DE102011118949B3

DE102011118949B3 - Kombiniertes Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis von Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und von atypischen Pneumonie-Erregern

Info

Publication number: DE102011118949B3
Application number: DE102011118949A
Authority: DE
Inventors: Christina Wolkowicz; Christian Aepinus; Andreas Podbielski
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: UNIVERSITAET ROSTOCK, DE; WOLKOWICZ, CHRISTINA, DE
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-10-25
Anticipated expiration: 2031-11-17

Abstract

Bei einem kombinierten Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis von Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und der atypischen Pneumonie-Erreger Chlomydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila und Legionella spp. wird das Verfahren auf der Basis einer Real-Time-PCR unter Verwendung von markierten Sonden durchgeführt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein kombiniertes Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis von Tuberkulose- und atypischen Pneumonie-Erregern sowie einen Testkit, Primer und Hybridisierungssonden für die Durchführung des Verfahrens.
Erkrankungen der Lunge sind für ein erhebliches Maß an Morbidität und Mortalität bei Kindern und Erwachsenen verantwortlich. Global spielen dabei Pneumonien und Tuberkulose als Infektionserkrankungen eine zentrale Rolle.
In der klinischen Praxis wird die Diagnose von Pneumonien auf der Basis verschiedener Parameter erstellt. Die Diagnose basiert im Wesentlichen auf den Details der klinischen Symptomatik sowie auf den Ergebnissen aus bildgebenden Verfahren und Laboruntersuchungen. Eine daraus abgeleitete adäquate Therapie kann zur raschen klinischen Besserung führen und dabei die Hospitalisierungszeit und Behandlungskosten deutlich vermindern.
Die meisten pulmonalen Infektionen werden außerhalb von Krankenhäusern erworben. Etwa 24% der außerhalb von Kliniken erworbenen Pneumonien werden von sogenannten atypischen Pneumonie-Erregern wie Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae und Legionella-Spezies (insb. Legionella pneumophila) verursacht. Die hiervon verursachten Pneumonien werden auch als atypische Pneumonien bezeichnet.
Tuberkulose wird durch Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes (MTK) verursacht. Nach WHO-Angaben stehen Infektionen durch diese Bakterien weltweit an der achten Stelle der häufigsten Todesursachen. Tuberkulose ist eine wichtige Differenzialdiagnose für atypische Pneumonien.
Herkömmlicherweise erfolgt der Nachweis dieser Erreger durch serologische Untersuchungen und durch selektive Kultur der Erreger. Dies ist jedoch zum Teil mit einer nicht befriedigenden Empfindlichkeit der Tests verbunden. Zudem sind für diese Nachweisverfahren sehr aufwändige Laborausstattungen erforderlich. Besonders nachteilig ist der große Zeitaufwand für die selektive Kultivierung der Erreger. Bis eine sichere Diagnose gestellt werden kann, vergehen in der Regel mehrere Tage, die nicht für eine gezielte Therapie genutzt werden können. Dies kann für den Patienten sehr schwerwiegende Folgen haben. Eine zeitgerechte Diagnostik bei diesen Erregern ist also schwierig. Eine Diskriminierung zwischen den einzelnen atypischen Pneumonie-Erregern aufgrund des klinischen Bildes ist nahezu unmöglich. Die klinische Symptomatik korreliert ggf. auch nicht mit einer Erregerlast. Eine Diagnose der Tuberkulose ist oftmals anhand von Röntgenaufnahmen des Thorax möglich. Doch im Einzelfall ist auch hier eine Abgrenzung von anderen pulmonalen Erkrankungen allein aufgrund des Röntgenbildes sehr schwierig. Dennoch ist die Diagnose einer Infektion mit Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes eine sehr wichtige Differenzialdiagnose bei allen respiratorischen Erkrankungen. Um eine sichere Diagnose stellen zu können, ist es daher in der Regel erforderlich, eine kulturelle Anzucht der Erreger durchzuführen, die mit einem erheblichen Zeitaufwand und den daraus für den Patienten resultierenden Nachteilen einhergeht. Andere Verfahren, Urintests, Antigentests etc. werden ebenfalls durchgeführt, sind aber gleichfalls suboptimal.
Die vorliegende Erfindung stellt sich demgegenüber die Aufgabe, ein sensitives, sicheres und schnelles Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis der genannten Erreger bereitzustellen. Hierdurch soll eine kurzfristige Diagnose ermöglicht werden, um so zeitnah möglich mit einer gezielten, in der Regel antibiotischen Therapie beginnen zu können. Eine schnelle adäquate Therapie kann zur raschen klinischen Besserung führen und dabei die Hospitalisierungszeit und Behandlungskosten deutlich vermindern.
Diese Aufgabe wird durch ein kombiniertes, differentialdiagnostisches Verfahren zum Nachweis der Erreger gelöst, wie es Gegenstand des Anspruchs 1 ist. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sowie ein entsprechender Testkit, die Verwendung des Testkits und geeignete Primer und Hybridisierungssonden ergeben sich aus den weiteren Ansprüchen.
Das erfindungsgemäße differentialdiagnostische Nachweisverfahren für Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes (MTK) und der atypischen Pneumonie-Erreger Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila und Legionella spp. basiert auf der Durchführung einer Real-Time-PCR unter Verwendung von markierten Sonden.
Bereits Anfang der 90er Jahre wurden die ersten PCR-Techniken (Polymerase Chain Reaction) zum direkten Nachweis erregerspezifischer DNA entwickelt, die seither die mikrobiologische Diagnostik revolutioniert haben. Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein hochsensitives in-vitro-Verfahren zur selektiven Vervielfältigung definierter DNA- oder RNA-Abschnitte. Der repetitive Durchlauf in beispielsweise 20–40 Zyklen führt zur exponentiellen Amplifikation, d. h. Vervielfältigung der DNA. Hierbei wird die doppelsträngige DNA zunächst durch Hitze denaturiert. Anschließend erfolgt bei einer niedrigeren Temperatur (Annealing) die Anlagerung von spezifischen Oligonukleotieden (Primer) an komplementäre Regionen der Matrix-DNA. Schließlich erfolgt die Extension oder Elongation bei einer etwas höheren Temperatur, wobei eine Polymerisation von dNTPs entlang der DNA-Matrize mit Hilfe des temperaturstabilen Enzyms Taq-DNA-Polymerase stattfindet. Auf diese Weise können hochspezifische Genregionen beispielsweise einer bestimmten mikrobiellen Familie, Gattung oder Spezies nachgewiesen werden.
