KR101413659B1 - 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의초기 농도를 결정하는 방법 - Google Patents

실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의초기 농도를 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 방법으로서, (a) 표적 핵산을 증폭하여 증폭 산물로부터 신호를 측정하는 단계; (b) 상기 신호로부터 증폭 시간에 따른 상기 표적 핵산의 증폭 효율을 얻고, 그로부터 증폭 시간에 대한 증폭 효율의 함수를 생성하는 단계로서, 상기 함수는 증폭 시간에 대한 상기 증폭 효율의 기하 평균 값으로 구성되는 함수인 것인 단계; (c) 상기 함수로부터 상기 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 증폭 시간을 계산하는 단계; 및 (d) 상기 계산된 증폭 시간으로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 단계로서, 상기 결정은 농도를 알고 있는 표적 핵산에 대하여 (a) 내지 (c) 단계를 반복하여 얻어진 표준 곡선 (standard curve)에 상기 증폭 시간을 대입하여 이루어지는 것인 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
Figure R1020070126378
증폭 효율의 함수, 증폭 효율의 기하 평균의 함수

Description

실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 방법{Method of determining initial concentration of nucleic acids in a sample using a real time amplification data}
본 발명은 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 방법에 관한 것이다.
핵산을 검출하고 정량화하기 위한 다양한 분석 방법들 중에서, PCR은 가장 널리 쓰이는 방법으로 미국특허공보 제4,683,195호 및 제4,683,202호에 그 원리가 개시되어 있다.
기존의 PCR은 단지-종말점 (end-point)에서 전기영동을 이용하여 증폭된 DNA의 정성적인 결과만을 보여주는 것으로서 DNA의 정량적 검출 정확성 등에 많은 문제점을 가지고 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 형광 염료 (fluorescent dye) 및 광학적 검출시스템을 이용하여 증폭된 DNA의 농도에 비례하는 형광 신호의 세기를 실시간으로 검출함으로써 DNA의 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 (real-time) PCR이 개발되었다.
핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 정량화하는 종래의 방법으로 미 국특허 제6,303,305호 및 제6,503,720호가 있다. 여기서는, 핵산을 증폭하고 증폭의 각 사이클에서의 핵산 증폭 양을 나타내는 함수를 구한 다음 그 함수를 n차 미분하여 그 결과로부터 핵산의 초기 농도를 구하는 방법을 제공한다. 미국특허 제6,303,305호는 미분의 최대값 (maximum value)을 Ct (threshold cycle)로 하는 정량분석 방법, 제6,503,720호는 미분의 최대값 (maximum vlaue), 최소값 (minimun value), 영 값 (zero value)을 Ct로 하는 정량분석 방법을 개시한다.
또한, 핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 정량화하는 종래의 다른 방법으로 미국특허공개번호 제2002-0031768호가 있다. 여기서는, 미분의 특정 값을 이용하여 핵산의 농도를 정량화하는 방법을 제공한다.
또한, 미국특허공개 제20060047443호 (대응 한국특허공개 제2006-0045671호)에는 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 핵산의 초기 농도를 구하는 방법에 있어서 핵산의 증폭 양과 증폭 사이클 사이의 상관 관계에 대한 수학적 모델을 기초로 미분을 사용하지 않고 배경 형광 신호를 제외한 최대 형광 신호의 세기의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간, 최대 증폭 효율에 해당하는 증폭 사이클 수 또는 증폭 시간, 배경 형광 신호를 제외한 핵산의 증폭 전 형광 신호의 세기로부터 핵산의 초기 농도를 구하는 방법이 개시되어 있다. 미국특허공개 제20060047443호에 개시된 내용은 원용에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되어 진다.
그러나, 이러한 선행기술에 의하더라도 증폭 시간에 따른 증폭 효율의 함수로부터 시료 중의 초기 농도를 결정하기 위한 효율적인 방법이 여전히 요구되고 있 다.
