CN103451313B - 一种基因芯片的金沉积检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基因芯片的金沉积检测方法，其特征在于所述方法包括将已知的DNA序列点样到微阵列上制备基因芯片，在待测核酸的5’端预先修饰一种生物大分子，以及在纳米金上标记与待测核酸上修饰分子匹配的另一生物大分子构建纳米金复合探针，然后将修饰好的待测核酸和标记好的所述纳米金复合探针与所述基因芯片混合，孵育，洗去未反应的所述纳米金复合探针，加入双氧水金增强反应液观察。本发明提供的基因芯片的金沉积检测方法最大的特点及优点为：灵敏度高，检测方便，操作简便，耗时短，成本低，目视化检测，检测及信号读取设备依赖程度低。

Description

一种基因芯片的金沉积检测方法

技术领域

本发明涉及生物芯片检测技术领域，更具体地涉及一种基因芯片的金沉积检测方法。

背景技术

微阵列是利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的生物样品有序地固化在硅衬底或玻璃上构成，利用微阵列可以快速地获取或处理大量的生命信息。基于微阵列的信号标记通常采用荧光标记检测法，而荧光试剂价格昂贵、生物分子自身荧光干扰、荧光衰减以及读取所用仪器价格昂贵等缺点，也大大限制了其在医学临床诊断方面的应用。ZL01113298.1提供了一种简单快速、低成本的基因芯片检测技术，该技术采用裸眼或者普通的光学扫描仪分析记录实验结果，摆脱了基因芯片技术对昂贵的荧光检测设备的依赖，为基因芯片的推广应用起到了巨大的推动作用。但是由于膜转印步骤的特殊需要，难以实现芯片上多样品检测，因此开发更为直观便捷的目视化检测技术仍然具有重大意义，仍然是本领域技术人员所想往的方法。

随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的成就。纳米材料具有传统材料所不具备的特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。作为标记材料而广泛应用于免疫检测中的纳米金颗粒对生物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合，因而在生物医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳米金颗粒具有高电子密度的特性，在纳米金颗粒结合处，在显微镜下可见褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而广泛应用于定性或半定量的快速检测方法中，但是这类检测技术的最大缺点是灵敏度低，检测蛋白的灵敏度为ng/ml，对微量生物分子检测无能为力（免疫标记技术的进展及纳米技术在其中的应用，贾春平等，生命科学，第20卷，第5期，第749-753页）。此外，这类检测方法大部分适用于试纸条或膜为固相载体的检测体系中，对于以玻璃等为固相载体的微阵列上的微米甚至纳米级的检测点来说，不经过进一步的信号放大，一般显微镜尤其肉眼根本是检测不到的，通常需要经过银染放大后才肉眼可见（CN02113147一种基因芯片的纳米金标记银染检测法）。但是，由于银染试剂毒性大，且光敏感性强，难以保存，限制了试剂盒开发及其在广大基层单位、医院等单位的发展。本发明就是在基于以上的需求提出的。

本申请的发明人多年来从事生物芯片技术的研究，并开发了一系列基于纳米金生物探针的生物芯片检测技术（201010156014.4，纳米复合探针及其用于基因芯片膜转印的检测方法；201110211260.X，一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法）。本发明是在原有技术的基础上进一步开发，发明了一种新型的基于金沉积技术的基因芯片检测方法。

