KR20100098570A - 핵산 증폭의 컨트롤의 검출 방법 및 그 용도 - Google Patents

핵산 증폭의 컨트롤의 검출 방법 및 그 용도

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KR20100098570A
KR20100098570A KR1020107016506A KR20107016506A KR20100098570A KR 20100098570 A KR20100098570 A KR 20100098570A KR 1020107016506 A KR1020107016506 A KR 1020107016506A KR 20107016506 A KR20107016506 A KR 20107016506A KR 20100098570 A KR20100098570 A KR 20100098570A
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사토시 마지마
신야 나카지마
다츠오 가마타
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아크레이 가부시키가이샤
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Abstract

하나의 반응계에서 간편하게, 양성 컨트롤 및 음성 컨트롤을 동시에 검출하는, 컨트롤의 검출 방법의 제공을 목적으로 한다. 컨트롤 검출용의 반응계에, 컨트롤용 주형 핵산을 첨가하여 증폭 반응을 행한다. 상기 주형 핵산은, 목적의 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며, 상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역에는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈(hybridize) 가능한 검출용 프로브(probe)가 하이브리다이즈 가능하며, 상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값이 되도록 설정한다. 이에 의해, 상기 TmC에 있어서의 피크의 유무로, 반응계에서 증폭이 일어나 있는 것을 확인할 수 있고, 또한, TmC 이외에서의 피크의 유무로, 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 확인할 수 있다.

Description

핵산 증폭의 컨트롤의 검출 방법 및 그 용도{METHOD FOR DETECTING CONTROLS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION, AND USE THEREOF}
본 발명은, 검체 핵산의 표적 서열을 증폭시킬 때에, 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 컨트롤의 검출 방법을 사용한 핵산 증폭 방법 및 융해 곡선 해석 방법, 및, 그것에 사용하는 컨트롤 검출용 시약에 관한 것이다.
근래, 유전자 해석에 있어서, 표적 서열과 프로브(probe)로 형성되는 2본쇄 핵산의 융해 온도(Tm : melting temperature)를 해석하는 방법이 실용화되어 있다. 이 방법은, 예를 들면, Tm 해석, 또는, 상기 2본쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지므로, 융해 곡선 해석이라 불리고 있다. 이 방법에 의하면, 예를 들면, 표적 서열의 증폭의 유무, 상기 표적 서열 내에 있어서의 목적의 다형(多形)의 검출이 가능하게 된다.
상기 증폭의 유무는, 예를 들면, 이하와 같이 하여 검출할 수 있다. 우선, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈(hybridize) 가능한 프로브의 존재 하, 검체 핵산에 있어서의 상기 표적 서열의 증폭을 행한 후, 상기 표적 서열의 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드를 형성시킨다. 그리고, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 수반하는 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널값으로서 검출하여, 큰 시그널 변동을 나타내는 Tm값(측정값)을 측정한다. 다른 한편, 상기 표적 서열과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해, 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해둔다. 그리고, 측정값이 평가 기준값과 동일 정도이면, 상기 표적 서열이 증폭했다고 판단할 수 있고, Tm값이 측정할 수 없었던 경우에는, 상기 표적 서열이 증폭되어 있지 않다고 판단할 수 있다. 또한, 다형은, 예를 들면, 이하와 같이 검출할 수 있다. 우선, 목적의 표적 부위가 변이형인 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 프로브의 존재 하, 검체 핵산에 있어서의 표적 서열의 증폭을 행하고, 상술한 바와 같이 하여, 시그널 변동의 검출로부터 Tm값을 측정한다. Tm값은, 하이브리드 형성체의 상보성이 높을수록 높고, 상보성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 상기 표적 부위가 변이형인 표적 서열과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해두어, 상술한 측정한 Tm값과 비교한다. 이 측정값이 평가 기준값과 동일 정도이면, 매치(match), 즉, 검체 핵산의 표적 부위가 변이형이라고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면, 미스매치(mismatch), 즉, 검체 핵산의 표적 부위가 야생형이라고 판단할 수 있다.
이와 같은 융해 곡선 해석을 이용하여 유전자 해석을 행하는 경우, 검체 핵산의 증폭의 검출과는 별도로, 양성 컨트롤 및 음성 컨트롤의 검출이 행하여지고 있다(특허문헌 1 참조). 상기 양성 컨트롤은, 일반적으로, 반응계에서 증폭 반응이 일어나고 있는지 여부를 나타내는 컨트롤이다. 상기 음성 컨트롤은, 반응계에 불필요한 핵산이 혼입하여 있는지 여부를 나타내는 컨트롤이다. 우선, 양성 컨트롤은, 이하의 이유에서 필요로 되고 있다. 핵산 증폭에 있어서, 표적 서열의 증폭이 검출되지 않았던 경우, 상기 검체 핵산에 상기 표적 서열이 존재하지 않는 것이 원인인지, 반응계에서 증폭 반응 자체가 일어나고 있지 않는 것이 원인인지, 불명확하다. 이 때문에, 검체 핵산을 증폭하기 위한 검체용 반응계와는 별도로, 양성 컨트롤용의 반응계를 사용하고, 마찬가지로 하여, 핵산의 증폭 및 Tm값의 해석이 행해진다. 상기 양성 컨트롤용의 반응계는, 검체 핵산을 무첨가로 하고, 상기 표적 서열을 포함하는 주형 핵산(양성 컨트롤용 주형 핵산)을 첨가한 이외는, 상기 검체용 반응계와 동일 조건이다. 그 결과, 상기 양성 컨트롤용의 반응계에서, 평가 기준과 동일 정도의 Tm값을 확인할 수 있으면, 양성 컨트롤(+)이며, 증폭 반응은 일어나고 있다고 판단할 수 있다. 이 때문에, 상기 검체용 반응계에서 증폭이 검출되지 않았던 경우는, 상기 검체 핵산에 표적 서열이 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 또한, 상기 양성 컨트롤용의 반응계에서, Tm값을 확인할 수 없으면, 양성 컨트롤(-)이며, 증폭 반응 자체가 일어나고 있지 않다고 판단할 수 있다. 이어서, 음성 컨트롤은, 이하의 이유에서 필요로 되고 있다. 반응계에는, 예를 들면, 실험자의 세포 등의 혼입에 의해, 검체 핵산 이외의 핵산이 혼입하고, 그 결과, 상기 혼입한 불필요한 핵산으로부터 증폭이 생기는 경우가 있다. 이렇게 하면, 평가 기준의 Tm값에서 시그널 변동이 확인되어도, 검체 핵산 유래의 증폭인지, 혼입한 핵산 유래의 증폭인지가 불명확하다. 이 때문에, 검체용 반응계 및 양성 컨트롤용의 반응계와는 별도로, 또한, 음성 컨트롤용의 반응계를 사용하고, 마찬가지로 하여, 핵산의 증폭 및 Tm값의 해석이 행해진다. 상기 음성 컨트롤용의 반응액은, 검체 핵산을 무첨가로 한 이외는, 상기 검체용 반응계와 동일 조건이다. 그 결과, 음성 컨트롤용의 반응계에서, Tm값을 확인할 수 없었던 경우에는, 음성 컨트롤(+)이며, 불필요한 핵산의 혼입은 없다고 판단하고, Tm값이 확인된 경우는, 음성 컨트롤(-)이며, 불필요한 핵산의 혼입에 의해 증폭이 생겼다고 판단하여, 다시, 해석을 정정 실행하게 된다.
이와 같이, 검체 핵산의 해석을 행하는 경우, 검체용 반응계와는 별도로, 반드시, 양성 컨트롤용의 반응계와 음성 컨트롤용의 반응계를, 각각 하나씩 준비하지 않으면 안된다. 그러나, 해석 기기 등에 있어서, 측정부의 개수는 한정되지 않고, 예를 들면, 상기 측정부가 4개의 경우, 동시에 해석할 수 있는 반응계의 수는 4개이다. 이 때문에, 한번의 해석에 있어서는, 절반을 컨트롤이 차지하게 된다. 또한, 해석시마다, 양성 컨트롤용의 반응계와 음성 컨트롤용의 반응계가 필요하게 된다. 또한, 1검체만의 해석이어도, 2종류의 컨트롤용 반응계가 필요하게 된다. 그리고, 컨트롤용의 반응계의 수가 늘어날수록, 시약 등의 비용도 증가한다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
특허문헌 1 : 일본 특허 제3331178호 공보
[발명의 개요]
[발명이 해결하고자 하는 과제]
그래서, 본 발명은, 하나의 반응계에서 간편하게, 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤 및 불필요한 핵산이 반응계에 혼입하여 있는 것을 나타내는 음성 컨트롤을 동시에 검출 가능한, 컨트롤 검출 방법의 제공을 목적으로 한다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 컨트롤 검출 방법은, 반응계에서 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 상기 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 방법으로서,
상기 컨트롤이, 반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤 및 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤이며,
상기 반응계는, 프라이머, 검출용 프로브 및 컨트롤용 주형 핵산을 함유하고,
상기 프라이머는, 상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머이며,
상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 프로브이며,
상기 컨트롤용 주형 핵산은, 상기 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역은, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며,
상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값이며,
하기 (a1)∼(a3) 공정을 포함하고,
상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤을, 하나의 반응계에서 검출하는 것을 특징으로 한다.
(a1)상기 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭을 행하는 증폭 공정
(a2)상기 (a1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
(a3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤이, 각각 양성인지 음성인지를 판단하는 판단 공정
본 발명의 핵산 증폭 방법은, 반응계에서 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 방법으로서,
하기 (A) 공정 및 (B) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A)상기 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의해, 상기 컨트롤용 주형 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에 대해, 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 검출 공정
(B)하기 (b1) 공정을 포함하는, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
(b1)상기 검체 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
본 발명의 융해 곡선 해석 방법은, 검체 핵산을 함유하는 반응계의 융해 곡선 해석 방법으로서,
하기 (A) 공정 및 (C) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A)상기 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의해, 상기 컨트롤용 주형 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에 대해, 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 검출 공정
(C)하기 (c1) 및 (c2) 공정을 포함하는, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
(c1)상기 검체 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
(c2)상기 (c1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
본 발명의 시약은, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 사용하기 위한 컨트롤 검출용 시약으로서,
컨트롤용 주형 핵산을 함유하고,
상기 컨트롤용 주형 핵산은, 목적의 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역에는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며,
상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값인 것을 특징으로 한다.
[발명의 효과]
본 발명에 의하면, 상술한 바와 같은 컨트롤용 주형 핵산을 사용함으로써, 종래는 별개로 행할 필요가 있었던 양성 컨트롤과 음성 컨트롤의 검출을, 하나의 반응계에서 행하는 것이 가능하다. 이와 같이, 양성 컨트롤과 음성 컨트롤을 하나의 반응계에서 검출함으로써, 예를 들면, 조작이 간편하게 되고, 시약 등의 비용도 저하할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은, 본 발명의 1실시 형태에서의, 프로브와, 표적 서열 및 컨트롤용 주형 핵산과의 하이브리다이즈를 나타내는 모식도.
도 2는, 본 발명의 다른 실시 형태에서의, 융해 곡선의 모식도.
도 3은, 본 발명의 다른 실시 형태에서의, 프로브와, 표적 서열 및 컨트롤용 주형 핵산과의 하이브리다이즈를 나타내는 모식도.
도 4는, 본 발명의 다른 실시 형태에서의, 프로브와, 표적 서열 및 컨트롤용 주형 핵산과의 하이브리다이즈를 나타내는 모식도.
도 5는, 본 발명의 다른 실시 형태에서의, 프로브와, 표적 서열 및 컨트롤용 주형 핵산과의 하이브리다이즈를 나타내는 모식도.
도 6은, 본 발명의 실시예A1에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 7은, 본 발명의 실시예A2에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 8은, 본 발명의 실시예A2에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 9는, 본 발명의 실시예A3에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 10은, 본 발명의 실시예A3에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 11은, 본 발명의 실시예A4에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 12는, 본 발명의 실시예A4에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 13은, 본 발명의 실시예B1에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 14는, 본 발명의 실시예B1에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 15는, 본 발명의 실시예B1에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 16은, 본 발명의 실시예B2에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 17은, 본 발명의 실시예B2에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 18은, 본 발명의 실시예B2에 있어서의, Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
[발명을 실시하기 위한 형태]
본 발명에서, 「표적 서열」이란, 검체 핵산에 있어서의 증폭 목적의 영역이며, 상기 프라이머에 의해 증폭하는 서열을 의미한다. 본 발명에서, 「표적 부위」란, 상기 검체 핵산의 상기 표적 서열에 있어서, 목적의 다형이 발생하는 염기 부위를 의미하며, 다형이 변이형의 경우, 「변이형의 표적 부위」, 다형이 야생형의 경우, 「야생형의 표적 부위」라고도 한다. 상기 야생형은, 정상형이라고 할 수도 있다. 야생형의 표적 부위를 갖는 표적 서열을, 「야생형 표적 서열」, 변이형의 표적 부위를 갖는 표적 서열을, 「변이형 표적 서열」이라고도 한다. 프라이머에 의해 증폭하는 상기 컨트롤용 주형 핵산의 영역을, 「상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역」이라고도 한다. 상기 검체 핵산의 표적 서열 및 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역에서, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역을, 각각, 이하, 「하이브리다이즈 영역」이라고도 한다. 본 발명에서, 하이브리다이즈 영역이란, 예를 들면, 전체로서 2본쇄를 형성하고 있는 영역을 의미한다. 상기 하이브리다이즈 영역은, 예를 들면, 상기 영역 내의 전 염기가 수소 결합에 의한 염기쌍을 형성해도 되고, 상기 영역의 내부에서, 염기쌍을 형성하고 있지 않는 미스매치의 염기를 함유해도 된다. 상기 미스매치란, 예를 들면, 아데닌과 시토신과의 조합과 같이, 대응하는 염기가 수소 결합하지 않는 형태이어도 되고, 서열 간에 있어서 대응하는 부위의 염기가 결실(缺失)하여 있는 형태이어도 된다. 또한, 본 발명에서, 상기 하이브리다이즈 영역 이외의 영역을, 예를 들면, 「비(非)하이브리다이즈 영역」이라고도 한다. 본 발명에서, 컨트롤용 주형 핵산을 증폭하기 위한 반응계를, 「컨트롤용 반응계」, 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하기 위한 반응계를, 「검체용 반응계」라고도 한다. 본 발명에서, 이하, 양성 컨트롤 및 음성 컨트롤을 검출하기 위한 「컨트롤용 주형 핵산」을, 「컨트롤용 주형」이라고도 한다.
본 발명에서, 「양성 컨트롤」은, 반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 컨트롤이므로, 「증폭 컨트롤」이라고도 한다. 양성 컨트롤이 양성(+)이란, 증폭 반응이 일어나고 있는 것을 의미하며, 양성 컨트롤이 음성(-)이란, 증폭 반응이 일어나고 있지 않는 것을 의미한다. 본 발명에서, 「음성 컨트롤」은, 반응계에 불필요한 핵산이 혼입하여, 상기 불필요한 핵산의 증폭 산물이 생성되어 있는 것을 나타내는 컨트롤이므로, 「혼입 컨트롤」이라고도 한다. 음성 컨트롤이 양성(+)이란, 상기 불필요한 핵산이 혼입하여, 상기 불필요한 핵산의 증폭 산물이 생성되어 있는 것을 의미하며, 음성 컨트롤이 음성(-)이란, 상기 불필요한 핵산이 혼입하고 있지 않는, 또는, 상기 불필요한 핵산이 혼입했다고 해도, 상기 혼입한 불필요한 핵산으로부터 문제가 되는 증폭 산물은 생성되어 있지 않는 것을 의미한다.
<컨트롤 검출 방법>
본 발명의 컨트롤 검출 방법은, 상술한 바와 같이, 반응계에서 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 상기 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 방법으로서,
상기 컨트롤이, 반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤 및 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤이며,
상기 반응계는, 프라이머, 검출용 프로브 및 컨트롤용 주형 핵산을 함유하고,
상기 프라이머는, 상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머이며,
상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 프로브이며,
상기 컨트롤용 주형 핵산은, 상기 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역은, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며,
상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값이며,
하기 (a1)∼(a3) 공정을 포함하고,
상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤을, 하나의 반응계에서 검출하는 것을 특징으로 한다.
