DE2241091A1 - Verfahren zur herstellung von cephalexin - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Wei er. mann,

Dipl.-Injg. H.Weickmann, Dipl.-1'hy.». Dr.K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

I MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22

<983921/22>

CASE; KP-4725

TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA 632-1, Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken / JAPAN

Verfahren zur Herstellung von Cephalexin.

Die Erfindimg betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalexin 7-(D-o£-Aminophenylacetamid)-desacetoxy-cephalosporarisäurel durch enzymatische Acylierung von 7-Aminodesacetoxy-cephalcsporansäure (nachfolgend als 7-ADCA be- . zeichnet)."Sie betrifft insbesondere das enzymatische Verfahren zur Herstellung von Cephalexin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß 7-ADCA mit D-Phenylglyein oder einem Derivat davon in Anwesenheit des acylierenden Enzympräparates, das von einem Mikroorganismenstamm stammt, der ein die Aminogruppe acylierendes Enzym für 7-ADCA erzeugt und ausgewählt v/ird unter Genus Alcaü igenes, Genus Achromobacter, Genus Plavobacterium, Genua Bacillus oder Genua Be:ieckeo._f in einem

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wässrigen Medium umgesetzt wird. Kit den acylierenden Enzympräparat en sind nachfolgend Kulturbrühen, Bakterienzellen, "behandelte Bakterienzellen, Enzyinextrakte, feste Enzympräparat e oder unlösliche Enzympräparate der Mikroorganismen oder dergleichen gemeint.

Bisher wurde Cephalexin durch Deacetoxylierung von 7(D-tfC-AminophenylacetamicQ-cephalosporansäure durch katalytische Hydrierung (vgl. Holländisches Paoent Nr. 67 04294); Ringerveiterung von 6-(D-tfC-siilDstituierterAniino-phenylacetamid)penicillanßäure-sulphoxydester durch Erhitzen in Anwesenheit eines Katalysators und von Xylol (vgl. Holländisches Patent Nr. 67 04294); und Acylierung von 7-ADCA durch D-o(~substituierte Aminophenylessigsäure und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppe (Holländisches Patent ITr. 69 05073) hergestellt.

Dieser Stand der Technik hat jedoch Nachteile. Beispielsvieise muß das chemische Acylierungsverfahren von 7-ADCA unter Verwendung des Aminogruppen-geschützten Phenylglycins durchgeführt werden, außerdem wäre diese Schutzgruppe zu entfernen. Diese Nachteile machen das Verfahren unwirtschaftlich.

Γ.ε.3 Acylierungsverfahren zur direkten Herstellung von Cephalexin aus 7-Phenylacetamid-3-methyl-A -cephem-4-carbonsäure, die ein Ringerweiterungsprodukt von Penicillin G ist, unter Verwendung eines Snsympräparates, das vom Bacillus Ilegaterium stammt, ist bereits beschrieben worden, vgl. Deutsche Patentanmeldung P 22 14 444; dieses Verfahren ist jedoch v.-egen der niedrigen Cephalexinausbeute nicht immer industriell vorteilhaft gevesen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines enzymatisehen Verfahrens zur Herstellung von chemotherapeutisch brauchbarem Cephalexin aus 7-ADCA, dazu gehört auch die Schaffung einen industriellen Verfahrens zur Her-

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stellung von Cephalexin sowie die Schaffung eines Verfahrens, "bei dem ein festes Enzympräparat zur Herstellung von Cephalexin verwendet wird.

Im Verlaufe einer Untersuchung über Acylierungsenzym erzeugende Bakterien, die eine Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe in 7-ADCA einführen, wurde jetzt ein Mikroorganismus gefunden, der zur Gattung Achromobacter gehört und nachfolgend als B-402-2 "bezeichnet wird, und es wurden Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes, der Gattung Flavobacterium, der Gattung Bacillus und der- Gattung Beneckea gefunden, die eine starke acylierende Wirksamkeit für die Aminogruppe in 7-ADCA haben und die Cephalexin nahezu quantitativ aus 7-ADCA und Phenylglycinester bilden.

Es folgt eine taxonomische Beschreibung des obigen Stammes B-402-2.

a) Beobachtungen auf Bouillonagar-Schrägkultur bei 30° C 24 Stunden lang.

1) Gestalt und Größe der Bakterienzellen: Kurze Stäbchen, runöeRänder. 0,5 - 0,8 · 2,0 - 2,5/1

2) Zellenform: Beinahe Einzelzellen, schwach kettig, keine Membran.

5) Mobilität: Keine.

4) Sporen: Keine.

5) Gram¹sehe Färbung: Negativ.

6) Säurefestigkeit: Negativ.