Die Produkte der Nukleinsäureamplifikation können entweder nach Ablauf der PCR oder simultan zur Entstehung mittels des sogenannten Real-Time-Verfahrens nachgewiesen werden. Hierbei unterscheidet sich die Real-Time-PCR (RT-PCR) von einfachen PCRs durch die quantitative Erfassung der entstandenen Amplikon-Menge noch während des PCR-Prozesses. Dies wird beispielsweise durch die Verwendung geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe und eines optischen Detektionssystems mit entsprechender Software, welche die Auswertung der während der Amplifikation gewonnenen Messergebnisse ermöglicht, realisiert. Neben dem Vorteil der Quantifizierbarkeit zeichnen sich RT-PCR-Verfahren durch eine sehr rasche Durchführbarkeit aus. Die Detektion der PCR-Produkte kann innerhalb der Reaktionsgefäße erfolgen. Es ist also insbesondere keine weitere Auftrennung der Reaktionsprodukte, beispielsweise durch Elektrophoresegele erforderlich. Das Kontaminationsrisiko und die damit einhergehende Verfälschung von Ergebnissen sind also im Vergleich mit einer herkömmlichen PCR geringer. Dies wiederum verbessert die Qualität des Real-Time-Verfahrens.
Diese Vorteile der Real-Time-PCR nutzt die vorliegende Erfindung, um einen sehr schnellen, sensitiven und sicheren differentiellen Nachweis der verschiedenen genannten Erreger von pulmonalen Erkrankungen durchführen zu können. Hierbei kombiniert das erfindungsgemäße Verfahren das RT-PCR-Verfahren für die einzelnen Erreger in der Weise, dass die spezifischen Reaktionsbedingungen für die einzelnen Nachweisverfahren derart aneinander angeglichen und angepasst werden, dass die einzelnen Verfahren in kombinierter Weise mit einer minimalen Anzahl von Reaktionsansätzen zeitgleich durchgeführt und simultan analysiert werden können. Diese Kombination der Reaktionen erfordert ein sehr gründliche Auswahl und Anpassung der verschiedenen Parameter für die einzelnen Nachweise, damit die Kombination der Nachweise nicht mit einem Verlust an Sensitivität und Spezifität einhergeht. Mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren können MTK-Bakterien und die in der klinischen Praxis wichtigsten atypischen respiratorischen Erregern Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. und Legionella pneumophila sehr schnell und sicher nachgewiesen werden. Bezüglich der Legionellen kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zwischen Legionella spp. und Legionella pneumophila unterschieden werden, indem ein Nachweis für Legionellen allgemein und ein Einzelnachweis speziell für Legionella pneumophila durchgeführt wird. Es sind zwar bereits auf PCR-Reaktionen basierende Nachweise für einzelne atypische Pneumonie-Erreger bekannt. Allerdings existiert bisher noch kein Verfahren, mit dem zum Einen MTK-Bakterien und zum Anderen neben dem Nachweis von Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae simultan zwischen Legionella spp. und Legionella pneumophila differenziert werden kann.
Die Zusammenlegung der Erregernachweise in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist insbesondere aus den folgenden Gründen sinnvoll und vorteilhaft: Zunächst handelt es sich um Erreger mit denselben Zielstrukturen, insbesondere dem Respirationstrakt. Die erfindungsgemäß nachweisbaren Erreger spielen eine große Rolle bei nosokomialen Infektionen und Epidemien. Die Diagnostik hat hierbei weitreichende Konsequenzen für die Therapie und die Einleitung hygienischer Maßnahmen. Die bisherige ätiologische Differenzierung bei den durch diese Erreger verursachten Erkrankungen ist von klinischer und labortechnischer Seite her schwierig. Dabei gehören sie zu den häufigsten für eine mikrobiologische Diagnostik angeforderten Erregern und die Nachweisanforderung beinhaltet oft alle drei atypischen Erreger. Durch die Zellwandbeschaffenheit oder den Metabolismus der Erreger ist der Nachweis mit herkömmlichen Methoden sehr aufwändig, Speziallaboratorien vorbehalten oder wegen langer Replikationszeiten nicht zeitgerecht möglich. Sofern die Erreger mittels kulturgebundener Methoden nachgewiesen werden, ist dies wegen der Spezialnährböden oder des Sicherheitsstandards sehr aufwendig, gehört nicht in die Routine eines diagnostischen Standardlabors und ist wegen langer Replikationszeiten nicht zeitgerecht möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis dieser Erreger bietet demgegenüber erhebliche Vorteile. Vor allem ist das erfindungsgemäße kombinierte Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis der Erreger sehr schnell, mit hoher Sensitivität und Sicherheit durchführbar und verhältnismäßig kostengünstig. Es kann mittel- und langfristig bisherige routinediagnostische Nachweise ersetzen und/oder ergänzen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für die RT-PCR Fluoreszenzsonden eingesetzt. Der Einsatz von fluorogenen Sonden hat beispielsweise gegenüber radioaktiven Sonden große Vorteile im Hinblick auf die Handhabbarkeit und die Geschwindigkeit bei der Durchführung des Verfahrens. In besonders bevorzugter Weise werden Sonden vom TaqMan^®-Typ verwendet. TaqMan^®-Sonden sind in besonderer Weise zum spezifischen Nachweis definierter Gensequenzen geeignet. Diese an sich bekannten Sonden sind komplementär zum gesuchten Genort konzipierte DNA-Sonden, die am 5'-Ende einen fluoreszierenden Reporterfarbstoff aufweisen und am 3'-Ende einen Phosphatrest sowie einen Fluoreszenzunterdrückenden Farbstoff, den Quencher, tragen. Dieser blockiert durch seine räumliche Nähe zum Reporterfarbstoff selbst bei optimaler Anregung dessen Fluoreszenzsignal (Fluoreszenz-Energietransfer-Effekt, FET-Effekt), solange die Sonde intakt ist. Kann die Sonde im Verlauf der PCR jedoch an die Erreger-DNA-Matrize hybridisieren, führt das Zusammentreffen mit der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase während der Extension zur Ausbildung einer räumlichen Sekundärstruktur. Dies aktiviert das Enzym und es kommt zur Hydrolyse durch die 5'-3'-Exonuklease-Eigenschaft der thermostabilen DNA-Taq-Polymerase. Der Reporterfarbstoff wird durch die Lyse der Sonde räumlich vom unterdrückenden Quencher getrennt, der FET-Effekt aufgehoben und der Reporterfarbstoff fluoresziert. Eine ungenügende Anlagerung der Sonde an die DNA (z. B. durch Inhibitoren) bzw. Abweichungen in der Sequenz führen nicht bzw. nur unzureichend zum Signal. Mit jedem Zyklus steigt die Menge der vervielfältigten DNA und damit steigt auch die Menge der potentiellen Hybridisierungsorte für die Sonde, sodass die Sonde vermehrt lysiert wird und die Intensität der Fluoreszenz linear ansteigt.