(a1)상기 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭을 행하는 증폭 공정
(a2)상기 (a1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
(a3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤이, 각각 양성인지 음성인지를 판단하는 판단 공정
본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의하면, 상술한 바와 같이, 목적의 검체 핵산의 증폭을 행할 때, 반응계에서, 증폭 반응이 정상으로 일어나고 있는지 여부, 및, 불필요한 핵산의 혼입이 원인이 되는 증폭이 생겨 있는지 여부를, 상기 검체 핵산을 증폭하기 위한 반응계와는 다른 컨트롤용 반응계에서 판단할 수 있다. 사용하는 반응계에서의 증폭 성능의 판단은, 상술한 바와 같이, 목적의 검체 핵산을 증폭시킬 때, 증폭의 유무를 보다 뛰어난 정밀도로 판단하기 위해서 중요하다. 이 때문에, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 있어서, 상기 컨트롤용 주형을 증폭시키는 상기 (a1) 공정은, 예를 들면, 상기 검체용 반응계를 사용한 검체 핵산의 증폭 공정에 앞서, 병행하거나, 또는, 그 후, 동일 조건 하에서 행하는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 예를 들면, 증폭 반응의 시간, 온도 등의 조건을 대략 동일하게 할 수 있으므로, 상기 컨트롤용 주형을 증폭시키는 상기 (a1) 공정과, 상기 검체 핵산의 증폭 공정은, 병행하여 동시에 행하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 복수의 측정부를 구비하는 기기(예를 들면, 증폭 장치)를 사용하여, 각 측정부에서, 상기 컨트롤용 반응계 및 상기 검체용 반응계에 대해, 각각의 증폭 반응을 동시에 행하는 것이 바람직하다. 또, 이 점은, 본 발명의 증폭 방법에 있어서, 상세하게 설명한다.
상기 (a1) 공정에서의 컨트롤용 반응계는, 양성 컨트롤과 음성 컨트롤을 검출하기 위한 반응계이다. 상기 컨트롤용 반응계는, 증폭의 주형으로서, 검체 핵산을 함유하지 않고, 컨트롤용 주형을 함유한다. 상기 컨트롤용 주형의 증폭에 사용하는 상기 컨트롤용 반응계와, 상기 검체 핵산의 증폭에 사용하는 상기 검체용 반응계는, 전자가 상기 컨트롤용 주형을 함유하고, 후자가 검체 핵산을 함유하는 이외는, 같은 조건인 것이 바람직하다. 또, 상기 컨트롤용 주형 및 상기 검체 핵산 중, 상기 컨트롤용 반응계는, 상기 컨트롤용 주형을 함유하고, 검체 핵산을 함유하지 않지만, 상기 검체용 반응계는, 예를 들면, 상기 검체 핵산을 함유하고, 또한, 상기 컨트롤용 주형을 함유하지 않아도 되고, 함유해도 된다.
상기 컨트롤용 주형은, 예를 들면, 1본쇄이어도 되고, 2본쇄이어도 된다. 상기 컨트롤용 주형이 2본쇄의 경우, 예를 들면, 상기 2본쇄를 구성하는 두 1본쇄 중, 어느 것을 핵산 증폭의 주형으로 해도 되지만, 증폭 효율의 점에서, 양방을 주형으로 하는 것이 바람직하다. 상기 2본쇄를 구성하는 두 1본쇄는, 모두가 센스쇄이어도 안티센스쇄이어도 된다.
본 발명의 컨트롤 검출 방법에 있어서, 상기 프라이머 및 검출용 프로브는, 검체 핵산을 증폭하기 위한 검체용 반응계에서 사용하는 검출용 프로브 및 프라이머와 동일한 것을 사용한다. 이 때문에, 상기 컨트롤용 주형은, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능한 것, 상기 검체 핵산의 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능인 것이 필수이다. 이들의 조건은, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형을, 3'측에 상기 프라이머와 상보적인 서열을 갖고, 또한, 상기 서열보다도 5'측에 상기 검출용 프로브와 하이브리다이즈 가능한 서열을 갖는 염기 서열로 설계함으로써 달성할 수 있다. 「프라이머와 상보적인 서열」이란, 예를 들면, 상기 프라이머가 어닐링하여 신장을 개시할 수 있으면 되고, 예를 들면, 상보성의 정도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50% 이상이며, 80% 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100%이다. 「검출용 프로브와 하이브리다이즈 가능한 서열」이란, 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 상기 검출용 프로브의 전체에 상보적인 서열이어도 되고, 상기 검출용 프로브의 부분 영역에 상보적인 서열이어도 되고, 후술하는 Tm값과의 관계 등에 따라 적절히 설정할 수 있다.
상기 컨트롤용 주형은, 또한, 그 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)이, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과, 다른 값인 것이 필수이다. 이 조건은, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역을, 다른 조건으로 함으로써 달성할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 양자의 하이브리다이즈 영역의 길이를 바꾸는 것, 또는, 상기 양자의 하이브리다이즈 영역의 상동성(相同性)을 바꾸는 것 등에 의해 달성할 수 있다. 또, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 표적 서열은, 예를 들면, 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 일부를 제외하고, 동일한 서열인 것이 바람직하다.
우선, 전자의 하이브리다이즈 영역의 길이를 바꾸는 방법에 대해 설명한다. Tm은, 예를 들면, 하이브리다이즈 영역이 상대적으로 길수록, 높고, 하이브리다이즈 영역이 상대적으로 짧을수록, 낮아진다. 따라서, 동일한 검출용 프로브를 사용하는 경우, 예를 들면, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 길이와, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 길이를 바꿈으로써, 양자의 Tm값을 다른 값으로 설정할 수 있다. 즉, 이 형태에 있어서, 상기 컨트롤용 주형은, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 길이가, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 길이와는 다른 길이이다. 이 경우, 예를 들면, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역이, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역보다 길어도 되고, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역이, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역보다 길어도 된다. 상기 컨트롤용 주형의 하이브리다이즈 영역과 상기 표적 서열의 하이브리다이즈 영역과의 관계에 대해, 이하에, 구체예를 들어 설명한다.
우선, 제1 형태로서, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역이, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역보다 긴 형태에 대해 예시한다. 이 경우, 상기 검출용 프로브로서, 예를 들면, 상기 표적 서열의 소정 영역에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 프로브를 사용하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 100% 상보적인 염기 서열인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 컨트롤용 주형은, 예를 들면, 그 증폭 영역에, 상기 검출용 프로브가 부분적으로 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는 것이 바람직하다. 이 형태에 의하면, 예를 들면, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가, 상기 표적 서열에 대해 하이브리다이즈 가능인 것에 대해, 상기 검출용 프로브는, 부분적으로 상기 컨트롤용 주형에 대해 하이브리다이즈 가능하게 된다. 이 때문에, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역이, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역보다도 길어진다. 또, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역에서, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능한 공통의 영역을, 공통 영역 또는 공통 염기 서열이라고도 한다.
상기 컨트롤용 주형은, 예를 들면, 그 증폭 영역에, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과는 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽이 다른 염기 서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 컨트롤용 주형은, 예를 들면, 그 증폭 영역에, 상기 검출용 프로브의 염기 서열에 있어서 5' 영역 및 3' 영역의 적어도 한쪽이 다른 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 것이 바람직하다고 할 수도 있다. 상기 컨트롤용 주형을 이와 같이 설계함으로써, 예를 들면, 상기 프로브는, 그 5' 영역 및 3' 영역의 한쪽을, 상기 컨트롤용 주형에 하이브리다이즈하고, 다른 쪽이, 상기 컨트롤용 주형에 하이브리다이즈하지 않는 상태가 된다.
상기 제1 형태의 구체예를, 도 1을 사용하여 설명한다. 또, 본 발명은, 이것에 제한되지는 않는다. 도 1에 있어서, 좌측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 표적 서열에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 개략도이며, 우측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 개략도이다. 좌측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가 상기 표적 서열의 소정 영역에 하이브리다이즈한다. 다른 한편, 우측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 컨트롤용 주형은, 그 증폭 영역에, 상기 검출용 프로브의 염기 서열에 있어서 3' 영역이 다른 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는다. 즉, 우측 도면의 상기 컨트롤용 주형은, 좌측 도면의 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역이라는, 5' 영역이 다른 염기 서열(도면에서 ×표시)을 갖고 있다. 이 때문에, 상기 컨트롤용 주형에 대해, 상기 검출용 프로브의 3' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 상태가 된다. 즉, 상기 검출용 프로브의 3' 영역은, 비(非)하이브리다이즈 영역이 된다. 이와 같이, 동일한 검출용 프로브를 사용해도, 상기 검출용 프로브의 전체가 하이브리다이즈한 2본쇄와, 상기 검출용 프로브의 부분 영역이 하이브리다이즈한 2본쇄에서는, 전자의 쪽이 후자보다도 높은 Tm값이 된다(TmA>TmC).
도 1에 있어서는, 상기 컨트롤용 주형에 대해, 상기 검출용 프로브의 3' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 예를 예시했지만, 이것에 제한되지는 않고, 상기 검출용 프로브의 5' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 형태이어도 된다.
상기 검출용 프로브의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 5∼50염기길이이며, 바람직하게는, 10∼30염기길이이다. 상기 검출용 프로브에 있어서, 상기 컨트롤용 주형과 하이브리다이즈하는 염기 서열의 길이는, 예를 들면, 5∼40염기길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 10∼30염기길이이며, 더욱 바람직하게는 15∼25염기길이이다. 이 길이는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역에서의, 상기 검출용 프로브가 부분적으로 하이브리다이즈 가능한 염기 서열의 길이에 상당하며, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역과, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과의 공통 서열의 길이라고도 할 수 있다. 또한, 상기 검출용 프로브에 있어서, 상기 컨트롤용 주형과 하이브리다이즈하지 않는 비하이브리다이즈 영역의 염기 서열의 길이는, 예를 들면, 1∼40염기길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 3∼20염기길이이며, 더욱 바람직하게는, 5∼10염기길이이다. 이 길이는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역에서, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과는 다른 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽의 서열의 길이에 상당하며, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역 중, 상기 컨트롤용형 핵산에 있어서의 하이브리다이즈 영역과의 공통 서열 이외의 서열(비공통 서열)의 길이라고도 할 수 있다. 도 1의 우측 도면에서는, 예를 들면, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈하지 않는 비하이브리다이즈 영역(도면에서 ×표시의 영역)의 길이에 상당한다. 또한, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 길이를 100%로 한 경우, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 길이는, 예를 들면, 그 50∼95%인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 75∼90%이다.
이어서, 제2 형태로서, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역이, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역보다 긴 형태에 대해 예시한다. 이 경우, 상기 검출용 프로브로서, 예를 들면, 상기 표적 서열에 부분적으로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 프로브를 사용한다. 즉, 상기 검출용 프로브로서는, 상기 표적 서열에 대한 하이브리다이즈 영역과 비하이브리다이즈 영역을 갖는 프로브를 사용한다. 그리고, 상기 컨트롤용 주형은, 예를 들면, 그 증폭 영역 내에, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과 동일한 염기 서열, 및, 그것에 인접하여, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽에 인접하는 영역과는 다른 염기 서열을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로, 상기 다른 염기 서열은, 상기 동일한 염기 서열의 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽, 보다 상세하게는, 5'말단 및 3'말단의 적어도 한쪽에 인접하여 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽에 인접하는 영역이란, 예를 들면, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브를 얼라인먼트(alignment)했을 때에, 상기 검출용 프로브와 대응하는 영역으로서, 상기 검출용 프로브의 부분 영역이 하이브리다이즈하지 않는 영역, 즉, 비하이브리다이즈 영역이다. 이 형태에 의하면, 예를 들면, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가, 상기 컨트롤용 주형에 대해 하이브리다이즈 가능인 것에 대해, 상기 검출용 프로브는, 부분적으로 상기 표적 서열에 대해 하이브리다이즈 가능하게 된다. 이 때문에, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역이, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역보다도 길어진다. 또, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역에서, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능한 공통의 영역을, 공통 영역 또는 공통 염기 서열이라고도 한다.
이 제2 형태의 구체예를, 도 3을 사용하여 설명한다. 또, 본 발명은, 이것에 제한되지는 않는다. 도 3에 있어서, 좌측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 표적 서열에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 모식도이며, 우측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 컨트롤용 주형에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 모식도이다. 좌측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 검출용 프로브는, 그 3' 영역을 제외하고, 상기 표적 서열의 소정 영역에 상보적인 염기 서열로 한다. 이 때문에, 상기 표적 서열에 대해서는, 상기 검출용 프로브의 3' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 상태가 된다. 즉, 상기 검출용 프로브의 3' 영역은, 비하이브리다이즈 영역이 된다. 다른 한편, 우측 도면의 상기 컨트롤용 주형은, 좌측 도면의 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 비하이브리다이즈 영역과는, 5' 영역이 다른 염기 서열(도면에서 ×표시)을 갖고 있다. 즉, 상기 컨트롤용 주형은, 상기 검출용 프로브 전체와 상보적인 염기 서열을 갖는다. 이 때문에, 상기 컨트롤용 주형에 대해서는, 상기 검출용 프로브의 전체가 하이브리다이즈하는 상태가 되고, 상기 표적 서열에 대해서는, 상기 검출용 프로브의 3' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 상태가 된다. 이와 같이, 동일한 검출용 프로브를 하이브리다이즈시켰을 때, 상기 검출용 프로브의 전체가 하이브리다이즈한 2본쇄와, 상기 검출용 프로브의 부분 영역이 하이브리다이즈한 2본쇄에서는, 전자의 쪽이 후자보다도 높은 Tm값이 된다(TmC>TmA).
도 3에 있어서는, 표적 서열에 대해, 검출용 프로브의 3' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 예를 예시했지만, 이것에 제한되지는 않고, 검출용 프로브의 5' 영역이 하이브리다이즈하지 않는 형태이어도 된다.
상기 검출용 프로브는, 상술한 바와 같이, 상기 표적 서열에 부분적으로 상보적인 염기 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 검출용 프로브에 있어서, 상기 표적 서열과 하이브리다이즈하는 염기 서열의 길이는, 예를 들면, 5∼40염기길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 10∼30염기길이이며, 더욱 바람직하게는 15∼25염기길이이다. 이 길이는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역 중, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과 공통하는 염기 서열의 길이에 상당하며, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역과, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과의 공통 서열의 길이라고도 할 수 있다. 또한, 상기 검출용 프로브에 있어서, 상기 표적 서열과 하이브리다이즈하지 않는 비하이브리다이즈 영역의 염기 서열의 길이는, 예를 들면, 1∼40염기길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 3∼20염기길이이며, 더욱 바람직하게는, 5∼10염기길이이다. 이 길이는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역 중, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과 다른 염기 서열의 길이에 상당하며, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역 중, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역과의 공통 서열 이외의 서열(비공통 서열)의 길이라고도 할 수 있다. 도 3의 우측 도면에서는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형에 대해, 상기 검출용 프로브가, 상기 공통 서열 이외에서 하이브리다이즈하는 영역(도면에서 ×표시의 영역)의 길이에 상당한다. 또한, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 길이를 100%로 한 경우, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 길이는, 예를 들면, 그 50∼95%인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 75∼90%이다.
이어서, 상술한, 후자의, 하이브리다이즈 영역의 상동성을 바꾸는 방법에 대해 설명한다. Tm은, 예를 들면, 검출용 프로브와의 하이브리다이즈 영역에서, 상기 검출용 프로브에 대한 상보성이 상대적으로 높을수록, 높고, 상기 검출용 프로브에 대한 상보성이 낮을수록, 낮아진다. 이 때문에, 동일한 검출용 프로브를 사용하는 경우, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형의 상기 하이브리다이즈 영역과, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 염기 서열의 상동성을, 100% 미만으로 한다. 이에 의해, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성과, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성을, 다른 값으로 설정할 수 있고, 결과적으로, 양자의 Tm값을 다른 값으로 설정할 수 있다. 이 경우, 예를 들면, 상기 표적 서열의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성을, 상기 컨트롤용 주형의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성보다 높게 해도 되고, 상기 컨트롤용 주형의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성을, 상기 표적 서열의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성보다 높게 설정해도 된다. 이 형태에 있어서, 하이브리다이즈 영역의 길이는, 예를 들면, 상기 표적 서열과 상기 컨트롤용 주형에 있어서, 동일해도 된다. 상기 컨트롤용 주형의 하이브리다이즈 영역과 상기 표적 서열의 하이브리다이즈 영역과의 관계에 대해, 이하에, 구체예를 들어 설명한다.
상기 하이브리다이즈 영역의 상동성은, 예를 들면, 100% 미만이 바람직하고, 보다 바람직하게는 95% 미만이며, 더욱 바람직하게는 90% 미만이다. 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역과, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역에서, 다른 염기의 수는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1∼20염기인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 1∼10염기이며, 더욱 바람직하게는, 1∼5염기이다. 상기 다른 염기는, 예를 들면, 하이브리다이즈 영역에서, 연속해도 되고, 비연속이어도 된다. 또한, 상기 컨트롤용 주형의 상기 하이브리다이즈 영역의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성과, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성은, 예를 들면, 한쪽의 상보성이, 다른 쪽의 상보성보다도 높으면 된다. 구체적으로는, 상대적으로 높은 상보성은, 예를 들면, 90∼100%이며, 바람직하게는 100%이며, 상대적으로 낮은 상보성은, 상기 상대적으로 높은 상보성보다도, 예를 들면, 5∼10% 정도 낮은 것이 바람직하다.
우선, 제1 형태로서, 상기 표적 서열의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성이, 상기 컨트롤용 주형의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성보다 높은 형태에 대해, 도 4를 사용하여 설명한다. 또, 본 발명은, 이것에 제한되지는 않는다.
