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Verfahren zur Herstellung von Derivaten der 7 -Aminocephalosporansäure u. ähnl. Verbindungen
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von antibiotisch wirksamen Verbindungen, nämlich von Derivaten der 7-Aminocephalosporansäure und ähnlichen Verbindungen.
Es wurde festgestellt, dass durch Behandlung von Cephalosporin C mit Säure das Molekül unter bestimmten Bedingungen in zwei Teile gespalten werden kann, nämlich in ein komplexes Ringsystem sowie eine Seitenkette, die als a-Aminoadipinsäure identifiziert wurde. Die Seitenkette haftet an der Aminogruppe eines komplexen Ringsystems in 7-Stellung. Diese als 7-Aminocephalosporansäure (Cephalosporin C-Kern) bezeichnete Verbindung entspricht der Formel
EMI1.1
Durch weitere Verseifung der Acetylestergruppe kann ein Lakton (Cephalosporin Cc-Kern) der folgenden Formel erhalten werden
EMI1.2
Durch Substitution des Acetylrestes der 7 -Aminocephalosporansäure mit einer tertiären Aminogruppe kann eine Verbindung mit einer schwach basischen quaternären Aminogruppe erhalten werden.
Die Verbindung mit Betaincharakter entspricht der allgemeinen Formel
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enthaltenden Acylierungsmittel, wobei R und R die oben angeführte Bedeutung haben, behandelt wird.
Als Acylierungsmittel können geeignete funktionelle Derivate der Säure RCH. COOH, z. B. ein Säurehalogenid, verwendet werden. Die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze der Derivate können aus den Acylierungsprodukten durch Behandlung mit Natrium-, Kalium-bzw. Ammoniumhydroxyd hergestellt werden.
Wenn X den Rest des Kerns einer Cephalosporin CA-Verbindung darstellt, so ist der bevorzugte Rest der des Cephalosporin CA (Pyridin).
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pen sein, wobei Gruppen mit 1-10 Kohlenstoffatomen und insbesondere solche mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen vorgezogen werden. Wenn eines der Symbole R oder R eine substituierte Phenylgruppe darstellt, werden Gruppen mit Nitro-, Chlor-, Alkyl- und Alkoxy-Substituenten bevorzugt. Von den Alkoxygruppen wären insbesondere die Methoxy- und Äthoxygruppen hervorzuheben.
Zu Verbindungen obiger Formel, denen eine besondere Bedeutung zukommt, zählen : die Phenylacetyl-, Phenoxyacetyl-, n-Propionyl-, cc-Phenoxypropionyl-und Isobutyryl-Derivate des Kerns von Cephalosporin C, Cephalosporin Cc und Cephalosporin CA (Pyridin). Von Interesse sind ferner die Hexanoyl-, p-Nitrophenylacetyl-und p-Nitrophenoxyacetyl-Derivate des Kerns von Cephalosporin C, Cephalosporin c. und Cephalosporin CA (Pyridin).
Der zu acylierende Kern kann gewünschtenfalls in dem Reaktionsgemisch durch Säurebehandlung der Cephalosporin C-, Cephalosporin Cc- oder einer Cephalosporin CA-Verbindung in situ hergestellt werden. Nach der Säurebehandlung und vor der Acylierung wird die Lösung vorzugsweise auf einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7 gepuffert. Zum Konzentrieren des Kerns kann bei einem solchen Verfahren zweckmässig die den Kern enthaltende Lösung mit einem stark basischen Anionen-Austauscherharz in Acetatform in Kontakt gebracht werden, wonach nach Eluierung mit Essigsäure die den Kern enthaltenden Fraktionen gesammelt werden. Ein hiefür hervorragend geeignetes Harz ist Dowex-1 X8 in Acetatform, ein geeignetes Eluierungsmittel ungefähr 0, 5 n-n Essigsäure.