본 발명의 목적은 증폭 시간에 따른 증폭 효율의 함수로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하기 위한 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 방법으로서, (a) 표적 핵산을 증폭하여 증폭 산물로부터 신호를 측정하는 단계; (b) 상기 신호로부터 증폭 시간에 따른 상기 표적 핵산의 증폭 효율을 얻고, 그로부터 증폭 시간에 대한 증폭 효율의 함수를 생성하는 단계로서, 상기 함수는 증폭 시간에 대한 상기 증폭 효율의 기하 평균 값으로 구성되는 함수인 것인 단계; (c) 상기 함수로부터 상기 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 증폭 시간을 계산하는 단계; 및 (d) 상기 계산된 증폭 시간으로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 단계로서, 상기 결정은 농도를 알고 있는 표적 핵산에 대하여 (a) 내지 (c) 단계를 반복하여 얻어진 표준 곡선 (standard curve)에 상기 증폭 시간을 대입하여 이루어지는 것인 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 (a) 표적 핵산을 증폭하여 증폭 산물로부터 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 증폭은 PCR, RT-PCR, 네스티드 (nested) PCR, LCR 등의 열적 사이클 (thermal cycle)을 필요로 하는 핵산 증폭 방법이나, SDA, NASBA, TMA, RCA 등의 등온 (isothermal) 핵산 증폭 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, PCR이다. 핵산이란 DNA, RNA 뿐만 아니라 PNA와 같은 이들의 유사체 (analog)를 포함한다. 상기 증폭방법은 당업자에게 잘 이해되고 있다.
상기 신호는 형광 신호, 전기적 신호 및 방사선 신호로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광신호는 예를 들면, 형광 표지된 혼성화 프로브 (hybridization probe), 예를 들면, FRET 혼성화 프로브, 분자 비이컨 (molecular beacon), 또는 두 성분으로 표지된 프로브로서, 한 성분은 빛에 의하여 여기되고 다른 성분은 여기된 빛을 흡수하는 것 (quencher)인 프로브에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 신호는 DNA 결합 염료 또는 인터컬레이팅 염료 (intercalating dye)에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 DNA 결합 염료는 빛으로 여기된 후 이중가닥 핵산과 반응하여 형광 신호를 발광한다. 전기적 신호를 측정하는 방법에는 예를 들면, 미국특허 제7,135,294호에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, (b) 상기 신호로부터 시간에 따른 상기 표적 핵산의 증폭 효율을 얻고, 그로부터 시간에 대한 증폭 효율의 함수를 생성하는 단계로서, 상기 함수는 시간에 대한 상기 증폭 효율의 기하 평균 값으로 구성되는 함수인 것인 단계를 포함한다.
상기 시간은 증폭 개시 시작으로부터 경과된 시간을 말하는 것으로, 사이클 수로 표시될 수도 있다. 따라서, 본 명세서 및 청구항에 있어서, 시간은 사이클 수로 치환가능하게 사용된다.
상기 증폭 효율은 하기 식 1로 표시되는 것일 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00001
(식 1)
식 중 En은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율이고, Rn -1은 (n-1) 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rn은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, n은 2보다 큰 정수이다.
상기 증폭 효율은 하기 식 2로 표시되는 것일 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00002
(식 2)
식 중 En은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율이고, Rn -1은 (n-1) 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rn은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rb는 0이 아닌 상수이고, n은 2보다 큰 정수이다.
식 2에 있어서, 상기 Rb는 초기 신호값, 제1 증폭 사이클에서의 증폭 신호값, 및 (d) 식 2의 함수로부터 증폭 효율의 최대값이 1이 되도록 하는 값으로부터 선택되는 것일 수 있다.
식 2에서, Rb의 값이 0이면서 증폭에 따른 형광 신호 세기의 최소값 (Rmin)이 0인 경우는 그래프의 모양이 매우 뾰족하고 날카로울 수 있다. 또한, Rb의 값이 0인 경우 최대 증폭 효율이 나타나는 시점은 일정하나 Rb의 값이 0이 아닌 경우보다는 최대 증폭 효율이 나타나는 시점이 빠르고 최대 증폭 효율의 값 또한 일정하지 않을 수 있다.
이에 반해, Rb의 값이 0이 아닌 경우에는 최대 증폭 효율이 나타나는 시점 및 최대 증폭 효율의 값이 보다 일정할 수 있다.
이하에서, 먼저, Rb의 값으로 사용가능한 상수에 대해 살펴본 후, Rb의 값을 고려한 경우의 향상된 점들에 대해서 살펴본다.
첫째, 핵산의 증폭량에 따른 형광 신호의 세기와 증폭 사이클 수와의 상관 관계의 실험 데이터를 곡선 맞춤 (curve fitting)하여 얻은 시그모이달 (sigmoidal) 모델 (하기 식 13)을 통해 산출한 배경 형광 신호의 세기 ((Rb)sigmoidal)를 Rb의 값으로 사용할 수 있다.