도 4는, 상기 표적 서열의 소정 영역에 100% 상보적인 염기 서열로 이루어지는 검출용 프로브를 사용하고, 상기 컨트롤용 주형에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 염기 서열을, 상기 검출용 프로브와의 상보성이 100% 미만이 되는 서열로 설정한 예이다. 도 4에 있어서, 좌측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 표적 서열에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 개략도이며, 우측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 개략도이다. 상기 검출용 프로브는, 상술한 바와 같이, 상기 표적 서열의 소정 영역에 100% 상보적인 서열이다. 이 때문에, 좌측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가, 상기 표적 서열의 소정 영역에 하이브리다이즈하고, 또한, 그 하이브리다이즈 영역에서, 모든 염기가 염기쌍을 형성하고 있다. 다른 한편, 상기 컨트롤용 주형은, 상기 검출용 프로브와의 상보성이 100% 미만이 되는 서열이며, 구체적으로는, 상기 검출용 프로브와, 우측 도면의 ×표시에 있어서, 비상보적인 미스매치의 염기를 갖고 있다. 즉, 상기 컨트롤용 주형은, 상기 표적 핵산의 소정 영역(하이브리다이즈 영역)과는 다른 상동성의 서열을 갖고 있다. 이 때문에, 우측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가, 상기 컨트롤용 주형에 하이브리다이즈하지만, 그 하이브리다이즈 영역의 내부에서, 염기쌍을 형성하지 않는 미스매치(도면에서 ×표시)가 생긴다. 이 때문에, 상기 컨트롤용 주형의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성은, 상기 표적 서열의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성보다도 낮아진다. 따라서, 동일한 검출용 프로브를 사용해도 상기 하이브리다이즈 영역의 전체가 염기쌍을 형성한 2본쇄와, 상기 하이브리다이즈 영역의 내부에서, 염기쌍을 형성하지 않는 미스매치를 갖는 2본쇄에서는, 전자의 쪽이 후자보다도 높은 Tm값이 된다(TmA>TmC). 또, 도 4에서는, 상기 프로브를, 상기 표적 서열의 소정 영역에 100% 상보적인 서열로 했지만, 상기 소정 영역과 미스매치를 갖는 서열이어도 된다. 이 경우, 예를 들면, 상기 표적 서열에 대한 미스매치의 수보다도, 상기 컨트롤용 주형에 대한 미스매치의 수가 많으면, 마찬가지의 것이 된다.
이어서, 제2 형태로서, 상기 컨트롤용 주형의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성이, 상기 표적 서열의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성보다 높은 형태에 대해, 도 5를 사용하여 설명한다. 또, 본 발명은, 이것에 제한되지는 않는다.
도 5는, 상기 컨트롤용 주형의 소정 영역에 100% 상보적인 염기 서열로 이루어지는 검출용 프로브를 사용하고, 상기 표적 서열에 있어서의 하이브리다이즈 영역의 염기 서열을, 상기 검출용 프로브와의 상보성이 100% 미만이 되는 서열로 설정한 예이다. 도 5에 있어서, 좌측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 표적 서열에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 개략도이며, 우측 도면은, 상기 검출용 프로브가 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역에 하이브리다이즈한 상태를 나타내는 개략도이다. 상기 검출용 프로브는, 상술한 바와 같이, 상기 컨트롤용 주형의 소정 영역에 100% 상보적인 서열이다. 이 때문에, 우측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가, 상기 컨트롤용 주형의 소정 영역에 하이브리다이즈하고, 또한, 그 하이브리다이즈 영역에서, 모든 염기가 염기쌍을 형성하고 있다. 다른 한편, 상기 표적 서열은, 상기 검출용 프로브와의 상보성이 100% 미만이 되는 서열이며, 구체적으로는, 상기 검출용 프로브와, 좌측 도면의 ×표시에 있어서, 비상보적인 미스매치의 염기를 갖고 있다. 즉, 상기 표적 서열은, 상기 컨트롤용 주형의 소정 영역(하이브리다이즈 영역)과는 다른 상동성의 서열을 갖고 있다. 이 때문에, 좌측 도면에 나타내는 바와 같이, 상기 검출용 프로브는, 그 전체가, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈하지만, 그 하이브리다이즈 영역의 내부에서, 염기쌍을 형성하지 않는 미스매치(도면에서 ×표시)가 생긴다. 이 때문에, 상기 표적 서열의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성은, 상기 컨트롤용 주형의 상기 검출용 프로브에 대한 상보성보다도 낮아진다. 따라서, 동일한 검출용 프로브를 사용해도 상기 하이브리다이즈 영역의 전체가 염기쌍을 형성한 2본쇄와, 상기 하이브리다이즈 영역의 내부에서, 염기쌍을 형성하지 않는 미스매치를 갖는 2본쇄에서는, 전자의 쪽이 후자보다도 높은 Tm값이 된다(TmC>TmA). 또, 도 5에서는, 상기 프로브를, 상기 컨트롤용 주형의 소정 영역에 100% 상보적인 서열로 했지만, 상기 소정 영역과 미스매치를 갖는 서열이어도 된다. 이 경우, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형에 대한 미스매치의 수보다도, 상기 표적 서열에 대한 미스매치의 수가 많으면, 마찬가지의 것이 된다.
상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)이, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값으로 하는 방법으로서는, 이상의 방법에 제한되지는 않는다. 예를 들면, RNA 아날로그인 LNA, 펩티드 핵산인 PNA, 가교화 핵산인 BNA 등의 인공 핵산을 사용함으로써, Tm값을 조정할 수도 있다. 구체예로서는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형의 상기 하이브리다이즈 영역, 상기 검출용 프로브에 있어서의, 상기 표적 서열 및 컨트롤용 주형의 어느 한쪽만과 하이브리다이즈하는 부위에, 상술한 인공 핵산 등을 함유시킴으로써, Tm값을 조정할 수도 있다.
상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)과, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과의 차는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1∼50℃가 바람직하고, 보다 바람직하게는 3∼30℃이며, 특히 바람직하게는 5∼10℃이다.
상기 컨트롤용 주형의 길이는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 표적 서열에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 컨트롤용 주형의 길이는, 예를 들면, 표적 서열보다도 0∼1,000,000염기 긴 서열이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 100∼100,000염기 긴 서열, 더욱 바람직하게는 1,000∼10,000염기 긴 서열이다. 구체예로서는, 예를 들면, 100∼1,000,000염기가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 500∼100,000염기, 더욱 바람직하게는 1,000∼10,000염기이다. 또한, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 20∼100,000염기가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 50∼10,000염기, 더욱 바람직하게는 100∼1,000염기이다.
본 발명에서, 상기 프라이머의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 센스쇄 및 안티센스쇄의 어느 한쪽만을 증폭하는 프라이머를 사용할 수도 있지만, 증폭 효율의 점에서, 센스쇄 및 안티센스쇄의 양방을 증폭하는 2종류 이상의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 프라이머의 길이는, 특별히 제한되지 않고, 일반적으로, 예를 들면, 10∼50염기이며, 15∼40염기, 더욱 바람직하게는, 16∼35염기이다.
본 발명에서, 상기 검출용 프로브는, 예를 들면, 센스쇄에 하이브리다이즈하도록 설계되어도 되고, 안티센스쇄에 하이브리다이즈하도록 설계되어도 된다. 본 발명에서, 「표적 서열에 하이브리다이즈 가능」이란, 표적 서열에 하이브리다이즈 가능해도 되고, 표적 서열의 상보쇄에 하이브리다이즈 가능해도 된다.
상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능하면 되고, 상기 표적 서열의 어느 영역에 하이브리다이즈하도록 설계되어도 된다. 또한, 후술하는 바와 같이, 본 발명은, 융해 곡선 해석에 의한 다형의 검출에 있어서도 유효하게 이용할 수 있다. 이 경우, 상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 있어서의 목적의 다형이 생기는 염기 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈 가능하도록 설계되는 것이 바람직하다. 또, 다형의 검출에 대해서는, 후술한다.
상기 검출용 프로브의 길이는, 특별히 제한되지 않고, 일반적으로, 예를 들면, 5∼50염기이며, 바람직하게는 10∼30염기이다.
상기 검출용 프로브는, 예를 들면, 표지 물질을 갖지 않는 미표지 프로브이어도 되고, 표지 물질을 갖는 표지 프로브이어도 된다. 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 올리고뉴클레오티드가, 상기 표지 물질로 표지화(수식)되어 있는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질에 의해 표지화되는 부위는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 5'말단 영역 또는 3'말단 영역인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5'말단 또는 3'말단이다. 또한, 후술하는 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질에 의해 표지화되는 염기는, 예를 들면, 시토신(c) 또는 구아닌(g)인 것이 바람직하다. 또, 상기 표지 물질은, 예를 들면, 염기를 직접 표지화해도 되고, 상기 염기를 함유하는 뉴클레오티드 잔기의 어느 부위를 표지함으로써, 상기 염기를 간접적으로 표지화해도 된다. 상기 표지 물질은, 예를 들면, 상기 검출용 프로브의 3'측 및 5'측의 어느 것에 결합시켜도 된다. 또한, 상기 검출용 프로브는, 예를 들면, 핵산 증폭 반응에 있어서의 프로브 자체의 신장을 예방하기 위해서, 그 3'말단에, 인산기 또는 상술한 바와 같은 표지 물질이 더 부가되어도 된다.
상기 표지 물질은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 표지 프로브가 단독인지, 하이브리드를 형성하고 있는지에 따라, 시그널을 발하는 것이 바람직하다. 상기 시그널의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 형광, 정색(呈色) 또는 발색(發色) 등을 들 수 있다. 상기 시그널이 형광의 경우, 시그널값으로서는, 예를 들면, 형광 강도를 들 수 있다. 상기 시그널이 정색 또는 발색의 경우, 상기 시그널값으로서는, 예를 들면, 반사율, 흡광도, 투과율 등을 들 수 있다. 또한, 상기 시그널은, 예를 들면, 상기 표지 물질로부터 직접 발해도 되고, 간접적으로 발해도 된다.
상기 표지 물질은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 형광단 등의 형광 물질 등을 들 수 있다. 상기 형광 물질로서는, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판의 형광 물질로서는, 예를 들면, Pacific Blue(상표명, 몰레큘러프로브사제), BODIPY FL(상표명, 몰레큘러프로브사제), FluorePrime(상품명, 아머샴-파르머시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(상표명, ABI사제), Cy3 및 Cy5(상품명, 아머샴-파르머시아사제), TAMRA(상표명, 몰레큘러프로브사제) 등을 들 수 있다. 상기 형광 물질의 검출 조건은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 사용하는 형광 물질의 종류에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들면, Pacific Blue는, 검출 파장 450∼480nm, TAMRA는, 검출 파장 585∼700nm, BODIPY FL는, 검출 파장 515∼555nm에서 검출할 수 있다. 이와 같은 검출용 프로브를 사용하면, 예를 들면, 시그널로서 형광을 검출하여, 시그널값으로서 형광 강도를 측정함으로써, 형광 강도의 변동으로부터, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 표지 프로브는, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브인 것이 바람직하다. 상기 표지 물질이 형광 물질의 경우, 상기 표지 프로브는, 예를 들면, 상기 형광 물질로 표지화되어, 단독으로 형광을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들면, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이와 같은 현상은, 일반적으로, 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)이라 불린다. 이 현상을 이용한 프로브는, 일반적으로, 형광 소광 프로브라 불린다. 그 중에서도, 상기 형광 소광 프로브로서는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 3'말단 혹은 5'말단이 상기 형광 물질로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 상기 말단의 염기는, 시토신(c) 또는 구아닌(g)인 것이 바람직하다. 상기 말단의 염기가 시토신(c)의 경우, 상기 형광 소광 프로브는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형 또는 검체 핵산과 하이브리드를 형성했을 때, 상기 컨트롤용 주형 또는 검체 핵산에 있어서의, 표지화된 말단의 시토신(c)과 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3염기 떨어진 염기가 구아닌(g)이 되도록, 상기 형광 소광 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1염기 떨어진 염기란, 상기 쌍을 이루는 염기의 이웃 염기를 의미한다. 이와 같은 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라 불리고, 이른바 QProbe(등록상표)로서 알려져 있다. 이와 같은 구아닌 소광 프로브가 상기 검체 핵산에 하이브리다이즈하면, 예를 들면, 상기 형광 물질로 표지화된 말단의 시토신(c)이, 상기 컨트롤용 주형 또는 검체 핵산에 있어서의 구아닌(g)에 접근함으로써, 상기 형광 물질의 발광이 약해지는(형광 강도가 감소하는) 현상을 나타낸다. 이와 같은 프로브를 사용하면, 형광 강도의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 검출용 프로브는, 예를 들면, 3'말단에 인산기가 부가되어도 된다. 후술하는 바와 같이, 상기 컨트롤용 주형 및 검체 핵산은, 예를 들면, PCR 등의 핵산 증폭법에 의해 제조할 수 있고, 이 때, 상기 검출용 프로브를 증폭 반응의 반응계에 공존시킬 수 있다. 이와 같은 경우, 상기 검출용 프로브의 3'말단에 인산기를 부가시켜두면, 상기 프로브 자체가 상기 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분하게 방지할 수 있다. 또한, 3'말단에 상술한 바와 같은 표지 물질을 부가함으로써도, 같은 효과가 얻어진다.
상기 프라이머, 검출용 프로브 및 상기 컨트롤용 주형은, 예를 들면, 디옥시리보뉴클레오티드나 리보뉴클레오티드 등의 뉴클레오티드로 구성되어도 되고, RNA 아날로그인 LNA, 펩티드 핵산인 PNA, 가교화 핵산인 BNA 등을 함유해도 된다.
상기 (a1) 공정에서, 핵산의 증폭 방법으로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)법, TMA(Transcription-Mediated Amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있고, 그 중에서도, PCR법이 바람직하다. 또, 상기 핵산 증폭법의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
상기 (a2) 공정은, 상술한 바와 같이 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정이며, 예를 들면, 이른바 Tm 해석을 행하는 것이 바람직하다. 여기서, Tm 해석에 있어서의 Tm값에 대해 설명한다. 예를 들면, 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을 가열해가면, 260nm에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양 쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다. 상기 Tm값은, 예를 들면, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)나 최근접염기쌍법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있고, 실제의 측정에 의해 결정할 수도 있다.
상기 (a2) 공정에서, 상기 융해 곡선 해석은, 예를 들면, 이하와 같이 행할 수 있다. 즉, 상기 (a2) 공정은, 예를 들면, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 산물을 함유하는 상기 (a1) 공정의 상기 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정이다.
상기 (a2) 공정에서, 상기 증폭 산물과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 상술한, 260nm에 있어서의 흡광도 측정이어도 되지만, 표지 물질의 시그널 측정이어도 된다. 구체적으로는, 상기 검출용 프로브로서, 상술한 바와 같이, 상기 표지 물질로 표지화된 표지 프로브를 사용하여, 상기 표지 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지 프로브로서는, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 상기 증폭 산물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 상기 증폭 산물로부터 상기 프로브가 해리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 상기 증폭 산물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 상기 증폭 산물로부터 상기 프로브가 유리(遊離)하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 상기 표지 물질의 시그널을 검출함으로써, 상기 260nm에 있어서의 흡광도 측정과 같이, 하이브리드 형성체의 융해의 진행 및 Tm값의 결정 등을 행할 수 있다. 상기 표지 물질의 시그널 검출은, 예를 들면, 상기 표지 물질의 시그널에 특유의 조건에서 검출하면 되고, 상기 조건으로서는, 예를 들면, 여기 파장, 검출 파장 등을 들 수 있다. 또, 상기 표지 프로브 및 상기 표지 물질에 대해서는, 상술한 바와 같다.
상기 검출용 프로브의 첨가의 타이밍은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 (a2) 공정 전이면 되고, 상기 (a1)의 증폭 공정 전, 도중 또는 후에 첨가할 수 있다. 그 중에서도, 예를 들면, 첨가를 위해서 상기 반응계를 외부 환경에 노출할 필요가 없고, 또한, 상기 (a1) 공정의 증폭 반응과 상기 (a2) 공정의 융해 곡선 해석을, 연속적으로 행하는 것이 가능하기 위해서, 상기 (a1) 공정의 증폭 반응 전에, 상기 반응계에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 검출용 프로브는, 상술한 바와 같이, 그 3'말단이 표지 물질 또는 인산기로 수식되어 있는 것이 바람직하다.
상기 (a3) 공정에서, 상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤이, 각각 양성인지 음성인지는, 예를 들면, 이하와 같이 판단할 수 있다. 즉, 상기 (a3) 공정은, 예를 들면, 상기 융해 곡선에 있어서,
상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)에 피크가 존재하는 경우, 양성 컨트롤이 양성(+)이라고 판단하고,
상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)에 피크가 존재하지 않는 경우, 양성 컨트롤이 음성(-)이라고 판단하고,
상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에 피크가 존재하지 않는 경우, 음성 컨트롤이 음성(-)이라고 판단하고,
상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에 피크가 존재하는 경우, 음성 컨트롤이 양성(+)이라고 판단한다.