Es können jedoch auch andere Sonden, insbesondere andere fluorogene Sonden für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann das sogenannte SYBR-Green I eingesetzt werden. Hierbei handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der unspezifisch zum Nachweis doppelsträngiger DNA geeignet ist. Eine Unterscheidung von Amplifikaten und Primerdimeren kann dann beispielsweise durch eine Schmelzkurvenanalyse erfolgen.
Weitere geeignete Sonden für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise sogenannte Molecular-Beacon-Sonden oder Scorpion-Primer. Die Molecular-Beacon-Sonden stellen eine weiterentwickelte Form der bereits erläuterten TaqMan^®-Sonden dar. Sie bilden eine dreidimensionale Haarnadelstruktur aus, bei der Fluoreszenzfarbstoff und Quencher unmittelbar benachbart liegen. Dieser Zustand minimiert die unvollständige Fluoreszenzunterdrückung. Bei den Scorpion-Primern ist am 5'-Ende eine Nukleinsäure-Sequenz mit Fluoreszenzfarbstoff und Quencher angehängt. Aufgrund ihrer räumlichen Haarnadelstruktur wird diese während der Amplifikation jedoch nicht komplementär ergänzt. Erst im Verlauf der Elongation entsteht eine Strangkopie, die an die Verlängerung hybridisiert und diese aktiviert, indem der Fluoreszenzfarbstoff und der Quencher voneinander getrennt werden.
Vorzugsweise ist in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren eine Kontrolle enthalten, um den ordnungsgemäßen Ablauf der Reaktion zu verifizieren. Insbesondere kann hierdurch kontrolliert werden, ob die PCR-Reaktion inhibiert ist. Vorteilhafterweise wird als Kontrolle ein Nachweis des humanen β-Globins (SEQ ID NO 5) durchgeführt. Das humane β-Globin lässt sich hochspezifisch und sehr sensitiv mittels RT-PCR nachweisen, Da das erfindungsgemäße Verfahren vor allem zur Analyse von humanem Material vorgesehen ist, ist das β-Globin in jedem Fall in den Proben vorhanden. Im Umkehrschluss kann auch gesagt werden: da β-Globin in allen humanen Sekreten und Präparaten enthalten ist, ist es für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Der Nachweis von β-Globin als Kontrolle ist darüber hinaus für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet, da die hierfür erforderliche PCR-Reaktion sich sehr gut mit den PCR-Reaktionen für die nachzuweisenden Erreger koppeln lässt. Vorteilhaft ist dabei auch die Kontrolle der Effizienz der DNA-Präparation durch die simultane Erfassung humaner Zellen, die in den zu untersuchenden Materialien typischerweise in ausreichender Menge vorliegen müssen.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Kopplung der verschiedenen PCR-Reaktionen für die einzelnen Erregernachweise. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren daher Duplex-Ansätze, in denen zwei Nachweise in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Dies ist insbesondere durch eine unterschiedliche Markierung der Sonden, also eine Markierung mit verschiedenen Farbstoffen, möglich. Durch die Duplex-Ansätze kann die Anzahl der Reaktionsansätze reduziert werden. So können alle Reaktionen zeitgleich beispielsweise auf einer Reaktionsplatte mit 96 Kavitäten durchgeführt und simultan analysiert werden. Weiterhin ist es auch möglich, mehr als zwei Reaktionen in einem Reaktionsgefäß durchzuführen, wenn die Reaktionsbedingungen und Komponenten der einzelnen PCR-Reaktionen entsprechend aufeinander abgestimmt sind, wobei sich die Duplex-Variante sich in der Praxis am besten bewährt und daher bevorzugt ist Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in zwei oder drei Duplex-Ansätzen durchgeführt. Hierbei werden vorteilhafterweise der Nachweis von Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae und der Nachweis von Legionella pneumophila und Legionella spp. miteinander jeweils in einem Duplex-Ansatz gekoppelt. Der Nachweis der Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und der Nachweis des humanen β-Globin-Gens können ebenfalls in einem Duplex-Ansatz miteinander gekoppelt werden oder auch jeweils separat durchgeführt werden. Die Durchführung als Einfach-Ansatz kann den Vorteil haben, dass hierbei eine Maskierung eines der beiden Signale des Duplex-Ansatzes vermieden werden kann, falls eines der Genprodukte in deutlich höherer Konzentration in der Probe enthalten ist. Die Kopplung von Reaktionsansätzen hat neben einer Verkürzung der Bearbeitungszeit auch den Vorteil, dass Reagenzien und Patientenmaterial eingespart werden können.
Für die unterschiedliche Markierung der Sonden in einem Duplex-Ansatz können als Farbstoffe F beispielsweise die Farbstoffe 6-Carboxyl-Fluorescein (FAM; Exzitation λ_max, 493 nm, Emission λ_max, 515 nm) und Yakima Yellow (YY; Exzitation λ_max 530 nm, Emission λ_max bei 550 nm) eingesetzt werden, deren Fluoreszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen nachweisbar ist. Die Kombination dieser Farbstoffe hat den Vorteil, dass die jeweiligen Fluoreszenzspektren deutlich voneinander abgegrenzt sind, sodass die Farbstoffe sehr gut in einem Duplex-Ansatz einsetzbar sind. Ein weiterer geeigneter Farbstoff ist beispielsweise der Fluoreszenzfarbstoff VIC (Exzitation λmax 538 nm, Emission λmax 554 nm), der statt YY eingesetzt werden kann. Ebenso kann der Succinimidylester des 6-Carboxyfluoresceins eingesetzt werden (Exzitation λmax 495 nm, Emission λmax 517 nm). Weitere geeignete Farbstoffe sind beispielsweise NED, JOE, TET, Cal Fluor Gold 540, HEX, Cal Fluor Orange 560, Cy3, Cy5, Cy5.5, Quasar 570, Cal Fluor Red 590, ROX, Texas Red, Quasar 670 und TAMRA. TAMRA kann ebenfalls als Quencher E Verwendung finden. Weitere geeignete Quencher E sind beispielsweise Block Hole Quenchers (BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), DABCYL, Methylorange oder BlueBerryQuencher (BBQ). Quencher können dementsprechend fluoreszente (z. B. TAMRA) oder nicht-fluoreszente Moleküle sein.
Für eine optimale Performance sollte das Absorbtionsspektrum des Quenchers dem Emmisionsspektrum des Farbstoffs entsprechen. Geeignete Kombinationen sind bekannt.
Der Begriff Farbstoff (F) steht synonym für Fluoreszenzfarbstoff, Fluorophor, Reporterfarbstoff, Fluoreszenzreporter. Der Begriff Quencher (E) steht synonym auch für Quenchermolkül, Quencherfarbstoff.
