DD143767A5

DD143767A5 - Verfahren zur herstellung von d-aminosaeuren

Info

Publication number: DD143767A5
Application number: DD79213063A
Authority: DD
Inventors: Roberto Clivieri; Aurelio Viglia; Ludwig Degen; Leonello Angelini; Eugenio Facetti
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1978-05-23
Filing date: 1979-05-22
Publication date: 1980-09-10
Also published as: SE436755B; IT1109506B; ZA792366B; NO791662L; FR2431536A1; IT7823679A0; CA1122552A; ATA375879A; JPS6320520B2; IL57276A0; DK153953B; BE876408A; LU81297A1; GB2022581A; CS211400B2; FI66021C; AU4711879A; NO151899B; NL7904097A; DE2920963A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren aus racemischeri Geraischen von N»Carbamoyl-derivaten dieser Säuren oder aus den entsprechenden Hydantoinen» Erfindungsger werden die racemischen Verbindungen der enzymatischen und iiiiki'obiologischen Wirkung eines Enzymkorrtp lex es unterworfen, der erhalten worden ist von Mikroorganismen der Art Agrobacterium, insbesondere dem Stamm NRRL B 11 291.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, ausgehend von racemischen Gemischen der K-Carbamoylderivate oder von den entsprechenden Hydantoinen,

Einige D-Aminosäuren, besonders Phenylglycin und p-Hydroxyphenylglycin sind wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Verbindungen, die verbreitet in der pharmazeutischen Industrie angewandt werden,

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die chemischen Verfahren, die bisher zur Trennung der optischen Antipoden angewandt wurden und die auf der Verwendung von Camphe'jrsulfonsäure beruhen, sind sehr teuer und führen zu geringen Ausbeuten

Ein anderes Verfahren besteht in der Hydrolyse von D-Acyl~ aminosäuren mit dem Enzym D-Acylase.

Dieses enzymatischen Präparate enthalten jedoch immer L-Acylase als Verunreinigung, was dazu führt, daß das erhaltene Produkt nur eine geringe optische Reinheit besitzt.

Ein Verfahren zur enzymatischen Auftrennung von D,L~Ajaino~ säuren oder deren Derivaten ist in der IT-PS 987 278, der DE-OS 2 811 303 und der DE-OS 2 631 048 angegeben.

Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, daß man die racemische Form von Verbindungen der Formel

-HH

X = Η,-ΟΗ,-ΟΟΗ-

der enzymatischen Hydrolyse durch Hydropyrimidin-Hydrolase (E»C,3.5*2*2) unterwirft j die aus Organen oder von Mikroorganismen extrahiert worden ist. Die Hydrolyse läuft entsprechend der folgenden Gleichung ab;

£ 1

COOH I? "θ-πττ_ΗΗ«00-ΗΗ,

Racemisierung

C~0

Anschließend vjird das K-Carbamoy!derivat durch Oxydation mit Nitrit zu der D-Aminosäure abgebaut (DE-OS 2 615 594)

Ziel der Erfindun

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens, mit dem D-Aminosäure in optisch reiner Form hergestellt werden kann·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Verbindungen zu hydrolysieren und die Hydrolyse durch enzymatisch^ Komplexe zu katalysieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die D-Aminosäuren aus den entsprechenden Hydantoinen

-3- . U-52

herstellt mit Hilfe einer Hydrolyserea.ktion, die ausschließlich durch enzyma.tische Komplexe katalysiert wird, entsprechend dem. folgenden Schema: . · .. .

R - CH - NH - CO - NH

COOIi R - CH - NH

Λ*

wobei S ein aliphatischer oder aromatischer substituierter oder nichtsubstituierter Rest sein kann.