本发明是在原有技术的基础上，进一步改进沉积检测***，开发了一种新型的基于金沉积技术的基因芯片检测方法，该方法利用双氧水的氧化还原作用，将***中的金离子还原成金原子，并以纳米金为核，在纳米金表面沉积，使特异性结合在芯片表面的纳米金信号得到级联放大。该方法与原有方法比，试剂稳定性更高，检测速度更快，检测背景更低，检测灵敏度及特异性更高，检测成本更低，具有明显的先进性及创新性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因芯片的金沉积检测方法，无需特殊仪器设备即可完成可目视化生物芯片检测，该方法基于纳米金生物复合探针、微阵列及纳米金增强原理，可对蛋白，核酸（DNA、RNA、miRNA等）等生物大分子进行快速检测。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种基因芯片的金沉积检测方法，所述方法包括：将已知的DNA序列点样到微阵列上制备基因芯片，在待测核酸的5’端预先修饰一种生物大分子，以及在纳米金上标记与待测核酸上修饰分子匹配的另一生物大分子构建纳米金复合探针，然后将修饰好的待测核酸和标记好的所述纳米金复合探针与所述基因芯片混合，孵育，洗去未反应的所述纳米金复合探针，加入双氧水金增强反应液观察。

所述双氧水金增强反应液的组成为：次氯金酸HAuCl·3H₂O1～100mM、双氧水0.5～4M，明胶1～10%（质量）。

优选为：次氯金酸HAuCl·3H₂O10mM、双氧水1.5M，明胶4%（质量）。

在待测核酸的5’端上预先修饰的生物大分子包括：核酸序列、生物素、地高辛或荧光素中的一种。

在纳米金上标记的与待测核酸上修饰分子匹配的另一生物大分子包括：核酸序列、链亲合素、抗地高辛抗体或抗荧光素抗体中的一种。

纳米金上标记核酸序列时，所述核酸序列为两种长度的DNA探针GP1和GP2，且GP1的碱基长度比GP2长10个碱基以上。

当纳米金的尺寸为5～40nm时，GP1与GP2的比例在1∶4～1∶30之间。

优选地，具体的检测步骤为：1）采用芯片点样仪将5’端氨基修饰的DNA探针点阵于醛基化修饰芯片表面制备基因芯片，置于密闭空间固定，所述DNA探针序列为：分枝杆菌通用探针：5’-NH₂-ggactgagatacggcc-3’；结核分枝杆菌探针：5’-NH₂-cacgggatgcatgtct-3’；龟分枝杆菌探针：5’-NH₂-ccacacacttcatggtga-3’；胞内分枝杆菌探针：5’-NH₂-gacctttaggcgcatg-3’；2）PCR扩增获得标记有生物素的DNA分子，其中，引物的序列为：16s1：5’-Biotin-gataagc(c/t)tgggaaactg-3’；16s2：5’-Biotin-tgcctcccgtaggagtctgg-3’；3）通过K₂CO₃将纳米金溶液调pH值至pH6，加入链亲和素溶液，混匀，再加入聚乙二醇溶液，离心，洗去未标记上的链亲和素，制得标记有链亲合素的纳米金复合探针；4）取所述步骤2）中制备的经过标记的DNA分子，滴于所述步骤1）中制备的基因芯片的点样区，杂交，洗去未杂交的DNA分子，然后将所述步骤3）中制备的标记好的纳米金复合探针滴于芯片点样区，反应30～60min，洗液清洗去除未反应的纳米金复合探针；5）将双氧水金增强反应液滴在点阵区，室温静置，肉眼或显微镜下观察。

所述步骤2）中还包括采用纳米金重悬液重悬标记好的核酸纳米金生物复合探针，所述纳米金重悬液的组成为：牛血清白蛋白0.25～10%（质量）、聚乙烯吡咯酮0.1～1%（质量）、蔗糖1.5～10%（质量）、聚乙二醇0.01～1%（质量）、吐温0.2～1%（质量）。

本发明的基因芯片的金沉积检测法是基于固相分子杂交的反应原理，即将已知DNA序列固定在玻璃基片上，相继加入待测核酸或待测核酸的PCR扩增产物（待测核酸的5’端事先修饰特定核酸序列或生物素、地高辛、荧光素等分子）和经过纳米金标记的与待测核酸上修饰分子匹配的另一生物大分子（核酸、链亲和素、抗地高辛抗体、抗荧光素抗体等），从而形成最后的杂交复合物，形成的结构可以表示为（以生物素修饰为例）：基片-DNA-待测序列-生物素-链亲和素-纳米金，如图1和图2所示。