Wie schon zuvor erwähnt, können, wenn R, und R, für Alkylgruppen stehen, diese Gruppen ziemlich gross sein. Wenn R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe und R eine Alkylgruppe bedeuten, soll die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in den Gruppen R und R vorzugsweise 4 betragen und erwünschterweise nicht grösser als 4 sein. Wenn rot eine Phenyl-, eine Phenoxy-, eine substituierte Phenyl- oder eine substituierte Phenoxygruppe und R eine Alkylgruppe bedeutet, enthält R vorzugsweise 1 Kohlenstoffatom und erwünschterweise nicht mehr als 3-4 Kohlenstoffatome.
Die Erfindung soll an Hand folgender Beispiele erläutert werden : Beispiel l : Überführung von 7-Aminocephalosporansäure (hergestellt in situ in Lösung durch Säurebehandlung von Cephalosporin C) in das Phenylacetylderivat dieser Säure (Benzylcephalosporin).
300 cm3 Aceton, die 3 cm3 Phenylacetylchlorid enthielten, wurden einer abgekühlten wässerigen Lösung von 7-Aminocephalosporansäure zugesetzt und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Es wurde sodann 1 h stehen und die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen, wonach das Aceton durch Destillation im Vakuum entfernt wurde. Das Volumen des wässerigen Rückstandes betrug jetzt 325 cm\ der PHWert 5, 9. Zwecks Entfernung von nicht abdestilliertem Aceton wurde mit 2 x 150 cms Benzol extrahiert, dann der p-Wert mit sirupöser Phosphorsäure auf 3, 3 eingestellt und die Lösung noch zweimal mit
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X 150 cmTiBenzylcephalosporin hingegen nicht.
Zur Vervollständigung dieser Extraktion wurde der pH-Wert der Lösung, der auf 3, 8 angestiegen war, auf 3, 3 rückgebracht und die Extraktion mit 3 x 150 cms Benzol fortgesetzt. Der pH-Wert wurde dann mit Phosphorsäure auf 2, 5 gesenkt und die Lösung mit 3 x 150 CM3 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 x 30 cm3 Wasser gewaschen und nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat im Vakuum auf 2 - 3 cm3 eingeengt. Ein Zusatz von 10 bis 15 Vol. Petroläther (Sp. 60-80 C) bewirkte die Ausfällung einer gelben Substanz (97 mg), welche abzentrifugiert, mehrmals mit bei 40 - 600C siedendem Petroläther gewaschen und dann im Vakuumexsikkator getrocknet wurde. Hierauf wurde wieder in Äthylacetat (2 cm3) aufgelöst ; sodann wurden 10 bis 15 Vol. Äther zugesetzt.
Dieser Zusatz bewirkte eine Ausfällung eines kleinen Anteils einer Substanz, die nicht verwertet wurde.
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n/10 Natriumhydroxydlösung bis zu einem PH = 6 titriert ; während der Titration ist ein stärkeres Rühren erforderlich. Ein kleiner Anteil an unlöslichem Material wurde filtriert und die wässerige Lösung der Gefriertrocknung unterworfen, wobei eine etwas klebrige Substanz zurückblieb. Diese wurde in einem Minimum einer Mischung von Aceton : Wasser 9:1 (# 1 cm3) gelöst und durch Zusatz von wasserfreiem Aceton ausgefällt. Es bildete sich ein flockiger Niederschlag von feinen, farblosen Nadeln (31, 2 mg). Eine weitere Reinigung wurde vorgenommen, indem in wässerigem Aceton wieder gelöst und nochmals mit wasserfreiem Aceton ausgefällt wurde.
Physikalische Eigenschaften des kristallinen Natriumsalzes des Benzylcephalosporin :
Bei Erhitzung wurde das Natriumsalz dunkler und zersetzte sich bei 1600C.
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28 + 1220U. V. Spektrum in Wasser : X 259 m E1% 190. max 1cm # 234 m E1% 138,5. mm 1 cm
I. R.-Spektrum :
Das Infrarotspektrum in Nujol mull. ist in Fig. 1 gezeigt.
Papier-Chromatographie :
Das verwendete Fliessmittelsystem war Butanol : Äthanol : Wasser (4 : 1 : 5). Die obere Phase aus dieser Mischung wurde auf Whatman Nr.1-Papier, gepuffert auf PH = 6, fliessen gelassen. RF = 0, 65 bis 0, 67.