Bas erfindungsgemäße Verfahren ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß die D-Aminosäuren erhalten werden können, ausgehend von eir.em racemischen Gemisch von Verbindungen der · folgenden allgemeinen Formel:

R-CM-NlI-CO-NH

i ²

COOH

in der R ein substituierter oder unsubstituierter alipha.tischer oder aromatischer Rest ist und das Enzym II (Carbamoyla.se) für die D-Form stereoselektiv ist.

Die· erfindungsgemäße enzymatische Hydrolyse findet na.oh dem unten angegebenen Schema statt und führt zur Bildung einer einzelnen stereoisomeren Form einer Aminosäure und eines Deriva.ti davon, ausgehend von einem racemischen Gemisch:

-4-

	-4-	1A-52	H I	291
		I . COOH .
C - NIICONH₂: COOH · '·	Ca r b a mo y 1 a s e	D C-)
DL		2 ·
	R-C- NHCONII COOH

Die erfixidungsgemäß angewandten Enzyme haben,im Gegensatz zu denjenigen die D-Acylase enthalten keinerlei Aktivität gegenüber dem L-Ena/ntiomer. Dadurch können D-Atninosäuren erhalten werden, die optisch absolut rein sind.

. Die erfindungsgemäßen Enzymkomplexe werden gebildet durch Mikroorganismen der Artfe.groba.kt er ium, die aus Ackerboden isoliert worden sind und die Nummern 1302, 1303 und 1304 erhalten haben. .. "·"·

Sie besitzen die folgenden morphologischen und biochemischen Eigenschaften: .

Mikroskopische Morphologie: . · .

Diskrete Stäbchen, Emnchaial gepaart, gram-negativ, 0,8 χ 1,5 bis 2,0 um , keine Kapseln und Sporen,·beweglich mit 4 bis 6 peritrichia.len Geißeln.

Makroskopische Morphologie: '

Kolonien auf Agar Nährmedien (Difco): aufgerichtet, glatte Kanten, Gremfarben, transparent, 0,5'"bis. 1 ram Durchmesser} glatte Oberfläche, reichliches Wachstum auf Calcium-glycerophosphat~Mannitol-nitra.t~lgar, unter braun werden und Ringbildung«

- 5 - 1A-52 291

Biochemische Eigenschaften: . .

Wachstum zwischen 4 und 39 0 auf allen 'einfachen La.bor-

medien auch ohne Y/achsturaafaktoren und Aminosäuren unter Ausnutzung quellen

nutzung von NH.⁺ , ΝθΓ oder Aminosäuren als einzige Stickstof f-

Oxidase : postiv (N. Kovacs, 1956, Natur, London, 178,703)

Catala.se: postiv (M. Levine, D. Q. Anderson, 1932, J.Bact. 337-347)

Nitrit-Bildung aus Nitraten (CE. Zobell, 1932, J.Bact.24 273).

Twenn 80; nicht hydrolysiert (C. Sierra, 1957, Antonie van Leeuwenhoek, 23, 15-22).

Casein, Gelatine, Cellulose, Stärke, Agax : nicht hydrolyse (V.BcD. Skerma.nn, "A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria ", 2. Aufl., The Williams & Wilkins Book Co₉, Ba.ltiro.c 1967). ' .

3-Ketoglycoside werden gebildet (M, J. Bernaerts, J.De Ley, 1963, Nature 197, 406). . ·

Anilin-Bla.u-Mannitol-Agar :' Wachstun unter Absorption des Farbstoffs (A„A. Hendrickson, J.L. Baldwin, A.J„ Riker, · 1934, J. Bact. 28, 597-618). ·

Lackmus-Milch : grau-bra.un .

Verwertung von Kohlenhydraten: oxyda.tiv (R.Hugh, E.Leifson, 1953, J. Bact_e 66, 24-26).

Die folgenden Verbindungen werden als einzige Kohlenstoff quelle ausgenutzt, wie von R..Y, Stanier abgegeben. (R_eY» Sta.nier et Al., 1966, J.GeD.Microbiol 43, 159-271): D(+)Glucose, L( + )Ara.binose, D(+)Xylose, D( + )Threose, D( + )Threa.lose, D(-)Rinose L(+)RIiamnose, Lactose, Cellobiose, Maltose, Citrat, Acetat, .