이어서, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 대해, 도 1에 나타내는 컨트롤용 주형 및 검출용 프로브를 사용하여, PCR법에 의해 핵산 증폭을 행하는 예를 들어 설명한다. 또, 본 발명은, 이것에 제한되지는 않는다. 또한, PCR의 조건은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
우선, 상기 컨트롤용 주형, 프라이머 및 검출용 프로브를 함유하는 반응액을 준비한다.
상기 반응액에 있어서의 상기 컨트롤용 주형의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 10-12∼10-7μmol/L가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10-11∼10-8μmol/L이며, 특히 바람직하게는 10-10∼10-9μmol/L이다.
상기 반응액에 있어서의 프라이머의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.01∼10μmol/L가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05∼5μmol/L이며, 특히 바람직하게는 0.1∼1μmol/L이다. 또한, 프라이머의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 상술한 바와 같이, 2종류 이상을 사용하는 것이 바람직하고, 각각 상술한 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 반응계에서의 검출용 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 10∼400nmol/L가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼200nmol/L이다.
상기 반응액에 있어서의 다른 성분은, 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 성분을 들 수 있고, 그 비율도 특별히 제한되지 않는다. 상기 성분으로서는, 예를 들면, DNA 폴리머라제 등의 폴리머라제, 뉴클레오티드(뉴클레오시드3인산) 및 용매 등을 들 수 있다.
상기 DNA 폴리머라제로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 구체예로서는, 테르무스·아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라제(미국 특허 제4,889,818호 및 동(同) 제5,079,352호)(상품명 Taq 폴리머라제), 테르무스·테루모필루스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 피로코쿠스·푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerase : Stratagenes사제), 테르모코쿠스·리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래 DNA 폴리머라제(EP-A 455 430)(상표Vent : New England Biolabs사제) 등이 상업적으로 입수 가능하며, 그 중에서도, 테르무스·아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 DNA 폴리머라제가 바람직하다.
상기 반응액 중의 DNA 폴리머라제의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1∼100U/mL이며, 바람직하게는 5∼50U/mL이며, 보다 바람직하게는 20∼30U/mL이다. 또, DNA 폴리머라제의 활성 단위(U)는, 일반적으로, 활성화 연어 정자 DNA를 주형 프라이머로서, 활성 측정용 반응액 중, 74℃에서, 30분간에 10nmol의 전 뉴클레오티드를 산불용성 침전물에 취입하는 활성이 1U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예를 들면, 25mmol/L TAPS buffer(pH9.3, 25℃), 50mM KCl, 2mmol/L MgCl2, 1mM 메르캅토에탄올, 200μmol/L dATP, 200μmol/L dGTP, 200μmol/L dTTP, 100μmol/L[α-32P] dCTP, 0.25mg/mL 활성화 연어 정자 DNA이다.
상기 뉴클레오시드3인산으로서는, 통상, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및, dTTP 또는 dUTP)를 들 수 있다. 상기 반응액 중의 dNTP의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.01∼1mmol/L이며, 바람직하게는, 0.05∼0.5mmol/L이며, 보다 바람직하게는, 0.1∼0.3mmol/L이다.
상기 용매로서는, 예를 들면, Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등을 들 수 있고, 시판의 PCR용 완충액이나 시판의 PCR 키트의 완충액 등이 사용할 수 있다.
또한, 상기 반응액은, 또한, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl2, MgSO4, 글리세롤 등을 함유해도 되고, 이들의 첨가 비율은, 예를 들면, PCR 반응을 저해하지 않는 범위로 설정하면 된다.
상기 반응액의 전 체적은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 사용하는 기기(써멀싸이클러) 등에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 통상, 1∼500μL이며, 바람직하게는 10∼100μL이다.
이어서, 상기 반응액을 사용하여, PCR에 의해, 상기 컨트롤용 주형의 증폭을 행한다. PCR는, 예를 들면, (1)2본쇄 핵산의 1본쇄 핵산으로의 해리, (2)프라이머의 어닐링, (3)프라이머의 신장(폴리머라제 반응)의 세 공정을 포함한다. 각 공정의 조건은, 특별히 제한되지 않지만, 상기 (1) 공정은, 예를 들면, 90∼99℃, 1∼120초가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 92∼95℃, 1∼60초이며, 상기 (2) 공정은, 예를 들면, 40∼70℃, 1∼300초가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 50∼70℃, 5∼60초이며, 상기 (3) 공정은, 예를 들면, 50∼80℃, 1∼300초가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 50∼75℃, 5∼60초이다. 또한, 사이클수도 특별히 제한되지 않고, 상기 (1)∼(3)의 3 공정을 1사이클로 하여, 예를 들면, 30사이클 이상이 바람직하다. 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 합계 100사이클 이하, 바람직하게는 70사이클 이하, 더욱 바람직하게는 50사이클 이하이다. 각 스텝의 온도 변화는, 예를 들면, 써멀싸이클러 등을 사용하여 자동적으로 제어하면 된다.
그리고, 상기 증폭 반응 후의 반응계를 사용하여, 융해 곡선 해석을 행한다.
상기 융해 곡선 해석은, 예를 들면, 상기 증폭 공정 후의 상기 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 공정에서 얻어진 상기 증폭 산물과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하여, 온도 변화에 수반하는 상기 시그널값의 변동을 해석한다. 그 결과, 큰 시그널값 변동을 나타내는 온도가, 상기 증폭 산물과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 Tm값이며, 그 온도에 시그널값 변동의 피크가 존재한다고 판단할 수 있다. 또한, 큰 시그널값 변동을 나타내는 온도가 존재하지 않는 경우에는, 시그널값 변동의 피크는 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 이 피크의 유무와, 피크를 나타내는 온도(Tm값)의 결과에 의거하여, 후술하는 상기 (a3)의 판단 공정에서, 컨트롤의 판단을 행한다.
상기 증폭 산물과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성은, 예를 들면, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 상기 반응액의 온도를 변화시킴으로써 행할 수 있다. 이 경우, 상술한 바와 같이, 미리 상기 검출용 프로브를 첨가한 상기 반응액에 대해, 증폭 반응을 행한 후, 상기 반응액을 온도 변화시키는 것이 바람직하다.
상기 하이브리드 형성은, 예를 들면, 우선, 2본쇄 DNA인 상기 증폭 산물을 1본쇄 DNA로 해리하고, 그리고, 상기 1본쇄 DNA와 상기 검출용 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다.
상기 증폭 산물의 해리는, 예를 들면, 상기 반응액을 가열함으로써 행할 수 있다. 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 85∼95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않지만, 통상, 1초∼10분이며, 바람직하게는 1초∼5분이다.
해리한 1본쇄 DNA와 상기 검출용 프로브와의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리를 위한 가열 처리 후, 그 가열 온도를 강하시킴으로써, 즉, 상기 반응액의 온도를 강하시킴으로써, 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면, 40∼50℃이다. 또한, 상기 온도에서의 처리 시간은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1∼600초이다.
계속해서, 상술한 바와 같이, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예를 들면, 상기 반응액(상기 하이브리드 형성체)을 가열하여, 온도 상승에 수반하는 시그널값의 변동을 측정한다.
시그널값의 측정은, 상술한 바와 같이, 상기 미표지 프로브를 사용하여, 260nm의 흡광도를 측정해도 되지만, 상기 표지 프로브를 사용하여, 각 표지 물질의 시그널을 측정하는 것이 바람직하다. 상기 표지 프로브로서는, 상술한 바와 같이, 예를 들면, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 들 수 있다. 전자의 프로브이면, 하이브리드(2본쇄 핵산)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 프로브가 유리(遊離)하면 시그널을 나타낸다. 따라서, 이와 같은 프로브를 사용하는 경우는, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다. 전자의 프로브로서는, 상술한 바와 같은 구아닌 소광 프로브 등을 들 수 있다. 또한, 후자의 프로브이면, 하이브리드(2본쇄 핵산)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이와 같은 프로브를 사용하는 경우는, 반대로, 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.
시그널값의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온∼85℃이며, 바람직하게는 25∼70℃이며, 종료 온도는, 예를 들면, 40∼105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1∼20℃/초이며, 바람직하게는 0.3∼5℃/초이다.
이어서, 측정한 시그널값으로부터, 온도 변화에 수반하는 시그널값의 변동을 해석하여, 큰 변동(피크)을 나타내는 Tm값을 결정한다. 시그널값의 변동은, 예를 들면, 단위 시간(t)당의 시그널값(F)의 변화량을 산출함으로써 해석할 수 있다. 하이브리드 형성체의 융해(1본쇄화)에 의해 시그널값이 증가하는 경우는, 예를 들면, 얻어진 시그널값으로부터, 각 온도에 있어서의 단위 시간(t)당의 시그널값(F)의 증가량 또는 그 음의 미분값(-dF증가량/dt)을 산출하여, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간(t)당의 시그널값(F)의 증가량 또는 그 미분값(dF증가량/dt)이 가장 높은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 다른 한편, 하이브리드 형성체의 융해(1본쇄화)에 의해 시그널값이 감소하는 경우에는, 예를 들면, 반대로, 단위 시간(t)당 시그널값(F)의 감소량을 산출함으로써, Tm값을 결정할 수도 있다.
또, 상술한 바와 같이, 상기 반응액의 온도를 상승시켜, 온도 상승에 수반하는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널값을 측정하고, 그 변동을 해석해도 된다. 즉, 상기 반응계의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 수반하는 시그널값의 변동을 해석해도 된다.
상기 시그널값의 변동의 해석은, 예를 들면, 온도와 시그널값의 변동과의 관계를 플로팅한 그래프를 작성하여 해석하는 것도 가능하지만, 상기 융해 곡선 해석 공정에서, 상기 그래프의 작성은 필수는 아니다.
계속해서, 상기 융해 곡선 해석의 결과에 의거하여, 양성 컨트롤 및 음성 컨트롤의 판단을 행한다.
상기 융해 곡선 해석에서 얻어진 피크의 온도가, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)인 경우, 반응액에 있어서 핵산 증폭이 일어나고 있음을 알 수 있다. 즉, 양성 컨트롤은 양성(+)이라고 판단할 수 있다. 다른 한편, 상기 융해 곡선 해석에 있어서 피크가 검출되지 않았던 경우에는, 반응계에서 핵산 증폭이 일어나 있지 않음을 알 수 있다. 즉, 양성 컨트롤은 음성(-)이라고 판단할 수 있다. 또한, 상기 융해 곡선 해석에 있어서, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에도 피크가 검출된 경우는, 반응계에 불필요한 핵산이 혼입하고, 그것을 주형으로 한 핵산 증폭이 일어나고 있음을 알 수 있다. 즉, 음성 컨트롤이 양성(+)이라고 판단할 수 있다. 다른 한편, 상기 융해 곡선 해석에 있어서, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에 피크가 검출되지 않았던 경우는, 반응계에 불필요한 핵산이 혼입하고 있지 않음을 알 수 있다. 즉, 음성 컨트롤이 음성(-)이라고 판단할 수 있다. 이들의 결과로부터, 예를 들면, 양성 컨트롤이 양성(+) 또한 음성 컨트롤이 음성(-)이라고 판단했을 때에는, 별도, 검체 핵산을 사용하여 증폭 반응을 행한 반응액에 대해, 증폭의 유무 등, 목적의 해석을 행하면 된다. 다른 한편, 양성 컨트롤이 음성(-) 또는 음성 컨트롤이 양성(+)이라고 판단했을 때에는, 검체 핵산의 반응계는, 해석 불가로 판단하고, 재측정을 행하면 된다.
도 2에, 도 1이 나타내는 컨트롤용 주형 및 검출용 프로브를 사용한 융해 곡선 해석에 있어서, 상기 시그널값의 변동(-dF/dt)과 온도와의 관계를 플로팅한 그래프의 일례를 나타낸다. 또, 이 그래프는 예시로서, 본 발명은 이것에는 하등 제한되지 않는다. 상기 검출용 프로브로서는, 2본쇄 형성으로 시그널이 억제되고, 해리에 의해 시그널을 발하는 프로브를 예로 든다. 도 2에 있어서, 횡축은, 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 시그널값의 변동을 나타내고, 단위는, 시그널 변화량의 미분값인 「-d(시그널 변화량)/dt」(-dF/dt)로 한다. 동 도면(A)은, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)에만 피크가 검출되므로, 증폭이 일어나고 있다고, 즉, 양성 컨트롤이 양성(+)이라고 판단할 수 있다. 또한, 상기 피크 이외에, 피크가 검출되지 않으므로, 반응계에 불필요한 핵산은 혼입하고 있지 않다고, 즉, 음성 컨트롤이 음성(-)이라고 판단할 수 있다. 동(同) 도면(B)은, 어느 온도에도 피크가 검출되지 않으므로, 증폭이 일어나 있지 않다고, 즉, 양성 컨트롤이 음성(-)이라고 판단할 수 있다. 동 도면(C)은, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)만이 아니라, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)에도 피크가 검출되었으므로, 반응계에 불필요한 핵산이 혼입했다고, 즉, 음성 컨트롤이 양성(+)이라고 판단할 수 있다.
또, 도 2(C)에 나타내는 바와 같이, 음성 컨트롤(+)의 경우, 양성 컨트롤(+)과는 다른 온도에 피크가 보인다. 이 때문에, 이하의 이유에서, 반응계에서의 컨트롤용 주형의 첨가 비율을 최소로 억제하는 것이 바람직하다. 이 조건으로 해석을 행한 경우, 예를 들면, 양성 컨트롤(+)을 나타내는 TmC에 있어서의 피크보다, 음성 컨트롤(+)을 나타내는 TmA에 있어서의 피크가 작으면, 불필요한 핵산의 혼입은 해석에 영향을 주지 않는 것으로 하여, 음성 컨트롤(+)에 수반하는 재측정을 생략할 수 있다. 이 경우, 상기 반응계에서의 상기 컨트롤용 주형의 첨가 비율은, 예를 들면, 10-12∼10-7μmol/L가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10-11∼10-8μmol/L이며, 특히 바람직하게는 10-10∼10-9μmol/L이다.
또한, 본 발명은, 상기 (a2) 공정에서, 예를 들면, 상기 검출용 프로브, 컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 상기 컨트롤용 프로브의 존재 하, 상기 융해 곡선 해석을 행해도 된다. 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 컨트롤용 프로브는, 예를 들면, Tm값이 기지이며, 또한, 반응계에서의 시그널 강도가 기지이다.
융해 곡선 해석은, 일반적으로, 온도 제어 유닛 및 시그널 검출 유닛을 구비하는 장치를 사용하여 행해진다. 그러나, 상기 장치는, 상기 온도 제어 유닛이 정확하게 온도를 제어할 수 없는 경우나, 상기 시그널 검출 유닛이 정확하게 시그널을 검출할 수 없는 경우가 있다. 이 때문에, 전자의 경우, 실제의 온도와는 다른 온도에 시그널의 피크가 검출될 우려가 있고, 후자의 경우, 실제와는 다른 크기의 피크가 검출될 우려가 있다. 이와 같은 이유에서, 장치에 있어서, 온도 제어 유닛 및 시그널 검출 유닛이, 정확하게 기능하고 있는지 여부를 확인하는 것이 중요하게 된다. 그래서, 상기 (a2) 공정에서, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 컨트롤용 프로브를 공존시키면, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 컨트롤용 프로브가 하이브리드를 형성하기 때문에, 이들에 대해서도, 동일한 반응계를 사용하여, 융해 곡선 해석을 행할 수 있다. 그리고, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 컨트롤용 프로브와의 Tm값은, 상술한 바와 같이 기지이므로, 상기 반응계에 대해, 상기 기지의 Tm값에 시그널의 피크가 있는지 여부로, 온도 제어 유닛이 정상으로 기능하고 있는지 여부를 판단할 수 있다. 즉, 예를 들면, 기지의 Tm값이 60℃의 경우에, 장치가 나타내는 60℃ 부근에서 피크가 확인되면, 상기 온도 제어 유닛은 정상으로 기능하고 있다고 판단할 수 있고, 장치가 나타내는 60℃ 부근에서 피크가 확인되지 않고, 다른 온도에서 피크가 확인되면, 상기 온도 제어 유닛은 정상으로 기능하고 있지 않다고 판단할 수 있다. 또한, 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 컨트롤용 프로브와의 융해 곡선 해석을 행함으로써, 예를 들면, 시그널 검출 유닛이 정상으로 기능하고 있는지 여부를 판단할 수 있다. 즉, 예를 들면, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 컨트롤용 프로브와의 융해 곡선 해석에 있어서, 노이즈의 유무를 확인함으로써, 목적의 피크가, 시그널 검출의 이상에 의한 것인지 여부를 판단할 수 있기 때문에, 오판정을 방지할 수 있다. 본 발명에서, 이하, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드를 「Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드」, 상기 컨트롤용 프로브를 「Tm컨트롤용 프로브」라고도 한다.
