DE3247703A1

DE3247703A1 - Verfahren zur herstellung von l-threonin

Info

Publication number: DE3247703A1
Application number: DE19823247703
Authority: DE
Inventors: Haruo Machida Tokyo Gomi; Masahisa Tokyo Ikemi; Yoshiaki Zama Kanagawa Ishimatsu; Masaaki Kato; Iwao Machida Tokyo Kibayashi; Noriaki Ibaraki Koizumi; Teruzo Miyoshi; Hideaki Kyoto Yamada
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1981-12-28
Filing date: 1982-12-23
Publication date: 1983-07-14
Also published as: GB2113691A; GB2113691B; US4492757A; FR2518988A1; FR2518988B1; DE3247703C2

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Behandlung einer DL-Threonin en-thaltenden Lösung mit D-Threonin-Aldolase oder mit D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase, oder von einer Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin mit D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase, worauf man durch asymmetrischen Abbau von D-Threonin, D-Allothreonin und L-Allothreonin zu Glycin und Acetaldehyd L-Threonin aus DL-Threonin bzw. der Mischung von DL-Threonin^ und DL-Allothreonin erhält.

L-Threonin ist eine der für Mensch und Tier essentiellen Aminosäuren. Wegen ihres verhältnismäßig geringen Gehaltes in verschiedenen tierischen und pflanzlichen Proteinen besteht ein potentieller Bedarf an L-Threonin als Zusatz für Futter- und Nahrungsmittel. Bisher hat man L-Threonin durch Extraktion aus natürlichen Materialien gewonnen oder durch Fermentation natürlicher , Materialien hergestellt. Wegen der verhältnismäßig ; hohen Kosten des auf diese Weise hergestellten L-Threonins hat man jedoch nach einem preisgünstigeren Verfahren zu seiner Herstellung gesucht.

.

Obgleich sich L-Threonin leicht unter Verwendung von Glycin, etc. synthetisieren läßt, entsteht D-Threonin in der gleichen Menge als Nebenprodukt-, ferner werden gleichzeitig D-Allothreonin und L-Allothreonin als DL-Isomeres gebildet. Dementsprechend sind die Stufen

den Isolierung und Reinigung von L-Threonin aus den Reaktionsprodukten außerordentlich kompliziert. Die Ausbeute an L-Threonin ist gering und der Preis des synthetisch hergestellten L-Threonins sehr hoch. In Bull.Soc.Chim., Band 20, Seite 903 (1953) und ebenda, Band 23, Seite 447 (1956) sind Verfahren zur optischen Auftrennung von DL-Threonin beschrieben. Diese Verfahren sind jedoch außerordentlich mühsam und führen nur zu einer geringen Ausbeute an L-Threonin. Hinzu kommt, daß für die Entfernung der Allothreonine eine sehr komplizierte und unwirksame Methode unumgänglich ist, z.B. die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 36-19562(1961) beschriebene, bei der Bis-(acetaldehyd )-threoninkupfer verwendet wird, oder das in der US-Patentschrift 2 461 847 angegebene Verfahren, nach dem Allothreonin und Threonin unter Verwendung von Natriumethylat in Ethanol in ihre Natriumsalze umgewandelt und dann aufgrund ihrer verschiedenen Löslichkeit voneinander getrennt werden.

Weitere Nachteile des synthetischen Verfahrens liegen darin, daß auf dem Markt kaum Bedarf für D-Threonin und Allothreonin besteht, und daß sich die" Racemisierung von D-Threonin zu L-Threonin nicht so leicht bewerkstelligen läßt.

Es wurde nun ein neues Enzym gefunden, das die Umwandlung von D-Threonin und auch von D-Allothreonin in Glycin und Acetaldehyd katalysiert. Es wurde als D-Threonin-Aldolase bezeichnet. Ferner wurde gefunden, daß bei Einwirkung von D-Threonin-Aldolase auf das Syntheseprodukt, d.h. DL-Threonin oder bei kombinierter Einwirkung von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase auf die komplexeren Syntheseprodukte, d.h.

eine Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin,

L-Threonin zusammen mit brauchbaren Abbauprodukten, d.h. Glycin und Acetaldehyd erhalten wird. Es läßt sich somit L-Threonin bei gleichzeitiger Verwertung der Nebenprodukte leicht herstellen, so daß alle vorstehend erläuterten Probleme gelöst werden.

Erfindungsgemäß läßt man zur Herstellung von L-Threonin D-Threonin-Aldolase oder D-Threonin-Aldolase- und L-AlIothreonin-Aldolase auf eine Lösung einwirken, die mindestens DL-Threonin enthält, insbesondere läßt man D-Threonin-Aldolase auf eine wäßrige Lösung von DL-Threonin oder D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase auf eine wäßrige Lösung einer Mischung von DL-Threonin und DL-Allothreonin einwirken, worauf man

"15 aus DL-Threonin bzw. der Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin das L-Threonin erhält.

Die D-Threonin-Aldolase ist ein neues Enzym,- das D-Threonin zu Glycin und Acetaldehyd abbaut und auch den Abbau von D-Allothreonin zu Glycin und Acetaldehyd katalysiert. Diese Wirksamkeit zum Abbau von D-Threonin und D-Allothreonin hat ein Enzym, das von einem Alcaligenes faecalis Stamm IFO 12669 erzeugt wird, der beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan hinterlegt ist, ferner ein Enzym, das von einem Pseudomonas Stamm .DK-2 gebildet wird, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 6200 hinter-legt ist, außerdem ein Enzym, das von einem Arthrobacter Stamm DK-19 erzeugt wird, der ebenfalls bei dem zuletzt genannten Institut unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 6201 hinterlegt ist.--

V ·

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nn. 6200) und des Stammes Arthrobacter DK-19 (FERM-P Nr. 6201) sind nachfolgend aufgeführt.