_ 6 - 1A-52 291

Lactat, Propionat, L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Histidin, L-Alawin, L-Arginin«

Vergleicht ma,n die Eigenschaften mit den Beschreibungen in Bergey's Manual of Determinative Ba.cteriology, YIII Aufl., so zeigt es sich, daß die erfindungsgemäßen . Mikroorganismen zur Gattung Rhizobiaceae Art" Agrobakterium gehören.

Der als Stamm 1302 bezeichnete Stamm ist am 6.April 1978, bei dem Northern Regional Research Center of Peoria, 111.,USA hinterlegt worden, wo er die Nummer HEEL B 11291 erhielt.

Die Mikroorganismen der Art Agrobakterium werden, erfindungs gemäß, unter a.eroben Bedingungen in einem Kulturmedium gezüchtet, das Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff, Phosphor sowie Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur zwischen 20⁰C und 40⁰C, vorzugsweise zwischen 25 und 35°C und zwa.r 10 bis 48 h, vorzugsweise 20 bis 30 h bei einem pH-Wert von 6, 0 bis 8,0, vorzugsweise von 7 bis 7,5. Glucose, Lactat,. Acetat, Maiswasser und Lactose können als Kohlenstoffq.uelle angewandt werden. . '

Fleischhydrolysate, Hydrolysate von Casein und Sojabohnen, Ammoniumsalze und Harnstoff, Hydantoine und N-Carba.moylderiva.te von Aminosäuren sind als Stickstoffquellen geeignet.

Ein geeignetes	Kulturmedium besitzt z.B. die folgende	g . ·
Zusammensetzung? ·		g .. '. ^ ' - .· .
Pleischpepton	5	g . '. . ' ·.
Pleischextrakt	5	000 ml
Glucose	5	η — 7 ?
Destilliertes	Wasser 1
pH	7,

-7-

D(-)Aminosäuren werden direkt in dem Fermentationsmedium gebildet, das DL-Hydantoine oder DL-N-Carbanioylderivate von Aminosäuren enthält, und zwar beide als einzige Stickstoff quelle und zusammen mit üblichen Stickstoffquellen.

D(-)Aminosäuren können auch direkt hergestellt werden, indeia man die mikrobiologische Zellaufschlämmung (as resting cells) oder Auszüge davon verwendet.

Die Extraktion der erfindungsgemäßen Enzymkomplexe findet nach üblichen in der Enzymologie angewandten Verfahren statt»

Zu diesem Zweck werden die Zellen mit entsprechenden Vorrichtungen aufgebrochen (French Pressure Cell Press, Manton Gauling Homogenizer) Zellmühlen sowie mit Ultraschallvibratoren.

Die Hydrolyse der Hydantoine oder der N-Carbamoylderivate der Aminosäuren kann durchgeführt werden, durch Zugabe des Enzyms zu dem Reakt ions gemisch in den folgenden Formen ί Frische Zellen, gefriergetrocknete Zellen, toluolisierte Zellen_s acetonhaltiges Pulver oder roher oder gereinigter Auszug bzw. Extrakt.

Eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung kann erreicht werden, indem man die Enzyme.immobilisiert durch Zusammenbringen mit makromolekularen Verbindungen, unter Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder lonenbindungen oder physikalische Immobilisierung.

Ausführungsbe ispiel

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert,

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt;

' ' ΊΑ-52

Fleischpepton 5 g

Fleischextrakt . 3 g

Glucose 5g

Destilliertes Wasser 1 000 ml .

Der pH-Wert wurde mit Soda a.uf 7>2 eingestellt und das Kulturmedium in Mengen von jeweils 100 ml in .500 ml Kolben" gegeben. ' . '' .

