DE2126181C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Arginase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginase durch aerobes Züchten eines Bazillus-Stammes in einem wäßrigen Nährmedium und durch Isolierung der L-Arginase in an sich bekannter Weise.

L-Arginase ist ein Enzym, welches i.-Arginin in Ornithin und Harnstoff hydrolytisch spaltet und im Tier- sowie Pflanzenbereich weit verbreitet ist. Die Bedeutung der L-Arginase ist stark gestiegen, seitdem bekanntgeworden ist, daß L-Arginase verschiedene physiologische Aktivitäten, wie z. B. die Behinderung der Biosynthese von DNA, aufweist. +0

Bei bekannten Verfahren hat man den Bazillus-Stamm (vgl. [1] Zeitschrift »J. Mol. Biol.«, 11/1965, S. 842 bis 844) oder statt dessen einen der Hefe- bzw. Pilzstämme (vgl. [2] Zeitschrift »Biophys. Acta«, 156/ 1968, S. 440 bis 443, und [3] Zeitschrift »C. R. Acad. «5 Sc. Paris«, t. 264, 12. 6.1967, Ser. D, S. 2777 bis 2780) gemäß nachfolgender Aufstellung eingesetzt, in welcher auch die berichteten L-Arginase-Aktivitätshöchstwerte der jeweils nach Züchten sowie Zertrümmern des Zellmaterials, z. B. durch Ultraschallbehandlung ([I]. [2])> isolierten L-Arginase in der Dimension I. E./mg Protein aufgeführt sind. (Die in der Dimension der L-Arginase-Aktivität enthaltene Einheit I. E. — Internationale Einheit gibt die pro Minute zersetzte L-Argininmenge in μΜοΙ an. Der in [3] angegebene. Wert für die L-Arginase-Aktivität wurde unter der Annahme umgerechnet, daß der Proteingehalt der Trockenzeiten 50% beträgt.)

Stamm L-Arginase-Aktivität iSo

[1] Bacillus licheniformis 0,54

Candida utilis 0,58

Candida bogoriensis 0,31

Cryptococcus albidus 0,06

Hansenula anomala 0,07

[2] Lipomyces starkeyi O_;25

Rhodotorula glutinis 0,13

Saccharomyces cerevisiae 1,58

SchLzosaccharomyces octosporus.. 0,25

Sporobolomyces holsaticus 0,22

Torula cremoris 0,35

[3] Peniciüium roquefort! (Stamm 143) 0,62

Die L-Arginase-Aktivität der nach dec --nannten bekannten Verfahren hergestellten L-A., ±ase ist vergleichsweise gering. Darüber hinaus ist die vor der Isolierung der L-Arginase erforderliche Zertrür-unerung der Zellwände, insbesondere durch Ultraschallbehandlung, bei Einsatz von Hefe- bzw. Pilzstämmen wesentlich schwieriger als bei Einsatz von Bakterienstämmen, weil die Zellwände von Hefen bzw. die Suspensionen von Pilzen größere Festigkeit aufweisen als die von Bakterien. Eine in kommerzieLler Hinsicht wirtschaftliche Herstellung von L-Arginase ist mit den bekannten Verfahren daher nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Gattung anzugeben, mit welchem eine L-Arginase-Hcrstellung mit hoher Ausbeute und hoher L-Arginase-Aktivität ermöglicht wird.

Die Erfindung besteht darin, daß man bei dem Verfahren der eingangs genannten Art als Bazillus-Stamm

Bacillus cereus ATCC 9139,

Bacillus circulans ATCC 4513,

Bacillus firmus ATCC 8247,

Bacillus fructosus ATCC 15451,

Bacillus megaterium ATCC 19380,

Bacillus pumilus ATCC 19182,

Bacillus pumilus subsp. nonpentosofermentus

ATCC 21398,

Bacillus stearothermophilus ATCC 7954,
Bacillus subtilis ATCC 6633 oder
Bacillus thuringiensis ATCC 10792

einsetzt. Vorzugsweise wird die Züchtung in 6 bis 30 Stunden bei einem pH-Wert von 5 bis 9 und bei 20 bis 40⁰C durchgeführt.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Bazillus-Stämme sind unter den aufgeführten Hinlerlegungsnummern bei der American Type Culture Collection für die Öffentlichkeit ohne Einschränkung zugänglich.

