Schmelzpunkt 204 bis 205⁰C (Zersetzung), [«]_D = +135°C (c = 1,0 in Wasser) wurde durch Behandlung der Säure in Essigesterlösung mit 10%igem Natriumäthylhexanoat in n-Butanol hergestellt.

b) N-(7,2'-Thienylacetamidoceph-3-em-3-ylmethyl)-pyridinium-4-carboxylat

10 ml Pyridin (10 Äquivalente) wurden unter Rühren zu einer Suspension von 5 g 7,2'-Thienylacetamidocephalosporansäure in 45 ml Wasser gegeben. Die Säure löste sich auf und ergab eine Lösung vom pH-Wert 6,5. Diese Lösung wurde 16 Stunden bei 46° C unter Stickstoff stehengelassen und dann viermal mit je 20 ml Methylenchlorid extrahiert. Nachdem die Lösung dann in einem Rotationsverdampfer bei weniger als 40⁰C konzentriert worden war, wurde sie über eine Dowex-1-Säule in Acetatform gegeben. Die Eluatfraktionen, welche die gewünschten Pyridinderivate enthielten (polarimetrisch gemessen), wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Durch Verreiben des gefriergetrockneten Feststoffs (1,75 g) mit Methanol wurden 994 mg (19%) des Pyridinderivats in Form eines weißen Feststoffs erhalten. )._max 237 πΐμ (Ei* = 365); λ Inflektion 256 πΐμ (EJl = 328); [_α]₀ = +45° C (c = 0,64 in Wasser).

Die methanolische Mutterlauge wurde in einem Rotationsverdampfer bei nicht mehr als 4O⁰C eingeengt und dann langsam in ein großes Volumen magnetisch gerührten Acetons (etwa 500 ml) gegeben. Auf diese Weise wurden weitere 301 mg (6%) des gewünschten Pyridinderivats als hellgelber fester ■ Stoff erhalten. A_mox237 ΐημ (E¹, *„ = 288); λ Inflektion 255 ηΐμ (E\t = 207).

Beispiel 2

■ώ1·-

a) N^-Aminoceph-S-em-S-ylmethylpyridinium-4-carboxylat

10,0 g 7-Aminocephalosporansäure wurden in 11 Wasser suspendiert, und 40 ml Pyridin (10 Äquivalente) wurden zugegeben. Diese Lösung vom pH-Wert 6,4 wurde 60 Stunden bei 35⁰C stehengelassen und dann 2 Tage in den Eisschrank gestellt. Dann wurde die Mischung dreimal mit je 1 1 Methylen-

chlorid extrahiert, und die wäßrige Schicht wurde durch eine 40 χ 3,3-cm-Säule von Dowex-1-Harz in Form des Acetats (pH 4.5) laufengelassen. Das Harz wurde mit 700 ml Wasser eluiert, bis das Eluat den optischen Drehwert 0 aufwies. Das Eluat wurde dann mit überschüssigem Dowex-50-Harz gerührt, bis der pH der Lösung 2,5 war. Dann wurde das Harz abfiltriert, mit Wasser gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten farblos waren, und dann mit 250 ml Wasser gerührt und mit 7n-Ammoniak auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Das Harz wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit, und das Filtrat wurden gefriergetrocknet. Man erhielt so 1,03 g (9,6%) einer rohen Probe von N-7-Aminoceph - 3 - em - 3 - ylmethylpyridinium - 4 - carboxylat, X_max 255 bis 256 ηΐμ (EJ °i = 349, ε = 10 150); ,, Nujoi = 1760 (/3-Lactam) und 1605 cm (-CO₂"); R_F = 0,25 (n-Propanol—Wasser 7 : 3), bezogen auf 7-Phenylacetamidocephalosporansäure.