Nach 30 raiii langem Sterillisieren bei 110⁰C wurden die Kolben mit einer Kultur des Stammes Wr. 1302 "beimpft,- der von Schrägen gewonnen v/orden wax, die das gleiche Medium_f zusammen¹ mit 2 $ Agar (OIFGO) enthielten und 24 h bei -30⁰C unter kreisförmigem Schütteln (orbital stirring) mit 220 UpM ineubiert worden waren« . ·

Aus dieser Vorkultur (optische Dichte, bei 550 nnu 0,250 Verdünnung (dil X) 1:10) wurde 1 ml in fünf 500-ml Kolben, enthaltend 100 ml des gleichen Mediums gegeben und die Kultur bei 30⁰C unter kreisförmigem Schütteln (220 UpM)24 h incubiert (optische Dichte bei 550 nm - 0,250; Verdünnung 1 :1O)*

Die Zellen wurden abschließend gewonnen^it einer physiologischen Lösung gewa.schen und in 100 ml Pyrophospha.t-Puffer (0,1 m; pH -7$7) enthaltend 10 g D_fL-5~Phenylhydantoin

ο bei 40 C unter StickstoffSchutzatmosphäre (UPP) aufgeschlämmt,

Nach 200 h langer Incubation unter den abgegebenen Bedingungen wa.r eine vollständige Hydrolyse zu Aminosäure (D-Phenylglycih) erreicht, wie sowohl aus der polarimetrischen Analyse des Reaktionsgemisches als auch durch Dünnschichtchroma.tographie (Suzuki in J. of Chromatography, 80 (1973? 199-204) gezeigt werde« konnte.

1A-52 291

Die Aminosäure'wurde., nach Ausfällen der Proteine mit Trichloressigsäure und Entfernung durch Abzentrifugieren isoliert durch Einstellen des pH-wertes a.uf den isoelektrisch* Punkt (5,8).' .

Der Niederschlag vrurde mit Wasser gewa.schen und im Va.kuum getrocknet. Die Identität der D(-)Phenylglycin-aminosäu wurde, durch das IR und NMR~Spektrum "bestätigt.

Die spezifische optische Drehung betrug /^oCj = - 154°

(c '- 1$ in HClLn) gegenüber einem V/ert von -157,8° wie er in der Literatur für die.reine Aminosäure angegeben ist.

Beispiel 2 ' .

Entsprechend Beispiel 1 gebildete Zellen aus 100 ml Kulturmedium wurden in 10 ml Pyrophosphatpuffer (0,1 m, pH 7,7 aufgeschlämmt und 10 min bei 5°C "beschallt. Das entstehende Produkt wurde zu 500 ml einer Lösung von D,L-N-Carbamoylphenyl· glycin 20 niM in Pyrophosphatpuffer (0,1m pH 7,7 ) gegeben und bei 65 C incubiert«

Der Reaktionsabla.uf wurde üborwa.cht durch Beobachtung des bei der Hydrolyse von N-Ca.rbamcyi freigesetzten Ammoniums nach dem Phenol-fiypochlorit.-Yerfahren.

. Nach 40 h langer Incubation wax eine Konzentration/M,⁺ —en/ _ '+

Ion/von 10 mMol pro .biter erreicht und es wurde im Laufe der Zeit keine weitere Zunahme beobachtet. .

Das .Rcaktionsgemisch wurde unter Vakuum bei 50 C auf 100 ml eingeengt. .

-10-

·«*» «10- Berlin,d.1O.1O«1979

55 539 12

Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5,8 mit konzentrierter HGl wurde der entstandene Niederschlag abfiltriert.

Der so erhaltene niederschlag wurde in 1n KGl gelöst und erneut mit NaOH bei einem pH-Wert von 5»B ausgefällt.