둘째, 증폭 사이클에 따른 형광 신호의 세기가 초기에 0이 아닌 값으로부터 출발하여 0으로 줄어들다가 다시 증가하는 경우, 초기 형광 신호의 세기 (증폭 사이클 = 0 인 경우) 값을 실험적으로 측정하여 Rb의 값으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 만약 초기 형광 신호의 세기가 평균적으로 0.01이면 Rb의 값으로 0.01을 사용할 수 있다. 이 방법은 시약, 형광 염료 및 형광 염료의 광 노출 시간 등이 바뀌지 않는 한, 초기 형광 신호의 세기는 일정할 것이기 때문에 처음에 한 번만 실험적으로 측정한 후에는 계속 Rb를 상수로 고정시켜 사용할 수 있는 장점이 있다. 다만, 시약, 형광 염료 및 형광 염료의 광 노출 시간 등이 바뀐다면, 처음에 한 번은 실험적으로 초기 형광 신호의 세기를 측정하여 상수 Rb의 값을 구해야 한다.
셋째, 첫 번째 사이클에서의 핵산 형광 신호의 세기(R1)를 Rb의 값으로 사용할 수 있다. 이 방법은 시약, 형광 염료 및 형광 염료의 광 노출 시간 등이 바뀌어도 매 실험마다 자동적으로 초기 형광 신호의 세기를 보정하는 방법으로 상기 두 번째 방법에 비해 장점을 갖지만 초기 형광 신호의 세기가 0에 매우 가까울 경우에는 오차가 커지는 단점이 있다.
넷째, 식 2의 증폭 효율 함수에서 최대 증폭 효율의 값이 '1'이 되도록 하는 값을 Rb의 값으로 사용할 수 있다. 이 방법은 최대 증폭 효율이 1이 되는 Rb를 구하기 위해 반복적으로 Rb의 값을 변화시켜가며 Rb를 구하는 방법으로, 원리적으로 가장 타당한 방법이지만 반복계산을 해야 한다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 배경 형광 신호의 세기는 크게 1) 시그모이달 (sigmoidal) 모델 (식 13)을 통해 얻은 배경 형광 신호의 세기((Rb)sigmoidal), 2) 초기 형광 신호의 세기에 해당하는 값 (예를 들면, 0.01), 3) 첫 번째 사이클에서의 형광 신호의 세기(R1), 4) 최대 증폭 효율의 값이 '1'이 되도록 하는 값으로 설정할 수 있다.
여기서, (Rb)sigmoidal값을 사용하고 하는 경우는 곡선 맞춤을 통해 그 값을 구해야 하는 불편함이 있으나, 그 외의 값들 (초기 형광 신호의 세기, R1 등)은 곡선 피딩을 사용하지 않아도 된다.
Rb의 값으로 위에서 살핀 네 가지의 상수 외에 더 큰 양수 또는 음수의 값을 사용하는 경우에도 증폭 효율 그래프는 일정한 형태로 나타난다. 각각의 그래프는 초기농도에 따라 일정한 패턴을 가지므로 본 발명에 따른 초기 농도를 정량화하는데 사용할 수 있다.
Rb의 값이 0인 경우에는 형광 신호 세기의 최저 값이 거의 0이 되어 (즉, Rb=Rmin=0) 식 13의 분모 (Rn -1)가 0에 가까워지므로, 증폭 효율 (En)이 현실과 맞지 않게 커지고, Emax 피크는 매우 날카로워지고, 노이즈 (noise)의 영향을 많이 받는다. Rb의 값이 0이 아닌 경우는 증폭 효율이 일정한 패턴으로 나타난다. 다만, Rb=R1을 사용한 경우, 증폭 사이클의 초기 (cycle number≤5)에 1보다 큰 최대 증폭 효율이 나타나고 그 피크의 모양이 매우 날카로운데, 일반적인 핵산 증폭 방법에서는 이와 같이 초기에 핵산이 급격히 증폭되는 일은 발생하지 않고 증폭 효율이 1보다 큰 것은 물리적으로 의미가 없으므로 그 피크를 무시해야 한다.
다음으로서, 최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV (=St.Dev(표준편차)/Avg(평균))와 핵산의 초기 농도와의 관계를 살펴본다. Rb의 값이 일정 이상이면 %CV 값은 별로 변화가 없으므로, 증폭 효율의 값이 0과 1사이에 위치하면서 %CV 값을 향상하고자 할 경우 R1, 초기 형광 신호의 세기, (Rb)sigmoidal을 Rb의 값으로 사용하는 것이 바람직하다.
최대 증폭 효율을 갖는 증폭 사이클 수의 %CV의 값이 조금만 커져도 실제 핵 산의 초기 농도의 정량 값에 큰 오차를 가져올 수 있기 때문에 매우 정확한 정량방법이 요구된다.