Elektrophorese :
Die Wanderungen zu der Anode gingen ungefähr mit derselben Geschwindigkeit vor sich wie bei Penicillin G in Kollidinacetat-Puffer bei PH = 7, 0.
Die Wirksamkeit der 7-Phenylacetamidocephalosporansäure (Benzylcephalosporin) gegenüber verschiedenen Bakterien wurde mittels der Reihenverdünnungsmethode (tube dilution technique) geprüft. Die Organismen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Nährbrühe wachsen gelassen, wobei die 2 cm* Medium enthaltenden Röhrchen mit 0,1 cm3 einer 1/100 Verdünnung einer etwa 12stündigen NährbrüheKultur beimpft und bei 370C 48 h bebrütet wurden. Die Resultate sind als minimale Hemmungskonzentration in g/cm3 angegeben.
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<tb>
<tb>
Organismus <SEP> Stamm <SEP> Medium <SEP> Minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> in <SEP> g/cm3
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 1 <SEP> (Nutrient <SEP> Broth) <SEP> 0,28
<tb> Nährbrühe
<tb> 2 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 3 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,28
<tb> 4 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,14
<tb> 5 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,38
<tb> 6 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> 7 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 8 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,57
<tb> 9 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> 10 <SEP> Nährbrühe <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 11 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 28
<tb> 12 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 1,14
<tb> 13 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> 14 <SEP> Nährbrühe <SEP> 2, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 15 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,28
<tb> 16 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,
<SEP> 56 <SEP>
<tb> 17 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,28
<tb> 18 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 1,14
<tb> 19 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,57
<tb> 20 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP>
<tb> 21 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 3,00
<tb> 22 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 3,00
<tb> 23 <SEP> Nährbrühe <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 1 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> Nährbrühe <SEP> 2, <SEP> 20 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> 2 <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,14
<tb> haemolyticus <SEP> (Brain-heart-infusion)
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Serum
<tb>
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<tb>
<tb>
Organismus <SEP> Stamm <SEP> Medium <SEP> Minimale <SEP> hemmungskonzentration <SEP> in <SEP> g/cm3
<tb> Streptococcus <SEP> 3 <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,28
<tb> haemolyticus <SEP> +10% <SEP> Serum <SEP>
<tb> 4 <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,14
<tb> +10% <SEP> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> - <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,14
<tb> agalactiae <SEP> +10% <SEP> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> - <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,07
<tb> dysgalactiae <SEP> +10% <SEP> Serum
<tb> Corynebacterium-Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,07
<tb> pyogenes
<tb> Corynebacterium <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,14
<tb> coryzae
<tb> Bacillus <SEP> subtilis-Nährbrühe <SEP> 0,07
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,
56
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> 1 <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,28
<tb> 2 <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,28
<tb> Haemophilus <SEP> pertussis <SEP> 1 <SEP> Bordet-Gengou-Agar <SEP> > <SEP> 15 <SEP>
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Schafsblut <SEP>
<tb> 2 <SEP> Bordet-Gengou-Agar <SEP> > 15
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Schafsblut <SEP>
<tb> 3 <SEP> Bordet-Gengou-Agar <SEP> > 15 <SEP>
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Schafsblut
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1 <SEP> Nährbrühe <SEP> 61
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 15
<tb> Salmonella <SEP> typhi-Nährbrühe <SEP> 7,
5
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 61
<tb> Salmonella <SEP> meloagidis <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 122
<tb> Salmonella <SEP> heidelburg <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 1,5
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 2% <SEP> Glucose <SEP> > <SEP> 122
<tb> Leptospira <SEP> pomona <SEP> - <SEP> Korthof's <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 20
<tb> Leptospira <SEP> ictero- <SEP> - <SEP> Korthof's <SEP> ¯ <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 10
<tb> haemorrhagiae
<tb>
Beispiel 2 : Herstellung von 7-Phenylacetamidocephalosporansäure.