상기 Tm컨트롤용 프로브는, 예를 들면, 표지 물질을 갖는 표지 프로브인 것이 바람직하다. 또한, 상기 반응계에서, 상기 검출용 프로브와 상기 Tm컨트롤용 프로브와 공존시키므로, 상기 검출용 프로브와 상기 Tm컨트롤용 프로브는, 다른 표지 물질로 표지화되어 있는 것이 바람직하다. 상기 표지 물질로서는, 예를 들면, 상술한 바와 같은 것을 들 수 있다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 Tm컨트롤용 프로브의 첨가의 타이밍은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 검출용 프로브와 같으며, 예를 들면, 상기 (a1) 공정에 앞서, 상기 반응계에 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 Tm컨트롤용 프로브의 존재 하에서, 상기 (a1) 공정의 증폭 반응을 행하는 경우, 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 Tm컨트롤용 프로브 자신으로부터의 신장을 방지하기 위해서, 그 3'말단에, 인산기가 더 부가되어도 된다. 또한, 상기 Tm컨트롤용 프로브는, 그 3'말단에 표지 물질을 가져도 된다. 이에 의해서도, 상기 Tm컨트롤용 프로브 자신의 신장을 방지할 수 있다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 Tm컨트롤용 프로브와의 상보성은, 예를 들면, 90% 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100%이다. 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 Tm컨트롤용 프로브의 길이는, 동일한 것이 바람직하고, 예를 들면, 5∼40염기길이가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10∼30염기길이이며, 더욱 바람직하게는 15∼25염기길이이다.
상기 Tm컨트롤용 프로브는, 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈시키기 위해서, 예를 들면, 반응계에 존재하는 그 밖의 핵산 서열에 대해서보다도, 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드에 대한 상보성이 높은 것이 바람직하다. 또한, 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드는, 상기 Tm컨트롤용 프로브와 하이브리다이즈시키기 위해서, 예를 들면, 반응계에 존재하는 그 밖의 핵산 서열에 대해서보다도, 상기 Tm컨트롤용 프로브에 대한 상보성이 높은 것이 바람직하다. 상기 Tm컨트롤용 프로브 및 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드는, 각각, 예를 들면, 상기 그 밖의 핵산 서열에 하이브리다이즈하기 어려운 것이 바람직하고, 또한, 상기 그 밖의 핵산 서열에 하이브리다이즈하지 않는 것이 바람직하다. 상기 그 밖의 핵산 서열로서는, 예를 들면, 상기 검출용 프로브, 상기 검체 핵산 및 그 표적 서열, 상기 컨트롤 주형 핵산 및 그 증폭 영역, 상기 프라이머 등을 들 수 있다. 이와 같은 Tm컨트롤용 프로브 및 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드는, 각각, 예를 들면, 상기 그 밖의 핵산 서열에 대한 상보성이, 예를 들면, 30% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20% 이하이다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 Tm컨트롤용 프로브와의 Tm값(Tmt)은, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)과 다른 값인 것이 바람직하다. 또한, 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 Tm컨트롤용 프로브와의 Tm값(Tmt)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과도 다른 값인 것이 바람직하다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 상기 Tm컨트롤용 프로브를 병용하는 경우, 상기 (a3) 공정은, 또한, 상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 (a2) 공정에서의 온도 제어가 정확한지 여부를 판단하는 것이 바람직하다.
<증폭 방법>
본 발명의 증폭 방법은, 상술한 바와 같이, 반응계에서 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 방법으로서, 하기 (A) 공정 및 (B) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A)상기 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의해, 상기 컨트롤용 주형 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에 대해, 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 검출 공정
(B)하기 (b1) 공정을 포함하는, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
(b1)상기 검체 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
본 발명의 증폭 방법은, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의해 컨트롤을 확인하는 것이 특징으로서, 그 이외의 공정이나 조건 등은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 본 발명의 컨트롤 검출 방법은, 상술한 대로이며, 본 발명의 증폭 방법에 적용할 수 있다. 상기 (A) 공정은, 예를 들면, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 있어서의 상기 (a1)∼(a3) 공정을 포함한다.
상기 (b1) 공정에서 사용하는 검체용 반응계는, 목적의 검체 핵산을 함유하는 이외는, 특별히 제한되지 않고, 상기 컨트롤용 반응계와 동일한 조건인 것이 바람직하다. 상기 검체용 반응계는, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형을 함유해도 되고, 함유하지 않아도 된다. 또한, 상기 (b1) 공정은, 상술한 바와 같이, 상기 (a1) 공정과 같이 행하는 것이 바람직하다.
상기 (B) 공정은, 또한, 하기 (b2) 공정 및 (b3) 공정을 갖는 것이 바람직하다. 하기 (b2) 공정은, 상기 (a2) 공정과 같이 행할 수 있다.
(b2)상기 (b1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
(b3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 검체 핵산의 표적 서열의 증폭의 유무를 판단하는 판단 공정
상기 (b3) 공정은, 예를 들면, 상기 (A) 공정의 상기 (a3) 공정에서, 양성 컨트롤(+) 또한 음성 컨트롤(-)로 판단한 경우에, 행하는 것이 바람직하다. 상기 (a3) 공정에서, 양성 컨트롤(-) 또는 음성 컨트롤(+)로 판단한 경우에는, 생략하여, 재측정을 행하는 것이 바람직하다.
상기 (b3) 공정에서는, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 표적 서열이 증폭했다고 판단하고, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)에 피크가 존재하지 않는 경우, 상기 검체 핵산의 표적 서열이 미증폭이라고 판단할 수 있다.
상기 컨트롤용 반응계에 대한 상기 (A) 공정과, 상기 검체용 반응계에 대한 상기 (B) 공정은, 동일 조건에서, 동시에 행하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, (a1) 공정과 (b1) 공정, (a2) 공정과 (b2) 공정을, 동일 조건에서, 동시에 행하는 것이 바람직하다.
상기 검체 핵산으로서는, 특별히 제한되지 않고, 1본쇄이어도 되고, 2본쇄이어도 된다. 상기 검체 핵산으로서는, 예를 들면, DNA나, 토탈RNA, mRNA 등의 RNA 등을 들 수 있다. 또한, 상기 검체 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 등의 시료에 함유되는 핵산을 들 수 있다. 상기 시료 중의 검체 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 중에 원래 함유되어 있는 핵산이어도 되지만, 예를 들면, 상기 생체 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 등이어도 된다. 구체예로서는, 예를 들면, 상기 생체 시료에 원래 함유되어 있는 DNA를 주형으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물이나, 상기 생체 시료에 원래 함유되어 있는 RNA로부터 역전사 반응(RT-PCR : Reverse Transcription PCR)에 의해 생성시킨 cDNA, 상기 cDNA를 주형으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 등을 들 수 있다. 상기 증폭 산물의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50∼1000염기이며, 바람직하게는 80∼200염기이다.
상기 검체 핵산을 함유하는 시료로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 전혈, 혈구, 혈장, 혈청, 구강 점막 등의 구강내 세포, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 객담, 양수, 파라핀 포매(包埋) 조직, 오줌, 위액, 위세정액 등이나, 그들의 현탁액 등을 들 수 있다.
상기 반응계에서의 검체 핵산의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1∼1,000,000μg/L가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10∼100,000μg/L이며, 특히 바람직하게는 100∼10,000μg/L이다.
또한, 본 발명은, 상기 (b2) 공정에서, 검체 핵산을 증폭하기 위한 상기 반응계를 사용하여, 예를 들면, 상기 검출용 프로브, 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 상기 Tm컨트롤용 프로브의 존재 하, 상기 융해 곡선 해석을 행해도 된다. 상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 Tm컨트롤용 프로브는, 상술한 바와 같다. 이들에 대해서도, 융해 곡선 해석을 행함으로써, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 온도 조절이 정상인지 여부를 판단할 수 있다.
<융해 곡선 해석 방법>
본 발명의 융해 곡선 해석 방법은, 상술한 바와 같이, 검체 핵산을 함유하는 반응계의 융해 곡선 해석 방법으로서,
하기 (A) 공정 및 (C) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A)상기 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의해, 상기 컨트롤용 주형 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에 대해, 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 검출 공정
(C)하기 (c1) 및 (c2) 공정을 포함하는, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
(c1)상기 검체 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
(c2)상기 (c1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
본 발명의 융해 곡선 해석 방법은, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 의해 컨트롤을 확인하는 것이 특징으로서, 그 이외의 공정이나 조건 등은 특별히 제한되지 않는다. 상기 (A) 공정은, 예를 들면, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 있어서의 상기 (a1)∼(a3) 공정을 포함한다.
본 발명의 융해 곡선 해석 방법은, 예를 들면, 다형 검출 방법으로 이용하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 융해 곡선 해석 방법은, 예를 들면, 다형 검출 방법이라 할 수도 있다. 본 발명의 융해 곡선 해석 방법을, 예를 들면, 상기 다형 검출 방법으로 하는 경우, 상기 검체 핵산의 표적 서열이, 다형을 나타내는 목적의 표적 부위를 포함하고, 상기 검출용 프로브가, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈 가능한 프로브이며, 상기 (C) 공정이, 또한, 하기 (c3) 공정을 갖는 것이 바람직하다.
(c3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 다형을 검출하는 검출 공정
상기 컨트롤용 반응계에 대한 상기 (A) 공정과, 상기 검체용 반응계에 대한 상기 (C) 공정은, 동시에 행하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, (a1) 공정과 (c1) 공정, (a2) 공정과 (c2) 공정을 동시에 행하는 것이 바람직하다. 상기 (C) 공정에서, 상기 (c1) 공정은, 본 발명의 증폭 방법에 있어서의 상기 (b1) 공정과 동일하며, 상기 (c2) 공정은, 본 발명의 증폭 방법에 있어서의 상기 (b2) 공정과 동일하다.
본 발명에서, 상기 검출용 프로브는, 예를 들면, 상기 표적 부위의 다형을 야생형(정상형)으로서 설계해도 되고, 변이형으로서 설정해도 된다. 즉, 상기 검출용 프로브는, 예를 들면, 상기 표적 부위와 대응하는 염기를, 야생형의 염기에 상보적인 염기로 해도 되고, 변이형의 염기에 상보적인 염기로 해도 된다. 전자의 경우, 상기 야생형의 표적 부위와 매치하며, 상기 변이형의 표적 부위와 미스매치한다. 또한, 후자의 경우, 상기 야생형의 표적 부위와 미스매치하며, 상기 변이형의 변이 부위와 매치한다. 이와 같이, 상기 표적 부위가 야생형인지 변이형인지에 따라, 상기 표적 부위에 있어서, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브 간에 염기의 차이가 생기기 때문에, 상기 표적 부위의 다형을 검출 분별하는 것이 가능하다. 상기 검출용 프로브에 있어서의 상기 표적 서열에 대한 하이브리드 영역과, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리드 영역은, 상기 표적 서열을 제외하고, 90∼100%의 상보성인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100%이다.
융해 곡선 해석에 있어서는, 예를 들면, 완전하게 상보인 하이브리드(퍼펙트매치)는, 1염기 또는 2염기 이상이 다른 하이브리드(미스매치)보다도, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다는 결과가 얻어진다. 따라서, 미리, 상기 검출용 프로브에 대해, 완전하게 상보인 하이브리드의 Tm값과, 1염기 또는 2염기 이상이 다른 하이브리드의 Tm값을 결정해둠으로써, 상기 표적 부위에 있어서의 다형을 결정할 수 있다.
상기 검출용 프로브가, 예를 들면, 상기 표적 서열에 있어서의 변이형의 상기 염기 부위를 포함하는 영역에 상보적인 프로브의 경우, 예를 들면, 상기 (c3) 공정에서, 이하와 같이 다형을 판단할 수 있다. 즉, 예를 들면, 상기 염기 부위가 변이형인 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmMT)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 염기 부위가 변이형이라고 판단하고, 상기 염기 부위가 야생형인 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmWT)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 염기 부위가 야생형이라고 판단할 수 있다. 이 경우, TmMT는, TmWT보다도 높은 온도가 된다.
또한, 상기 검출용 프로브가, 상기 표적 서열에 있어서의 야생형의 상기 염기 부위를 포함하는 영역에 상보적인 프로브의 경우, 상기 (c3) 공정에서, 이하와 같이 다형을 판단할 수 있다. 즉, 예를 들면, 상기 염기 부위가 야생형인 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmWT)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 염기 부위가 야생형이라고 판단하고, 상기 염기 부위가 변이형인 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmMT)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 염기 부위가 변이형이라고 판단할 수 있다. 이 경우, TmWT는, TmMT보다도 높은 온도가 된다.
또한, 본 발명은, 상기 (c2) 공정에서, 검체 핵산을 증폭하기 위한 상기 반응계를 사용하여, 예를 들면, 상기 검출용 프로브, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 상기 컨트롤용 프로브의 존재 하, 상기 융해 곡선 해석을 행해도 된다. 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 컨트롤용 프로브는, 상술한 바와 같다. 이들에 대해서도, 융해 곡선 해석을 행함으로써, 예를 들면, 상술한 바와 같이, 온도 조절이 정상인지 여부를 판단할 수 있다.
<컨트롤 검출용 시약>
본 발명의 컨트롤 검출용 시약은, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 사용하기 위한 컨트롤 검출용 시약으로서,
컨트롤용 주형 핵산을 함유하고,
상기 컨트롤용 주형 핵산은, 목적의 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역에는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며,
상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 컨트롤용 시약은, 상술한 컨트롤용 주형을 함유하는 것을 특징으로 하고, 그 밖의 구성에 대해서는 하등 제한되지 않는다.
본 발명의 컨트롤 검출용 시약은, 예를 들면, 상기 컨트롤용 주형 이외에, 예를 들면, 프라이머 및 검출용 프로브를 함유해도 된다. 본 발명의 컨트롤 검출용 시약이, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 경우, 상기 컨트롤 검출용 시약은, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하므로, 예를 들면, 상기 검체 핵산의 증폭 및 상기 검체 핵산의 융해 곡선 해석에 사용할 수도 있다. 이 경우, 상기 검체 핵산을 함유하는 검체용 반응계는, 예를 들면, 결과적으로, 상기 컨트롤용 주형을 함유해도 된다. 상기 검체용 반응계에 상기 컨트롤용 주형이 함유되어도, 상술한 바와 같이, 상기 검체 핵산의 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)은, 상기 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)과 다르기 때문에, 상기 검체용 반응계의 증폭 및 융해 곡선 해석은, 상기 검체용 반응계에 상기 컨트롤용 주형이 함유되지 않는 경우와 같이, 행할 수 있다.
본 발명의 컨트롤 검출용 시약은, 또한, 폴리머라제, dNTP 등, 상술한 각종 성분을 적절히 함유해도 된다. 또한, 본 발명의 컨트롤 검출용 시약은, 예를 들면, 각 성분이 각각 별개의 용기에 수용된, 본 발명의 컨트롤 검출 방법에 사용하기 위한 키트이어도 된다. 상기 키트는, 사용 설명서를 포함하는 것이 바람직하다.
<해석용 시약>
본 발명의 해석용 시약은, 본 발명의 융해 곡선 해석 방법에 사용하기 위한 해석용 시약으로서, 상기 본 발명의 컨트롤 검출용 시약과,
상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 검체 핵산용의 증폭 반응용 시약을 구비하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 해석용 시약은, 예를 들면, 각 성분이 각각 별개의 용기에 수용된, 본 발명의 융해 곡선 해석 방법에 사용하기 위한 키트이어도 된다. 또한, 상기 컨트롤 검출용 시약과, 상기 증폭 반응용 시약이, 각각 별개의 용기에 수용된, 키트이어도 된다. 상기 키트는, 예를 들면, 사용 설명서를 포함하는 것이 바람직하다.
<설계 방법>
또한, 본 발명은, 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하기 위한 컨트롤용 주형 핵산의 설계 방법으로서,
상기 컨트롤용 주형 핵산은, 반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤 및 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤의 양방을 검출 가능한 주형 핵산이며,
상기 컨트롤용 주형 핵산의 염기 서열을,
상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
상기 프라이머에 의한 증폭 영역이, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며, 또한,
상기 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)이, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과, 다른 값을 나타내는 염기 서열로 설정하는 것을 특징으로 한다.
<사용>
본 발명은, 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하기 위한 컨트롤용 주형 핵산의 사용 방법이며,
상기 컨트롤용 주형 핵산은,
상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
상기 프라이머에 의한 증폭 영역이, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며, 또한,
상기 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)이, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과, 다른 값을 나타내는 염기 서열로 이루어지고,
반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤과 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤을, 하나의 반응계에서, 아울러 검출하기 위한 컨트롤용 주형 핵산으로서 사용하는 것을 특징으로 한다.
<융해 곡선 해석 방법>
본 발명의 융해 곡선 해석 방법은, 검체 핵산을 함유하는 반응계의 융해 곡선 해석 방법으로서,
상기 검체 핵산을 함유하는 반응계에 대해, 검출용 프로브, 컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 컨트롤용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정을 포함하고,
상기 검출용 프로브는, 상기 검체 핵산의 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 프로브이며,
상기 컨트롤용 프로브는, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 상술한 바와 같이, 상기 검체 핵산과 상기 검출용 프로브와의 해석만이 아니라, 온도 제어 및 시그널 검출이 정상인지 여부를 판단하는 것도, 동일 반응계에서 가능하게 된다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 검출용 프로브, 상기 컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 상기 컨트롤용 프로브는, 예를 들면, 상술한 바와 같으며, 융해 곡선 해석 등도 같다.