Die Zielsequenzen für die Amplifikation während der PCR-Reaktion werden vorzugsweise aus den folgenden Genorten ausgewählt: für die Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes das Insertionselement IS6110 (SEQ ID NO 1), für Chlamydophila pneumoniae das ompA-Gen (SEQ ID NO 2), für Mycoplasma pneumoniae das Adhäsin-P1-Gen (SEQ ID NO 3) und für Legionella spp. und Legionella pneumophila das 16S ribosomale DNA-Gen (SEQ ID NO 4). Die Amplifikation der 16S ribosomalen DNA von Legionella spp. und auch von Legionella pneumophila erfolgt vorzugsweise mit dem gleichen Primerpaar. Eine Differenzierung erfolgt durch den Einsatz von spezifischen Sonden, das heißt von einer Sonde für Legionella spp. allgemein und einer spezifischen Sonde nur für Legionella pneumophila.
In besonders bevorzugter Weise werden als Amplifikate, also als zu vervielfältigende Abschnitte der DNA, verhältnismäßig kurze Sequenzen gewählt, insbesondere Sequenzen mit einer Länge von circa 100 bis circa 250 bp. Verhältnismäßig kleine, spezifische Amplifikate haben den Vorteil, dass die Möglichkeit der Interaktion von DNA miteinander geringer ist als bei größeren Amplifikaten. Kleinere Amplifikate erleichtern daher die Abgrenzbarkeit von spezifischen Amplifikaten gegenüber einer Primerdimerbildung. Durch kleinere Amplifikate wird weiterhin die Zyklusdauer im Amplifikationsprozess verkürzt, da entsprechend weniger Zeit für beispielsweise die Elongation benötigt wird. Die Grenze der Amplikongröße nach unten ist allerdings nicht unbeschränkt, da bei zu kurzen Strängen Primer und Sonden interagieren und einander behindern können. Die erfindungsgemäß eingesetzte Amplifikatgröße erlaubt eine hohe Spezifität, die Einbeziehung repräsentativer Genabschnitte und eine optimale Zeitanforderung für den Amplifikationsprozess.
Bevorzugt eingesetzte Primer für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren sind im Folgenden aufgelistet:
Für die Amplifikation der DNA von Legionella pneumophila und Legionella spp. wird jeweils das gleiche Primerpaar eingesetzt. Die Differenzierung erfolgt anhand von spezifischen Sonden, wie bereits oben ausgeführt. Die Sonden sind vorzugsweise mit verschiedenen Farbstoffen markiert, sodass eine simultane Differenzierung zwischen Legionellen-Spezies allgemein und Legionella pneumophila in einem Duplex-Ansatz durchgeführt werden kann. Diese sofortige Diskriminierung ist aufgrund der besonderen Bedeutung von Legionella pneumophila für schwere klinische Verläufe einerseits und der Bedeutung anderer Legionellenarten für außerhalb von Kliniken erworbenen Legionellosen (insbesondere für Immunsupprimierten andererseits besonders vorteilhaft. Eine darüber hinaus gehende exakte Unterscheidung zwischen den einzelnen Legionellen-Spezies spielt für die Klinik, Therapie und den Umgang mit hygienischen Maßnahmen von bzw. mit Legionellosen nur eine untergeordnete Rolle im Vergleich zur Wichtigkeit der prompten Diskriminierung zwischen Legionellen allgemein und Legionella pneumophila, welche durch das erfindungsgemäße Real-Time-PCR-Verfahren sehr vorteilhaft möglich ist.
Bevorzugte fluoreszenzmarkierte Sonden für das erfindungsgemäße Verfahren sind im Folgenden aufgelistet:
Am 5'-Ende sind die Sonden mit einem Fluoreszenzfarbstoff F, insbesondere mit 6-Carboxyfluorescein (6FAM), insbesondere SEQ ID NOs 8, 14, 17, 23, oder mit Yakima Yellow (YY), insbesondere SEQ ID Nos 11 oder 20, markiert. Am 3'-Ende tragen die Sonden ein Quenchermolkül E, insbesondere den sogenannten BlueBerryQuencher (BBQ). In den gezeigten Beispielen für Sonden sind die Sonden, die für einen Duplex-Ansatz vorgesehen sind, vorzugsweise mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen F markiert. Dies ermöglicht eine simultane Fluoreszenzmessung in dem jeweiligen Reaktionsansatz. Die Sonden können jedoch auch mit anderen Farbstoffen F, gegebenenfalls auch in anderen Kombinationen markiert sein (siehe oben).
Die beispielhaft gezeigten Primer und Sonden wurden dahingehend entwickelt und optimiert, dass unter anderem unter Berücksichtigung von deren thermodynamischen Schmelzpunkten eine Angleichung der Amplifikationsbedingungen möglich war, um eine Kopplung der verschiedenen PCR-Reaktionen bei hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu erlauben. Durch die Kopplung der Erregernachweise konnte eine erhebliche Einsparung von Arbeitszeit, Personal und Material ohne Sensitivitätsverlust im Vergleich mit herkömmlichen Methoden erzielt werden. Die Sensitivität, die Spezifität, der positive prädiktive Wert (PPV), der negative prädiktive Wert (NPV), die Reproduzierbarkeit, die Linearität, die Richtigkeit und die Präzision des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden im Zuge der Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, durch umfangreiche Tests und Vergleiche validiert.
Die Erfindung umfasst weiterhin einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei wenigstens eines der beschriebenen Primerpaare und wenigstens eine der beschriebenen Sonden enthalten ist. Darüber hinaus kann der Testkit übliche Pufferlösungen, Salzlösungen, Enzyme und/oder weitere Reagenzien und Reaktionsgefäße enthalten, die für das erfindungsgemäße RT-PCR-Verfahren verwendet werden können. Die Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung des beschriebenen Testkits zum differentialdiagnostischen Nachweis von Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und der atypischen Pneumonie-Erreger Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. und Legionella pneumophila. Bezüglich weiterer Einzelheiten hierzu wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Die Erfindung umfasst darüber hinaus die folgenden Primer, die für eine PCR-Reaktion zum Nachweis der genannten Erregerorganismen und insbesondere für eine Real-Time-PCR in der kombinierten Form geeignet sind:
Schließlich umfasst die Erfindung Hybridisierungssonden mit den folgenden Sequenzen:
Vorzugsweise tragen die Sonden am 5'-Ende einen Reporterfarbstoff (F) und am 3'-Ende einen Quencherfarbstoff (E).