(a) Morphologische Eigenschaften:

Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-19

Zellform

stabförmig stabförmig

Zellgröße, μ,

1,5 χ 0,8 2,5 χ 0,8

Auftreten verschiedener
Formen

nein Mischung aus normalen gebogenen linienförmigen Stäbchen, V-förmigen und Zweig-ahn liehen

Beweglichkeit

positiv eine Geißel positiv sehr aktiv Flimmerhärchen

Sporen

keine keine

Gram-Färbung

negativ Gram-positive Körnchen innerhalb Gram-negativer Zellen

Säurefestigkeit

keine keine

(b) Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien:

Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-19

Plattenkultur: halbtransparent

Agar mit
Bouillon

kreisförmige Kolonien mit konvexkreisförmigen Protuberanzen, glänzend halbtransparent

cremefarbene kreisförmige Kolonien mit konvex-kreisförmigen
Protuberanzen, glänzend

Schrägkultur

Agar mit
Bouillon

mäßiges Wachstum halbtransparent und glänzend mäßiges Wachstum, halbtransparent, fadenförmige Kolonien von cremeartiger Farbe, glänzend

flüssiges
Kulturmedium mit Bouillon

mäßiges Wachstum vorteilhaftes Wachstum flockig

Stabkultur

aus Gelatine und Bouillon

mäßig vorteilhaftes Wachstum auf der Oberfläche des Kulturmediums mäßig vorteilhaftes Wachstum auf der Oberfläche des Kulturmediums in Fadenform

Lackmusmilch

Veränderung alkalischer Farbe

zu Verfärbung ohne Verflüssigung

(c) Physiologische Eigenschaften

Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-19

Nitratreduktion

Freisetzung von Stickstoff

MR-Test VP-Test Indol-Erzeugung HpS-Erzeugung

Stärkehydrolyse Venwertung von

Zitronensäure

Koser's Medium

Chr istensen's Med ium

Verwertung

anorganischen

Stickstoffquellen Nitrat Ammon iumsalz

Erzeugung von Farbstoff·

Urease-Wirksamkeit

Oxidase-Wirksamkeit

Katalase-Wirksamkeit

Wachstum bei pH

+ (schwach) + (schwach)

Temperatur,

6 bis 9,5

5 bis 4,5 bis 9,5, vorzugsweise 8 bis 8,5

15 bis 38,
vorzugsweise 28 bis 30

Fortsetung der Tabelle (c) Physiologische Eigenschaften

Pseudomonas DK-2 Arthrobacter DK-19

aerobes Wachstum

O-F Test (Methode nach Hush Leifson)

ja

oxidierend ja

oxidierend

Erzeugung von Säure und Gas aus Zucker Säure

Säure

Gas

L-Arabinose D-Xylose D-Glukose D-Mannose D-Fruktose D-Galaktose Maltose Saccharose Laktose Trehalose D-Sorbit D-Mannit •Inosit Glycerin

Stärke j Raffinose Inulin D-Ribose Dulcit Sorbose

Carboxymethylcellulose

+ (schwach) -

•«■••TO*'-

Fortsetung der Tabelle (c) Physiologische Eigenschaften:

Pseudomonas DK-2

Arthrobacter DK-19

Empfindlichkeit gegenüber Halogen

5 Gew.%ige wäßrige Natriumchloridlösung

10 Gew.°/cige wäßrige Natriumchloridlösung

Zersetzung von Gelatine

DNA-ase Wirksamkeit

essentielle Vitamine

wächst

wächst nicht

Thiamin und Folsäure

wächst

wächst schwach

Pantothensäure und Nikotinsäure

Isolierungsquelle

Boden

Bei der Klassifizierung dieser beiden Stämme aufgrund der bakteriologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf "Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974)" von Burgey wurde der Stamm DK-2 als zur Gattung Pseudomonas gehörend identifiziert, da er Gram-negative Stäbchen mit einer Geißel aufweist und hinsichtlich der Oxidase-Wirksamkeit und der Denitrifizierung eine positive Reaktion verursacht.

Auf der anderen Seite wurde der Stamm DK-19 als zur Gattung Arthrobacter gehörend identifiziert, da er schwach Gram-positive Stäbchen aufweist, in verschiede-

nen Formen auftritt, Flimmerhärchen aufweist und Saccharide nicht verwertet.

Das erfindungsgemäße Enzym mit sowohl D-Threonin-Aldolase als auch D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit kann durch Kultivieren eines der genannten Stämme in einem Nährmedium erzeugt werden, wie es für die Kultivierung von Bakterienstämmen üblich ist, und das Saccharide, wie Glukose, Glycerin, Melasse und dergleichen oder

ΊΟ organische Carbonsäuren, wie Essigsäure, Äpfelsäure und dergleichen als Kohlenstoffquelle enthält, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff und dergleichen als Stickstoffquelle, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser usw. als organische Nährstoffe und Magnesium, Eisen, Mangan, Kalium, Phosphat usw. als anorganische Ionen. Die Kultivierung kann unter den herkömmlichen Bedingungen durchgeführt werden, d.h. bei pH 4 bis 10 des Kulturmediums bei einer Temperatur von 20 bis 60 C, wobei nach der Beimpfung 1 bis 3 Tage aerob kultiviert wird.

Durch Kultivierung der oben genannten Stämme unter den angegebenen Bedingungen wird das Enzym mit sowohl D-Threonin-Aldolase als auch D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit in den Bakterienzellen erzeugt und dort (angereichert. Zur Isolierung des Enzyms in reinerer Form aus dem Kulturmedium werden die vermehrten Mikroorganismenstämme, nachfolgend als "Bakterienzellen" bezeichnet, in herkömmlicher Weise zerstört, z.B. mechanisch oder durch Behandlung mit einem Enzym und Autolyse, um einen Rohextrakt des Enzyms zu erhalten. Dieser Rohextrakt wird durch eine geeignete Kombination einer Fällung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Methanol und Chromatographieren unter Verwendung eines Ionenaustauschers, wie

*-"i2 -

Diethylaminoethyl (nachfolgend als "DEAE" bezeichnet)-Cephalose, DEAE-Cephadex und Calciumphosphatgel usw. oder eines Adsonptionsmittels usw. gereinigt. Zur Feststellung der Enzymwirkung ist die Gegenwart eines Coenzyms, Pyridoxal-5'-phosphat, gewöhnlich in einer Menge

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von 10 bis 10 M notwendig.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des neuen Enzyms gemäß der Erfindung sind nachfolgend aufgeführt. 10

(1) Wirksamkeit und Substratspezifität:

Das neue erfindungsgemäße Enzym baut sowohl D-Threonin als auch D-Allothreonin zu Glycin und Acetalde-"15 hyd ab. Andererseits wirkt es überhaupt nicht auf L-Threonin und L-Allothreonin.