Zum aeroben Züchten der Bazillus-Stämme wird vorteilhafterweise ein organische Stickstoffverbindungen und andere Zusätze aufweisendes Nährmedium, z. B. mit Fleischextrakt, Pepton, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehlwasser, Caseinhydrolysat, geeigneten Aminosäuren, wie Glutaminsäure usw. verwendet. Der Einsatz eines flüssigen Nährmediums mit Zusatz geeigneter Vitamine und anorganischer Salze ist auch möglich. Der auf das Nährmedium geimpfte Bazillus-Stamm wird 6 bis 30, vorzugsweise 20 Stunden lang bei einem pH von 5 bis 9 und einer Temperatur von 20 bis 40⁰C unter Schütteln oder Rühren und Belüften gezüchtet, wobei sich etwa 8 bis 20 g/l Naßzellen bilden. Nach Beendigung der Züchtung wird die Fermentbrühe zentrifugiert oder filtriert, um die Zellen zu isolieren, welche dann zur Gewinnung einer Extraktlösung mit L-Arginase-Aktivität in üblicher Weise, z. B. durch Ultraschallbehandlung oder Druckzertrümmerung, aufgeschlossen werden. Zur Reinigung der die L-Arginase enthaltenden Extraktlösung werden bekannte Enzymreinigungsverfahren (Ausfällung mit Ammoniumsulfat und einem Lösungsmittel, Chromatographie mit Ionenaustauschern und Adsorbentien usw.) angewandt.

Nachfolgend wird die Erfindung an Hand zweier Beispiele und eines Vergleichsversuchs näher erläutert.

Beispiel 1

Bacillus pumilus subsp. nonpentosofermentus ATCC 21398 wurde 20 Stunden lang bei 28° C unter Belüften und Rühren in einem 5 % Maisquellflüssigkeit enthaltenden Medium gezüchtet. Die erhaltene Fermentbrühe wurde als Keimkultur in einem Volumenverhältnis von 1: 10 auf 1000 Liter eines Nährmediums in einem 2000-Liter-Fermenter geimpft, welches 2% Bouillonpulver, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCi und 0,01 % MgSo₁ · 7H₂O enthielt und auf ein pH von 7,2 eingestellt war. Es wurde 18 Stunden lang bei 30⁰C unter Rühren (110 U. p. M.) und Belüften (200 l/Min.) gezüchtet, wobei sich eine Fermentbrühe mit einer Enzymaktivität von 2,0 L E./ml ergab und aus der durch Zentrifugieren 15,8 kg Naßzellen gewonnen wurden. Die Naßzellen wurden in eine 0,01 molare Phosphatpufferlösung (pH = 8) suspendiert und mit Hilfe eines Homogenisierers zertrümmert. Der Zeilrückstand wurde abzentrifugiert, wobei sich eine Rohextraktlösung mit einer i.-Arginase-Aktivität von 1,31. E./mg Protein ergab. Die Rohextraktlösung wurde zur Entfernung der Nucleinsäuren einer Behandlung mit Mn⁺⁺, Teilfällung durch Ammoniumsulfat, Chromatographie mit Diäthylaminoäthylzellulose, Carboxylmethylgruppen aufweisendem Dextran und Polyacrylamidgel usw. unterworfen. Man erhielt ein L-Arginase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 43 1. E./mg Prolein und einer Ausbeute von etwa 23%.

Beispiel 2

Bacillus subtilis ATCC 6633 wurde zum Erhalt einer Keimkultur in der im Beispiel \ beschriebenen Weise gezüchtet. Mit der Keimkultur wurde in einem Volumenverhältnis von 1: 10 ein Nährmedium (3 Liter) in einem 5-Liter-Fermenter beimpft, welches 2% Glutaminsäure, 0,5% hydrolysiertes Kasein, 0,25% NaCl, 0,5% KH₂PO₄, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ •7 H₈O, 4,7 mg/1 MnCl₂ · 4 H₂O, 0,3 mg/1 CaCl₈, 3,0 mg/1 ZnSO₄, 6,0 mg/l FeCl und 4,3 mg/1 CuSO₄ • 5 H₂O enthielt und auf ein pH von 7,2 eingestellt war. Die Züchtung wurde 12 Stunden lang bei 30°C unter Rühren (450 U. p. M.) und Belüften (31 l/Min.) ausgeführt; es ergab sich eine Zuchtbrühe mit einer Enzymaktivität von 1,8 I. E./ml, aus der durch Abzentrifugieren etwa 50 g Naßzellen gewonnen wurden. Diese wurden in eine Phosphatpufferlösung (pH = 8,0) suspendiert und für 10 Minuten einer 10-kHz-Schallbehandlung unterworfen. Nach Abzentrifugieren ergab sich eine Rohextraktlösung mit einer L-Arginase-Aktivität von 1,21. E./mg Protein. Das Extrakt wurde zur Reinigung in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt. Ees ergab sich ein L-Arginase-Präparat mit einer Aktivität von 35 I. E./mg Protein in einer Ausbeute von etwa 20%.