Nach dem Trocknen wurde die spezifische optische Drehung bestimmt* Sie betrug -153 Identität der Aminosäure.

bestimmt* Sie betrug -153°. Das ΙΕ-Spektrum bestätigte die

Aus dem Eiltrat, das vorsichtig mit 3n HGl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt worden war» wurde auf dem Eisbad ein Niederschlag erhalten, der wurde zur Trockne eingedampft und mit absiedendem Äthanol extrahiert. Beim Abkühlen der alkoholischen Lösung erhielt man einen kristallinen Niederschlag, der nach dem Trocknen der Dünnschichtchromatographie und IK-Spektroskopie unterworfen wurde«

Diese Analysen bestätigten, daß chemisch reines H-Garbamoylphenylglycin erhalten worden war.

Die spezifische optische Drehung betrug £"<£j^ - 134° (c κ 1 % in 1n NaOH) gegenüber einem Wert von + 137° s> wie er in der Literatur für das L-Enantiomer angegeben ist.

Aus einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten Vorkultur wurden fünf 500-JDl-KoIben beimpft., die jeweils 100 ml eines Mediums enthielten^ das ausschließlich aus einer 5 %igen Lösung von Maiswasser bestand, di© mit NaOH auf einen pH-Wert von 7j8 gebracht und 30 min bei 121 ⁰O sterilisiert worden ist«,

. Die Kultur wurde 24 h bei 30⁰C unter kreisförmigen Schütteln (220 ΌρΨί) incubiert. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) gewaschen und in 100 ml des gleichen Puffers enthaltend 10 g 5-p-Hydroxy-D,L-phenylhy- dantoin aufgeschlämmt und bei 40⁰C unter einer (UPP) Stickstoffschutzatmosphäre incubiert. Nach 160 h-langer Incubation unter diesen Bedingungen war vollständige Hydrolyse zu der Aminosäure (D(-)-p~Hydroxyphenyl-glycin) eingetreten, was sowohl durch polariaetische Untersuchung des Reaktionsgemisches als auch durch Dünnschichtchromatografie nach Suzuki (J. of Chromatography, 80, 1973, 199 bis 204),bestätigt wurde.

Die Amimosäure wurde aus dem Reaktionsgemisch nach Ausfällen der Proteine mit Trichloressigsäure und Entfernung durch Zentrifugieren isoliert, indem man den pH-Wert auf dem isoelektrischen Punkt (5,2) brachte. Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Identität der Aminosäure wurde durch das IR-und NMR-Spektrum bestätigt. Die spezifische optische Drehung betrug &3τ?~ -¹56,5° (c = 1 %.in 1n HCl) gegenüber einem Wert von -161,2 ,wie/in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist.

Beispiel 4

Es wurden Zellen des Stammes Agrobacterium sp, aus 100 ml Kulturmedium auf Basis von Maiswasser, wie sie entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden waren, angewandt.

-12-

Die gewaschenen Zellen wurden in 10 ml Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) aufgeschlämmt und 15 min unter Rühren bei Raumtemperatur mit Toluol behandelt. . . . ·.; '

Die mit Toluol behandelte Aufschlämmung wurde zu 500 ml einer Lösung von 20 mMol N-Carbamoyl-D,L-p~hydroxyphenylglycin in Pyrophosphat-Puffer (0,1 m pH 7,7) gegeben und bei 65⁰C unter einer UPP ¹ StickstoffSchutzatmosphäre incubiert. . -

Der Re.aktionsverlauf wurde überwacht durch Beobaichtung des bei der Hydrolyse des N-Carbamoylderivatß freigesetzten Amoniums nach dein Phenol-Hypo-

i chlorit verfahren wie im Beispiel 1 angegeben* · . ·!' .' . ·

Nach 18 stündiger Incubation hatten die Nat-Io~ nen eine Konzentration von 10 mMol pro Liter erreicht und im Laufe der.Zeit wurde keine weitere Zunahme beobachtet.

in diesem Stadium wurde das Reaktionsgemisch im ei 500C/ Vakuum/auf ein.. Gesamtvolumen von 100 ml eingeengt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 5»2 mit konzentrierter HCl wurde ein Niederschlag erhalten, der abfiltriert wurde* . .