(2) Optimaler pH-Wert:

Aus" der Feststellung des durch das neue Enzym aus D-Threonin als Substrat innerhalb von 10 Minuten bei 30 C bei einer Reihe von pH-Werten gebildeten Aldehyds ermittelte man, daß der optimale pH-Wert des neuen Enzyms im Bereich von 7 bis 9 liegt. Die verwendeten entsprechenden Pufferlösungen sind 0,1 M Phosphatpuffer für einen pH-Bereich von 4 bis 7,5, 0,1 M tris-HCl-Puffer für einen pH-Bereich von 7 bis 9 und 0,1 M Natriumcarbonatpuffer für einen pH-Bereich von 9 bis 11.

(3) pH-Bereich, in dem das neue Enzym beständig ist:

Aus der Feststellung der verbliebenen Wirksamkeit des neuen Enzyms nach 1-stündigem Erwärmen einer

Lösung des Enzyms auf 30° C bei einer Reihe von

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pH-Werten ermittelte man, daß das neue Enzym In einem pH-Bereich von 6 bis 9 in beständigem Zustand existieren kann. Die für die Kultivierung verwendeten entsprechenden Pufferlösungen sind 0,1 M Phosphatpuffer für den pH-Bereich 4 bis 7,5, 0,1 M tris-HCl-Puffer für den pH-Bereich 7 bis 9 und 0,1 M Natriumcarbonatpuffer für den pH-Bereich 9 bis 11 ."

(4) Methode zur Bestimmung der Enzymwirksamkeit:

Die Menge des Acetaldehyde, die gebildet wird, wenn man 0,1 ml einer das neue Enzym enthaltenden Flüssigkeit zu 0,4 ml einer 0,1 M tris-HCL-Puffer lösung gibt, die 100 Mikromol D-Threonin bei pH 8,0 enthält, und die Mischung 10 Minuten auf 30° C erwärmt, wird nach der Methode von Paz bestimmt (Arch. Biochem. Biophys., Band- 109, Seite 548 (1965)). Die Enzymwirksamkeit für den Abbau von 1 Mikromol D-Threonin bei 30 C wird als Standard, d.h. eine Einheit (E) genommen.

(5) Optimale Temperatur für die Wirksamkeit

Aus der Feststellung der Menge Acetaldehyd, die von dem neuen Enzym bei einem optimalen pH-Wert (8,0) bei verschiedenen Temperaturen während 10 Minuten unter Verwendung von 0,1 M tris-HCl-Puffer lösung gebildet wurde, stellte man fest, daß der optimale Temperaturbereich für das Enzym 40 bis 50 C beträgt.

(6) Hitzebeständigkeit des neuen Enzyms

Aus der Bestimmung der verbliebenen Wirksamkeit nach dem Erwärmen einer Lösung des neuen Enzyms in einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH 8,0 während einer Stunde auf eine Reihe von Temperaturen ermittelte man, daß die Temperatur, bei der das Enzym beständig ist, unter 40° C liegt.

(7) Bedingungen für die Inaktivierung des neuen Enzyms:

Das neue Enzym gemäß der Erfindung wird vollständig bei pH unter 5 und bei pH über 11 inaktiviert, ferner durch einstündiges Erhitzen auf eine Temperatür über 70° C.

(8) Mittel, die die Wirksamkeit hemmen, aktivieren oder stabilisieren:

Das neue Enzym wird durch Mercaptoethanol, Natrium-

2+ sulfit, Natriumhydrogensulfit, Dithiothreit, Mn ,

2+ 2+ 2+
Co , Fe und Mg aktiviert und stabilisiert und

+ 2+ 2+ 2+ 2+ durch einwertiges Ag , Cu , Hg ,· Zn , Pd , Hydroxylamin und p-Chlormercuribenzoat gehemmt.

(9) Coenzym:

Das Coenzym für das Enzym ist Pyridoxal-5'-phosphat. (10) Molekulargewicht:

Das Molekulargewicht des Enzyms liegt im Bereich von 100 000 bis 150 000, wie durch Gelfiltration unter Verwendung von Cephadex^ G-200 festgestellt wurde.

(11) Elementaranalyse:

50,7 bis 52,7 % C

6,8 bis 8,8 % H

14,7 bis 16,7 % N

Da die bekannte Threonin-Aldolase und Allothreonin-Aldolase nur L-Threonin und L-Allothreonin abbauen und keine die D-Isomeren abbauenden Enzyme -IQ bekannt sind, stellen die in den Mikroorganismenstämmen festgestellten Enzyme neue Enzyme mit neuer Wirksamkeit dar.

Das heißt jegliches Enzym mit D-Threonin-Aldolase Wirk- -j5 samkeit kann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sofern es sowohl D-Threonin als auch D-AlIothreonin in Glycin und Acetaldehyd umwandelt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete L-AlIothreonin-Aldolase ist ein Enzym, das die Umwandlung von L-Allothreonin in Glycin und Acetaldehyd katalysiert. Es ist bekannt, daß dieses Enzym in Schafsleber und in keimender Mais-(Korn)-saat enthalten ist.· Ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung ist jedoch nicht bekannt.

Es wurde jedoch jetzt gefunden, daß einige Bakterien, die zu den Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter und Alcaligenes gehören, dieses Enzym bilden, und ein Verfahren zur technischen Erzeugung des Enzyms in großem Maßstab entwickelt. Beispiele für Mikroorganismen , die L-Allothreonin-Aldolase zu erzeugen vermögen, sind ein Stamm von Bacillus DK-315, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and

* V W W M M

Industry, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 6202 hinterlegt und aus einer Bodenprobe isoliert wurce, ein Stamm von Arthrobacter DK-19 (FERM-P Nr. 6201), der Stamm Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) und ein Stamm von Alcaligenes faecalis, der beim Institut for Fermentation, Osaka, Japan unter der Hinterlegungsnummer IFO-12669) hinterlegt wurde.