2 g Natriumsalz von Cephalosporin C wurden in 30 cm3 Wasser gelöst. Hierauf wurde der PH-Wert durch Zusatz von Dowex 50 X 8 (H+) auf 2, 5 eingestellt, das Harz filtriert und mit 10 cm3 Wasser gewaschen, wonach den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten 10, 2 cm3 n HCl zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 3 Tage bei 200C stehen gelassen und in eine Kolonne von Dowex 1 (Acetatform), 2, 1 cm Durchmesser x 7 cm, eingebracht. Das Perkolat wurde in 5 cm3-Fraktionen (1-12) gesammelt, wonach
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mit Wasser eluiert wurde, bis insgesamt 34 Fraktionen gesammelt waren. Sodann wurde die Eluierung mit
0, 5 n Essigsäure vorgenommen ; es wurden weitere 66 Fraktionen gesammelt. Von jeder Fraktion wurde die optische Dichte bei 260 mll gemessen.
Die Fraktionen 2-16 wurden zusammengegeben. Die erhaltene Lösung, die 7-Aminocephalosporan- säure und andere unter den mässig sauren Bedingungen gebildete Abbauprodukte des Cephalosporin C ent- hielt, wurde neutralisiert und in einer C02 -Atmosphäre mit einer Natriumbicarbonatlösung auf PH = 7, 0 gepuffert. Phenylacetylchlorid (1, 2 Äquiv., bezogen auf die Menge an verwendetem Cephalosporin C) in Aceton wurde langsam der neutralen Lösung zugesetzt, die auf 0 C abgekühlt worden war, und mit so viel Aceton vermischt, dass die Acetonkonzentration, nach Zusatz der Phenylacetylchloridlösung, auf
50% gebracht wurde. Nach 1 h wurde das PH der Mischung auf 5, 0 (Glaselektrode) eingestellt und das
Aceton im Vakuum entfernt.
Der pH-Wert wurde dann auf 2, 0 gesenkt, wonach die 7-Phenylacetamido- cephalosporansäure, zusammen mit N -Phenacetylcephalosporin Cc und N-Phenylacetylcephalosporin C mit Butylacetat extrahiert wurde. Das Butylacetat wurde abgetrennt, wonach wieder mit Wasser extra- hiert wurde, welches durch Zusatz von Alkali, in Gleichgewicht, auf einen pH-Wert von 5, 0 gebracht wurde. Der wässerige Extrakt wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Bei Chromatographie eines Teiles des Produktes (150 Mg) auf Papier in n-Butanol-Äthanol-Wasser (4 : 1 : 5 Vol.) wurde festgestellt, dass dieses drei gegenüber Staph. aureus wirksame Komponenten (s. Fig. 1) enthielt. Die vorwiegend vorhan- dene wirksame Komponente war 7-Phenylacetamidocephalosporansäure.
Die andern aktiven Komponen- ten waren N-Phenylacetylcephalosporin Cc und N-Phenylacetylcephalosporin C, wobei letztere zwei
Komponenten durch das Butylacetat nur teilweise extrahiert wurden.
Die 7-Phenylacetamidocephalosporansäure wurde von den andern aktiven Komponenten des rohen
Gemisches (17 Einheiten/mg gegenüber Staph. aureus) mittels Chromatographie auf einer Grycksbo-Paper-Kolonne (paper roll column ; LKB-Produkter-Schweden) und mittels Gegenstromverteilung (counter current distribution) abgetrennt.
Die Eluierung aus der Kolonne wurde mit n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, ausgeführt ; in einem Vor versuch wurde das Natriumsalz der 7-Phenylacetamidocephalosporansäure aus der Kolonne als ein Pulver mit einer Wirksamkeit von 167 Einheiten/mg erhalten. Dieses Material war weit davon entfernt, rein zu sein.
Hierauf wurden Gegenstromverteilungen in zwei Lösungsmittelsystemen vorgenommen. Das erste System bestand aus gleichen Teilen von Butylacetat und 10/0 Essigsäure (Lösungsmittel I) und das zweite aus n-Butanol und 0, 05 m Natriumphosphatpuffer, PH = 6, 0 (Lösungsmittel II). Nach acht Übertragungen im Lösungsmittel 1 (10 cm'obere Schicht und 20 cm3 untere Schicht) erreichte die Konzentration der 7-Phe- nylacetamidocesshalosporansäure ein Maximum zwischen den Röhrchen 6 und 7, wogegen die andern aktiven Komponenten in den Röhrchen 0 und 1 gefunden wurden. Ein aus den Röhrchen 5,6 und 7 erhaltenes Produkt zeigte eine Wirksamkeit von zirka 50 Einheiten/mg.