(b) 단계에서 상기 기하 평균 값은, 하기 식3 또는 식4로 표시되는 것일 수 있다. 하기 식3 또는 식4는 n 번째 사이클을 포함하고, 그 이전 및 그 이후의 증폭 효율에 대한 기하 평균값으로서, 각각 3 또는 5개 증폭 효율의 기하 평균값이다.
Figure 112007087990712-pat00003
(식 3),
식 중
Figure 112007087990712-pat00004
은 En을 중심으로 한 3개 증폭 효율의 기하 평균 값이고, En -1, En, En +1은 (n-1), n, 및 (n+1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 3 이상의 정수이다.
Figure 112007087990712-pat00005
(식 4),
식 중
Figure 112007087990712-pat00006
은 En을 중심으로 한 5개 증폭 효율의 기하 평균 값이고, En -2, En-1, En, En +1, En +2는 각각 (n-2), (n-1), n, (n+1), 및 (n+2) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 4 이상의 정수이다.
(b) 단계에서 상기 기하 평균 값은, 하기 식5 내지 식8 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다. 하기 식5 내지 식8은 n 번째 사이클을 포함하고, 그 이전까지의 증폭 효율에 대한 기하 평균값으로서, 각각 2 내지 5개 증폭 효율의 기하 평균값이다.
Figure 112007087990712-pat00007
(식 5),
식 중
Figure 112007087990712-pat00008
은 En 및 En -1의 기하 평균 값이고, En 및 En -1은 n, 및 (n-1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 3 이상의 정수이다.
Figure 112007087990712-pat00009
(식 6),
식 중
Figure 112007087990712-pat00010
은 En -2, En -1 및 En의 기하 평균 값이고, En -2, En -1 및 En은 (n-2), (n-1), 및 n 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 4 이상의 정수이다.
Figure 112007087990712-pat00011
(식 7),
식 중
Figure 112007087990712-pat00012
은 En -3, En -2, En -1 및 En의 기하 평균 값이고, En -3, En -2, En -1 및 En은 (n-3), (n-2), (n-1), 및 n 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 5 이상의 정수이다.
Figure 112007087990712-pat00013
(식 8),
식 중
Figure 112007087990712-pat00014
은 En -4, En -3, En -2, En -1 및 En의 기하 평균 값이고, En-4, En-3, En-2, En -1 및 En은 각각 (n-4). (n-3), (n-2), (n-1), 및 n 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 6 이상의 정수이다.
(b) 단계에서 상기 기하 평균 값은, 하기 식9 내지 식12 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다. 하기 식9 내지 식12는 n 번째 사이클을 포함하고, 그 이후의 증폭 효율에 대한 기하 평균값으로서, 각각 2 내지 5개 증폭 효율의 기하 평균값이다.
Figure 112007087990712-pat00015
(식 9),
식 중
Figure 112007087990712-pat00016
은 En 및 En +1의 기하 평균 값이고, En 및 En +1은 각각 n, 및 (n+1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수이고,
Figure 112007087990712-pat00017
(식 10),
식 중
Figure 112007087990712-pat00018
은 En, En +1 및 En +2의 기하 평균 값이고, En, En +1 및 En +2는 각각 n, (n+1), 및 (n+2) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수이고,
Figure 112007087990712-pat00019
(식 11),
식 중
Figure 112007087990712-pat00020
은 En, En +1, En +2 및 En +3의 기하 평균 값이고, En, En +1, En +2 및 En+3은 각각 n, (n+1), (n+2), 및 (n+3) 번째 사이클에서의 효율이고, n은 2 이상의 정수이고,
Figure 112007087990712-pat00021
(식 12),
식 중
Figure 112007087990712-pat00022
은 En, En +1, En +2, En +3 및 En +4의 기하 평균 값이고, En, En+1, En+2, En+3 및 En +4는 n. (n+1), (n+2), (n+3), 및 (n+4) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수이다.
(b) 단계에서 상기 함수는 곡선 맞춤 (curve fitting)에 의하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 곡선 맞춤은 n이 2이상의 정수인 n차 다항식, 사인 또는 코사인 함수, 가우스 분포 함수, 및 규빅 스플라인 (cubic spline) 보간 방법 중 어느 하나 이상을 사용하는 것일 수 있다. 이러한 곡선 맞춤은 당업자에게 잘 이해되고 있으며, 적절한 곡선 맞춤 방법을 선택하여 시간에 따른 효율의 기하 평균값들에 대한, 함수를 생성할 수 있다.