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b) Wachstum auf verschiedenen Medien:

1) Bouillon-Plattenagar (bei 30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, erhebt sich konvex, keine Ausbreitung, weiß oder hellgelb, glänzend, weich, feucht _t semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

2) Bouillon-Schrügaßar (bei 30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, glatte Oberfläche, keine Ausbreitung, glänzend, feucht, milchig weiße Kolonie, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Kodiums.

3) Bouillonbrühe, (bei 30° C, 2 Tage): Gutes Wachstum, gleichmäßig trübe, keine Ausfällung, keine Membranbildung, keine Pigmentierung.

4) Bouillongelatine-Einstich: Oberflächenwelle turn entlang der Stichlinie bis zur halben Tiefe, keine Verflüssigung der Gelatine.

5) Sojabohnen-Schrägagar (30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, weiße oder hellgelbe Kolonie, glatte und weiche Oberfläche, semi transparent, keine Änderung eier Farbe des Mediums.

6) Kartoffelagar (30° C, 5 Tage): Gutes Wachstum, milchig wcißeKolonie, glatte und v/eiche Oberfläche, konvexe Erhebung, keine Änderung der Faxbe des Mediums.

7) Lackrrjsn.i] oh: Sauer, Peptoniniorung«

c) Physiologische Eigenschafter:

1) Nitratreduktion: Negativ.

2) Denitrierun.'^reaktior.: ITegativ.

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3) MR-Test: Negativ.

4) VP-Test: Negativ.

5) Indolbildung: Schv/ache Bildung.

6) Hydrogensulfatbildung: Positiv.

7) Stärke-Hydrolyse: Positiv.

8) Zitratverwertung: Positiv (stark).

9) Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: Nitrat- und Aimnoniümsalzverwertung.

10) Pigmenfbildung: Keine.

11) Urease: Positiv (schwach).

12) Oxydase: Positiv.

13) Katalase: Positiv.

14) Bereich des Wachstums: Wachstums-pH: 5 - 9» optimaler· Wachstums-pH: 7-8; Wachstumstemperatur: 7 - 40° C; optimale Temperatur: 24 - 30 G.

15) Aerob oder anaerob: Aerob.

16) O-P-Test: O-Typ.

17) Kohlenhydra.tfermentation:

Säurobildung Gasbildung

L-Arabinoae

IJ-XyIo üe . -

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D-Mannose D-Fructose D-Galactose Kaitose Saccharose Lactose Trehalose D-Sorbit Inosit Glyzerin Stärke Rhamnooe Ribose Ceroliose Rafflnose Melezitose Inulin Saricin Glueit

Säurebildung

Gasbildung

Nach Bergey'8 Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, wird der taxonomische Standort des obigen Stammes B-402-2 bestimmt und gehört demnach zur Gattung Achromobacter, da er Agar nicht zersetzt, kein Pigment bildet und auf Lackmu3-milch sauer reagiert. Außerdem ähnelt er Achromobacter par-Tulus v/eil er keine Mobilität zeigt und keine Säurebildung aus Glukose. Er unterscheidet sich jedoch in den folgenden Punkten:

Stamm B-402-2

Indolbildung Stärkehydrolyse Nitratreduktion

schv/ache Bildung positiv negativ

Achromobacter parvulus

keine Bildung negativ positiv

Bei dem Stamm B-402-2 kann eo oich daher um eine andersartige Spezies von Ac"hromobacter parvulus handeln und Achronobacter

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B-402-2 wird daher als neue Spezies geführt. Dieser Stamm ist im^lrlnstitut for Micorbiological Industriy and Technology, Agency of Industrial Science and Technology" hinterlegt worden und trägt die Kinterlegungsbezeichnung FBRM-P ITr. 1095. Dieser Stamm ist auch im US-Department of Agriculture, Agricultural Research Service, unter der Bezeichnung NRRl-B-5393 hinterlegt worden.

Weitere Mikroorganismenspezies, die für die erfindungsgemäße Herstellung von Cephalexin verwendet werden können, sind z. B.:

Alcaligenes faecalis ATCC 8750
Achromobacter aceris IFO 3320 [NRRL B-5391] Achromobacter liquidum IFO 3084 [mRL B-5392] Flavobacterium aquatile IFO 3772 ;[NRRL B-5394] Flavobacterium capsulatum IFO 12533 [ATCC 14666] Beneckea hiperotica ATCC 15803

Die oben beschriebenen Mikroorganismenstämme oder deren Enzym-Präparate haben eine spezifische Wirkung auf Cephalexin und die Fähigkeit nahezu quantitativ Cephalexin aus 7-ADCA und D-Phenylglycin zu bilden.