Die Papierchromatographie dieses Materials in n-Butanol-Wasser-Äthanol (4 : 5 : 1 Vol. ) zeigte an, dass die 7-Phenylacetamidocephalosporansäure die einzig wirksame der vorhandenen Substanzen war.
Nach acht Übertragungen im Lösungsmittel II (20 cm3 jede Schicht) zeigte das Natriumphenylacetamidocephalosporanat eine Spitze zwischen den Röhrchen 3 und 4, wobei jedoch die Hauptmenge des Restes an aktivem Material in dem Röhrchen 0 verblieben war.
7-Phenylacetamidocephalosporansäure bewegte sich zu der Anode mit fast der gleichen Geschwindigkeit wie Penicillin G, wenn es der Elektrophorese auf Papier in Kollidinacetat-Puffer, PH = 7, 0, unterworfen wurde. Nach Inkubation mit wässerigem Pyridin bei 370C wurde die Phenylacetamidocephalosporansäure teilweise in ein aktives Derivat der Cephalosporin CA (Pyridin)-Art überführt. Dieses Derivar reagierte als eine neutrale Substanz, wenn es der Elektrophorese bei PH = 7, 0 unterworfen wurde.
7-Phenylacetamidocephalosporansäure (zirka 10 gag) wurde durch eine Lösung von Penicillinase nicht wesentlich inaktiviert, welche das zehnfache der Enzymmenge enthielt, die unter gleichen Bedingungen 50 jig Penicillin G vollständig inaktivierte.
Beispiel 3 : Herstellung des Phenylacetylderivats des Cephalosporin CA (Pyridin)-Kerns aus Cephalosporin'CA (Pyridin).
Cephalosporin CA (Pyridin) wird drei oder mehr Tage lang bei Raumtemperatur in 0, 1 n oder n HC1 gehalten. Bei Analyse der Reaktionsprodukte durch Elektrophorese auf Papier in Pyridinacetat-Puffer (PH = 4, 0) und nachfolgendem Inberührungbringen des Papiers mit Agarplatten, die mit Staph. aureus beimpft waren, wurde bei der verwendeten Konzentration eine einzige aktive Zone, nämlich die dem unveränderten Cephalosporin CA (Pyridin) zukommende, festgestellt. Duplikat-Papierstreifen, die mit m-Pyridin in 50% wässerigem Aceton und 0, 125% Phenylacetylchlorid in trockenem Aceton besprüht worden waren,
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zeigen eine zusätzliche wirksame Zone auf den besäten Platten, die auf das Produkt der Phenylacetylierung des Cephalosporin CA (Pyridin)-Kerns zurückzuführen ist.
Das Phenylacetylderivat des Cephalospo-
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7, in 16 h und nachfolgender Phenylacetylierung gebildet.
Beispiel 4 : Herstellung des Phenylacetylderivates des Cephalosporin Cc-Kerns aus Cephalospo- rin cc. a Cephalosporin C (50 mg) wurde in n oder 0, 5 n Hel (l. 33 cm) 2 oder 3 Tage bei 20 C gehalten.
Unter diesen Bedingungen verschwand die 7-Aminocephalosporansäure, die nach24hindernHCl-Lö-
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Der Cephalosporin Cc-Kern wurde auch gebildet, wenn Cephalosporin C mit einem gleichen Gewicht an nassem Dowex 50 X 8 (-H"1-Ionenaustauscherharz 15 - 48 h bei 200C in Kontakt gehalten wurde.
Streifen von Ionogramme, die mit Pyridinacetatpuffer, PH = 4, 5, behandelt und sodann mit Phenylace- tylchlorid besprüht wurden, zeigten gleichfalls eine aktive Zone, wenn sie mit einem Testorganismus in
Kontakt gebracht wurden, womit das Vorhandensein des Phenylacetylderivates des Cephalosporin Cc-Kerns angezeigt wurde.