상기 증폭 효율 및 곡선 맞춤에 대하여는 예를 들면, 본 발명자들의 선행출원인 미국특허공개 제20060047443호 (대응한국특허공개 제2006-0045671호)에 개시 된 내용을 참조할 수 있으며, 상기 미국특허공개 제20060047443호에 개시된 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어 진다.
실시간 PCR 데이터는 시간에 따른 형광신호의 함수로 모델링할 수 있다. 예를 들면 시그모이달 모델 (sigmoidal model)을 사용하여 함수로 모델링할 수 있다. 예를 들면, 하기 식 13의 수학식에 의하여 모델링될 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00023
(식 13)
식 중 R은 증폭된 표적 핵산의 형광신호이고, Rb는 배경 형광신호이고, Rmax는 증폭된 표적 핵산의 최대 형광신호이고, n은 증폭 사이클 수이고, n1 /2는 배경 신호를 제외한 증폭된 표적 핵산의 형광신호의 최대 값의 반에 해당하는 증폭 사이클 수이고, k는 형광신호의 증가에 대한 기울기이다.
수학적 모델과 실제 PCR 실험 데이터와의 오차는 하기 식 14로부터 구할 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00024
(식 14)
식 중 Rn은 n 번째 사이클에서 실제로 실험에서 얻은 증폭된 표적 핵산의 형광신호이다. Rb, Rmax, n, n1 /2, k는 상기한 바와 같다.
식 13과 같은 수학적 모델에 의하여 얻어진 함수에 대한 각각의 파라메터 (Rb, Rmax, n1 /2, k) 값을 구하기 위하여 최소 자승법 (least square fitting)을 사용하면, 식 15 및 식 16a 내지 16d의 비선형 방정식을 얻게 되는데, 이 방정식을 Newton-Raphson 방법으로 풀 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00025
(식 15)
식 중 ε2 은 식 14에서 정의된 바와 같다.
Figure 112007087990712-pat00026
(식 16a),
Figure 112007087990712-pat00027
(식 16b),
Figure 112007087990712-pat00028
(식 16c),
Figure 112007087990712-pat00029
(식 16d)
그리고, 배경 형광신호 (Rb)를 제외한 표적 핵산의 증폭 전 형광 신호의 세기는 식 13에서 n=0일 경우이므로, 식 17과 같이 정의된다.
Figure 112007087990712-pat00030
(식 17)
본 발명의 방법은 (c) 상기 함수로부터 상기 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 시간을 계산하는 단계를 포함한다. (c) 단계에서 상기 함수로부터 상기 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 시간을 계산하는 것은, 최대 값이 발생하는 근처에서 곡선 맞춤 (curve fitting)을 사용하여 것일 수 있다. 상기 계산은 예를 들면, 곡선 상의 세 점에서의 데이터를 알고 있는 경우, y 축의 최대 값에 해당하는 x 값을 구하기 위하여 포물선 곡선 맞춤 (parabolic curve fitting)을 사용할 수 있다.
먼저, 3개의 좌표점 (x1,y1),(x2,y2),(x3,y3)에 대해 다음 수학식 18a를 세운다.
y1=ax1 2+bx1+c, y2=ax2 2+bx2+c, y3=ax3 2+bx3+c (식 18a)
식 18a를 다시 행렬로 정리하면, 수학식 18b와 같다.
Figure 112007087990712-pat00031
여기서,
Figure 112007087990712-pat00032
라 하면, 상수 a,b,c는 다음과 같이 구할 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00033
Figure 112007087990712-pat00034
Figure 112007087990712-pat00035
(식 18c)
다음으로, 아래 식 18d로부터 xmax를 구할 수 있다.