纳米金金沉积作用是利用了金离子可以在还原剂作用下还原成金原子，并以纳米金为核，在纳米金表面沉积的原理，使特异性结合在芯片表面的纳米金信号得到放大的过程。

金离子可以在还原剂作用下还原成金原子，基于这个原理的应用，多数是用于纳米金的制作、在一些纳米粒子表面形成金壳结构或在一些器件表面形成金金属层从而进行表面改性、SERS（表面增强拉曼光谱Surfaceenhancedramanspectroscopy）等技术基片的基底层制作等等，而作为一种信号检测方法，尤其是用于基因和蛋白芯片的目视化检测方面的报道未见，以前都是用银染的方法（原理是在纳米金表面沉积金属银），然而银染的方法弊端很多，相比较来说，信号弱，背景大，试剂稳定性差，需要现配现用，因此结果重复性差等。

金离子的还原剂有很多，强还原剂一般包括硼氢化物、水合肼、氢气、四丁基硼氢化物等，这类还原剂具有很强的还原能力，反应速率很快；弱还原剂包括柠檬酸钠、酒石酸钾、胺类化合物、葡萄糖、抗坏血酸、次亚磷酸钠和亚磷酸钠、醇类化合物、醛类化合物、双氧水、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。强还原剂反应速度快，到达反应终点速度快，信号放大能力反而不强，而且背景大，条件控制比较难；弱还原剂反应速度慢，条件可控，但是太慢信号相应也太弱，反应时间长也容易产生非特异性的信号。申请人对多种还原剂进行了比较，发现双氧水、羟胺、柠檬酸钠的效果都比较好。其中效果最好的是双氧水。

本发明提供的基因芯片的金沉积检测方法最大的特点及优点为：灵敏度高，检测方便，操作简便，耗时短，成本低，目视化检测，检测及信号读取设备依赖程度低。

（1）背景信号低，检测灵敏度高

本发明提供的测试方法主要是基于纳米金生物复合探针及纳米金增强技术的信号检测技术，只有当待测分子存在时，纳米金探针才会结合在芯片上，纳米金与芯片的非特异性结合明显低于化学分子（荧光信号分子、蛋白及其他生物分子）；金沉积作用是以纳米金为核进行的，因此只有纳米金存在的地方，才会发生进一步的信号级联放大作用，没有纳米金的地方则不会有信号，背景信号很低，提高了信噪比，从而提高了检测灵敏度。

（2）试剂稳定，成本低

本发明利用纳米金沉积作用进行显色检测，可以用价格相对低廉的化学试剂替换掉常规显色方法中的酶联免疫试剂，包括酶和响应的底物，而且这些试剂的储存条件与酶相比要求较低，试剂的稳定性更强，提高了试剂盒的稳定性及使用时效。

（3）操作简便，耗时短

本发明提供的测定方法从检测标本开始，只需要1-1.5h的时间，就可以得到检测结果；另外，本技术操作步骤少，操作方便、简单，适于临床大批量标本的快速检测。

（4）目视化的检测，信号读取对大型仪器设备的依赖程度低

本发明提供的检测方法，信号强，背景低，信号肉眼可见，因此可肉眼分析结果进行定性检测，也可采用普通光学扫描仪、普通光学显微镜接普通CCD（电荷耦合元件，harge-coupledDevice）图像传感器、电脑读取、储存并通过软件分析试验结果的灰度值，进行半定量的检测，使检测方法易于推广。

本发明相对现有技术的创造性主要在于：通过金沉积技术实现了对基因芯片进行可目视化检测，克服了现有的荧光标记检测法，银染检测法以及膜转印技术的各种缺陷，提供了一种灵敏度高，操作简便，耗时短，成本低的基因芯片的金沉积检测方法。