Beispiel 5 : a) Acylierung von 7-Aminocephalosporansäure auf Papier.
Muster (jedes 200 zig) einer Rohdarstellung des Cephalosporin C-Kerns wurden 2 h bei 14 Volt/cm in
Pyridinacetat-Puffer, PH = 4, 5, einer Elektrophorese auf Papier unterworfen. Papierstreifen, auf welchen jedes Muster fliessen gelassen worden war, wurden dann ausgeschnitten und jeder dieser Streifen zunächst mit m-Pyridin in 50% (Vol. /Vol.) Aceton und dann mit einer Lösung eines bestimmten Säurechlorids (0, 1 cm3) in Aceton (8 cm3) besprüht. Die Papierstreifen wurden auf mit Staph. aureus besäte Platten aufgelegt und Bioautographien (bioautographs) gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Die Hemmungszonen wa- ren in allen Fällen in gleicher Entfernung von der Ausgangsstellung (1, 6 cm zu der Anode), wobei diese Stellungen der Wanderung des Cephalosporin C-Kerns entsprachen.
Auf diese Weise wurden die Phenyl- acetyl-, Phenoxyacetyl-, n-Propionyl-, Acetyl- und Isobutyrylderivate des Cephalosporin C-Kerns hergestellt. Die Zonen, die den Phenylacetyl- und den Phenoxyacetylderivaten des Kerns entsprachen, hat- ten einen Durchmesser von zirka 3, 5 cm. Die demPropionylderivat zukommende Zone wies einen Durchmesser von zirka 2 cm auf, wogegen die den Acetyl- und Isobutyrylderivaten zukommenden Zonen klar zu erkennen, jedoch sehr klein waren. b) Acylierung von 7-Aminocephalosporansäure in Lösung.
Ein Muster von rohem Cephalosporin C-Kern (4 mg) wurde in 50 11 einer Lösung aufgelöst, die durch
Zusatz von 1 cms Pyridin zu 5 cms Wasser erhalten worden war. Zu den Mustern (10 ill) der Lösung des Kerns wurden 10 11 einer Lösung eines bestimmten Säurechlorids in Aceton zugesetzt. (Die Säurechloridlösungen wurden durch Zusatz von 0, 68 cms Phenoxyacetylchlorid, 0, 62 cnr Phenylacetylchlorid bzw.
0, 37 cm3 n-Propionylchlorid zu 10 cm3 Aceton erhalten.) Die Mischungen wurden 15 min bei Raumtem- peratur gehalten, wenn erforderlich verdünnt und dann 5 pl Muster auf Papier zur Elektrophorese oder Chromatographie aufgetupft.
Papierchromatogramme wurden bei Zimmertemperatur in Äthylacetat aufgenommen, das mit einem wässerigen Natriumacetat-Puffer (0, 1 m auf Natrium), PH = 5,4, gesättigt war. Das Papier wurde durch Weichenlassen in der Pufferlösung, Ablöschen (blotting) und Aufhängen in einem Luftstrom bei Raumtemperatur vorbehandelt und, sobald es trocken war, verwendet. Mit diesem System erreichte die Fliessmittelfront den unteren Teil des Papieres in ungefähr 3 h, wobei jedoch das Chromatographieren 18 h fortgesetzt wurde.
Die Wirksamkeit der Acylderivate wurde gegenüber Staphylococcus aureus gemessen. Es wurde gefunden, dass die Wirksamkeit des Phenoxyacetylderivates der Wirksamkeit des Phenylacetylderivates entsprach, die Wirksamkeit des n-Propionylderivates beträchtlich geringer war und schliesslich dass die Benzoyl-, Isobutyryl- und Acetylderivate eine merkbare, jedoch geringe Wirksamkeit aufwiesen.