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Bacillus DK-315 (FERM-P Nr. 6202) sind:

(a) Morphologische Eigenschaften:

(1) Form und Größe der Zellen: Stäbchen von 0,8 χ 2,0 Mikrometer

(2) Tritt nicht in mehreren Form auf

(3) Beweglichkeit: positiv, Flimmerhärchen

(4) Sporen: ellipsoid, nicht zentrisch

(5) Gram-Färbung: positiv
(6) nicht säurefest

(b) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien:

(1) Plattenkultur aus Agar und Bouillon: vorteilhaft mit kreisförmigen Kolonien

(2) Schrägkultur aus Agar und Bouillon: vorteilhaft, halbdurchsichtig, glänzend

(3) flüssiges Kulturmedium mit Bouillon: vorteilhaft

(4) Stabkultur aus Gelatin und Bouillon: vorteilhaft in Fadenform auf der Oberfläche des Kulturmediums

(5) Lackmusmilch: Entfärbung und Verflüssigung

(c) Physiologische Eigenschaften:

(1) Nitratreduktion: . +

(2) Denitrifizierung: +

(3) MR-Test: + (schwach)

(4) VP-Test:

(5) Indol-Erzeugung:

(6) H₂S-Erzeugung:

(7) Stärkehydrolyse: + (8) Verwertung von Zitronensäure

in Koser-s Medium: -

in Christensen ' s Medium: -

(9) Verwertung von anorganischem Stickstoff

Nitrat:

Ammoniumsalz: +

(10) Erzeugung von Farbstoff: -

(11) Urease-Wirksamkeit:

(12) Oxidase-Wirksamkeit: +

(13) Katalase-Wirksamkeit: + (schwach) (14) Wachstum bei

pH: 5 bis

Temperatur: 5 bis 40 C

(15) aerobes Wachstum: ja

(16) OF-Test (Hush Leifson's Methode): F

(17) Erzeugung von Säure und Gas aus Zuckern

Säure Gas

L-Arabinose - -

D-Xylose -

D-Glukose + +

D-Mannose + +

D-Fruktose + +

D-Galaktose + +

Maltose +

Sacchrose -

Laktose -

Trehalose + D-Sorbit

D-Mannit +
Inosit

Glycerin + +

Stärke +

(18) Empfindlichkeit gegenüber Halogen: wächst nicht in wäßriger 5 %iger Natriumchloridlösung
(19) Zersetzung von Gelatine: +

(20) DNA-ase-Wirksamkeit: ' +

(21) essentielle Vitamine: keine

Aufgrund der oben genannten bakteriologischen Eigenschäften wurde unter Bezugnahme auf "Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974)" von Burgey der Stamm DK-315 als zur Gattung Bacillus gehörend identifiziert, da er sich mit Flimmerhärchen bewegt und Grampositive Stäbchen mit der Fähigkeit zur Sporenbildung aufweist.

L-Allothreonin-Aldolase kann durch Kultivieren der oben genannten Mikroorganismenstämme in einem 'Nährmedium erzeugt werden, wie es üblicherweise für die Kultivierung von Bakterienstämmen verwendet wird, und das Saccharide, wie Glukose, Glycerin und Melasse oder eine organische Säure, wie Essigsäure, Apfelsäure und dergleichen als Kohlenstoffquelle, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff und dergleichen als Stickstoffquel-Ie, organische Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und dergleichen, ferner Metallsalze, wie Magnesium-, Eisen-, Mangan- und Kaliumsalze sowie Phosphate als anorganische Ionen enthält. Die Kultivierung erfolgt unter den für Bakterien übliehen Bedingungen bei einem pH-Wert von 4 bis 10

Q — * *

während 1 bis 3 Tagen bei 20 bis 60° C. Sie wird aerob bei einem pH-Wert des Kulturmediums von 4,0 bis 10,0 durchgeführt.

Die auf diese Weise gebildete L-Allothreonin-Aldolase reichert sich in den Bakterienzellen an. Zur Isolierung des Enzyms aus dem Kulturmedium werden die Bakterienzellen in bekannter Weise aufgebrochen, z.B. mechanisch, enzymatisch oder durch Autolyse, worauf man einen Rohextrakt des Enzyms gewinnt. Der Rohextrakt wird durch eine geeignete Kombination von Fällverfahren mit Ammoniumsulfat oder einem Lösungsmittel, wie Aceton oder Ethanol und chromatographische Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern, wie DEAE-Cepharose, DEAE-Cephadex, Calciumphosphatgelen oder Adsorptionsmitteln gereinigt, um ein Enzym hoher Qualität zu erhalten. Nachfolgend sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften einer auf diese Weise erhaltenen gereinigten L-Allothreonin-Aldolase aufgeführt:

(1) optimaler pH-Wert: 8 bis 9

(2) optimale Temperatur: 60 bis 70 C

(3) Inaktivierungsbedingungen: wird in einer Stunde bei 25

30 C und einem pH-Wert von unter 5 oder über 11 oder in einer Stunde bei einer Temperatur' von über 50 C und einem pH-Wert von 8 inaktiviert

(4) Hemmstoffe: Cu²⁺, Hg²⁺ und Ag¹⁺

(5) Stabilisierungsmittel: Mercaptoethanol, Dithiothreit

und Natriumsulfit

(6) Coenzym: Pyridoxal-5'-phosphat

Da L-Allothreonin-Aldolase zur Ausübung seiner Wirksamkeit Pyridoxal-5'-phosphat als Coenzym erfor-

-3 -5
dert, werden gewöhnlich 10 bis 10 M Pyridoxal-

5'-phosphat für die Enzymreaktion verwendet.
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• τη ·_ · ·

(7) Molekulargewicht: 100 000 bis 150 000, ermittelt durch Gelfiltration mittels Cephadex^ G-200.

(8) Elementaranalyse:

C: 51,4 bis 53,4 %
H: 6,5 bis 8,5 % und
N: 14,2 bis 16,2 %.

Für die Verwendung von L-Allothreonin-Aldolase im erfindungsgemäßen Verfahren reicht es aus, wenn sie L-AlIothreonin zu Glycin und Acetaldehyd abbaut. Selbstverständlich ist dieses Enzym nicht auf ein solches beschränkt, das von Mikroorganismen stammt.