附图说明

图1是基于核酸互补配对反应的纳米金增强基因芯片检测法的流程示意图，A为纳米复合探针构建，B为芯片检测流程；

图2是基于蛋白免疫反应的纳米金增强基因芯片检测法的流程示意图，A为纳米复合探针构建，B为基于地高辛-抗地高辛抗体检测***的芯片检测流程，C为基于生物素-链亲和素检测***的芯片检测流程；

图3是基于双氧水还原的金沉积基因芯片检测法检测结核分枝杆菌的结果，A为双氧水法纳米金沉积染色6min，B为羟胺法纳米金沉积染色10min，C为银染10min。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1：基于双氧水还原与基于羟胺还原以及银染法的基因芯片的金沉积检测法检测结核分枝杆菌的结果比较

1.芯片制备

采用芯片点样仪将氨基修饰探针（探针序列见表1）点阵于醛基化修饰芯片表面，点阵好的芯片置于相对湿度为75％、温度为30℃的密闭空间固定24～48小时。

表1核酸探针序列表

注：Biotin：生物素；NH2：氨基，所有序列均由Takara公司合成

2.纳米金复合探针制备

用0.1mol/LK₂CO₃将纳米金溶液（20μl/ml）调pH值至pH6，加入1/10体积的链亲和素溶液（60μg/ml）（浓度通过纳米金蛋白稳定性实验确定）。室温条件下混匀20min～2h，再加入一定浓度的聚乙二醇（0.1%～20%（质量，下同）），4℃过夜，离心，洗去未标记上的链亲和素，用纳米金重悬液（牛血清白蛋白BSA0.25～10%、聚乙烯吡咯酮PVP0.1～1%、蔗糖1.5～10%、聚乙二醇PEG0.01～1%、吐温Tween200.2～1%）重悬标记好的纳米金复合探针，置4℃保存备用。

3.PCR扩增并标记待检测核酸

引物合成时5’端修饰生物素分子，如表1所示，用修饰好的引物扩增，从而标记待测核酸标本。

PCR反应总体系为15μl，其中双蒸水8μl，10×PCR缓冲液1.5μl，1.5mmol/LMgcl₂溶液1μl，10mMdNTP1μl，10μM16S1、16S2各0.75μl，模板DNA1μl，TaqDNA聚合酶1μl（Takara，1.25U）。反应参数：94℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，30s，30个循环；72℃延伸10min。置于DNA热循环仪上进行PCR反应。取PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

4.杂交

取PCR扩增产物1μl，变性后与9μl杂交液（EasyHyb，购自Roche公司）混合，滴于芯片点样区，54℃杂交30min，洗液清洗去除未杂交的DNA分子，然后将纳米金复合探针用反应液Ⅰ稀释，滴于芯片点样区，室温反应30-60min，洗液清洗去除未反应的纳米复合探针。

反应液Ⅰ：PBS缓冲液，含0.1～1%BSA（1～5%脱脂奶粉），0.01～0.1%Tween20，用于蛋白纳米金复合探针。

5.显色

上述杂交反应结束后，将两种金增强反应液平行对照滴在点阵区，盐酸羟胺显色法室温静置10min，双氧水显色法室温静置5min，银染增强法室温避光静置10min，然后用超纯水清洗，肉眼观测或显微镜下用CCD图像传感器拍照。

其中，双氧水金增强反应液的组成为：次氯金酸（HAuCl·3H₂O）10mM、双氧水（H₂O₂）1.5M，明胶4%（质量/体积）。

羟胺金增强反应液的组成为：次氯金酸HAuCl·3H₂O10mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl10mM、明胶4%（质量/体积）。

银增强液的组成为:硝酸银AgNO₃42.8mM、氢醌C₆H₆O₂0.37M、柠檬酸三钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O0.19M（含柠檬酸C₆H₈O₇0.32M）。

6.结果分析

三种不同的纳米金增强液分别进行染色和比较，结果如图3所示，其中A为双氧水法纳米金沉积染色6min，B为羟胺法纳米金沉积染色10min，C为银染10min。可见，检测同一结核分枝杆菌标本，本发明提供的双氧水金沉积检测法与羟胺金沉积检测法和银染增强法相比，显色时间短，且显色结果信号强，信噪比高；羟胺金沉积检测法次之，银染增强信号弱，且容易受杂交液中SDS等杂质干扰，背景强且不稳定。