Es wurde festgestellt, dass alle diese Derivate einen gleichen Weg zu der Anode zurücklegten, wenn sie der Elektrophorese auf Papier bei einem PH-Wert von 4, 5 unterworfen wurden und ihre Stellung durch Untersuchungen gemäss Beispiel 1 (bioautographs) festgestellt wurde. Der Weg entsprach der Wanderung von Cephalosporin C und von Benzylpenicillin.
Die Phenylacetyl-, Phenoxyacetyl-und n-Propionylderivate des Cephalosporin C-Kerns konnten voneinander durch Papierchromatographie in dem Äthylacetat-Natriumacetat-Puffersystem, das von Hale, Müller und Kelly (Nature 1953, 172,545) angegeben wird, unterschieden werden. Die Tabelle 1 zeigt die RF-Werte der verschiedenen Derivate, bezogen auf die des Benzylpenicillins (Phenylacetylderivats
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der 6-Aminopenicillansäure; 6-aminopenicillanic acid). Die entsprechenden Rp-Werte sind mit dem ZeichenRPhenylacetyl-6-APAbezeichnet.
Tabelle 1
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<tb>
<tb> Derivat <SEP> Phenylacetyl-8-APA
<tb> n-Propionyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP>
<tb> Phenylacetyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP>
<tb> Phenoxyacetyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP>
<tb> n-Propionyl-6-APA <SEP> (Äthylpenicillin) <SEP> 0,43
<tb> Phenylacetyl-6-APA <SEP> (Benzylpenicillin) <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Phenoxyacetyl-6-APA <SEP> (Phenoxymethylpenicillin) <SEP> 1, <SEP> 07 <SEP>
<tb> α-Phenoxypropionyl-6-APA <SEP> (α-Phenoxyäthylpenicillin) <SEP> 1,20
<tb>
Die N -Acylderivate der 7-Aminocephalosporansäure reagierten mit wässerigem Pyridin in einem PH-
Bereich von zirka 7 unter Bildung aktiver Verbindungen der CA-Art (III).
Diese CA-Verbindungen ver- hielten sich so, als hätten sie keine Ladung (net charge) bei Elektrophorese auf Papier bei einem PH-Wert von 4, 5 oder 7, 0, wogegen die N-Acylderivate selbst zu der Anode wanderten.
Beispiel 6 : Herstellung des cx-Phenoxypropionylderivates der 7-Aminocephalosporansäure.
Kristalline 7-ACA (5, 6 mg) wurden in einer Mischung von Wasser (0,9 cm) und 0, 1 sema 8% Na- triumbicarbonat (mit CO2 auf einen pH-Wert von 7, 0 gebracht) gelöst. Dieser Lösung wurde Aceton (1, 0 cm3) zugesetzt und die Mischung sodann auf OOC abgekühlt. Die abgekühlte Lösung wurde mit einem magnetischen Rührer gerührt, während eine Lösung von 6 jul von frisch destilliertem cx-Phenoxypropionyl- chlorid in 1,0 cm3 trockenem Aceton innerhalb von 20 min durch eine Kapillare eingeführt wurde. Während des Zusatzes des Säurechlorids wurde 1 cm3 einer Lösung, die 25 l 8% Natriumbicarbonat (PH =
7, 0) enthielt, durch eine zweite Kapillare hinzugefügt.
Nach Zusatz des Säurechlorids und des Puffers wurde die Mischung bei 0 C weitere 20 min gerührt. Das Eisbad wurde dann entfernt, die Mischung auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 20 min bei dieser Temperatur gehalten.
Hierauf wurde die Lösung auf ein PH von ungefähr 5, 0 angesäuert, wonach Wasser (5 cm3) zugesetzt wurden. Das Aceton wurde im Vakuum entfernt ; es blieben ungefähr 3 cm3 einer wässerigen Lösung zurück. Dieser Lösung wurde n Hel zugesetzt, bis ein PH-Wert von 3, 5 erreicht war, wonach die saure Lösung, zwecks Entfernung von vorhandener freier a-Phenoxypropionsäure, dreimal mit einem gleichen
Volumen an Benzol extrahiert wurde. Der wässerige Rückstand wurde auf einen pH-Wert von 2, 0 gebracht und, zwecks Entfernung des a-Phenoxypropionylderivats des 7-ACA, zweimal mit dem gleichen Volumen Butylacetat extrahiert. Die vereinigten Butylacetatextrakte (6 cm3) wurden mit 1, 5 cm3 Wasser gewaschen.