Die Verwendung der erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme, d.h. der D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase ist nicht auf eine Verwendung in isoliertem reinen Zustand beschränkt, sondern es können halbgereinigte Produkte, Rohextrakte, selbst das Kulturmedium, lebende Zellen, gefriergetrocknete Zellen, mittels Aceton getrocknete Zellen, vermahlene Zellen, vermahlene Schafsleber usw. für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Es ist auch möglich, die Enzyme in immobilisierter Form oder in Form von immobilisierten Zellen einzusetzen. Für die Immobilisierung ist eine Kombination mit einem Träger, ein Vernetzungsverfahren, ein Einschließungsverfahren, ein Agglutinationsverfahren und dergleichen anwendbar.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann auf jegliche bekann-

te Weise erhaltenes DL-Threonin oder eine Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin verwendet werden. Zum Beispiel kann man ein Produkt einsetzen, das dadurch erhalten wurde, daß man als Ausgangsstoff verwendetes Acetoacetat in einen Ester der alpha-Amino-beta-hydroxy-

buttersäure umsetzte, das Amino-hydroxybutyrat mit

Thionylchlorid in einen Oxazolinester umwandelte und dann den Ester durch Erhitzen hydrolisiert , vgl. J.Am. Chem.Soc, Band 71 (1949) Seite 1101, ferner ein solches, bei dem Vinylacetat als Ausgangsstoff in einem 5 Oxo-Verfahren einer Hydroformylierung zu alpha-Acetoxypropionaldehyd unterworfen und der Aldehyd dann mit Cyanwasserstoff und Ammoniak zu alpha-Amino-beta-hydroxybutyronitril umgesetzt, wurde, das seinerseits mit Phosgen in ein Oxazolidonderivat umgewandelt und dieses Derivat dann hydrolisiert wurde, vgl. japanische Patentveröffentlichung Nr. 40-11608(1965). Da im erfindungsgemäßen Verfahren die angestrebte Verbindung jedoch L-Threonin ist und die Nebenprodukte aus Glycin und Acetaldehyd bestehen, wird ein synthetisches Verfahren bevorzugt, das in kleinerer Menge zu den allo-Formen führt und Glycin und Acetaldehyd als Ausgangsstoffe erfordert. Deshalb ist ein Verfahren, bei dem ein Metallsalz mit Glycin zu einem Metallkomplex von Glycin und dieser Komplex darauf mit Acetaldehyd kondensiert wird, ein geeignetes Verfahren für die Herstellung einer Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin, vgl. die japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 36-19562(1961) und 47-39093(1972). Die die Mischung enthaltende Lösung kann aus einer wäßrigen Lösung bestehen, die man durch Lösen des in Form von Kristallen erhaltenen Produktes in Wasser erhalten hat. Es kann jedoch auch die durch Synthese erhaltene Flüssigkeit sein oder eine als Zwischenprodukt gebildete Flüssigkeit bei der Gewinnung der Kristalle aus der Mischung.

^O Kurz gesagt, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, DL-Threonin und DL-Allothreonin enthaltende Flüssigkeit kann aus einer DL-Threonin und DL-Allothreonin enthaltenden Lösung bestehen, wobei das Verhältnis des D-Isomeren zum L-Isomeren in der Lösung sowie das Verhältnis der Threonine zu den Allothreoninen in der

Lösung keine Rolle spielen. Weitenhin kann die Lösung andere Verunreinigungen enthalten, jedoch sollten Verunreinigungen, die die Enzymreaktion hemmen, entfernt werden. Zum Beispiel sollte, wenn bei der Synthese ein Metallion verwendet wurde, das für die Enzymreaktion schädlich ist, dieses vor der Enzymreaktion mit einem Kationenaustauscherharz etc. entfernt werden.

Die Behandlung einer DL-Threonin enthaltenden Lösung "10 mit D-Threonin-Aldolase oder einer sowohl DL-Threonin als auch DL-Allothreonin enthaltenden Lösung mit einer Mischung von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase macht keine Schwierigkeit. Das Enzym muß lediglich in der wäßrigen Lösung der angegebenen Substanz "15 vorhanden sein. Die Konzentration des DL-Threonins und/oder des DL-Allothreonins in der Lösung ist variierbar und beträgt vorzugsweise 0,1 bis 2 Mol/Liter. Das Lösungsmittel für das eηζymatisehe Reaktionssystem ist hauptsächlich Wasser, jedoch kann auch ein organisches Lösungsmittel enthalten sein, sofern dieses die Enzymreaktion nicht hemmt. Obgleich der pH-Wert des Reaktionssystems vom Enzym abhängt, liegt er vorzugsweise um pH 7 bis 10 in den Fällen, in denen das Enzym nach den angegebenen Beispielen erhalten wurde. Ebenso hängt die Reaktionstemperatur vom Enyzm ab, beträgt jedoch vorzugsweise 30 bis 45° C in den Fällen, in denen das Enzym wie in den Beispielen hergestellt wurde. Außerdem kann bei Verwendung der gemäß den Beispielen hergestell-

_3 ten Enzyme die Enzymreaktion durch Einbringung von 10

-5

bis 10 Mol Pyridoxal-5'-phosphat als Coenzym beschleunigt werden. Schließlich kann für verschiedene Zwecke ein oberflächenaktives Mittel in das Reaktionssystem gegeben werden. Die enzymätische Reaktion kann chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Dabei

***23 ■·· ·♦·»

kann man die D-Threonin-Aldolase und die L-Allothreonin-Aldolase zusammen oder getrennt zufügen.

Die Reaktionszeit kann je nach dem für das L-Threonin beabsichtigten Verwendungszweck ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel zusammen mit dem L-Threonin nicht abgebautes Isomeres vorhanden sein kann, kann man die Reaktion vor Beendigung des enzymatIschen Abbaus des Isomeren unterbrechen. Auf jeden Fall ist für jedes Enzym eine Reaktionszeit von 5 bis 100 Stunden ausreichend.