Entsprechend dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren wurden die D-Aminosäure und das L,N-Car~ bamoyl isoliert und identifiziert. Die spezifische Drehung betrug.; -157* 2° bzw* +171 ° gegenüber V/erten von -161,2 bzw« +175,4⁰C, wie sie in der Literatur für die reinen Produkte angegeben sind.

-13-

Beispiel 5 ' ' '.. . · '...

Zellen von Agrobacterium sp. wurden entsprechend Beispiel 1 hergestellt. Einige g einer feuchten Zellaufs chiämmung wurden·in Pyröphosphat-Puffer (0,1 m" pH 7*7) aufgeschlämmt und in der Kälte mit Aceton behandelt.

Nach Entfernen des Acetpns durch Filtration wurde das so erhaltene acetonhaltige Produkt im Vakuum bei 35°C auf Gewichtskonstanz getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in einer Reibschale homogenisiert und das so erhaltene Pulver zur Untersuchung der Enzyrnaktivität angewandt.

Das acetonische Pulver wurde mit folgenden Substraten untersucht: N-Carbamoyl-D-(-)-alanin,..N-Carbamoyl-I3[-)-valin, N-Carbampyl-D-(-)-glutamin^, N-Carbamoyl-D(-)-p.-hydroxyphenylglycin, N-Carbamoyl-r(- )- -p.-methoxyphenylglycin, N-Carbamoyl-D-(-)-phenylglycin, N-Carbamoyl-L(+)-phenylglycin, N-Carbamoyl-

*~ saure/ D(-)~phenylalanin, N-Carbamoyl-LC+J-glutaminrund.N- ' Carbamoyl-D(-)-(2-thienyl)-glycin.

Eine Lösung von 20 mMol. jedes Carbamoylderj.vats in 0,1 m Pyrophosphat-Puffer (pH 7,7) wurde herge-

2U/

stellt und/jeweils 10 ml dieser Lösung wurde eine entsprechende Menge des acetonischen Pulvers, die für jedes Substrats gleich war, zugegeben.

Die Incubation wurde unter UPP~Stickstoffschutzatmosphäre unter Rühren bei einer Temperatur von 4O⁰C durchgeführt. Nach 1 stündiger Incubation wurde die Menge der entstandenen Aminosäure gemessen,indem man

-14-

die Konzentration an NH^-Ionen in dem Reaktionsgemisch nach dem Beispiel 2 angegebenen Phenol-Hypochlorit-Verfahr en bestimmte. ·

Es zeigte sich, daß die höchste Aktivität des carbamoylytischen Enzyms gegenüber N-Carbamoyl-D-(-)~p.-hydroxypheiiylglycin erzielt wurde.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle angegeben, γ/obei die hydrolytische Aktivität gegenüber M-Carbamoyl-D(-)~p.-hydroxyphenylglycin gleich 100 gesetzt wurde.

T a b e 1 1 e 1

Substrat Aktivität

N-Carbamoyl-D-(-)-alanin 57,5

N-Carbamoyl-D(-)-iralin . 34,25

N-Carbamoyl-D(-)glutaminsäure 21,7

N-Carbamoyl-L(+)glutaminsäure 0

N-Carba33aöyl-D(-)-p,.-hydroxyphenylglycin 100,0

N-Carbamoyl-D(-)-p_JI-'methoxyphenylglycin 40,0

N~Carbamoyl-D(-)-plienylglyein .81,25

N-Carbamoyl-L(+)-piienylglycin 0

N-Carbamoyl-D(-)-(2-thienyl)glycin 40,7

N-Carbamoyl-D(-)-plaenylalanin 50,0

Beispiel 6 . .

• Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetziing wurde hergestellt:

MgSO₄.7H₂O - . . 0,2 g

Na₂HPO₄-^H₂O '. 6 g

KH₂PO₄ ' 3g

1 3 063 - 15 - Berlin,d,10.10.1979

55 539 12

IiE₄Cl 2 g

NaCl . 0,5 S

Glycerin 5 δ

5~Phenyl-D,L-hydantoin 2 g

Hefe-Extrakt 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Jeweils 100 ml des Mediums wurden in 500-ml-Kolben gegeben und 30 min bei 116 ⁰C sterilis: durch Eiltration sterilisiert.

und 30 min bei 116 ⁰C sterilisiert· Das Hydantoin wurde

Aus einer entsprechend Beispiel 1 erhaltenen Vorkultur wur« den 5 ml pro Kolben zugegeben und die neue Kultur bei 30 ⁰C unter kreisförmigem Schütteln mit 220 UpM 36 h incubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und die Aminosäure aus der überstehenden Flüssigkeit nach Einengen und Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt gewonnen. Aus 10 1 des so behandelten Kulturmediums erhielt man"11,2 g D(~)-Phenylglycin mit der spezifischen optischen Drehung von f^J/ψ s -156° (c = 1 % in 1n HCl) gegenüber einem Wert von -15718°, wie er in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist.

Beispiel 7

Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

MgSO₄ .	7H₂O	0	,2	g
Ha₂HPO₄	. 12H₂O		6	g
EH₂PO₄			3	S
5-Methyl	-hydantoin		2	S
MaCl		0	,5	S
Glucose			1	S

13 063 — 16- Berlin,d.10.10.1979

539 12

Hefe-Extrakt 0,1 g ·

destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,1

Jeweils 100 ml des Kulturmediums wurden in 500ml-Kolben gegeben und 20 min bei 116 ⁰C sterilisiert· Methylhydantoin wurde getrennt sterilisiert·

Von einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten Vorkultur wurden $ wl in jeden Kolben gegeben und die neue Kultur unter kreisförmigem Schütteln (220 UpM) 24 h bei 30 ⁰C incubiert.

Die aus 1000 ml Kulturmedium durch Zentrifugieren erhaltene ZeIlaufschlämmung wurde in Phosphat-Puffer (pH 7,5) gewaschen und erneut in 100 ml des gleichen Puffers, enthaltend 4 g DL-5~-(2-thienyl)-hydantoin, auf geschlämmt·

Dieses Eeaktionsgemisch wurde unter einer TJPP-Stickstoffschutaatmosphäre bei 40 ⁰G incubiert· Nach 30 h war die Hydrolyse zn der Aminosäure (D(-)-(2-thienyl)glycin) vollständig. Die Aminosäure wurde isoliert durch Einengen des Re akt ions gemisches auf ein Volumen von 20 ml und Einstel- . lung des pH-Wertes auf 5,6, Der so erhaltene Niederschlag wurde im Vakuum getrocknete Die Identität der Aminosäure wurde durch IR- und HMR-Spektram bestätigt*

Die spezifische optische Drehung betrug £~<£j^ = -72,6° (c ss 1 % in H₂O) gegenüber einem Wert von -73*7°, wie er in der Literatur für die reine Aminosäure angegeben ist·

Claims

ί 3 ;0.&3 - 17 - Berlin ,-d. 10.10.1979 55 539 12 Erf indungsansprueh ' . ,

1. Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäure, ausgehend von racemischen Gemischen der H-Garbamoylderivate oder den entsprechenden Hydantoinen, gekennzeichnet dadurch, daß man die Reaktion in Gegenwart von Enzymkomplexen durchführt, die erhalten worden sind von Mikroorganismen der Art Agrobacterium.

2* Verfahren zur Herstellung von D-aminosäure nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Mikroorganismus der Art Agrobacterium denjenigen mit der Nummer KBRL B 11 verwendet.