Das α-Phenoxypropionylderivat der 7-ACA wurde, nachdem zu der Mischung 0, 1 n Natronlauge zugesetzt worden war, bis der PH-Wert der wässerigen Lösung im Gleichgewicht bei 5, 4 lag, als Natriumsalz in ein gleiches Volumen Wasser rückextrahiert. Es wurde eine zweite Extraktion mit einem gleichen Volumen an Wasser vorgenommen ; die vereinigten wässerigen Extrakte wurden einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei 9 mg eines flaumigen weissen Pulvers erhalten wurden.
Eigenschaften des α-Phenoxypropionylderivates der 7-ACA :
Biologische Wirksamkeit :
Das teilweise reine Natriumsalz des < x-Phenoxypropionylderivates von 7-ACA enthielt, wie festgestellt werden konnte, wenn es Benzylpenicillin gegenüber geprüft wurde, wobei die Plattenmethode (whole plate method) und als Testorganismus Staphylococcus aureus verwendet wurde, 107 Penicillin- Einheiten/mg. Da spektrophotometrische Untersuchungen zeigen, dass das verwendete Muster einen Reinheitsgrad von ungefähr 70% hat (s. unten), ist zu erwarten, dass das reine Natriumsalz des α-Phenoxy- propionylderivates von 7-ACA ungefähr 150 Penicillin-Einheiten/mg aufweist.
Ultraviolett-Absorptionsspektrum : Das U. V. -Spektrum des teilweise reinenNatriumsalzesdés cx-Phenoxypropionylderivates von 7-ACA
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derivat der 7-ACA berechneten U. V.-Spektrum zeigte, dass der Reinheitsgrad des vorliegenden Musters bei ungefähr 70%war.
<Desc/Clms Page number 9>
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Wenn unter Verwendung eines Fliessmittelsystems, das aus mit Natriumacetat-Puffer (PH = 5, 0, 0, 1 m bezogen auf Natrium) gesättigtem Äthylacetat besteht, aufWhatmanNr.
l-Papierchromatographiert wird, welches mit der gleichen Natriumacetat-Pufferlösung behandelt und gerade luftgetrocknet worden war, wies das Natriumsalz des a-Phenoxypropionylderivates der 7-ACA, ersehen aus einem Bio-
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Derivate der 7-ACA und der 6-Aminopenicillansäure (6-aminopenicillanic acid, 6-APA) folgende RPenicillin G - Werte :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> RP--Wert
<tb> Natriumbenzylpenicillin <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Natrium-6- <SEP> (ct-phenoxypropionamid)- <SEP>
<tb> penicillanat <SEP> 1, <SEP> 20 <SEP>
<tb> (Natrium-a-phenoxyäthylpenicillin)
<tb> Natrium-7-(α
-phenoxypropionamid)-
<tb> -cephalosporanat <SEP> 0, <SEP> 775
<tb> Natrium-6- <SEP> (2',6'-dimethoxybenzamid)penicillanat <SEP> 0, <SEP> 414
<tb> (Natrium-2,6-dimethoxyphenylpenicillin)
<tb> Natrium-7- <SEP> (2', <SEP> 6'-dimethoxybenzamid)- <SEP>
<tb> - <SEP> cephalosporanat <SEP> 0, <SEP> 115 <SEP>
<tb>
PATENTANSPRÜCHE : 1.
Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirksamer Verbindungen der allgemeinen Formel
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worin X für einen Rest des Kerns von Cephalosporin C, Cephalosporin Ce oder einer Cephalosporin CAVerbindung steht und in der sowohl Rl als auch R2 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Aryl-, Alkyloxyoder Aryloxygruppe darstellen, sowie von Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern des Cephalosporin C, Cephalosporin Cc oder einer Cephalosporin CA-Verbindung mit einem die funktionelle Gruppe
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enthaltenden Acylierungsmittel, wobei Rl und % die oben angeführte Bedeutung haben, behandelt wird.