Nach Beendigung der Enzymreaktion werden im Reaktionsgemisch suspendierte Substanzen, sofern notwendig, durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, worauf man das Reaktionsgemisch durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz und Kristallisation reinigt, oder nach der Entfärbung der Reaktionslösung mit A-Kohle etc. die entfärbte Lösung zur Erzielung von Kristallen aus L-Threonin in reinem Zustand einengt. Das Reaktionsprodukt enthält außer dem L-Threonin Glycin und Acetaldehyd bei Verwendung von D-Threonin-Aldolase und auch bei Verwendung von D-Threonin-Aldolase und L-Allothreonin-Aldolase_. Das Glycin kann durch Chromatographieren, z.B. unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes abge-

trennt und isoliert werden. Wegen der nicht-enzymatischen Kondensation des Acetaldehyds mit Glycin während der Enzymreaktion oder der Wiedervereinigung mit Glycin aufgrund der Enzymeinwirkung, ist es besser, den Acetaldehyd während der Enzymreaktion durch Destillation etc. zu entfernen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich das D-Threonin oder das DL-Allothreonin bequem in einer Stufe aus einer Threoninmischung entfernen, was bisher

nicht möglich war. Die Erfindung löst somit das große

Problem, das bisher die Abtrennung des Isomeren behinderte, und stellt ein kostengünstiges Verfahren zur Gewinnung von L-Threonin aus synthetisch hergestelltem Threonin zur Verfügung. Es ist besonders günstig, wenn die synthetische Herstellung des Threonins aus Glycin und Acetaldehyd erfolgte, da in diesem Fall die Nebenprodukte der enzymatischen Reaktion als Ausgangsstoffe wieder verwendet werden können.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

In ihnen beziehen sich alle Prozentangaben auf das Gewicht. Die Wirksamkeit der D-Allothreonin-Aldolase und der L-Allothreonin-Aldolase wurde wie die der D-Threonin-Aldolase gemessen, mit der Abweichung, daß das Substrat dem Enzym entsprechend ausgetauscht wurde. Die Aktivität wurde in der Weise festgelegt, daß die Aktivität für den Abbau eines Mikromols Allothreonin, des Substrats, in einer Minute eine Einheit ist (1 E).

A. Herstellung eines Enzyms mit D-Threonin-Aldolase und D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit

Man stellte ein auf pH 7,5 eingestelltes Kulturmedium her, das 0,5 % Polypepton, 0,2 % Hefeextrakt, 0,1 % Kaliumdihydrogensulfat, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,1 % L-Glutaminsäure und 0,5 % D-Threonin enthielt. In einen 5-Liter-Behälter wurden 3 Liter dieses Kulturmediums eingeführt. Dann wurde dieses Medium 10 Minuten bei 120 C sterilisiert. Das so sterilisierte Kulturmedium wurde mit Arthrobacter DK-19 (FERM-P Nr. 6201) beimpft und 20 Stunden bei 30° C unter Belüften und Rühren bebrütet.

Nach Beendigung den Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeit gesammelt, und nach denn Waschen der Zellen mit wäßriger 0,9 %iger Natriumchloridlösung wurden die nassen ZeI-len in 100 ml 0,1 M Phosphatpufferlösung suspendiert, die 10 mM Mercaptoethanol und 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat enthielt. Nach der Behandlung der so erhaltenen Zellsuspension mit Ultraschall von 20 kHz 5mal für jeweils 5 Minuten wurde die Suspension zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu sammeln. Nach der Zugabe von Protaminsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit zur Entfernung von Nukleinsäure wurde die Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat fraktioniert, um eine enzymhaltige Fraktion mit D-Threonin-Aldolase Wirksamkeit zu erhalten.

Nachdem man diese Fraktion einer Dialyse gegen 0,01 M Phosphatpuffer unterworfen hatte, der 10 mM Mercaptoethanol und 0,1 mM Pyridoxal-5'-phosphat enthielt und einen pH-Wert von 7,5 aufwies, wurde das erhaltene Dialysat durch eine Säule geführt, die 100 ml DEAE-Cephadex^ A-50 enthielt. Die von der Säule adsorbierte Fraktion wurde unter Anwendung eines Kaliumchlorid-Konzentrationsgradienten fraktioniert eluiert, um eine enzymhaltige Fraktion mit D-Threonin-Aldolase Aktivität zu gewinnen. Durch Einengen dieser Fraktion durch Ultrafiltration erhielt man 10 ml einer Lösung von gereinigter D-Threonin-Aldolase. Die D-Threonin-Aldolase und die D-AlIothreonin-Aldolase Aktivität der so erhaltenen Lösung betrug.5 E/ml bzw. 12,5 E/ml.

B. Herstellung von Enzymen mit D-Threonin-Aldolase und D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit

Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) und Alcaligenes faecalis IFO 12669 wurden jeweils im gleichen Kulturmedium nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben kultiviert. Aus den erhaltenen Kulturmedien wurden nach den gleichen Verfahren jeweils 10 ml einer Lösung von gereinigter D-Threonin-Aldolase erhalten. Die D-Threonin-Aldolase und die D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit des Enzyms, das durch Kultivierung von Pseudomonas DK-2 erhalten worden war, betrug 4,5 E/ml bzw. 10,8 E/ml und die des Enzyms, das durch Kultivierung von Alcaligenes faecalis erhalten worden war, 4,2 E/ml bzw. 9,5 E/ml.

C. Herstellung von L-Allothreonin-Aldolase

Bacillus DK-315 (FERM-P Nr. 6202) wurde im gleichen Kulturmedium in gleicher Weise wie oben kultiviert, worauf man nach den gleichen Verfahren 10 ml wäßrige Lösung gereinigter L-Allothreonin-Aldolase erhielt. Die L-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit der erhaltenen Lösung betrug 4,5 E/ml. Diese Lösung zeigte keinerlei Wirkung auf D-Allothreonin und D-Threonin.

D. Herstellung von DL-Threonin

In 5 Liter heißem Wasser löste man 75 g Glycin und gab dann langsam 100 g basisches Kupfercarbonat zu der Lösung. Die Mischung wurde durch Erhitzen zur Umsetzung gebracht. Nach beendeter Umsetzung wurde der Überschuß an basischem Kupfercarbonat aus der heißen Lösung abfiltriert und nach dem Einengen des Filtrats unter verringertem Druck wurde das konzen-

trierte Filtrat gekühlt. Man erhielt 110 g kristallinen Kupfer-Glycin Komplex.