본 발명은, 상기 해석 공정에 앞서, 예를 들면, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정을 가져도 된다. 상기 검체 핵산의 증폭 공정은, 예를 들면, 상술한 바와 같이 행할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 대해 설명한다. 단, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 제한되지 않는다.
[실시예]
[실시예A1]
HPV 양성 패널 혈장을, 핵산 정제 키트(상품명 QIAamp)를 사용하여 TE액으로 용출함으로써 정제했다. 정제 용액을 2000배로 더 희석하여, 혈장 유래의 핵산 시료로 했다. 다른 한편, 서열번호 1에 나타나는 폴리뉴클레오티드를 인서트 서열로서 pT7 플라스미드 벡터에 삽입하여, 재조합 플라스미드를 제작했다. 상기 재조합 플라스미드는, TE액으로 희석하고, 이것을 플라스미드 용액으로 했다.
인서트 서열(서열번호 1)
5'-tcacctctgcctaatcatctcattttcatgtcctatgttcaatcttccaagctgtgccttgggtggctttgTTgcatTgacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttcc-3'
그리고, 상기 혈장 유래의 핵산 시료 1μL를, 하기 반응액 49μL에 첨가하고, 써멀싸이클러(상품명 Mastercycler ep gradient S, eppendorf사제)를 사용하여 PCR를 행했다. PCR는, 50℃에서 2분, 95℃에서 2분 처리한 후, 95℃ 10초, 54℃ 10초 및 72℃ 30초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 또한, PCR 반응액이 든 튜브를, iCycler(상품명, Bio-Rad Laboratories사제)로 옮기고, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리한 후, 승온 속도 1℃/1초로, 40℃에서 80℃까지 상승시켰다. 승온하는 사이, 각 온도에 있어서의 형광 강도의 변화를 측정하여, Tm 해석을 행했다. 또, 검출 대상은 하기 프로브1이며, 여기광(勵起光)은 370-415nm로 하고, 검출은 445-480nm로 했다. 또한, 상기 핵산 시료 대신에 증류수 1μL를 상기 하기 반응액 49μL에 첨가하고, 마찬가지로 하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. 하기 반응액에 있어서, F프라이머는, 포워드 프라이머, R프라이머는, 리버스 프라이머이다(이하, 같음).
[표 1]
Figure pct00001
F프라이머1(서열번호 2)
5'-cataagaggactcttggact-3'
R프라이머3(서열번호 3)
5'-atttatgcctacagcctcc-3'
F프라이머3(서열번호 4)
5'-tcacctctgcctaatcatctc-3'
R프라이머2(서열번호 5)
5'-ggaaagaagtcagaaggcaa-3'
프로브1(서열번호 6)
5'-atgtccatgccccaaagccacc-(Pacific Blue)-3'
프로브2(서열번호 7)
5'-atgtccatgTccTaaagccacc-(BODIPY FL)-3'
프로브3(서열번호 8)
5'-aTcAttaacctaatctcctccc-(TAMRA)-3'
저해용 올리고뉴클레오티드(서열번호 9)
5'-aggcttgaacagtaggacatgaacaAgagatga-P-3'
상기 혈장 유래의 핵산 시료는, 서열번호 10(ggtggctttgGGgcatGgacat)으로 표시되는 서열을 갖고, 상기 PCR에 있어서는, 이 서열을 포함하는 영역을 증폭시켰다. 상기 서열은, 상기 프로브1과 완전하게 상보적이다(퍼펙트매치). 다른 한편, 상기 재조합 플라스미드는, 서열번호 1의 하선부(下線部)로 표시되는 서열, 즉, 서열번호 45(ggtggctttgTTgcatTgacat)로 표시되는 서열을 갖고, 상기 PCR에 있어서는, 이 서열을 포함하는 영역을 증폭시켰다. 상기 서열에 있어서, 대문자로 표시되는 세 염기(T)는, 상기 서열번호 10의 염기 서열과 다른 염기로서, 상기 서열은, 상기 프로브1과 부분적으로 비상보적이다(미스매치).
이들의 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6은, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이며, 동 도면(A)이, 플라스미드 용액과 혈장 유래 핵산 샘플의 양방을 첨가한 반응액의 결과이며, 동 도면(B)이, 플라스미드 용액만을 첨가한 반응액의 결과이다. 동 도면에서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다. 또, 미리 설정한 각 Tm값은, 이하와 같다.
동 도면(A)의 혈장 유래 핵산 샘플을 첨가한 반응액에서는, 73℃ 부근과 48℃ 부근에 피크가 보이고, 동 도면(B)의 플라스미드 용액만을 첨가한 반응액에서는, 48℃ 부근에서 피크가 보였다. 이와 같이, 동일한 프로브1을 사용해도, 프로브에 대한 상보성을 바꿈으로써, 다른 Tm값에 피크를 설정할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예A2]
(실시예A2-1)
검체 핵산을 함유하는 반응계와 함께, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응계에 대해, PCR 및 Tm 해석을 행하여, 상기 반응계의 증폭 성능을 확인했다. 본 예에서는, 후술하는 바와 같이, 상기 프로브 및 컨트롤용 주형을, 상술한 도 5에 나타내는 형태(TmA<TmC)로 설정했다.
[표 2]
Figure pct00002
상기 검체 핵산 및 컨트롤용 주형의 서열에 있어서, 사각으로 둘러친 서열은, F프라이머 및 R프라이머와 상보적인 서열이며, 하선부는, 프로브와 상보적인 서열을 나타낸다. 상기 프로브 및 컨트롤용 주형은, 상술한 도 5에 나타내는 형태로 설정했다. 즉, 상기 프로브는, 상기 컨트롤용 주형에 대해, 완전하게 상보적이며, 상기 검체 핵산에 대해, 부분적으로 비상보적인 서열로 했다. 또, 미리 구한, 검체 핵산의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmA)은, 53℃이며, 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmC)은, 64℃이었다.
[표 3]
Figure pct00003
상기 검체 핵산 1μL 또는 컨트롤 주형 핵산 1μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제2 시약 13μL, 상기 제3 시약 10μL 및 증류수 3μL를 혼합하고, 또한, 미네랄오일(상품명 Mineral oil, 나칼라이테스크사제) 30μL를 첨가하여, 반응액을 제조했다. 상기 검체 핵산을 함유하는 반응액을, 검체 반응액, 상기 컨트롤 주형 핵산을 함유하는 반응액을, 컨트롤 반응액으로 했다. 상기 각 반응액을, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 PCR를 행했다. PCR는, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 58℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 또한, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리한 후, 승온 속도 1℃/3초로, 40℃에서 85℃까지 상승시켰다. 승온하는 사이, 각 온도에 있어서의 형광 강도의 변화를 측정하여, Tm 해석을 행했다. 또, 형광 강도의 검출은, 파장 585∼700nm(형광 물질 TAMRA)로 했다.
이들의 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 7에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다. 도 7에 있어서, (A)가, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액, (B)가, 검체 핵산을 함유하는 반응액의 결과이다.
도 7(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 64℃ 부근에서만 피크가 확인되고, 도 7(B)에 나타내는 바와 같이, 검체 핵산을 함유하는 반응액은, 검체 핵산과 프로브와의 Tm값(TmA) 53℃ 부근에서만 피크가 확인되었다. 이 결과로부터, 이하의 것을 알 수 있다. 우선, 컨트롤용 반응액에 있어서, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC)에서의 피크의 발생은, 컨트롤용 주형이 정상으로 증폭되어 있는 것을 나타낸다. 동 도면(A)에서는, Tm값 64℃ 부근에서 피크가 생겨 있으므로, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 양성 컨트롤(+), 즉, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있음이 증명되었다. 그리고, 컨트롤용 주형의 증폭에 사용한 반응액은, 컨트롤용 주형 대신에 검체 핵산을 함유하는 이외, 동일한 조성이며, 컨트롤용 반응액의 반응 조건과, 검체 반응액의 반응 조건도 동일 조건이다. 이로부터, 검체 반응액에 있어서의 피크의 발생은, 정상적인 증폭에 의한 것임이, 간접적으로 증명되었다. 또한, 컨트롤용 반응액에 있어서, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에서의 피크의 발생은, 반응액에 컨트롤용 주형 이외의 불필요한 핵산이 혼입하여, 불필요한 핵산의 증폭이 생긴 것을 나타낸다. 동 도면(A)에서는, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 64℃ 부근 이외에서, 피크는 생겨 있지 않으므로, 컨트롤용 반응액은, 음성 컨트롤(-), 즉, 불필요한 핵산의 혼입 및 증폭은 일어나 있지 않음이 증명되었다. 그리고, 검체용 반응액은, 컨트롤용 반응액과 같이 제조하여, 반응을 행하여 있다. 이로부터, 검체 반응액에 있어서의, 검체 핵산과 프로브와의 Tm값(TmA) 53℃ 부근의 피크는, 불필요한 핵산의 혼입에 의한 증폭이 아니라, 상기 검체 핵산의 증폭에 의한 피크인 것이, 간접적으로 증명되었다.
(실시예A2-2)
컨트롤용 주형을 사용하여, 불필요한 핵산이 혼입한 반응액에 대해, 음성 컨트롤의 확인을 행했다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 실시예A2-1과 같이 했다.
실시예A2-1의 컨트롤용 주형 0.1μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제2 시약 13μL, 상기 제3 시약 10μL 및 증류수 3μL를 혼합한 후, 이하에 나타내는 혼입 핵산 0.9μL를 혼입시키고, 또한, 상기 미네랄오일 30μL를 첨가하여, 컨트롤용 반응액을 제조했다. 그리고, 상기 실시예A2-1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 하기 혼입 핵산은, 각 프라이머가 어닐링 가능하며, 상기 실시예A2-1의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 서열로 했다. 하기 서열에 있어서, 사각으로 둘러친 서열은, F프라이머 및 R프라이머와 상보적인 서열이며, 하선부는, 프로브와 상보적인 서열을 나타낸다. 또, 미리 구한, 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmC)은, 64℃이며, 혼입 핵산의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값은, 53℃이었다.
[표 4]
Figure pct00004
이 결과를 도 8(A)에 나타낸다. 도 8(A)은, 컨트롤용 반응액에 대해, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 8(A)에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다.
도 8(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 반응액은, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 64℃ 부근 및 혼입 핵산과 프로브와의 Tm값 53℃ 부근의 양방에서 피크가 확인되었다. 전자의 Tm값(TmC) 64℃ 부근에서 피크가 생겨 있으므로, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 양성 컨트롤(+), 즉, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있지만, 후자의 Tm값 53℃ 부근에서도 피크가 생겨 있으므로, 음성 컨트롤(+), 즉, 불필요한 핵산의 혼입 및 증폭이 일어나고 있음이 증명되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에 있어서의, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값 이외에서의 피크의 유무에 따라, 불필요한 핵산의 혼입에 의한 증폭을 확인하는 것이 가능하다.
(실시예A2-3)
컨트롤용 주형을 사용하여, 증폭 반응을 저해하는 SDS가 첨가된 반응액에 대해, 양성 컨트롤의 확인을 행했다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 실시예A2-2와 같이 했다.
실시예A2-2의 컨트롤용 반응계에 대해, 증류수 3μL 대신에, 10v/v% SDS 3μL를 혼합한 이외는, 상기 실시예A2-2와 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
이 결과를 도 8(B)에 나타낸다. 도 8(B)은, 컨트롤용 반응액에 대해, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 8(B)에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다.
도 8(B)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 반응액은, 어느 온도에서도 피크는 확인되지 않았다. 이로부터, 정상적인 증폭 반응이 일어나 있지 않음이 증명되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에 있어서의, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값에서의 피크의 유무에 따라, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있는지 여부를 확인하는 것이 가능하다.
[실시예A3]
(실시예A3-1)
검체 핵산을 함유하는 반응계와 함께, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응계에 대해, PCR 및 Tm 해석을 행하여, 상기 반응계의 증폭 성능을 확인했다. 본 예에서는, 후술하는 바와 같이, 상기 프로브 및 컨트롤용 주형을, 상술한 도 4에 나타내는 형태(TmA>TmC)로 설정했다.
[표 5]
Figure pct00005
상기 검체 핵산 및 컨트롤용 주형의 서열에 있어서, 사각으로 둘러친 서열은, F프라이머 및 R프라이머와 상보적인 서열이며, 하선부는, 프로브와 상보적인 서열을 나타낸다. 상기 프로브 및 컨트롤용 주형은, 상술한 도 4에 나타내는 형태로 설정했다. 즉, 상기 프로브는, 상기 검체 핵산에 대해, 완전하게 상보적이며, 상기 컨트롤용 주형에 대해, 부분적으로 비상보적인 서열로 했다. 또, 미리 구한, 검체 핵산의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmA)은, 64℃이며, 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmC)은, 53℃이었다.
1μL의 상기 검체 핵산 또는 1μL의 컨트롤 주형 핵산을 사용한 이외는, 상기 실시예A2-1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
이들의 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9는, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 9에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다. 도 9에 있어서, (A)가, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액, (B)가, 검체 핵산을 함유하는 반응액의 결과이다.
도 9(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 53℃ 부근에서만 피크가 확인되고, 도 9(B)에 나타내는 바와 같이, 검체 핵산을 함유하는 반응액은, 검체 핵산과 프로브와의 Tm값(TmA) 64℃ 부근에서만 피크가 확인되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에서는, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 53℃ 부근에서만 피크가 확인되었으므로, 상기 실시예A2-1과 같이, 양성 컨트롤(+) 및 음성 컨트롤(-)임을 알 수 있었다. 이 때문에, 검체용 반응액에 있어서의 피크의 발생은, 정상적인 증폭에 의한 것이며, 또한, 검체 핵산과 프로브와의 Tm값(TmA) 64℃ 부근의 피크는, 불필요한 핵산의 혼입에 의한 증폭이 아니라, 상기 검체 핵산의 증폭에 의한 피크인 것이, 간접적으로 증명되었다.
(실시예A3-2)
컨트롤용 주형을 사용하여, 불필요한 핵산이 혼입한 반응액에 대해, 음성 컨트롤의 확인을 행했다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 실시예A3-1과 같이 했다.
실시예A3-1의 컨트롤용 주형 0.9μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제2 시약 13μL, 상기 제3 시약 10μL 및 증류수 3μL를 혼합한 후, 이하에 나타내는 혼입 핵산 0.1μL를 혼입시키고, 또한, 상기 미네랄오일 30μL를 첨가하여, 컨트롤용 반응액을 제조했다. 그리고, 상기 실시예A3-1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 하기 혼입 핵산은, 각 프라이머가 어닐링 가능하며, 상기 실시예A3-1의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 서열로 했다. 하기 서열에 있어서, 사각으로 둘러친 서열은, F프라이머 및 R프라이머와 상보적인 서열이며, 하선부는, 프로브와 상보적인 서열을 나타낸다. 또, 미리 구한, 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmC)은, 53℃이며, 혼입 핵산의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값은, 64℃이었다.
[표 6]
Figure pct00006
이 결과를 도 10(A)에 나타낸다. 도 10(A)은, 컨트롤용 반응액에 대해, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 10(A)에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다.
도 10(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 반응액은, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 53℃ 부근 및 혼입 핵산과 프로브와의 Tm값 64℃ 부근의 양방에서 피크가 확인되었다. 전자의 Tm값 53℃ 부근에서 피크가 생겨 있으므로, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 양성 컨트롤(+), 즉, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있지만, 후자의 Tm값 64℃ 부근에서도 피크가 생겨 있으므로, 음성 컨트롤(+), 즉, 불필요한 핵산의 혼입 및 증폭이 일어나고 있음이 증명되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에 있어서의, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값 이외에서의 피크의 유무에 따라, 불필요한 핵산의 혼입에 의한 증폭을 확인하는 것이 가능하다.
(실시예A3-3)
컨트롤용 주형을 사용하여, 증폭 반응을 저해하는 SDS가 첨가된 반응액에 대해, 양성 컨트롤의 확인을 행했다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 실시예A3-2와 같이 했다.
실시예A3-2의 컨트롤용 반응계에 대해, 3μL의 증류수 대신에, 3μL의 10v/v% SDS를 혼합한 이외는, 상기 실시예A3-2와 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
이 결과를 도 10(B)에 나타낸다. 도 10(B)은, 컨트롤용 반응액에 대해, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 10(B)에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다.
도 10(B)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 반응액은, 어느 온도에서도 피크는 확인되지 않았다. 이로부터, 정상적인 증폭 반응이 일어나 있지 않음이 증명되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에 있어서의, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값에서의 피크의 유무에 따라, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있는지 여부를 확인하는 것이 가능하다.