Figure 112007087990712-pat00036
지금까지, 증폭시간에 따른 증폭된 표적 핵산으로부터 얻어지는 형광신호의 함수를 수학적 모델을 이용하여 얻고, 상기 함수의 각 파라메터를 구하는 방법에 대하여 살펴보았다. 이들 파라메터는 표적 핵산의 초기 농도와 다음과 같은 상관관계를 갖는다. 즉, 초기 표적 핵산 농도가 높을수록 최대 형광 신호의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 (n1 /2) 및 최대 증폭 효율이 나타나는 사이클 수 (nEmax)가 낮아진다. 그리고, 종래 미분 값을 이용하여 초기 핵산 농도를 구하는 방법을 이용한 표준 곡선 (standard curve)의 기울기와 최대 형광 신호의 반에 해당하는 증폭 사이 클 수 (n1 /2) 및 최대 증폭 효율 (nEmax)를 이용한 표준 곡선 (standard curve)의 기울기와 거의 동일하게 된다. 다만, 최대 증폭 효율 (nEmax)에 해당하는 사이클 수가 최대 형광 신호의 반에 해당하는 증폭 사이클 수 (n1 /2) 보다 아래 쪽에 위치하므로, nEmax를 이용하는 경우 (n1 /2) 보다 더 적은 증폭 사이클 수로 표적 핵산의 초기 농도를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법은 (d) 상기 계산된 시간으로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 단계로서, 상기 결정은 농도를 알고 있는 표적 핵산에 대하여 (a) 내지 (c) 단계를 반복하여 얻어진 표준 곡선 (standard curve)에 상기 시간을 대입하여 이루어지는 것인 단계를 포함한다. 상기 표준 곡선은 표적 핵산의 농도를 제외하고는 동일한 조건하에서, (a) 내지 (c) 단계를 수행하여 얻어지는 것이다.
본 발명은 또한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체에 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록장치를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체의 예로는 ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피디스크, 광데이터 저장장치 등이 있으며, 또한 캐리어 웨이브(예를 들어 인터넷을 통한 전송)의 형태로 구현되는 것도 포함한다. 또한 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템에 분산되어 분산방식으로 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드가 저장되고 실행될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여, 시간에 따른 증폭 효율의 기하 평균값의 함수를 이용하여 시료 중의 핵산 농도를 낮은 변동 계수 (CV: coefficient of variation)로 결정할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: 2차 미분함수의 산술평균을 이용한 최대 형광 신호에 해당하는 사이클 수의 측정
본 비교예에서는, B 형 간염 바이러스의 플라스미드 DNA (7.4kb, 유전자형 A 서타입 adw)를 주형으로 하고, 1, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 copy/㎕의 농도에서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 리얼 타임 (real time) PCR을 수행하였다. PCR 반응 용액의 구성은 아래와 같다.
DNA 주형 (HBV 플라스미드 DNA ;7.4kb, 유전자형 A 서타입 adw), 1xSYBRTM GreenI PCR 버퍼, 1mM 포워드 및 리버스 프라이머, 200μM dNTP (데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트), 5mM MgCl2, 5% 글리세롤, 500mM 포름아미드, 0.2ng/㎕ BSA, 1 유니트/㎕ 우라실-N-글리코실라제, 1 유니트/㎕ Taq 폴리머라제.
PCR은 TMC-1000 시스템 (Samsung Electronics Co. Ltd) 상에서 SYBR Green I 형광 염료를 사용하여 실시간으로 수행하였다. PCR 조건은 92℃에서 120초 전변성 (predenaturation), 변성 (denaturation) 92℃에서 1초, 프라이머 결합 및 합성 (annealing and extension) 62℃에서 15초를 40회 반복하였다.
형광 신호는 프라이머 결합 및 합성 단계의 끝 부분에서 5초 동안 측정하였고, 이렇게 얻어진 실시간 형광 신호에 해당하는 함수의 그래프 및 이를 2차 미분하여 얻어지는 함수를 상기 PCR 장치의 제조사의 지침에 따라 얻고, 이를 도면으로 표시하였다.
도 1a는 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 2차 미분 함수의 그래프를 나타내는 도면이다. 도 1a에서, 좌측 세로 축은 형광신호 값, F(n) 함수이고, 우측 세로 축은 F(n) 함수의 2차 미분 함수 F''(n)의 값이다.
도 1b는 도 1a에서 얻어진 실시간으로 측정된 형광신호의 산술 평균 값에 해당하는 함수 및 그의 2차 미분 함수 값의 산술평균의 함수의 그래프를 나타내는 도면이다. 도 1b에서, 좌측 세로 축은 산술 평균 형광 신호, F_avg(n)이고, 우측 세로 축은 F_avg(n) 함수의 2차 미분 함수 F''_avg(n)의 값이다.
다음으로, 도 1a에서 2차 미분 함수의 최대 값에 해당하는 사이클 수의 평균값, 표준편차 및 변동 계수 (%CV)를 구하였다. 또한, 도 1b에서 2차 미분 함수 값 의 산술 평균값의 함수의 최대 값에 해당하는 사이클 수의 평균값, 표준편차 및 변동 계수 (%CV)를 구하였다. 얻어진 최대 값에 해당하는 사이클 수의 값, 표준편차 및 변동 계수 (%CV)는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1.