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Ausführungsbeispiele
Material und Methoden
Klinische Proben und Referenzmaterial
Die PCR-Reaktionen wurden mit extrahierten Nukleinsäuren aus klinischen Proben durchgeführt. Die klinischen Proben stammten aus stationären und ambulanten Bereichen eines Universitätsklinikums. Dabei wurden folgende (respiratorische) Materialien von Patienten zur Aufreinigung der Nukleinsäuren verwendet: Bronchialsekret, Bronchio-alveoläre Lavage (BAL), Nasen- und Rachenabstriche, Pleurapunktat, Sputum und Trachealsekret. Als Material bei Tuberkulose-Verdacht wurden zusätzlich folgende Proben verwendet: Punktat (z. B. Aszitis-, Gelenk-, Gewebspunktat), Liquor bei Verdacht auf Meningitis tuberculosa, Magensaft (bei Kindern), Gewebe in Form von Paraffinblöcken (Lymphknoten, Parotis, Bandscheibe, Colon, Ileum), Biopsien (Frischmaterial), EDTA-Blut bei Immunsupprimierten mit Verdacht auf Miliar-Tuberkulose, Menstrualblut, Ejakulat, Prostatasekret und Urin.
Als Referenzmaterial dienten Bakterienstämme von Konsiliar- oder Referenzlaboratorien, aus Patientenkulturen sowie aus Wasserproben (Gewinnung einiger Legionellen-Stämme, GVPC-Agar bei 35°C im CO₂-Brutschrank über 3–7 Tage).
DNA-Extraktion
Aliquots von 1–2 ml Patientenmaterial wurden für ein Zielvolumen von ca. 200 μl für 10 min bei 3000 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Abstriche wurden mit 2–5 ml 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen, mit 3000 × g für 10 min bei 20°C zentrifugiert und der Überstand bis auf 300 μl verworfen. Gewebeproben aus Paraffinblöcken wurden zerkleinert, im Vortex gemischt und nach Entparaffinierung mit Xylol und Isopropanol direkt eingesetzt. Kulturmaterial wurde in 200–400 μl destilliertem Wasser gelöst. Die Dekontamination eines Einsatzvolumens von 200 μl erfolgte durch 20-minütiges Erhitzen im Heizblock bei 95°C, dreimaliges Gefrieren und Auftauen von –196°C auf 100°C und anschließende Zentrifugation bei 3000 × g bei 20°C für 5 mm. Jeweils insgesamt 200 μl des Volumens wurde für die DNA-Extraktion in eine neues Reaktionsgefäß überführt.
Für die Extraktion der DNA wurde der QlAamp-DNA-Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) eingesetzt. Entsprechend der Arbeitsanleitung des Herstellers erfolgte die DNA-Aufreinigung. Im Anschluss wurden die DNA-Pellets mit verschiedenen Waschpuffern gewaschen, in 50 μl Eluationspuffer (10 mM TrisHCl; 0,5 mM EDTA; pH 9,0) resuspendiert und bei –20°C gelagert. Die Reinheit und die Menge der DNA wurden durch UV-Licht-Spektroskopie bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm bestimmt.
Wenn die Anzahl der positiven Patientenproben für die Validierung des Testes nicht ausreichend war (n < 20) wurden negative Patientenproben mit entsprechender DNA versetzt, die aus gereinigter bakterieller oder rekombinanter Plasmid-DNA stammte. Eine 10-fache Verdünnungsreihe mit 10¹–10⁸ Kopien der Plasmid-DNA pro μl TE-Puffer (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8,3) wurde verwendet.
Zur Herstellung der rekombinanten Plasmide wurden Amplifikate mit der gesuchten Zielsequenz für die jeweiligen Erreger kloniert. Als Vektor dienten pCR-II-TOPO-Plasmide (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Nach der Aufreinigung der Plasmide (Qiagen MIDI Kit) und Quantifizierung wurden Verdünnungen zur Einstellung der erforderlichen DNA-Konzentration hergestellt. Für die Extraktion von bakterieller DNA aus Erregerstämmen wurden 10⁹ Bakterien eingesetzt und die DNA entsprechend isoliert.
Alle extrahierten Nukleinsäuren wurden dahingehend getestet, ob PCR-amplifizierbare DNA vorliegt. Hierfür wurden Standardprotokolle zur Vervielfältigung der 165 rDNA eingesetzt. Ein zu erwartendes Amplikon in der entsprechenden Größe wurde durch Standard-Agarose-Gelelektrophorese visualisiert.
Primer und TaqMan^®-Sonden
Die Wahl der Zielregionen der Genorte orientierte sich an etablierten, in jeweils mehreren Publikationen beschriebenen, vollständig sequenzierten Genregionen. Die gewählten Regionen sind hochspezifisch für die jeweiligen Erreger. Die entsprechenden Primer und Sonden wurden, mit Ausnahme des 5'-Legionellen- und des 5'-β-Globin-Primers sowie der β-Globin-Sonde, eigens für das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt und optimiert (Legionellenprimer: Jonas, D., Rosenbaum A., Weyrich S., Bhakdi S. (1995) Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in bronchoalveolar fluid. J Clin Microbiol 33: 1247–1252).
Für den MTK-Nachweis wurde das Insertionselement IS6110 gewählt. Für den Nachweis von Chlamydophila pneumoniae wurde das ompA-Gen eingesetzt. Für den Nachweis von Mycoplasma pneumoniae wurde das Adhäsin-P1-Gen verwendet. Das 16S ribosomale DNA-Gen wurde für den Nachweis von Legionella spp. und Legionella pneumophila eingesetzt. Es liegt genau wie das IS6110-Element in multipler Form im Genom vor und erhöht somit die Sensitivität des Nachweises.
Zur Inhibitionskontrolle wurde ein publiziertes Protokoll von Klaassen et al. 2003 (Klaassen, C. M., et al., Quantification of human DNA in feces as a diagnostic test for the presence of colorectal cancer. Clin Chem, 2003. 49(7): p. 1185–7) modifiziert und integriert. Die Sequenz für den 5'-Primer und die TaqMan^®-Sonde wurden übernommen. Durch die Vergrößerung des Amplikons und die Wahl des 3'-Primers wurde der Nachweis für das erfindungsgemäße Verfahren angepasst und optimiert.
Die verwendeten Primerpaare und Sonden wurden eigens für dieses Detektionssystem konzipiert und hinsichtlich des Temperaturprofils und der Arbeitsbedingungen optimiert (Tabelle 1). Ausnahmen stellen die 5'-Primer für β-Globin und Legionellen und die β-Globin-Sonde dar. Die Entwicklung der TaqMan^®-Sonden wurde durch die Primer-Express-Software (Applied Biosystems (ABI), Foster City, USA) unterstützt.