经过实验摸索，当双氧水金增强反应液的组成为：次氯金酸HAuCl·3H₂O1～100mM、双氧水0.5～4M，明胶1～10%时，均能实现本发明的技术效果，此处不再赘述。

上述实施例中所使用的双氧水金增强反应液和羟胺金增强反应液均为预先配置母液，低温储存，使用前按一定比例混合即可。

而银增强反应液中，仅硝酸银可预先配制母液，低温储存，而氢醌和柠檬酸三钠溶液必须使用前现配现用。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (5)

1.一种基因芯片的金沉积检测方法，所述的方法包括将已知的DNA序列点样到微阵列上制备基因芯片，在待测核酸的5’端预先修饰一种生物大分子，以及在纳米金上标记与待测核酸上修饰分子匹配的另一生物大分子构建纳米金复合探针，然后将修饰好的待测核酸和标记好的所述纳米金复合探针与所述基因芯片混合，孵育，洗去未反应的所述纳米金复合探针，加入双氧水金增强反应液观察，其特征在于，具体的检测步骤为：

①采用芯片点样仪将5’端氨基修饰的DNA探针点阵于醛基化修饰芯片表面制备基因芯片，置于密闭空间固定，所述DNA探针序列为：

分枝杆菌通用探针：5’-NH₂-ggactgagatacggcc-3’；

结核分枝杆菌探针：5’-NH₂-cacgggatgcatgtct-3’；

龟分枝杆菌探针：5’-NH₂-ccacacacttcatggtga-3’；

胞内分枝杆菌探针：5’-NH₂-gacctttaggcgcatg-3’；

②PCR扩增获得标记有生物素的DNA分子，其中，引物的序列为：

16s1：5’-Biotin-gataagcytgggaaactg-3’,其中y代表c/t；

16s2：5’-Biotin-tgcctcccgtaggagtctgg-3’；

③通过K₂CO₃将纳米金溶液调pH值至6，加入链亲和素溶液，混匀，再加入聚乙二醇溶液，离心，洗去未标记上的链亲和素，制得标记有链亲合素的纳米金复合探针；

④取所述步骤②中制备的经过标记的DNA分子，滴于所述步骤①中制备的基因芯片的点样区，杂交，洗去未杂交的DNA分子，然后将所述步骤③中制备的标记好的纳米金复合探针滴于芯片点样区，反应30～60min，洗液清洗去除未反应的纳米金复合探针；

⑤将双氧水金增强反应液滴在点阵区，室温静置，肉眼或显微镜下观察；所述的双氧水金增强反应液的组成为次氯金酸1～100mM、双氧水0.5～4M和质量百分数为1～10％的明胶。

2.根据权利要求1所述的金沉积检测方法，其特征在于，所述步骤③中还包括采用纳米金重悬液重悬标记有链亲合素的纳米金复合探针，所述纳米金重悬液的组成为：牛血清白蛋白0.25～10％、聚乙烯吡咯酮0.1～1％、蔗糖1.5～10％、聚乙二醇0.01～1％、吐温0.2～1％，以上组成均为质量百分数。

3.根据权利要求1所述的金沉积检测方法，其特征在于，所述双氧水金增强反应液的组成为：次氯金酸10mM、双氧水1.5M和质量百分数为4％的明胶。

4.根据权利要求1所述的金沉积检测方法，其特征在于，纳米金上标记核酸序列时，所述核酸序列为两种长度的DNA探针GP1和GP2，且GP1的碱基长度比GP2长10个碱基以上。

5.根据权利要求4所述的金沉积检测方法，其特征在于，当纳米金的尺寸为5～40nm时，GP1与GP2的比例在1∶4～1∶30之间。