번호 2차 미분 최대 2차 미분값의 산술평균값의 최대
1 13.70 13.77
2 14.10 13.94
3 15.93 14.63
4 14.58 13.84
5 14.17 14.17
6 14.37 14.66
평균 14.48 14.17
표준편차 0.77 0.39
변동 계수(%CV) 5.32 2.78
표 1에 나타낸 바와 같이, 2차 미분값의 산술평균값의 함수를 사용하는 경우, 표준편차 및 변동 계수가 줄어든 것을 알 수 있다. 이를 통해 핵산 초기 농도를 구하는 정량의 정확도가 증가될 수 있다.
실시예 1: 증폭효율의 기하 평균 이용한 최대 형광 신호에 해당하는 사이클 수의 측정
본 실시예에서는, 비교예 1과 동일한 조건에서 실험하여 얻어지는 실시간 형광 신호를 하기 식 1로 표시되는 증폭 효율로 전환하여, 증폭 효율 함수를 구하였다.
Figure 112007087990712-pat00037
(식 2)
식 중 En은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율이고, Rn -1은 (n-1) 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rn은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rb는 첫번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호인 R1을 사용을 사용하였고, n은 2보다 큰 정수이다.
또한, 상기 증폭 효율 함수의 값을 하기 식 3으로 표시되는 기하 평균 값으로 전환하여, 증폭 효율의 기하 평균값의 함수를 구하였다.
Figure 112007087990712-pat00038
(식 3),
식 중
Figure 112007087990712-pat00039
은 En을 중심으로 한 3개 증폭 효율의 기하 평균 값이고, En -1, En, En +1은 (n-1), n, 및 (n+1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 3 이상의 정수이다.
도 2a는 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 증폭 효율 함수의 그래프를 나타내는 도면이다.
도 2b는 도 2a에서 얻어진 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 증폭 효율의 기하 평균값의 함수의 그래프를 나타내는 도면이다.
다음으로, 도 2a에서 증폭 효율 함수의 최대 값에 해당하는 사이클 수의 평균값, 표준편차 및 변동 계수 (%CV)를 구하였다. 또한, 도 2b에서 증폭 효율의 기 하 평균값의 함수의 최대 값에 해당하는 사이클 수의 평균값, 표준편차 및 변동 계수 (%CV)를 구하였다. 얻어진 최대 값에 해당하는 사이클 수의 평균값, 표준편차 및 변동 계수 (%CV)는 하기 표 2에 나타내었다.
표 2.
번호 증폭 효율 최대 증폭 효율의 기하 평균값의 최대
1 15.73 15.95
2 15.63 15.91
3 15.08 15.82
4 15.97 16.16
5 16.06 16.26
6 16.19 16.32
평균 15.78 16.07
표준편차 0.40 0.20
변동 계수(%CV) 2.51 1.27
표 2에 나타낸 바와 같이, 2차 미분 함수 또는 그의 산술 평균값의 함수를 사용하지 않더라도, 낮은 표준편차 및 변동 계수로 Ct 값을 구할 수 있다. 즉, 측정의 정확도가 2차 미분 함수 또는 그의 산술 평균값의 함수를 이용하는 것에 비하여, 증폭 효율의 함수를 이용하는 경우, 더 증가된다. 더욱이, 증폭 효율의 기하 평균값의 함수를 이용하는 경우, 그 정확도가 가장 우수하였다.
도 1a는 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 2차 미분 함수의 그래프를 나타내는 도면이다.
도 1b는 도 1a에서 얻어진 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 2차 미분 함수 값의 산술평균의 함수의 그래프를 나타내는 도면이다.
도 2a는 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 증폭 효율 함수의 그래프를 나타내는 도면이다.
도 2b는 도 2a에서 얻어진 실시간으로 측정된 형광신호에 해당하는 함수 및 그의 증폭 효율의 기하 평균값의 함수의 그래프를 나타내는 도면이다.