Bei der Generierung der hochspezifischen und sensitiven Primer erwies sich ein ausgeglichener Guanin/Cytosin- zu Adenin/Thymin-Gehalt als vorteilhaft. Auch eine ähnliche Schmelztemperatur der 5'- und 3'-Primer, die Vermeidung der Bildung von Primerdimeren und die Vermeidung von langen Poly(N)- oder Guanin/Cytosin-Abschnitten insbesondere am 3'-Ende erwies sich als vorteilhaft, da hierdurch die Gefahr eines Mispriming, das heißt einer Fehlpaarung von Primer und Matrize durch Sekundärstrukturen vermieden werden konnte.
Bei der Auswahl der Sonden wurde die relative Entfernung zur Lage der Primer berücksichtigt und mit Vorteil wurden repetitive Sequenzen Vermieden. Vorteilhafterweise lag der Sondenschmelzpunkt der Sonden 8–10°C höher als der Schmelzpunkt der Primer.
Tabelle 1: Primer und Sonden () Amplikongröße in bp
Die Sonden wurden am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzreporter FAM (6-Carboxyfluorescein, ABI) oder YY (Yakima Yello, Epoch Bioscience, Bothell, USA) markiert. Am 3'-Ende wurde das Quenchermolekül BBQ (Black Berry Quencher, Berry & Associates, Dexter, USA) angefügt.
Die Auswahl dieser Fluoreszenzreporter ist besonders vorteilhaft, da die Fluoreszenzspektren der verwendeten Farbstoffe 6-Carboxyl-Fluorescein (FAM; Exzitation λ_max 493 nm, Emission λ_max 515 nm) und Yakima Yellow (YY; Exzitation X_max 530 nm, Emission λ_max 550 nm) relativ weit auseinander liegen und daher simultan in einem Reaktionsansatz gemessen werden können. Da VIC (Exzitation λ_max 538 nm, Emission λ_max 554 nm) (ABI, Foster City, USA) fast dasselbe Fluoreszenzspektrum wie YY hat, kann beispielsweise auch VIC statt statt YY alternativ verwendet werden. Zu den bekanntesten Dark-Quenchern gehören Dabcyl und Methlyorange. Der hier verwendete Dark-Quencher BlueBerryQuencher (BBQ) ist für TaqMan-Sonden besonders gut geeignet, da er zu extrem niedrigen Hintergrundssignalen führt und nicht fluoresziert.
Durchführung der Standard-Real-Time-PCR
Es wurde als Master-Mix der Taq^®-2X-Universal-PCR-Master-Mix-No-AmpErase-UNG (ABI) eingesetzt. Die finalen Konzentrationen in einem Standard-Reaktionsansatz waren 0,4 μM für jeden Primer und 0,13 μM für die TaqMan^®-Sonden. Die Volumen wurden mit Nukleinsäurefreiem Wasser auf 29 μl pro Ansatz aufgefüllt und bis zu 6 μl extrahierte Proben-DNA vor dem PCR-Reaktionsstart zugesetzt. Bei den Duplex-Ansätzen wurde das Gesamtvolumen auf 35 μl erhöht, um von Präparationen des Patientenmaterials, insbesondere bei Liquor und Gewebe, ausreichend große Volumina einsetzen zu können (bis zu 6 μl).
Die Reaktionen wurden vorzugsweise in einer 96-Kavitäten-Mikrotiterplatten durchgeführt, wobei alle RT-PCR-Reaktionen auf einer Platte parallel und simultan erfolgen konnten. Auf einer 96-Kavitäten-Platte konnten beispielsweise maximal 20 Patientenproben inkl. Kontrollen bei sechs zu unterscheidenden Parametern oder 87 Einzelnachweise eines Parameters (inkl. Positiv-/Negativkontrollen mit Standardkurven) untersucht werden.
Als Standardprotokoll wurden nach 10 min anfänglicher Denaturierung bei 95°C 40 Zyklen mit 10 s Denaturierung (95°C), 15 s Annealing (60°C) und 40 s Elongation ((72°C) durchgeführt (StepOnePlus-Instrument, Applied Biosystems). Die Fluorochrome-Emission wurde während der Elongation gemessen. Insgesamt betrug die Laufzeit der PCR-Reaktion 75 mm. Um die Ergebnisse zu bestätigen, wurden positive Patientenproben zum Teil sequenziert.
Durch die geeignete Auswahl der Zielsequenzen, und durch die Entwicklung der Primer und Sonden unter Berücksichtigung verschiedener Aspekte konnten die Reaktionsbedingungen so aneinander angepasst werden, dass für alle Nachweise bei dem gleichen Temperaturprofil optimale Ergebnisse zustande kamen und somit eine simultane Durchführung aller Nachweise in einem Gerätelauf möglich war.
Vergleich mit herkömmlichen Protokollen
Die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens wurden mit etablierten Nachweisverfahren verglichen, insbesondere mit selektiven Kulturverfahren, anderen PCR-Protokollen zum Nachweis der Erreger, Antikörper-basierten Nachweisverfahren und serologischen Untersuchungen. Insbesondere wurden die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit herkömmlichen PCR-Systemen aus der Routinediagnostik verglichen. Für MTK-Bakterien wurde herkömmlicherweise ein PCR-Protokoll mit anschließender Hybridisierung verwendet. Außerdem wurden sämtliche Patientenproben mit dem Goldstandard Kultur verglichen. Der Chlamydien-Nachweis erfolgte durch ein Nested-PCR-Protokoll und der Mykoplasmen-Nachweis ebenfalls durch ein Nested-PCR-Protokoll. Für den allgemeinen Legionellen- und den Legionella pneumophila-Nachweis wurde ein PCR- und Hybridisierungsverfahren verwendet. Die Überprüfung der Referenzstämme erfolgte durch ein 16S-Protokoll (Medlin, L., et al., The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene, 1988. 71(2): p. 491–9).
Ergebnisse
Validierung und Qualitätsparameter
Alle Tests wurden einer intensiven internen und externen Validierung unterzogen. Hierbei wurden keine Kreuzreaktionen mit 109 allgemeinen Besiedlern oder Pathogenen des Respirationstraktes festgestellt. Im Einzelnen wurden für MTK-Bakterien 79 andere Bakterien oder Pilze getestet, einschließlich 19 nicht-tuberkulöse Mycobacteria spp., zwei Nocardia spp. und drei Actinomyces spp.. Weiterhin wurde keine Kreuzreaktion mit Chlamydophila pneumoniae (71 Arten einschließlich C. psittaci- und C. trachomatis-Isolaten) und mit Mycoplasma pneumoniae (70 Arten einschließlich M. hominis-, M. genitalium- und M. hyorhinis-Isolaten), mit Pan-Legionella (81 Arten einschließlich 17 nicht-pneumophila Legionellae und drei L. pneumophila-Stämme von verschiedenen Serogruppen) und mit einer L. pneumophila-spezifischen Probe (81 Arten, 19 Legionella spp., einschließlich drei L. pneumophila-Stämmen von verschiedenen Serotypen und L. micdadei).