Gemäß den angewendeten Bedingungen haben die Enzympräparate die Wirksamkeit, die Amidbindung in Cephalexin zu spalten und 7-ADCA zu bilden, sie haben jedoch nahezu keine Wirkung auf D-Phenylacetamid-desacetoxy-cephaloGporansäure. Es war nicht bekannt, daß das acylierende Enzym die spezifische Aktivität in Bezug auf die Acylierung der Arninogruppe in 7-ADCA hat.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete 7-ADCA wird nach Verfahren hergestellt, die dem Stand der Technik angehören, vgl. z. B. die Herstellung aus Cephalosporin-C (vgl. US-Patentschrift 3 124 576), Verfahren zur Herstellung aus

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7-Aminocephalosporansäure (vgl. US Patentschrift 3 124 576), Herstellung nach dem Verfahren aus 7-Phenoxyacetamid- oder 7-Phenylacetanid-desacetoxy-cephalosporansäureester (vgl. US Patentschrift 3 275 626, Belgisches Patent 696 026, Holländisches Patent 68 06532, Belgisches Patent 745 845, Britisches Patent 1 204 394, Belgisches Patent 746 860 und Belgisches Patent 747 118-747 120) oder die enzymatische Deacylierung von 7-Acylamino-desacetoxy-cephalo3poransäure (vgl. Deutsche Patentanmeldung P 22 12 276.5).

Um die Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe in 7-ADCA einzuführen verwendet man D-Phenylglyein oder ein Derivat davon. Beispiele für diese Derivate sind D-Phenylglycinaraid, D-Phenylglycylglyein, D-Phenylglycylleucin, D-Phenylglycylalanin, D-Phenylglycinmethylester, D-Pheynlglycinäthylester oder ähnliche. Von diesen Derivaten können vorzugsweise D-Phenylglycinmethj^lester, D-Phenylglycinäthylester oder ähnliche verwendet v/erden, das bevorzugteste Derivat ist ein D-Phenylglycinmethylester. Falls ea sich um ein wasserunlösliches Derivat handelt, kann das wasserlösliche Saureadditionssalz verwendet v/erden, das die acylierende Enzymreaktion nicht ."behindert.

Der das Acylierungsenzym erzeugende Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann durch aerobe Kultivierung mit einem Nährmedium, das organische oder anorganische Stlckctoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt,, Mais-3inweichbrühe, Hefeextrakt, trockene Hefe, Sojabohnenprotein-Hydrolycate, Soja/bohnenextrakt, llitrat, Ammoniumsalz oder dergleichen, eine Kohlenstoff quelle, v/ie Melasse, Glukose, Stärkehydrolysat oder dergleichen und anorganischem Salz, gewünschtenfalls auch andere geeignete Wachstumsetimulierende wichtige Substanzen enthält, bei 20 - 35° C_f 12-48 Stunden lang, hergestellt werden.

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Für eine industrielle Produktion wird im allgemeinen die submerse aerobe Kultivierung angev/endet.

Das acylierende Enzym für die Aminogruppe in 7-ADCA kann im allgemeinen als Endo-Enzym vorliegen. Als Ensympräparate können Mikroorganismenlculturen, nach der Kultivierung isolierte native Bakterienzellen oder Suspensionen davon, in einer Ensymreaktion verwendet v/erden. Außerdem können chemisch oder physikalisch behandelte Milcro Organismenzellen,

beispielsweise Aceton, Methanol oder Äthanol getrocknete

Zellen; sprühgetrocknete Zellen, zerriebene- oder beschallte Zellen; durch Pufferlösung oder -Cetylpyridiniumchlorid hergestellte Zell-Lysate; gereinigte Enzyme, erhalten nach bekannten Trennungs- und Reinigungsverfahren, wie z. B. Aussalzen, fraktionierte Ausfällung, Dialyse, Absorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration zerriebener Zellen oder von Zell-Lysaten; und die festen Enzympräparate oder unlöslich,gemachtes Enzym, hergestellt durch Absorption des Acylierungsenzyms oder der erzeugenden Mikroorganismen auf einem inerten Träger, der gegenüber den Substraten nicht aktiv ist und die Aktivität des acylierenden Enzyms nicht inaktiviert, im Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden, sofern die acylierende Enzymaktivität erhalten bleibt.