In 1 Liter Wasser wurden 58 g des Kupfersalzes von Glycin, 40 g Anionenaustauscherharz SA 21A (HCO-Typ) und 45 ml Acetaldehyd gegeben. Die Mischung wurde unter Rühren 2 Stunden auf 40 C erwärmt. Nach beendeter Umsetzung wurde das ■ Reaktionsgemisch 24 Stunden bei 5 C stehengelassen. Es fielen Kri-

-|0 stalle des Bisacetaldehyd-Threonin-Kupf er Komplexes aus. Nach dem Abfiltrieren der Kristalle zusammen mit dem Katalysator wurde der Feststoff in 0,6 Liter wäßriger 3 %iger Ammoniaklösung suspendiert und die Suspension filtriert. Das Filtrat wurde durch eine

-15 Säule geführt, die mit 1,2 Liter Chelatharz, Dowex
A-1 (NH -Typ) gefüllt war,, um das Kupfer aus dem Filtrat zu entfernen. Die Fraktion mit positiver-Ninhydrin Reaktion wurde gesammelt und unter verringertem Druck eingeengt. Durch Zugabe von Methanol zu dem Konzentrat erhielt man Kristalle, die aus wäßriger methanolischer Lösung umkristallisiert wurden. Ausbeute 41 g DL-Threonin, das keinerlei Allothreonin enthielt.

E. Synthese einer Mischung aus DL-Threonin und DL-AlIothreonin.

In 5 Liter heißem Wasser wurden 75 g Glycin gelöst, worauf man langsam 100 g basisches Kupfercarbonat zu der Lösung gab und die Mischung durch Erhitzen zur Umsetzung brachte. Nach beendeter Reaktion wurde das überschüssige basische Kupfercarbonat aus der heißen Lösung abfiltriert und nach dem Einengen des Filtrates unter verringertem Druck wurde das Filtrat gekühlt, worauf man 110 g kristallinen Kupfer-Glycin Komplex erhielt.

In 0,8 Liter Methanol, die 6 g Kaliumhydroxid enthielten, wurden 58 g Kupfer-Glycin Komplex und 50 g Acetaldehyd gegeben. Diese Mischung ließ man 1 1/2 Stunden unter Rühren bei 50 bis 60° C reagieren. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um eine kleine Menge nicht gelösten Materials zu entfernen. Nach Zugabe von 6,4 g Essigsäure zum Filtrat wurde zur Entfernung des Lösungsmittels" unter verringertem Druck destilliert. Nachdem die rohe Kupfer-Threonin Verbindung, die als Destillationsrückstand verblieben war, ausreichend mit Wasser gewaschen worden war, wurde die kristalline Verbindung in 0,5 Liter 6N wäßriger Ammoniaklösung gelöst. Die erhaltene Lösung wurde durch eine

-15 Säule geführt, die mit 2 Liter Dowex-^ A-1 (NH -Typ), einem chelatbildenden Harz gefüllt war, um das Kupfer aus der Lösung zu entfernen und die das Threonin enthaltende Fraktion zu sammeln. Sie wurde unter verringertem Druck auf 100 ml eingeengt, worauf man 400 ml Methanol zusetzte und die Mischung kühlte. Die ausgeschiedenen Kristalle wurden aus wäßriger methanolischer Lösung umkristallisiert. Ausbeute 38 g kristallines DL-Threonin, das 10 % DL-Allothreonin enthielt.

Beispiel 1

In 20 ml einer wäßrigen Lösung, die 10 Mol Pyridoxal-

— 4 — 3

. 5'-phosphat, 10 Mol Mercaptoethanol, 10 Mol Manganchlorid und 2,38 g kristallines DL-Threonin enthielten, das wie oben unter E hergestellt worden war und 10 % DL-Allothreonin enthielt, wurden 10 ml der . gereinigtes Enzym enthaltenden Lösung gemäß A mit D-Threonin-Aldolase und D-Allothreonin-Aldolase Wirksamkeit sowie 10 ml

der gereinigten D-Allothreonin-Aldolase Lösung gemäß C gegeben. Diese Mischung wurde 24 Stunden bei 30° C zur Umsetzung gebracht, wobei man den während der enzymatischen Reaktion gebildeten Acetaldehyd zur Entfernung und Gewinnung unter verringertem Druck abdestillierte. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde während der Reaktion durch Zugabe von 0,1 N Natr i'umhydroxidllösung auf 7,5 bis 8,5 gehalten.

Nach beendigter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit verdünnter Chlorwassersäure neutralisiert und dann

CrS

durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Dowex .50 WX-8 (H -Typ) gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und das Threonin, Glycin usw., die auf der Säule adsorbiert worden waren, wurden mit wäßriger 0,2 N Ammoniaklösung eluiert. Nach dem Einengen des Eluats zur Trockene unter verringertem Druck wurde der zurückgebliebene Feststoff in 20 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 3 eingestellt und die Lösung erneut

/B)

durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Dowex 50 WX-8 (H -Typ) gefüllt war. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser, führte man wäßrige 0,1 N Ammoniaklösung durch die Säule, um eine Fraktion zu eluieren, die Threonin enthielt. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zu einem Feststoff eingeengt. Der Feststoff wurde in 4 ml Wasser gelöst, worauf man langsam 10 ml Ethanol zu der Lösung gab. Die ausgefallenen Kristalle wurden isoliert. Das Trockengewicht der Kristalle betrug 0,9 g.

Die Papierchromatographie bestätigte, daß die Kristalle aus reinem Threonin bestanden.. Die spezifische Drehung der Kristalle betrug

= -28,7° (in Wasser),

.30 ν." „:l.

die mit der einer authentischen Probe von reinem L-Threonin übereinstimmte.

Die wäßrige 0,1 N Ammoniaklösung wurde durch die übrige ,- Säule geführt, um eine Glycin enthaltende Fraktion zu eluieren. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zu einem Feststoff eingeengt und der Feststoff in 1 ml Wasser gelöst. Durch langsame Zugabe von 4 ml Ethanol zu der Lösung fielen Kristalle aus, die isoliert und getrocknet wurden. Ausbeute 0,65 g Glycin, wie durch Papierchromatographie bestätigt wurde.

Die Menge des während der Reaktion unter verringertem Druck entfernten Acetaldehyde betrug 0,34 g.

