CN112538539A - 用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒及*** - Google Patents

用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒及*** Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒及***，该试剂盒包括用于检测分子标志物的试剂，其中，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点、acpM C177T位点中的至少一种。通过识别上述分子标志物，本公开能够实现鸟分枝杆菌的精确检测。

Description

用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒及***
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒、用于检测分子标志物的试剂在制备用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒中的用途以及用于鸟分枝杆菌检测的***。
背景技术
非结核分枝杆菌(Non-tuberculous Mycobacterium，NTM)是指除结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis(Mtb)complex)和麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)以外的分枝杆菌，广泛存在于自然环境中。约三分之一的NTM可引起动物或人感染，例如堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌等。
NTM感染常见于结构性肺部疾病患者，感染人体后，NTM多侵犯患者肺组织，导致支气管和肺泡组织发生进行性破坏，引起与肺结核相似的症状，影响患者的呼吸功能，严重时可造成宿主死亡。近年来，NTM感染率逐年上升，且多个研究表明NTM可在人与人之间传染，因此，及时且准确地进行NTM检测，具有重要的社会和临床价值。
相关技术中，NTM检测多依赖于靶基因测序和质谱检测，其中，常见的靶基因有16SrRNA、16S-23S rRNA基因间隔区(ITS)、RNA聚合酶β亚基(rpoB)、热休克蛋白65(hsp65)和DNA解旋酶(gyrA/gyrB)的编码基因、sodA基因、recA基因等基因。
然而，在实现本公开的过程中，发明人发现现有NTM检测技术的分辨率较低，无法准确分辨亲缘关系较近的NTM菌种。
发明内容
本公开的目的是解决现有NTM检测技术中存在的分辨率较低的问题，提供一种能够精确检测鸟分枝杆菌的试剂盒及***。
为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒，该试剂盒包括用于检测分子标志物的试剂，其中，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点中的至少一种。
可选地，所述用于检测分子标志物的试剂包括能够特异性扩增所述分子标志物的引物对，和/或，能够与所述分子标志物特异性杂交的探针。
可选地，所述引物对包括SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10和SEQ ID NO:11～12所示引物中的至少一对。
第二方面，本公开提供用于检测分子标志物的试剂在制备用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒中的用途，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点中的至少一种。
可选地，所述用于检测分子标志物的试剂，包括能够特异性扩增所述分子标志物的引物对，和/或，能够与所述分子标志物特异性杂交的探针。
可选地，所述引物对包括SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10和SEQ ID NO:11～12所示引物中的至少一对。
第三方面，本公开提供用于鸟分枝杆菌检测的***，该***包括测序装置、计算装置和输出装置；
所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；
所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：
若所述总核酸序列中含有nikA基因序列、ddpC基因序列、yejF基因序列、rrlG2368T位点序列、rrl T3066A位点序列和acpM C177T位点序列中的至少一种，则判定所述待测样本中存在鸟分枝杆菌；
所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。
可选地，所述***还包括核酸提取装置，所述核酸提取装置用于对所述待测样本进行核酸提取，得到所述待测样本的总核酸。
可选地，所述核酸提取装置包括核酸提取仪和/或核酸提取试剂盒。
可选地，所述测序装置包括Sanger测序平台、Illumina Novaseq、HiSeq Xten、HiSeq 2500/2000/4000测序平台中的至少一种。
通过上述技术方案，本公开通过识别nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点等分子标志物，能够至少部分地实现鸟分枝杆菌的精确检测。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒，该试剂盒包括用于检测分子标志物的试剂，其中，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrlG2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点中的至少一种。
本公开发明人发现，鸟分枝杆菌中存在区别于其它非结核分枝杆菌或结核分枝杆菌的专属分子标志物，分别是nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点，通过检测这些分子标志物，能够准确区分鸟分枝杆菌与其它非结核分枝杆菌或结核分枝杆菌，从而至少部分地实现鸟分枝杆菌的精确检测。
具体地，上述各分子标志物的基因编号如表1所示。
表1
分子标志物 基因编号
nikA基因 2718029
ddpC基因 2720266
yejF基因 2720026
rrl G2368T位点 2700466
rrl T3066A位点 2700466
acpM C177T位点 15609381
根据本公开，所述用于检测分子标志物的试剂可以在一定的范围内选择，例如，所述用于检测分子标志物的试剂可以包括能够特异性扩增所述分子标志物的引物对，和/或，能够与所述分子标志物特异性杂交的探针。
根据本公开，所述引物对和所述探针可以在一定的范围内选择，满足上述要求的引物对和探针均可用于本公开。作为本公开的一个优选实施例，所述引物对可以包括SEQID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10和SEQID NO:11～12所示引物中的至少一对。
其中，上述各引物对的靶分子标志物及核苷酸序列如表2所示。
表2
Figure BDA0002800945270000041
Figure BDA0002800945270000051
本公开的第二方面提供用于检测分子标志物的试剂在制备用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒中的用途，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点中的至少一种。
可选地，所述用于检测分子标志物的试剂，可以包括能够特异性扩增所述分子标志物的引物对，和/或，能够与所述分子标志物特异性杂交的探针。
可选地，所述引物对可以包括SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10和SEQ ID NO:11～12所示引物中的至少一对。