Auch eine externe Validierung wurde erfolgreich durchgeführt, wobei alle Erreger-Spezies über vier Jahre korrekt identifiziert wurden.
Für die MTK-Bakterien wurden alle klinischen Proben (n = 966) mit dem gegenwärtigen Goldstandard, das heißt mit einer spezifischen Kultur verglichen. Von 101 RT-PCR positiven Ergebnissen wurden 96 durch Kultur bestätigt. Zwei der fünf falschpositiven Proben zeigten nur schwache Signale und waren vermutlich während der Probenaufbereitung kontaminiert worden. Die anderen drei positiven RT-PCR Ergebnisse gehörten zu Material von Patienten, die eine frühere Tuberkulose-Infektion aufwiesen, jedoch keine akuten MTC-spezifischen Symptome zeigten.
Alle RT-PCR negativen Proben waren ebenfalls im MTK-Kulturtest negativ, einschließlich 24 Proben von verschiedenen nicht-tuberkulösen Mycobacteria spp. und ähnlichen Bakterien. Alle im Kulturtest positiven Proben wurden auch im erfindungsgemäßen RT-PCR-Verfahren detektiert.
Die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Nachweises der atypischen Pneumonie-Erreger wurden mit etablierten in-house PCR-Protokollen verglichen. Alle klinischen Proben, die mit dem in-house PCR-Protokoll und gegebenenfalls durch Kultur negativ getestet wurden, ergaben auch im erfindungsgemäßen RT-PCR-Verfahren ein negatives Ergebnis (C. pneumoniae (n = 238), M. pneumoniae (n = 242), Legionella spp. (n = 278) und L. pneumophila (n = 309) mit Ausnahme von zwei Legionella pneumophila Proben mit dringlichem Verdacht auf Kontamination. Die Anzahl der richtig positive Patientenproben pro Pathogen während des Validierungsprozesses war folgendermaßen: 96 für MTK-Bakterien, zehn für L. pneumophila und simultan für Legionella spp., null für C. pneumoniae und neun für M. pneumoniae. Die Anzahl der durch Anreicherung mit entsprechender DNA positive Proben war n = 28 für C. pneumoniae, n = 35 für M. pneumoniae, n = 91 für Legionella spp. und n = 39 für L. pneumophila.
Alle Proben, die mit dem in-house PCR-Verfahren positiv im Hinblick auf die atypischen Pneumonie-Erreger getestet wurden, wurden auch mit dem erfindungsgemäßen RT-PCR-Verfahren positiv getestet mit Ausnahme von einer Legionella pneumophila Probe.
Die interne Prüfung erfolgte auf der Grundlage einer internen Validierungsanleitung für qualitative In-House-Tests. So erfolgte die Messung der Sensitivität anhand von mindestens zehn bekannt positiven und mindestens 10 bekannt schwach positiven bzw. grenzwertigen Proben. Zur Überprüfung der Spezifität gehörte die Testung von mindestens 20 bekannt negativen Proben inklusive potentiell kreuzreaktiver Analyte.
Entsprechend wurde für jeden der folgenden Nachweise a) MTK-Komplex, b) C. pneumoniae – M. pneumoniae, c) Legionella spp. – L. pneumophila die geforderte Anzahl an Proben getestet, bei b) und c) jeweils 40 negative Proben. Zur Gewährung kontinuierlich grenzwertiger Proben wurden auch hier mit Referenzstamm-DNA versehene negative Patientenproben verwendet.
Bei der Berechnung der Sensitivität und Spezifität wurden außerdem während der Entwicklung der Nachweise getestete bekannte Proben berücksichtigt, um einen bestmöglichen Überblick mit repräsentativ großen Zahlen zu gewährleisten.
Für den Nachweis von MTK-Bakterien stand mit der Kultur als Goldstandard die maßgebliche Detektionstechnik zur Verfügung. Von allen 966 Patientenproben wurden parallel zum Nukleinsäurenachweis Mykobakterien-Kulturen angelegt.
Für den Nachweis von C.-pneumoniae- und M.-pneumoniae-DNA wurden alle mit rekombinanten Plasmiden versetzten Patientenproben mit der RT-PCR und einem zuvor etablierten Nested-PCR-Verfahren verglichen. Dabei waren die Ergebnisse aller Proben bei beiden Verfahren für beide Erreger-DNA-Nachweise identisch.
Das vergleichende Verfahren für Legionellen umfasst ein PCR-Verfahren mit anschließender Überprüfung im Elektrophoresegel.

Tabelle 2 fasst die Versuchsergebnisse der Sensitivitäts- und Spezifitätsmessungen zusammen. In die Werte gingen alle Untersuchungen mit „modifizierten” Patientenmaterialien, echten Patientenproben, Materialien aus Ringversuchen und Kulturmaterialien von Stammsammlungsisolaten mit ein. Die Angaben spiegeln die erwarteten Ergebnisse wider, nur in Ausnahmefällen kam es zu falsch positiven oder falsch negativen Testungen.

Erreger-nachweis	Tatsächlicher Sachverhalt (alle Proben) korrekt nicht korrekt		Vergleichsmethode	Sensitivität in%	Spezifität in%	PPV	NP V
M. tuberculosis			Kultur	100	99,4	0,9	1,0
						7
Test positiv	96	5
Test negativ	0	865
C. pneumoniae			Nested-PCR [1]	100	100	1,0	1,0
Test positiv	28	0
Test negativ	0	238
M. pneumoniae			Nested-PCR [2]	100	100	1,0	1,0
Test posit iv	39	0
Test negativ	0	242
Legionella spp.			DEIA [3]	98.82	99.29	0,9	0,9
						9	9
Test positiv	84	1
Test negativ	2	278
L. pneumophila			DEIA [3]	96.30	99.68	0,9	0,9
						8	9
Test positiv	52	1
Test negativ	2	309

Tabelle 2: Sensitivität und Spezifität

[1] Tong, C. Y. und M. Sillis, Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR. J Clin Pathol, 1993. 46(4): p. 313–7.
[2] Talkington, D. F., et al., Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in autopsy and openlung biopsy tissues by nested PCR. J Clin Microbiol, 1998. 36(4): p. 1151–3.
[3] Jonas, D., et al., Enzyme-linked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in bronchoalveolar fluid. J Clin Microbiol, 1995. 33(5): p. 1247–52.