[실시예A4]
(실시예A4-1)
검체 핵산을 함유하는 반응계와 함께, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응계에 대해, PCR 및 Tm 해석을 행하여, 상기 반응계의 증폭 성능을 확인했다. 본 예에서는, 후술하는 바와 같이, 상기 프로브 및 컨트롤용 주형을, 상술한 도 5에 나타내는 형태(TmA<TmC)로 설정했다.
[표 7]
Figure pct00007
상기 검체 핵산 및 컨트롤용 주형의 서열에 있어서, 사각으로 둘러친 서열은, F프라이머 및 R프라이머와 상보적인 서열이며, 하선부는, 프로브와 상보적인 서열을 나타낸다. 상기 프로브 및 컨트롤용 주형은, 상술한 도 5에 나타내는 형태로 설정했다. 즉, 상기 프로브는, 상기 컨트롤용 주형에 대해, 완전하게 상보적이며, 상기 검체 핵산에 대해, 부분적으로 비상보적인 서열로 했다. 또, 미리 구한, 검체 핵산의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmA)은, 71℃이며, 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmC)은, 79℃이었다.
[표 8]
Figure pct00008
상기 컨트롤용 주형(106copy/μL) 1μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제2 시약 13μL, 상기 제4 시약 9μL 및 증류수 4μL를 혼합하고, 또한, 상기 미네랄오일 30μL를 첨가하여, 반응액을 제조했다. 상기 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액을, 컨트롤 반응액으로 했다. 또한, 상기 검체 핵산(30copy/μL) 1μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제2 시약 13μL, 상기 제4 시약 9μL 및 증류수 4μL를 혼합하고, 또한, 상기 미네랄오일 30μL를 첨가하여, 반응액을 제조했다. 상기 검체 핵산을 함유하는 반응액을, 검체 반응액으로 했다. 상기 각 반응액을, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 PCR를 행했다. PCR는, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 60℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 또한, 95℃에서 1초, 55℃에서 60초 처리한 후, 승온 속도 1℃/3초로, 62℃에서 85℃까지 상승시켰다. 승온하는 사이, 각 온도에 있어서의 형광 강도의 변화를 측정하여, Tm 해석을 행했다. 또, 형광 강도의 검출은, 파장 585∼700nm(형광 물질 TAMRA)로 했다.
이들의 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11은, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 11에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다. 도 11에 있어서, (A)가, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액, (B)가, 검체 핵산을 함유하는 반응액의 결과이다.
도 11(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 79℃ 부근에서만 피크가 확인되고, 도 11(B)에 나타내는 바와 같이, 검체 핵산을 함유하는 반응액은, 검체 핵산과 프로브와의 Tm값(TmA) 71℃ 부근에서만 피크가 확인되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에서는, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 79℃ 부근에서만 피크가 확인되었으므로, 상기 실시예A2-1과 같이, 양성 컨트롤(+) 및 음성 컨트롤(-)임을 알 수 있었다. 이 때문에, 검체용 반응액에 있어서의 피크의 발생은, 정상적인 증폭에 의한 것이며, 또한, 검체 핵산과 프로브와의 Tm값(TmA) 71℃ 부근의 피크는, 불필요한 핵산의 혼입에 의한 증폭이 아니라, 상기 검체 핵산의 증폭에 의한 피크인 것이, 간접적으로 증명되었다.
(실시예A4-2)
컨트롤용 주형을 사용하여, 불필요한 핵산이 혼입한 반응액에 대해, 음성 컨트롤의 확인을 행했다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 실시예A4-1과 같이 했다.
실시예A4-1의 컨트롤용 주형 1μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제2 시약 13μL, 상기 제4 시약 9μL 및 증류수 3μL를 혼합한 후, 이하에 나타내는 서열을 갖는 플라스미드를 혼입 핵산으로 하여 1μL(30copy/μL)를 혼입시키고, 또한, 상기 미네랄오일 30μL를 첨가하여, 컨트롤용 반응액을 제조했다. 그리고, 상기 실시예A4-1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 하기 혼입 핵산은, 각 프라이머가 어닐링 가능하며, 상기 실시예A4-1의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 서열로 했다. 하기 서열에 있어서, 사각으로 둘러친 서열은, F프라이머 및 R프라이머와 상보적인 서열이며, 하선부는, 프로브와 상보적인 서열을 나타낸다. 또, 미리 구한, 컨트롤용 주형의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값(TmC)은, 79℃이며, 혼입 핵산의 증폭 영역과 프로브와의 Tm값은, 65℃이었다.
[표 9]
Figure pct00009
이들의 결과를 도 12(A)에 나타낸다. 도 12(A)는, 컨트롤용 반응액에 대해, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 12(A)에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다.
도 12(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 반응액은, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값(TmC) 79℃ 부근 및 혼입 핵산과 프로브와의 Tm값 65℃ 부근의 양방에서 피크가 확인되었다. 전자의 Tm값 79℃ 부근에서 피크가 생겨 있으므로, 컨트롤용 주형을 함유하는 반응액은, 양성 컨트롤(+), 즉, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있지만, 후자의 Tm값 65℃ 부근에서도 피크가 생겨 있으므로, 음성 컨트롤(+), 즉, 불필요한 핵산의 혼입 및 증폭이 일어나고 있음이 증명되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에 있어서의, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값 이외에서의 피크의 유무에 따라, 불필요한 핵산의 혼입에 의한 증폭을 확인하는 것이 가능하다.
(실시예A4-3)
컨트롤용 주형을 사용하여, 증폭 반응을 저해하는 SDS가 첨가된 반응액에 대해, 양성 컨트롤의 확인을 행했다. 또, 특별히 명시되지 않는 한, 상기 실시예A4-2와 같이 했다.
실시예A4-1의 컨트롤용 주형 1μL, 상기 제1 시약 23μL, 상기 제3 시약 13μL, 상기 제4 시약 9μL, 검체 핵산으로서, 인간 게놈 DNA(Human Genomic DNA, 로슈사제) 4μL 및 10v/v% SDS 1μL를 혼합하여, 반응액을 제조한 이외는, 상기 실시예A4-2와 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 또, 반응액에 있어서의 상기 인간 게놈 DNA의 최종 농도는, 103copy/μL로 했다.
이들의 결과를 도 12(B)에 나타낸다. 도 12(B)는, 컨트롤용 반응액에 대해, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 12(B)에 있어서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다.
도 12(B)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤용 반응액은, 어느 온도에서도 피크는 확인되지 않았다. 이로부터, 정상적인 증폭 반응이 일어나 있지 않음이 증명되었다. 이와 같이, 컨트롤용 반응액에 있어서의, 컨트롤용 주형과 프로브와의 Tm값에서의 피크의 유무에 따라, 정상적인 증폭 반응이 일어나고 있는지 여부를 확인하는 것이 가능하다.
[실시예B1]
본 예에서는, 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 컨트롤용 프로브를 사용하여, 온도 제어 및 시그널 검출이 정상인지 여부를 확인함과 함께, 여러가지 핵산 시료에 대해, Tm 해석에 의해, CYP2C19 유전자의 표적 부위에 있어서의 다형(CYP2C19*2 및 CYP2C19*3)을 검출했다. CYP2C19*2는, CYP2C19 유전자의 엑손(exon)5의 681위의 다형이며, 야생형이 구아닌, 변이형이 아데닌이다. 또한, CYP2C19*3은, CYP2C19 유전자의 엑손4의 636위의 다형이며, 야생형이 구아닌, 변이형이 아데닌이다.
[표 10]
Figure pct00010
(CYP2C19*2용)
F프라이머(서열번호 11)
5'-taaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3'
R프라이머(서열번호 12)
5'-cccgagggttgttgatgtccatc-3'
프로브(서열번호 13)
5'-tcccaggaacccataac-(BODIPY FL)-3'
(CYP2C19*3용)
F프라이머(서열번호 14)
5'-tgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta-3'
R프라이머(서열번호 15)
5'-tcaaaaatgtacttcagggcttggtcaata-3'
프로브(서열번호 16)
5'-(TAMRA)-ccctgaatccaggtaag-P-3'
(Tm컨트롤용 시약)
Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드(서열번호 17)
5'-gcatggcttccattggg-P-3'
Tm컨트롤용 프로브(서열번호 18)
5'-(Pacific Blue)-cccaatggaagccatgc-P-3'
(희석액1)
10mmol/L Tris-HCl(pH8)
0.1mmol/L EDTA
0.3v/v% SDS
0.05w/v% 아지화나트륨(sodium azide)
(희석액2)
10mmol/L Tris-HCl(pH8)
0.1mmol/L EDTA
0.05w/v% 아지화나트륨
(정제 인간 게놈)
정제 인간 게놈 시료는, 핵산 정제 키트(상품명 Q1Aamp, Qiagen사제)를 사용하여 제조했다. 이 정제 인간 게놈 시료의 다형은, 미리, CYP2C19*2 및 CYP2C19*3 공히, 야생형과 변이형의 헤테로(Ht)인 것을 확인했다. 1μL의 상기 정제 인간 게놈 시료(0.3ng/μL)를, 상기 PCR 반응액 46μL에 첨가하고, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy LS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 PCR를 행했다. PCR는, 90℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 64℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복했다. 또한, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리한 후, 승온 속도 1℃/3초로, 40℃에서 75℃까지 상승시켰다. 승온하는 사이, 각 온도에 있어서의 형광 강도의 변화를 측정하여, Tm 해석을 행했다. 또, 형광 강도의 검출은, 파장 450∼480nm(형광 물질 Pacific Blue), 파장 515∼555nm(형광 물질 BODIPY FL) 및 파장585∼700nm(형광 물질 TAMRA)로 했다.
(플라스미드)
CYP2C19 유전자의 부분 서열로서, 야생형 CYP2C19*2의 올리고뉴클레오티드(서열번호 27)가 삽입된 야생형 플라스미드(WT*2), 야생형 CYP2C19*3의 올리고뉴클레오티드(서열번호 29)가 삽입된 야생형 플라스미드(WT*3), 변이형 CYP2C19*2의 올리고뉴클레오티드(서열번호 28)가 삽입된 변이형 플라스미드(mt*2), 변이형 CYP2C19*3의 올리고뉴클레오티드(서열번호 30)가 삽입된 변이형 플라스미드(mt*3)를 제조했다. 이어서, 각 플라스미드가 400copy/μL가 되도록, 야생형 플라스미드(WT*2)와 야생형 플라스미드(WT*3)를 혼합하여, 플라스미드 시료(WT)를 제조했다. 또한, 각 플라스미드가 400copy/μL가 되도록, 변이형 플라스미드(mt*2)와 변이형 플라스미드(mt*3)를 혼합하여, 플라스미드 시료(mt)를 제조했다. 그리고, 상기 플라스미드 시료 10μL와, 70μL의 상기 희석액1을 혼합하고, 이 혼합액 10μL를, 또한, 70μL의 상기 희석액2와 혼합했다. 그리고, 얻어진 혼합액 17μL를, 95℃에서 10분간 처리하여, 상기 PCR 반응액 46μL에 첨가하고, 상기 정제 인간 게놈과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
(혈액)
EDTA 채혈관에 의해 혈액을 채취했다. 이 혈액 시료의 다형은, 미리, CYP2C19*2 및 CYP2C19*3 공히, 야생형과 변이형의 헤테로(Ht)인 것을 확인했다. 상기 채혈한 혈액 10μL와, 70μL의 상기 희석액1을 혼합하고, 이 혼합액 10μL를, 또한, 70μL의 상기 희석액2와 혼합했다. 그리고, 얻어진 혼합액 17μL를, 95℃에서 10분간 처리하여, 상기 PCR 반응액 46μL에 첨가하고, 상기 정제 인간 게놈과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
(컨트롤)
17μL의 상기 희석액2를 95℃에서 10분간 처리하여, 상기 PCR 반응액 46μL에 첨가하고, 상기 정제 인간 게놈과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 Tm컨트롤용 프로브와의 Tm값은, 62℃이다. 따라서, Tm 해석에 있어서, 62℃에 피크가 보인 경우, Tm 해석 장치의 온도 제어 유닛 및 시그널 검출 유닛이 정상으로 기능하고 있다고 판단할 수 있다. 또, 정상적인 온도 조건 하에 있어서의 Tm값은, 이하와 같다.
(1)Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 Tm컨트롤용 프로브와의 Tm값 : 62℃
(2)야생형 CYP2C19*2와 CYP2C19*2용 프로브와의 Tm값 : 51℃
(3)변이형 CYP2C19*2와 CYP2C19*2용 프로브와의 Tm값 : 59℃
(4)야생형 CYP2C19*3과 CYP2C19*3용 프로브와의 Tm값 : 50℃
(5)변이형 CYP2C19*3과 CYP2C19*3용 프로브와의 Tm값 : 59℃
이들의 결과를 도 13∼도 15에 나타낸다. 도 13∼도 15는, 각각, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 각 도면에서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다. 도 13(A)이, 컨트롤, 도 13(B)이, 정제 인간 게놈, 도 14(A)가, 야생형 플라스미드(WT), 도 14(B)가, 변이형 플라스미드(mt), 도 15가, 혈액의 결과이며, 각 도면에서, 상단이, Tm컨트롤용 프로브에 의거한 형광 변화를 나타내는 그래프(Tm컨트롤), 중단이, CYP2C19*2용 프로브에 의거한 형광 변화를 나타내는 그래프(CYP2C19*2), 하단이, CYP2C19*3용 프로브에 의거한 형광 변화를 나타내는 그래프(CYP2C19*3)이다.
도 13(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해, 62℃ 부근에서만 피크가 확인되고, CYP2C19*2용 프로브 및 CYP2C19*3용 프로브에 대해, 피크는 확인되지 않았다. 도 13(B)에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 62℃ 부근, CYP2C19*2용 프로브에 대해 51℃ 부근 및 59℃ 부근, CYP2C19*3 프로브에 대해 50℃ 부근 및 59℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 도 14(A)에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 62℃ 부근, CYP2C19*2용 프로브에 대해 51℃ 부근, CYP2C19*3 프로브에 대해 50℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 도 14(B)에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 62℃ 부근, CYP2C19*2용 프로브에 대해 59℃ 부근, CYP2C19*3 프로브에 대해 59℃에서, 각각 피크가 확인되었다. 도 15에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 62℃ 부근, CYP2C19*2용 프로브에 대해 51℃ 부근 및 59℃ 부근, CYP2C19*3 프로브에 대해 50℃ 부근 및 59℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 이와 같이, 어느 반응액에 대해서도, Tm컨트롤용 프로브에 대해 62℃ 부근에서 피크가 보였으므로, Tm 해석 장치의 온도 제어가 정상으로 행해져 있음을 확인할 수 있었다. 또한, Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 Tm컨트롤용 프로브의 공존 하에서, PCR과 Tm 해석을 행하고 있지만, CYP2C19*2용 프로브 및 CYP2C19*3용 프로브에 대해, 상술한 Tm값 이외에서의 피크는 보이지 않았다. 이로부터, Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 Tm컨트롤용 프로브를 공존시켜도, 목적의 다형의 검출에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 의하면, Tm 해석 장치의 온도 제어 및 시그널 검출이 정상으로 행해져 있는지 여부를 확인하면서, 다형의 검출을 행할 수 있으므로, 보다 신뢰성이 뛰어난 다형 해석이 가능하게 된다.
[실시예B2]
본 예에서는, 컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 컨트롤용 프로브를 사용하여, 온도 제어 및 시그널 검출이 정상인지 여부를 확인함과 함께, 여러가지 핵산 시료에 대해, Tm 해석에 의해, UGT1A1 유전자의 표적 부위에 있어서의 다형(UGT1A1*6 및 UGT1A1*28)을 검출했다. UGT1A1*6은, UGT1A1 유전자의 엑손1의 211번째의 다형이며, 야생형이 구아닌, 변이형이 아데닌이다. 또한, UGT1A1*28은, UGT1A1 유전자의 프로모터 영역에서의 다형이며, 6회의 TA리피트(repeat) 및 7회의 TA리피트이다.