Vergleichsversuch

Zu einem Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem aus [1] bekannten Verfahren, bei dem ein von anderer Seite bekanntes Nährmedium verwendet wurde (vgl. Zeitschrift »Arch. Biochem. Biophys.«, 103/1963, S. 95), wurde das in [1] beschriebene Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Bazillus-Stämme nachvollzogen.
Dazu wurde eine Mischung aus Glukose (20 μΜοΙ/ ml), Ammoniumlaktat (50 μΜοΙ/ml), MgSO₁ · 7 H₂O (1 g/l), NaCl (0,4 g/l), H₃PO₄ (0,45 g/l), Zitronensäure (0,31 g/1), MnSO₄ (6 mg/1) und FeSO₁ - (NH₄)^O₄ • 6 H₂O (0,25 mg/1) hergestellt und in Mengen von

ίο jeweils 25 ml unterteilt. Jede Teilmischung wurde in einen Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen. von 250 ml gefüllt und unter Verwendung einer Platinöse mit einem der erfindungsgemäß einzusetzenden Bazillus-Stämme geimpft. Zum Erhalt von Keimkulturen wurde 18 Stunden lang bei 37°C unter Schütteln gezüchtet. Getrennt davon wurde nochmals eine gleiche Mischung hergestellt, der jedoch eine auf ein pH von 7,2 mit KOH eingestellte Lösung mit 10 mMol/ml L-Arginin zugesetzt wurde. Dieses Mean dium wurde wiederum in Teilmengen von jeweils 25 ml unterteilt; die Teilmengen wurden ebenfalls jeweils in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingegeben und daraufhin mit obigen Keimkulturen beimpft (8 Volumprozent). Anschließend wurde das Keimgut

=>5 6 Stunden rfang bei 37° C unter Schütteln gezüchtet und nachfolgend zentrifugiert. Die gewonnenen Naßzellen wurden mit einer 5-mM-tris-Pufferlösung (pH -= 7,5) gewaschen, zentrifugiert und in 10 ml 5 mM-tris (pH = 7,5) mit einem Gehalt von 0,1 mM-Mercaptoäthanol suspendiert. Alsdann wurden die Zellen in Zentrifugierröhren eingefüllt und für 5 Minuten bei 2°C in der Kammer eines 28-kHz-Ultraschallgerätes behandelt. Die Homogenate wurden dann für 60 Minuten bei 105 000 g zentrifugiert; die sich ergebenden überschüssigen Flüssigkeiten wurden bei zweimaligem Wechsel von 1 Liter 2-mM-tris-Pufferlösung (pH = 7,5) mit einem Gehalt von jeweils 0,1 mM-Mercaptoäthanol jeweils 75 Minuten dia'ysiert. Die in der nachfolgenden Tabelle 1 in 1. E./mg Protein angegebenen L-Arginase-Aktivitäten der Lösungen wurden in der in [1] beschriebenen Weise bestimmt.

Tabelle I

Stamm

vArginase-Aktivität

Bacillus cereus ATCC 9139 1,42

Bacillus circulans ATCC 4513 1,85

Bacillus firmus ATCC 8247 1,23

Bacillus fructosus ATCC 15451 1,72

Bacillus megaterium ATCC 19380 .. 1,10

Bacillus pumilus ATCC 19182 2,05

Bacillus pumilus subsp. nonpentosofermentus ATCC 21398 2,56

Bacillus stearothermophilus

ATCC 7954 2,01

Bacillus subtUis ATCC 6633 2,13

Bacillus thuringiensis ATCC 10792.. 0,93

Die Werte in Tabelle I zeigen, daß bei Einsatz der erfindungsgemäßen Bazillus-Stämme etwa zwei- bis sechsfach höhere Aktivitätswerte erreicht werden als bei Verwendung von Bacillus licheniformis. wo die L-Arginase-Aktivität nur 0,541. E./mg Protein betrug.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Arginase durch aerobes Züchten eines Bazillus-Stammes in s einem wäßrigen Nährmedium und durch Isolierung der L-Arginase in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bazillus-Stamm

Bacillus cereus ATCC 9139, Bacillus circulans ATCC 4513,

Bacillus firmus ATCC 8247,

Bacillus fructosus ATCC 15451,

Bacillus megaterium ATCC 19380,

Bacillus pumilus ATCC 19182, ^1S

Bacillus pumilus subsp. nonpentosofermentus ATCC 21398,

Bacillus stearothermophilus ATCC 7954,
Bacillus subtilis ATCC 6633 oder
Bacillus thuringiensis ATCC 10792

einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in 6 bis 30 Stunden bei einem pH von 5 bis 9 und bei 20 bis 40°C aj durchführt.