Elektrophorese bei pH 1,9 zeigte eine Kationenbeweglichkeit von 6,3 cm, bezogen auf die Neutralmarkierung, und einen Potentialgradienten von 15,5 Volt pro Zentimeter.

b) N-(7,2'-Thienylacetamidoceph-3-em-3-ylmethyl)-pyridinium-4-carboxylat

Eine Lösung von 10 mg N-7-Aminoceph-3-em-S-ylmethylpyridinium^-carboxylat in 10 ml Wasser wurde mit überschüssigem Thienyl-2-acetylchlorid (5 Äquivalente) behandelt, und die Mischung wurde Stunde bei Zimmertemperatur geschüttelt und dann papierchromatographisch (n-Propanol—Wasser 7:3) im aufsteigenden System und durch Elektrophorese bei pH 1,9 untersucht. Das N-(7,2'-Thienylacetamidoceph-3-em-3-ylmethyl)-pyridinium-4-carboxylat wurde gefunden. R_F == 0,66, bezogen auf 7-Phenylacetamidocephalosporansäure. Beweglichkeit als Kation bei der Elektrophorese: 1,8 cm bei 15,5 Volt pro Zentimeter. Es zeigte ein gleiches Verhalten wie das im Beispiel 1 b) hergestellte Material, das auf diesen Papieren als Standard verwendet wurde.

Die biologischen Eigenschaften der in den obigen Beispielen hergestellten Verbindung zeigt folgende Tabelle. Die Staph. aureus-Stämme A und C waren penicillinresistent, während der Stamm B penicillinempfindlich war.

	Reagenzglasverdünnungsversuch (y/ml)	gramnegativ	4	Schutz von Mäusen (ED50/mg/kg/Dosis)
	grampositiv	S. typhimurium	8	subkutan
Staph. aureus		Pr. mirabilis		S. aureus
Stamm A	0,62			Stamm B 2 .
Stamm B	0,02			E.coli <6,25
Stamm C	<0,5
E. coli	8

Die erfindungsgemäße Verbindung ist den aus »The Bioehemical Journal«, Bd. 79, 1961, S. 403 bis 407, bekannten Verbindungen in ihrer Wirkung deutlich überlegen.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. N-(7,2'-Thienylacetamidoceph-3-em-3-ylmethyl)-pyridinium-4-carboxylat der Formel

-S_x

^<\~\- CH₂ — CO — NH — HC —/

= C-N

2. Verfahren zur Herstellung von N-(7,2'-Thieny lacetamidoceph - 3 - em - 3 - y lmethyl) - py ridini um-4-carboxylat, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise eine Verbindung der' allgemeinen Formel

RNH- HC

O = C-N

II

-CH₂OCOCH₃

60

CO₂H

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Thienylacetylgruppe bedeutet, oder ein wasserlösliches Salz derselben, mit 1 bis 10 Mol Pyridin in Wasser, das gegebenenfalls ein mit Wasser mischbares

65

— CH, — N

organisches Lösungsmittel enthält, bei 15 bis 70°C^und einem pH-Wert von 5 bis 8 umgesetzt und, falls R ein Wasserstoffatorn bedeutet, die erhaltene Verbindung mit dem Chlorid, Bromid oder gemischten Anhydrid der 2-Thienylessigsäure in einem gegebenenfalls Wasser enthaltenden organischen Lösungsmittel oder in wäßriger Lösung bei 0 bis 25⁰C und einem pH-Wert von 5 bis 7, gegebenenfalls in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, umgesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Umsetzung mit Pyridin als organisches Lösungsmittel Dimethylformamid oder Aceton verwendet wird und daß der pH-Wert bei der Umsetzung 6 bis 7 beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel bei der Acylierungsreaktion Aceton oder Tetra*

7 . 8 -

hydrofuran verwendet wird und daß als säure- haltendes Reaktionsgemisch nach der Umsetzung

bindendes Mittel Natriumbicarbonat verwendet mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert,

wird. die wäßrige Phase mit einem Ionenaustauscher-

5. Verfahren nach den Ansprüchen 2, 3 oder 4, harz behandelt und dann konzentriert und gefrier-

dadurch gekennzeichnet, daß ein Wasser ent- 5 getrocknet wird.