[표 11]
Figure pct00011
(UGT1A1*6용)
F프라이머(서열번호 19)
5'-tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3'
R프라이머(서열번호 20)
5'-caaaagactctttcacatcctccctttgg-3'
프로브(서열번호 21)
5'-gagacagagcattttacac-(TAMRA)-3'
(UGT1A1*28용)
F프라이머(서열번호 22)
5'-agctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3'
R프라이머(서열번호 23)
5'-cgcctttgctcctgccagag-3'
프로브(서열번호 24)
5'-(BODIPY FL)-ccatatatatatatatataagtaggagag-P-3'
(Tm컨트롤용 시약)
Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드(서열번호 25)
5'-gcatggcttccattggg-P-3'
Tm컨트롤용 프로브(서열번호 26)
5'-(Pacific Blue)-cccaatggaagccatgc-P-3'
(정제 인간 게놈)
정제 인간 게놈 시료는, 상기 실시예B1과 같이 하여 제조했다. 이 정제 인간 게놈 시료의 다형은, 미리, UGT1A1*28 및 UGT1A1*6 공히, 야생형과 변이형의 헤테로(Ht)인 것을 확인했다. 이 정제 시료와 상기 표 11에 나타내는 PCR 반응액을 사용한 이외는, 상기 실시예B1에 있어서의 정제 인간 게놈과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
(플라스미드)
UGT1A1 유전자의 부분 서열로서, 야생형 UGT1A1*28의 올리고뉴클레오티드(서열번호 31)가 삽입된 야생형 플라스미드(WT*28), 야생형 UGT1A1*6의 올리고뉴클레오티드(서열번호 33)가 삽입된 야생형 플라스미드(WT*6), 변이형 UGT1A1*28의 올리고뉴클레오티드(서열번호 32)가 삽입된 변이형 플라스미드(mt*28), 변이형 UGT1A1*6의 올리고뉴클레오티드(서열번호 34)가 삽입된 변이형 플라스미드(mt*6)를 제조했다. 이어서, 각 플라스미드가 400copy/μL가 되도록, 야생형 플라스미드(WT*28)와 야생형 플라스미드(WT*6)를 혼합하여, 플라스미드 시료(WT)를 제조했다. 또한, 각 플라스미드가 400copy/μL가 되도록, 변이형 플라스미드(mt*28)와 변이형 플라스미드(mt*6)를 혼합하여, 플라스미드 시료(mt)를 제조했다. 그리고, 상기 플라스미드 시료와 상기 표 11에 나타내는 PCR 반응액을 사용한 이외는, 상기 실시예B1에 있어서의 플라스미드와 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
(혈액)
EDTA 채혈관에 의해 혈액을 채취했다. 이 혈액 시료의 다형은, 미리, UGT1A1*28 및 UGT1A1*6 공히, 야생형과 변이형의 헤테로(Ht)인 것을 확인했다. 상기 채혈한 혈액과 상기 표 11에 나타내는 PCR 반응액을 사용한 이외는, 상기 실시예B1에 있어서의 혈액 시료와 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
(컨트롤)
17μL의 상기 희석액2를 95℃에서 10분간 처리하여, 상기 PCR 반응액 46μL에 첨가하고, 상기 실시예B1에 있어서의 컨트롤과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.
상기 Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 Tm컨트롤용 프로브와의 Tm값은, 57℃이다. 따라서, Tm 해석에 있어서, 57℃에 피크가 보인 경우, Tm 해석 장치의 온도 제어 유닛 및 시그널 검출 유닛이 정상으로 기능하고 있다고 판단할 수 있다. 또, 정상적인 온도 조건 하에 있어서의 Tm값은, 이하와 같다.
(1)Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드와 Tm컨트롤용 프로브와의 Tm값 : 57℃
(2)야생형 UGT1A1*6과 UGT1A1*6용 프로브와의 Tm값 : 47℃
(3)변이형 UGT1A1*6과 UGT1A1*6용 프로브와의 Tm값 : 55℃
(4)야생형 UGT1A1*28과 UGT1A1*28용 프로브와의 Tm값 : 47℃
(5)변이형 UGT1A1*28과 UGT1A1*28용 프로브와의 Tm값 : 52℃
이들의 결과를 도 16∼도 18에 나타낸다. 도 16∼18은, 각각, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 각 도면에서, 횡축은, 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은, 형광 강도의 변화를 나타내고, 단위는, 형광 강도 변화량의 미분값인 「d(형광 강도 변화량)/dt」(dF/dt)로 했다. 도 16(A)이, 컨트롤, 도 16(B)이, 정제 인간 게놈, 도 17(A)이, 야생형 플라스미드(WT), 도 17(B)이, 변이형 플라스미드(mt), 도 18이, 혈액의 결과이며, 각 도면에서, 상단이, Tm컨트롤용 프로브에 의거한 형광 변화를 나타내는 그래프(Tm컨트롤), 중단이, UGT1A1*28용 프로브에 의거한 형광 변화를 나타내는 그래프(UGT1A1*28), 하단이, UGT1A1*6용 프로브에 의거한 형광 변화를 나타내는 그래프(UGT1A1*6)이다.
도 16(A)에 나타내는 바와 같이, 컨트롤에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해, 57℃ 부근에서만 피크가 확인되고, UGT1A1*28용 프로브 및 UGT1A1*6용 프로브에 대해, 피크는 확인되지 않았다. 도 16(B)에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 57℃ 부근, UGT1A1*28용 프로브에 대해 47℃ 부근 및 52℃ 부근, UGT1A1*6 프로브에 대해 47℃ 부근 및 55℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 도 17(A)에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 57℃ 부근, UGT1A1*28용 프로브에 대해 47℃ 부근, UGT1A1*6 프로브에 대해 47℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 도 17(B)에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 57℃ 부근, UGT1A1*28용 프로브에 대해 52℃ 부근, UGT1A1*6 프로브에 대해 55℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 도 18에서는, Tm컨트롤용 프로브에 대해 57℃ 부근, UGT1A1*28용 프로브에 대해 47℃ 부근 및 52℃ 부근, UGT1A1*6 프로브에 대해 47℃ 부근 및 55℃ 부근에서, 각각 피크가 확인되었다. 이와 같이, 어느 반응액에 대해서도, Tm컨트롤용 프로브에 대해 57℃ 부근에서 피크가 보였으므로, Tm 해석 장치의 온도 제어가 정상으로 행해져 있음을 확인할 수 있었다. 또한, Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 Tm컨트롤용 프로브의 공존 하에서, PCR과 Tm 해석을 행하고 있지만, UGT1A1*28용 프로브 및 UGT1A1*6용 프로브에 대해, 상술한 Tm값 이외에서의 피크는 보이지 않았다. 이로부터, Tm컨트롤용 올리고뉴클레오티드 및 Tm컨트롤용 프로브를 공존시켜도, 목적의 다형의 검출에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 의하면, Tm 해석 장치의 온도 제어 및 시그널 검출이 정상으로 행해져 있는지 여부를 확인하면서, 다형의 검출을 행할 수 있으므로, 보다 신뢰성이 뛰어난 다형 해석이 가능하게 된다.
[산업상의 이용 가능성]
이상과 같이, 본 발명에 의하면, 상술한 바와 같은 컨트롤용 주형을 사용함으로써, 종래는 별개로 행할 필요가 있었던 양성 컨트롤과 음성 컨트롤의 검출을, 하나의 반응계에서 행하는 것이 가능하다. 이와 같이, 양성 컨트롤과 음성 컨트롤을 하나의 반응계에서 검출함으로써, 예를 들면, 조작이 간편하게 되고, 시약 등의 비용도 저하할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY Inc. <120> A process for synthesizing a target nucleic acid sequence <130> TF09012-01 <150> 2008-173986 <151> 2008-07-02 <160> 11 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ggacggacgg accgtcctcg ttgtcttgtt ggc 33 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 ttcccgtagg tcatgaactc ag 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 aggttcccgt aggtcatgaa ctcaa 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 4 ctcaatgatg atatagaacg 20 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 ggacggacgg accgcactcc ctcaggtagt ccag 34 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template <400> 6 gtaggtcatg aactcagtga tgatatagaa cgggggctcc cgggtgcaga 50 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template <400> 7 gtaggtcatg aactcaatga tgatatagaa cgggggctcc cgggtgcaga 50 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 cccccgttct atatcatcac 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 ggagcccccg ttctatatca tcat 24 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 gaccgaccga ccccaggagg ttcccgtagg tc 32 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 11 cccgttctat atcatcattg ag 22

Claims (31)

  1. 반응계에서 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 상기 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 방법으로서,
    상기 컨트롤이, 반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤 및 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤이며,
    상기 반응계는, 프라이머, 검출용 프로브(probe) 및 컨트롤용 주형 핵산을 함유하고,
    상기 프라이머는, 상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머이며,
    상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈(hybridize) 가능한 프로브이며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 상기 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
    상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역은, 상기 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값이며,
    하기 (a1)∼(a3) 공정을 포함하고,
    상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤을, 하나의 반응계에서 검출하는 것을 특징으로 하는 컨트롤 검출 방법.
    (a1)상기 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭을 행하는 증폭 공정
    (a2)상기 (a1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
    (a3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤이, 각각 양성인지 음성인지를 판단하는 판단 공정
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a3) 공정이,
    상기 융해 곡선에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)에 피크가 존재하는 경우, 상기 양성 컨트롤이 양성이라고 판단하고,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)에 피크가 존재하지 않는 경우, 상기 양성 컨트롤이 음성이라고 판단하고,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에 피크가 존재하지 않는 경우, 음성 컨트롤이 음성이라고 판단하고,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC) 이외에 피크가 존재하는 경우, 음성 컨트롤이 양성이라고 판단하는 공정인, 컨트롤 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 그 증폭 영역에서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 길이가, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 길이와는 다른 길이인, 컨트롤 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열의 소정 영역에 상보적인 염기 서열이며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 그 증폭 영역에, 상기 검출용 프로브가 부분적으로 하이브리다이즈 가능한 염기 서열을 갖는, 컨트롤 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 그 증폭 영역에, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과는 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽이 다른 염기 서열을 갖는, 컨트롤 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 부분적으로 상보적인 염기 서열이며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 그 증폭 영역에, 상기 검출용 프로브에 상보적인 염기 서열을 갖는, 컨트롤 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 그 증폭 영역에, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과 동일한 염기 서열, 및, 그것에 인접하여, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 하이브리다이즈 영역의 5'측 및 3'측의 적어도 한쪽에 인접하는 영역과는 다른 염기 서열을 갖는, 컨트롤 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은,
    그 증폭 영역에서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 염기 서열이, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역의 염기 서열과 상동성(相同性) 100% 미만의 서열인, 컨트롤 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 상기 하이브리다이즈 영역과 상기 검출용 프로브와의 상보성이, 상기 표적 핵산의 상기 검출용 프로브의 하이브리다이즈 영역과 상기 검출용 프로브와의 상보성과 다른, 컨트롤 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표적 서열이, 다형(多形)을 나타내는 표적 부위를 포함하고,
    상기 검출용 프로브가, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는, 컨트롤 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 검출용 프로브는, 상기 표적 서열에 있어서의 변이형의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는, 또는, 상기 표적 서열에 있어서의 야생형의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하는, 컨트롤 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)과, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과의 차가, 1∼50℃인, 컨트롤 검출 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 검출용 프로브가, 표지 물질을 갖는 표지 프로브인, 컨트롤 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 표지 물질이, 형광 물질인, 컨트롤 검출 방법.
  15. 반응계에서 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 방법으로서,
    하기 (A) 공정 및 (B) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭 방법.
    (A)제1항에 기재된 컨트롤 검출 방법에 의해, 상기 컨트롤용 주형 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에 대해, 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 검출 공정
    (B)하기 (b1) 공정을 포함하는, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
    (b1)상기 검체 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
  16. 제15항에 있어서,
    상기 (A) 공정에서의 하기 (a1) 공정과, 상기 (B) 공정에서의 상기 (b1) 공정을, 동시에 행하는, 증폭 방법.
    (a1)상기 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭을 행하는 증폭 공정
  17. 제15항에 있어서,
    상기 (B) 공정이, 또한, 하기 (b2) 공정 및 (b3) 공정을 포함하는, 증폭 방법.
    (b2)상기 (b1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
    (b3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 검체 핵산의 표적 서열의 증폭의 유무를 판단하는 판단 공정
  18. 제17항에 있어서,
    상기 (b3) 공정에서,
    상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)에 피크가 존재하는 경우, 상기 표적 서열이 증폭했다고 판단하고,
    상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)에 피크가 존재하지 않는 경우, 상기 표적 서열이 미증폭이라고 판단하는, 증폭 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 (A) 공정에서의 하기 (a2) 공정과 상기 (b2) 공정을, 동시에 행하는, 증폭 방법.
    (a2)상기 (a1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
  20. 제19항에 있어서,
    상기 (A) 공정에서의 하기 (a3) 공정에서, 양성 컨트롤이 양성이고 음성 컨트롤이 음성이라고 판단한 경우에, 상기 (b3) 공정의 판단을 행하는, 증폭 방법.
    (a3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤이, 각각 양성인지 음성인지를 판단하는 판단 공정
  21. 검체 핵산을 함유하는 반응계의 융해 곡선 해석 방법으로서,
    하기 (A) 공정 및 (C) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 융해 곡선 해석 방법.
    (A)제1항에 기재된 컨트롤 검출 방법에 의해, 상기 컨트롤용 주형 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에 대해, 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하는 검출 공정
    (C)하기 (c1) 및 (c2) 공정을 포함하는, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
    (c1)상기 검체 핵산, 상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 검체 핵산의 표적 서열을 증폭하는 증폭 공정
    (c2)상기 (c1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
  22. 제21항에 있어서,
    상기 검체 핵산의 표적 서열이, 다형을 나타내는 목적의 표적 부위를 포함하고,
    상기 검출용 프로브가, 상기 표적 서열에 있어서의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 하이브리다이즈 가능한 프로브이며,
    상기 (C) 공정이, 또한, 하기 (c3) 공정을 갖는, 융해 곡선 해석 방법.
    (c3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 다형을 검출하는 검출 공정
  23. 제22항에 있어서,
    상기 검출용 프로브가, 상기 표적 서열에 있어서의 변이형의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하고,
    상기 (c3) 공정에서,
    상기 변이형의 상기 표적 부위를 포함하는 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(Tmm)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 표적 부위가 변이형이라고 판단하고, 상기 야생형의 상기 표적 부위를 포함하는 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(Tmw)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 표적 부위가 야생형이라고 판단하는, 융해 곡선 해석 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 검출용 프로브가, 상기 표적 서열에 있어서의 야생형의 상기 표적 부위를 포함하는 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하고,
    상기 (c3) 공정에서,
    상기 야생형의 상기 표적 부위를 포함하는 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(Tmw)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 표적 부위가 야생형이라고 판단하고, 상기 변이형의 상기 표적 부위를 포함하는 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(Tmm)에 피크가 존재하는 경우, 상기 검체 핵산의 상기 표적 부위가 변이형이라고 판단하는, 융해 곡선 해석 방법.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 (A) 공정에서의 하기 (a1) 공정과 상기 (c1) 공정을, 동시에 행하고, 상기 (A) 공정에서의 하기 (a2) 공정과 상기 (c2) 공정을, 동시에 행하는, 융해 곡선 해석 방법.
    (a1)상기 반응계에서, 상기 프라이머를 사용하여, 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭을 행하는 증폭 공정
    (a2)상기 (a1) 공정의 상기 반응계를 사용하여, 상기 검출용 프로브의 존재 하, 융해 곡선 해석을 행하는 해석 공정
  26. 제22항에 있어서,
    상기 (A) 공정에서의 하기 (a3) 공정에서, 양성 컨트롤이 양성이고 음성 컨트롤이 음성이라고 판단한 경우에, 상기 (c3) 공정의 판단을 행하는, 융해 곡선 해석 방법.
    (a3)상기 융해 곡선에 있어서의 피크에 의해, 상기 양성 컨트롤 및 상기 음성 컨트롤이, 각각 양성인지 음성인지를 판단하는 판단 공정
  27. 제1항에 기재된 컨트롤 검출 방법에 사용하기 위한 컨트롤 검출용 시약으로서,
    컨트롤용 주형 핵산을 함유하고,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 목적의 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
    상기 프라이머에 의한 상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역에는, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)은, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과 다른 값인 것을 특징으로 하는 컨트롤 검출용 시약.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 더 함유하는, 컨트롤 검출용 시약.
  29. 제21항에 기재된 융해 곡선 해석 방법에 사용하기 위한 해석용 시약으로서,
    제27항에 기재된 컨트롤 검출용 시약과,
    상기 프라이머 및 상기 검출용 프로브를 함유하는 검체 핵산용의 증폭 반응용 시약을 구비하는 것을 특징으로 하는 해석용 시약.
  30. 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하기 위한 컨트롤용 주형 핵산의 설계 방법으로서,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은, 반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤 및 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤의 양방을 검출 가능한 주형 핵산이며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산의 염기 서열을,
    상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
    상기 프라이머에 의한 증폭 영역이, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며, 또한,
    상기 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)이, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과, 다른 값을 나타내는 염기 서열로 설정하는 것을 특징으로 하는 설계 방법.
  31. 검체 핵산의 표적 서열을 증폭할 때, 반응계의 증폭 성능을 나타내는 컨트롤을 검출하기 위한 컨트롤용 주형 핵산의 사용이며,
    상기 컨트롤용 주형 핵산은,
    상기 표적 서열을 증폭 가능한 프라이머에 의해 증폭 가능하며,
    상기 프라이머에 의한 증폭 영역이, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈 가능한 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능하며, 또한,
    상기 증폭 영역과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmC)이, 상기 표적 서열과 상기 검출용 프로브와의 Tm값(TmA)과, 다른 값을 나타내는 염기 서열로 이루어지고,
    반응계에서 증폭 반응이 일어나는 것을 나타내는 양성 컨트롤과 반응계에의 불필요한 핵산의 혼입을 나타내는 음성 컨트롤을, 하나의 반응계에서, 아울러 검출하기 위한 컨트롤용 주형 핵산으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 컨트롤용 주형 핵산의 사용.
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