Für MTK-Bakterien ergab eine Analyse der Daten eine spezifische Sensitivität von 100%, eine Spezifität von 99,4%, einen positiven prädikativen Wert (pvv) von 0,97 und einen negativen prädikativen Wert (npv) von 1,0. Eine Analyse der Daten für die atypischen Pneumonie-Erreger ergab die folgenden Ergebnisse für Sensitivität/Spezifität/PPV/NPV: C. pneumoniae 100%/100%/1,0/1,0; M. pneumoniae 100%/100%/1,0/1,0; Legionella spp. 98.82%/99.29%/0,99/0,99; L. pneumophila 96.30%/99,68%/0,98/0,99.
Für das Nachweispaar Legionella pneumophila (FAM) und Legionella spp. (YY) wurden die gleichen Amplifikations-Primerpaare eingesetzt. Die Spezifität des Nachweises beruhte auf spezifischen Sonden. Der Vergleich von Monoplex- und Duplex-Ansätzen ergab keine Unterschiede im Hinblick auf Sensitivität oder Spezifität.
Anhand der Steigung der Regressionsgerade in der Standardkurve einer 10-fachen Verdünnungsreihe wurde die Effizienz jeder einzelnen RT-PCR des erfindungsgemäßen Verfahrens errechnet. Die durchschnittlichen Effizienzen waren folgendermaßen: 95.09 ± 196% (Korrelationskoeffizient r = 0.99) für M. tuberculosis, 87.62 ± 8.15% (r = 0.99) für C. pneumoniae, 96.31 ± 5.35% (r = 0.99) für M. pneumoniae, 101.34 ± 8.08% für Legionella species (r = 0.99) und 97.62 ± 3.87% für L. pneumophila.
Die folgende Tabelle 3 fasst verschiedene statistische Daten bei der Auswertung der Ergebnisse zusammen. Aus den Daten der Tabelle 3 wird deutlich, dass je nach nachzuweisender Nukleinsäure Unterschiede innerhalb eines (Intra-) und zwischen verschiedenen (Inter-)Tests (Assays) auftreten können. So waren Schwankungen zwischen 0,1 und 1,85 Zyklen möglich. In der Bilanz jedoch verhielten sich die Mittelwertabweichungen in der Gesamtberechnung von Intra- und Interassay fast gleich und waren mit durchschnittlich 0,27 Zyklen minimal. Diese Aussage gilt auch für die Korrelationskoeffizienten der Verdünnungsreihen. Im Einzelfall betrug die Streuung 0,9–10,6%, im Schnitt waren es 5,9%. Die Untersuchung zeigt, dass die Nachweise den Anforderungen gut gerecht werden.
Tabelle 3: Bestimmung der Präzision der verschiedenen Nukleinsäurenachweise
Weiterhin wurde die Nachweisgrenze überprüft. Hierzu wurden Verdünnungsreihen von 0,1 fg/μl bis 1 ng/μl verwendet. In mehrfacher Wiederholung wurde diejenige Probe bestimmt, bei der konstant noch ein C_t ≤ 38 Zyklen zu finden war. Die Festlegung von C_t 38 war eine subjektive Festlegung, die sich im Verlauf als gutes Qualitätskriterium erwies.
Die Nachweisgrenze der RT-PCR für MTK-Bakterien von rekombinanter Plasmid-DNA lag bei 0,6–6 fg, was äquivalent zum Nachweis von ca. 1–60 Mykobakterien pro Reaktion war. Abhängig von der Subspezies liegt das Insertionselement IS6110 im Genom von M. tuberculosis-Stämmen variabel in 1–20 Kopien vor, während M. bovis-Stämme nach Literaturangaben nur 1–3 Kopien besitzen. Die Sensitivität für den Nachweis von β-Globin liegt bei ca. 80 Kopien und entspricht circa 40 humanen Zellen.
Bei der gekoppelten Nachweisreaktion für C. pneumoniae- und M. pneumoniae-DNA lag das Detektionslimit jeweils bei 0,6–6 fg. Für Mykoplasmen ist dies äquivalent zu circa 10 Bakterien und erreicht damit nahezu dieselbe Sensitivität wie bekannte Nested-PCR-Protokolle. Das Ziel-Gen für den Legionellen-Nachweis, das 165-rDNA-Gen, lag bei diesen Bakterien in sechs bis acht Kopien pro Genom vor. Damit entsprach eine detektierbare Kopienzahl von 60–600 dem Nachweis von 10–100 Organismen pro Reaktion (Tabelle 4).
Tabelle 4: Nachweisgrenzen der spezifischen RT-PCR SEQUENCE LISTING

Claims

Kombiniertes Verfahren zum differentialdiagnostischen Nachweis von Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und der atypischen Pneumonie-Erreger Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. und Legionella pneumophila, wobei das Verfahren auf der Basis einer Real-Time-PCR unter Verwendung von markierten Sonden durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Real-Time-PCR Fluoreszenzsonden, insbesondere Sonden vom TaqMan^®-Typ eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Kontrolle ein Nachweis des humanen β-Globin-Gens (SEQ ID NO 5) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für den Nachweis der Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes ein Einfach-Ansatz oder ein Duplex-Ansatz zusammen mit einem Nachweis des humanen β-Globin-Gens, für den Nachweis von Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae ein Duplex-Ansatz und für den Nachweis von Legionella spp. und Legionella pneumophila ein Duplex-Ansatz durchgeführt werden und die Detektion der Nachweise vorzugsweise simultan erfolgt, wobei die Sonden in den Duplex-Ansätzen jeweils mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Farbstoffe 6-Carboxyl-Fluorescein und Yakima Yellow sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielregionen für die Amplifikation der DNA aus folgenden Genorten ausgewählt sind: – für Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes das Insertionselement IS6110 (SEQ ID NO 1), – für Chlamydophila pneumoniae das ompA-Gen (SEQ ID NO 2), – für Mycoplasma pneumoniae das Adhäsin-P1-Gen (SEQ ID NO 3) und – für Legionella ssp. und Legionella pneumophila das 16S ribosomale DNA-Gen (SEQ ID NO 4), wobei die Zielregionen vorzugsweise Sequenzen mit einer Länge von circa 100 bis circa 250 bp sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Primer für die Real-Time-PCR folgende Sequenzen eingesetzt werden:
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Sonden eingesetzt werden:
stehen.
Testkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Primerpaare nach Anspruch 7 und/oder wenigstens eine Sonde nach Anspruch 8 enthalten ist.
Verwendung eines Testkits gemäß Anspruch 9 zum differentialdiagnostischen Nachweis von Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes und der atypischen Pneumonie-Erreger Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. und Legionella pneumophila.
Primer für eine PCR-Reaktion, durch wenigstens eine der folgenden Sequenzen gekennzeichnet:
Hybridisierungssonde, durch wenigstens eine der folgenden Sequenzen gekennzeichnet:
wobei vorzugsweise das 5'-Ende der Sonde einen Reporterfarbstoff und das 3'-Ende einen Quencherfarbstoff trägt.