Beispiel 2

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß 10 ml der gereinigten D-Threonin-Aldolase __ Lösung verwendet wurden, die mit Pseudomonas DK-2 FERM-P 6200 gemäß B erhalten worden waren, wurde das 10 % DL-Allothreonin enthaltende DL-Threonin abgebaut. Man erhielt 0,91 g kristallines Threonin,, das keinerlei Allothreonin enthielt, 0,66 g kristallines Glycin und 0,34 g Acetaldehyd. Die spezifische Drehung des kristallines Threonine betrug

[α]^⁷ = -28,7° (in Wasser) ,

was bestätigt, daß die Kristalle ausschließlich aus L-Threonin bestanden.

Beispiel 3

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß 10 ml der geneinigten D-Threonin-Aldolase Lösung verwendet wurden, die mit Alcaligenes faecalis IFO 12669 gemäß B erhalten worden waren, wurde das 10 % DL-Allothreonin enthaltende DL-Threonin abgebaut. Man erhielt 0,91 g kristallines Threonin, das keinerlei Allothreonin enthielt, 0,66 g kristallines Glycin und 0,34 g Acetaldehyd. Die spefizische Drehung des kristallines Threonine betrug

[a]^⁷ = -28,7° (in Wasser),

"^ was bestätigt, das die Kristalle ausschließlich aus L-Threonin bestanden.

Beispiel 4

Zu 30 ml einer wäßrigen Lösung, die 2,38 g DL-Threonin gemäß D, 10~ Mol Pyridoxal-5'-phosphat, 10 Mol Mer-

— 3

captoethanol und 10 Mol Manganchlorid enthielten, wurden 10 ml der gereinigten D-Threonin-Aldolase Lösung gemäß A gegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden bei

ο '

30 C zur Umsetzung gebracht, wobei man den während der enzymatischen Reaktion gebildeten Acetaldehyd entfernte und gewann. Der pH-Wert des Reaktionssystems wurde durch Zugabe wäßriger 0,1 N Natriumhydroxidlösung auf

7,5 bis 8,5 gehalten.
.

Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert und dann

• (R)

durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Dowex^u 50 WX-8 (H -Typ) gefüllt war. Nach dem Waschen der Säule mit

Wasser wurden das auf der Säule adsorbierte Threonin und das Glycin mit wäßriger 0,2 N Ammoniaklösung eluiert. Nach dem Einengen des Eluats unter verringertem Druck zu einem Feststoff wurde der Feststoff in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung durch Zugabe verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 eingestellt. Dann wurde sie erneut durch eine mit 100 ml Dowex^ 50 WX-8 (H -Typ) gefüllte Säule geführt. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde wäßrige 0,1 N Ammoniaklösung durch die Säule geführt, um die Threonin enthaltende Fraktion zu eluieren. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zu einem Feststoff eingeengt und dann der Feststoff in 4 ml Wasser gelöst. Durch langsame Zugabe von 10 ml Ethanol zu der Lösung wurden Kristalle ausge-

"15 fällt, die abgetrennt und getrocknet wurden. Sie wogen 0,95 g und bestanden aus reinem Threonin mit einer spezifischen Drehung von

= -28,7° (in Wasser),

die mit der einer authentischen Probe von L-Threonin übereinstimmte.

Die 0,1 N Ammoniaklösung wurde weiter durch die oben 25

genannte Säule geführt, um die Glycin enthaltende Fraktion zu eluieren. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Nach dem Lösen des Feststoffes in 1 ml Wasser wurden langsam 4 ml Ethanol zugefügt, worauf sich Kristalle aus der Lösung abschieden. 30

Sie wogen nach dem Trocknen 0,6 g und bestanden ausschließlich aus Glycin, wie durch Papierchromatographie bestätigt wurde. Die Menge des während der Umsetzung unter verringertem Druck entfernten und gewonnenen Acetic aldehyde betrug 0,3 g.

Beispiel 5

Das enzymatische Verfahren und die Abtrennung den Produkte wunde in gleicher Weise ausgeführt wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß während der enzymatischen Reaktion nicht unter verringertem Druck destilliert wurde. Auf diese Weise erhielt man 0,8 g kristallines Threonin, das 10 % Allothreonin enthielt, 0,3 g kristallines Glycin und 0,05 g Acetaldehyd.

Beispiel 6

Pseudomonas DK-2 (FERM-P Nr. 6200) wurde unter den gleichen Bedingungen wie unter A angegeben kultiviert. Die erhaltene 10 ml Fraktion mit D-Threonin-Aldolase Wirksamkeit sowie eine 10 ml Fraktion gemäß C mit L-AlIothreonin-Aldolase Wirksamkeit wurden durch Ultrafiltration eingeengt, worauf man zwei Lösungen erhielt, die D-Threonin-Aldolase bzw. L-Allothreonin-Aldolase enthielten.

Durch Zugabe der beiden Lösungen zu einer Mischung aus 2 g DL-Threonin und 1 g DL-Allothreonin unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß eine Temperatur von 35 C anstelle von 30 C eingehalten wurde, erhielt man 0,85 g kristallines L-Threonin, das weder D-Threonin noch DL-Allothreonin enthielt, ferner 1,01 g Glycin und 0,51 g Acetaldehyd. Die

spezifische Drehung des erhaltenen L-Threonins betrug
30

[a]j:⁷ = -28,6° (in Wasser).

SCHA/wo

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DL-Threonin enthaltende Lösung mit D-Threonin-Aldolase oder mit D-Threonin-Aldolase .und L-Allothreonin-Aldolase behandelt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DL-Threoninlösung behandelt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von einer Mischung aus DL-Threonin und DL-Allothreonin behandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die D-Threonin-Aldolase aus einem Enzym besteht, das D-Threonin und D-Allothreonin asymmetrisch zu Glycin und Acetaldehyd abbaut.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Allothreonin-Aldolase aus einem Enzym besteht, das L-Allothreonin asymmetrisch zu Glycin und Acetaldehyd abbaut.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die D-Threonin-Aldolase von einem Mikororganismenstamm der Gattung Arthrobacter, Pseudomonas oder Alcaligenes gebildet wurde.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Allothreonin-Aldolase von einem Mikroorganismenstamm der Gattung Bacillus, Arthrobacter,

Pseudomonas oder Alcaligenes gebildet wurde. 20