本公开的第三方面提供用于鸟分枝杆菌检测的***，该***包括测序装置、计算装置和输出装置；所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：若所述总核酸序列中含有nikA基因序列、ddpC基因序列、yejF基因序列、rrl G2368T位点序列、rrl T3066A位点序列和acpM C177T位点序列中的至少一种，则判定所述待测样本中存在鸟分枝杆菌；所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。
可选地，所述***还可以包括核酸提取装置，所述核酸提取装置用于对所述待测样本进行核酸提取，得到所述待测样本的总核酸。
可选地，所述核酸提取装置可以包括核酸提取仪和/或核酸提取试剂盒。
可选地，所述测序装置例如可以是二代测序装置，例如，所述测序装置可以包括Sanger测序平台、Illumina Novaseq、HiSeq Xten、HiSeq2500/2000/4000测序平台中的至少一种。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
实施例1
本实施例用于说明本公开提供的用于鸟分枝杆菌检测的生物标志物的确定。
收集81株具有完整基因组的NTM菌株，作为发现组，其中包括7株堪萨斯分枝杆菌、27株鸟分枝杆菌、6株胞内分枝杆菌、5株龟分枝杆菌和36株脓肿分枝杆菌。
另外，收集384株具有原始测序reads的NTM菌株，作为第一验证组，其中包括14株堪萨斯分枝杆菌、111株鸟分枝杆菌、26株胞内分枝杆菌、33株龟分枝杆菌和200株脓肿分枝杆菌。
对发现组的基因组数据进行比较基因组学分析，确定27株鸟分枝杆菌的基因组中区别于其它NTM菌株基因组的区别基因和区别SNPs位点，分别为nikA基因、ddpC基因、yejF基因、moxC基因、hldE基因、ino1 G832A位点、clpB G2124C位点、rrl G447A位点、rrl T455A位点、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点、Rv1461 G2133A位点、acpM C177T位点、Rv2402G570C位点、rpsK C90G位点和pks13 G672C位点。
针对上述区别基因和区别SNPs位点，在第一验证组中进行χ2检验和随机森林预测模型分析，从上述区别基因和区别SNPs位点中，筛选出鸟分枝杆菌的基因组中区别于其它NTM菌株基因组的特定基因和特定SNPs位点，分别为nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrlG2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点，将上述特定基因和特定SNPs位点作为用于鸟分枝杆菌检测的生物标志物。
实施例2
本实施例用于验证本公开提供的生物标志物对鸟分枝杆菌的检测效果。
收集164株具有原始测序reads的NTM菌株，作为第二验证组，其中包括6株堪萨斯分枝杆菌、48株鸟分枝杆菌、11株胞内分枝杆菌、14株龟分枝杆菌和85株脓肿分枝杆菌。
利用核酸提取试剂盒分别对上述五种分枝杆菌进行总核酸提取，得到各分枝杆菌的总核酸。然后对上述得到的各分枝杆菌的总核酸进行二代测序，得到各分枝杆菌的总核酸序列。
基于实施例1确定出的分子标志物中的至少部分，判断上述各分支杆菌的总核酸序列中是否存在相应的分子标志物序列，并将含有相应分子标志物序列的分枝杆菌判定为鸟分枝杆菌，得到检测结果。其中，每次检测时所针对的分子标志物如表3所示。
表3
Figure BDA0002800945270000071
针对检测1～9的检测结果，分别进行ROC分析，确定每次检测的特异性、灵敏度和AUC值，结果如表4所示。
表4
检测 灵敏度 特异性 AUC
检测1 0.987 0.997 0.992
检测2 0.987 0.995 0.991
检测3 0.887 0.992 0.942
检测4 0.987 0.995 0.991
检测5 0.987 0.995 0.991
检测6 0.987 0.995 0.991
检测7 0.717 0.995 0.856
检测8 0.635 0.997 0.816
检测9 0.692 0.995 0.843
由表4可知，基于本公开提供的生物标志物，能够实现鸟分枝杆菌的精确检测。
对比例1
分别将moxC基因、hldE基因、ino1 G832A位点、clpB G2124C位点、rrl G447A位点、rrl T455A位点、Rv1461 G2133A位点、Rv2402 G570C位点、rpsK C90G位点和pks13 G672C位点作为分子标志物，判断实施例2中得到的各分枝杆菌的总核酸序列中是否存在上述各分子标志物的序列，并将含有上述各分子标志物的序列的分枝杆菌判定为鸟分枝杆菌，得到检测结果。
针对各检测结果，分别进行ROC分析，确定每次检测的特异性、灵敏度和AUC值，结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002800945270000081
Figure BDA0002800945270000091
由表5可知，本对比例中涉及的各分子标志物针对鸟分枝杆菌的检测精度不如公开实施例中涉及的各分子标志物。
对比例2
将Hsp65基因的序列中自5’端起第184位(SNP1)、241位(SNP2)、299位(SNP3)、346位(SNP4)的碱基突变共同作为检测位点，并对实施例2中得到的各分枝杆菌的总核酸序列中的Hsp65基因序列进行判断，当SNP1为C、SNP2为G、SNP3为T、SNP4为C时，判定对应的分枝杆菌为鸟分枝杆菌，得到检测结果。
针对上述检测结果进行ROC分析，确定上述检测的特异性、灵敏度和AUC值，结果如表6所示。
表6
检测 灵敏度 特异性 AUC
检测20 0.503 0.995 0.749
由表6可以看出，本对比例中涉及的检测位点针对鸟分枝杆菌的检测精度不如公开实施例中涉及的各分子标志物。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒及***
<130> 17947PUMC
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aactacagcg ccaacaacct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgacgattg actgctggag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcgaaacc cgttgaagg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggatcaccg acaggacgac 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttcgggcaa aacgacttt 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgagacgaa cagataggtc a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgaagtcgca agacgatgta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtcaagctc ccttgtgcat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcaagcagg gacgaaagtc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggttagcac cagttcccta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcctgtcac tcaggaagaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggggttctcc gactcaatct 20