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Claims (10)

  1. 실시간 핵산 증폭 데이터로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 방법으로서,
    (a) 표적 핵산을 증폭하여 증폭 산물로부터 신호를 측정하는 단계;
    (b) 상기 신호로부터 시간에 따른 상기 표적 핵산의 증폭 효율을 얻고, 그로부터 시간에 대한 증폭 효율의 함수를 생성하는 단계로서, 상기 함수는 시간에 대한 상기 증폭 효율의 기하 평균 값으로 구성되는 함수인 것인 단계;
    (c) 상기 함수로부터 상기 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 시간을 계산하는 단계; 및
    (d) 상기 계산된 시간으로부터 시료 중의 표적 핵산의 초기 농도를 결정하는 단계로서, 상기 결정은 농도를 알고 있는 표적 핵산에 대하여 (a) 내지 (c) 단계를 반복하여 얻어진 표준 곡선 (standard curve)에 상기 시간을 대입하여 이루어지는 것인 단계;를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 단계에서 상기 신호는 형광 신호, 전기적 신호 및 방사선 신호로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, (b) 단계에서 상기 효율은 하기 식 1로 표시되고,
    Figure 112013107951641-pat00040
    (식 1)
    식 중 En은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율이고, Rn-1은 (n-1) 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rn은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, n은 2보다 큰 정수인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, (b) 단계에서 상기 효율은 하기 식 2로 표시되고,
    Figure 112013107951641-pat00041
    (식 2)
    식 중 En은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 효율이고, Rn-1은 (n-1) 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rn은 n 번째 증폭 사이클에서의 증폭 신호이고, Rb는 0이 아닌 상수이고, n은 2보다 큰 정수인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Rb는 초기 신호 값, 제1 증폭 사이클에서의 증폭 신호값, 및 상기 식 2로 표시되는 증폭 효율의 최대 값이 1이 되도록 하는 값으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, (b) 단계에서 상기 기하 평균 값은, 하기 식3 또는 식4로 표시되고,
    Figure 112013107951641-pat00042
    (식 3),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00043
    은 En을 중심으로 한 3개 증폭 효율의 기하 평균 값이고, En-1, En, En+1은 (n-1), n, 및 (n+1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 3 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00044
    (식 4),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00045
    은 En을 중심으로 한 5개 증폭 효율의 기하 평균 값이고, En-2, En-1, En, En+1, En+2는 (n-2), (n-1), n, (n+1), 및 (n+2) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 4 이상의 정수인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, (b) 단계에서 상기 기하 평균 값은, 하기 식5 내지 식8 중 어느 하나로 표시되고,
    Figure 112013107951641-pat00046
    (식 5),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00047
    은 En 및 En-1의 기하 평균 값이고, En 및 En-1은 각각 n, 및 (n-1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 3 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00048
    (식 6),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00049
    은 En-2, En-1 및 En의 기하 평균 값이고, En-2, En-1 및 En은 (n-2), (n-1), 및 n 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 4 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00050
    (식 7),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00051
    은 En-3, En-2, En-1 및 En의 기하 평균 값이고, En-3, En-2, En-1 및 En은 각각 (n-3), (n-2), (n-1), 및 n 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 5 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00052
    (식 8),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00053
    은 En-4, En-3, En-2, En-1 및 En의 기하 평균 값이고, En-4, En-3, En-2, En-1 및 En은 각각 (n-4). (n-3), (n-2), (n-1), 및 n 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 6 이상의 정수인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, (b) 단계에서 상기 기하 평균 값은, 하기 식9 내지 식12 중 어느 하나로 표시되고,
    Figure 112013107951641-pat00054
    (식 9),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00055
    은 En 및 En+1의 기하 평균 값이고, En 및 En+1은 각각 n, 및 (n+1) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00056
    (식 10),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00057
    은 En, En+1 및 En+2의 기하 평균 값이고, En, En+1 및 En+2는 각각 n, (n+1), 및 (n+2) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00058
    (식 11),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00059
    은 En, En+1, En+2 및 En+3의 기하 평균 값이고, En, En+1, En+2 및 En+3은 각각 n, (n+1), (n+2), 및 (n+3) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수이고,
    Figure 112013107951641-pat00060
    (식 12),
    식 중
    Figure 112013107951641-pat00061
    은 En, En+1, En+2, En+3 및 En+4의 기하 평균 값이고, En, En+1, En+2, En+3 및 En+4는 n. (n+1), (n+2), (n+3), 및 (n+4) 번째 사이클에서의 증폭 효율이고, n은 2 이상의 정수인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, (c) 단계에서 상기 함수로부터 상기 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 시간을 계산하는 것은, 최대 값이 발생하는 근처에서 곡선 맞춤 (curve fitting)을 사용하여 증폭 효율이 최대 값이 되도록 하는 시간을 계산하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 곡선 맞춤은 n이 2이상의 정수인 n차 다항식, 사인 또는 코사인 함수, 가우스 분포 함수, 및 규빅 스플라인 (cubic spline) 보간 방법 중 어느 하나 이상을 사용하는 것인 방법.
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