Claims (10)

1.用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于检测分子标志物的试剂，其中，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrlT3066A位点和acpM C177T位点中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测分子标志物的试剂包括能够特异性扩增所述分子标志物的引物对，和/或，能够与所述分子标志物特异性杂交的探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对包括SEQ ID NO:1～2、SEQID NO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10和SEQ ID NO:11～12所示引物中的至少一对。
4.用于检测分子标志物的试剂在制备用于鸟分枝杆菌检测的试剂盒中的用途，其特征在于，所述分子标志物包括nikA基因、ddpC基因、yejF基因、rrl G2368T位点、rrl T3066A位点和acpM C177T位点中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用于检测分子标志物的试剂，包括能够特异性扩增所述分子标志物的引物对，和/或，能够与所述分子标志物特异性杂交的探针。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述引物对包括SEQ ID NO:1～2、SEQ IDNO:3～4、SEQ ID NO:5～6、SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10和SEQ ID NO:11～12所示引物中的至少一对。
7.用于鸟分枝杆菌检测的***，其特征在于，该***包括测序装置、计算装置和输出装置；
所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；
所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：
若所述总核酸序列中含有nikA基因序列、ddpC基因序列、yejF基因序列、rrl G2368T位点序列、rrl T3066A位点序列和acpM C177T位点序列中的至少一种，则判定所述待测样本中存在鸟分枝杆菌；
所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。
8.根据权利要求7所述的***，其特征在于，所述***还包括核酸提取装置，所述核酸提取装置用于对所述待测样本进行核酸提取，得到所述待测样本的总核酸。
9.根据权利要求8所述的***，其特征在于，所述核酸提取装置包括核酸提取仪和/或核酸提取试剂盒。
10.根据权利要求7～9中任意一项所述的***，其特征在于，所述测序装置包括Sanger测序平台、Illumina Novaseq、HiSeq Xten、HiSeq 2500/2000/4000测序平台中的至少一种。
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Citations (4)

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