Die Acylierung kann im allgemeinen durch Umsetzung von 7-ADCA und Phenylglycin oder einem Derivat davon mit.den acylierenden Enzympräparaten erfolgen. Gewöhnlich wird eine freie Säure von 7-ADCA in einer Konzentration von 0,1 bi3 20 mg/ml, vorzugsweise 2-5 mg/ml, verwendet. D-Phenylglycin wirkt nicht als Substrat in seiner freien Säureform, man kann daher ein aktives Derivat davon, wie. das Säureamid oder ein Ester einen niedrigen Alkohols, vorzugsweise den Methylester, verwenden. Daß Phenylglycinderivat wird im allgemeinen in einem 2-20 molaren Überschuß für 7-ADCA verwendet, dieses Molverhältnio

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kann jedoch je nach der Konzentration von 7-ADCA in der Reaktionomischung geändert werden, die bevorzugteste Ilenge 13t ein 6-10 molarer Überschuß. Die Reaktionstemperatur kann optimalen Bedingungen angepaßt v/erden, im allgemeinen liegt die Temperatur bei 20-45 C, vorzugsweise bei 30 - 37° C. Man kann eine stationäre, geschüttelte oder gerührte Kultur verwenden.. Der pH der Reaktionsrnischung kann bei pH 5,5 - 7,5, ara günstigsten bei 6,0 bis 6,5 gehalten werden. Die Reaktionszeit kann je nach den Reaktionsbedingungen 0,5-3 Stunden betragen und die Umsetzung kann beendet werden, wenn die stärkste Cephalexinbildung erreicht ist.

Im Falle der Acylierung mit einem festen Enzympräparat wird zuerst das acylierende Enzym oder der erzeugende Mikroorganismus auf dem Träger absorbiert. Wenn es sich um Exo-Enzym handelt, kann das Acylierungsenzym absorbiert werden, in dem man das Kulturfiltrat des das Acylierungsenzym erzeugenden Stammes auf den Träger gibt. Im Falle von Endo-Enzym werden native Mikroorganismenzellen aus der Kultur des daß Acylierungsenzym erzeugenden Mikroorganismus isoliert und auf dem Träger absorbiert oder es werden mit Azeton oder Äthanol getrocknete Zellen auf dem Träger absorbiert; oder eine Lösung des acylierenden Enzyma, extrahiert aus Mikroorganiomenzellen, wird auf dem Träger absorbiert.

Die in der vorliegenden" Erfindung verv/endeten Träger, die je nach der Art des Mikroorganismus oder je nach der Herstellung dea Acylierungsenzyms oder der Mikroorganismenzellen variiert werden sollten, müssen unter Berücksichtigung der Eigenschaften der das Enzym oder die Mikroorganismenzellen absorbierenden Träger ausgewählt werden, bo daß sie die Aktivität des Acylierungaenzyms nicht inaktivieren; dabei massen die Träger so beschaffen sein, daß das absorbierte Enzym oder die Mikroorgani:*.Tienzellen nicht durch V/aschen entfernt werden; sie

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sollen gegenüber jedem Substrat inaktiv sein und das entstehende Cephalexinprodukt nicht absorbieren. Beispiele für Träger, die vorteilhafterweise für die Absorption einer wässrigen Enzymlösung verwendet werden, sind aktives Aluminiumoxyd, Diatomeeneräe, saurer Ton, aktiver Ton, Kaolin, Kalziumphosphat, Hydroxyapatit oder ähnliche. Zur Absorption der Mikroorganismenzellen verwendet man vorteilhafterv/eise CM-Cellulose, CM-Sephadex, DEAE-Cellulose, TEAE-Cellulose, Diatomeenerde oder ähnliches Material.

Es empfiehlt sich, den pH vorher so zu regeln, daß das acylierende Enzym bei der Absoprtion auf dem Träger einen stabilen pH hat. Die Absorption kann ansatzweise oder in Kolonnen durchgeführt v/erden. Die Kolonnenabsorption verv/endet man vorzugsweise für die kontinuierliche Enzymreaktion. Die Trägermenge kann je nach der Menge der Mikroorganismenzellen, dem Volumen der KuItürfiltrate, dem Enzymgehalt oder dem Absorptionsverhältnis des Trägers schwanken. Im allgemeinen kann bei einer ansatzweise durchgeführten Absorption die Trägerinenge 5-15 Gev/.leile/Vol. für KuIturfiltrat, oder 5-20 Voluminaüberschuß für native Zellen betragen» Bei der Absorption auf Kolonnen wird eine Kolonne mit einem Träger gefüllt, mit Yiasser oder Pufferlösung befeuchtet, wobei die gleiche Pufferlösung verv/endet wird, die für die Einstellung des optimalen pH-Wertes des Enzymes verwendet wird, dann wird die Kulturbrühe oder Enzymlösung hindurchgeschickt, die Kolonne mit Wasser oder Pufferlösung nachgev/aschen, so daß man ein Enzympräparat auf fester Phase erhält. Bei der Absorption Mikroorganismenzellen auf dem Träger wird eine Zellsuspension in Wasser oder Pufferlösung mit dem Träger vereinigt, dabei berücksichtige man den Effekt des pH-Wertes, da die Absorption stark von der Ionenstärke beeinflußt wird.

Der Träger, der das acylierende Enzym oder die Mikroorganismenzellen absorbiert hat, das ist das Enzympräparat auf

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fester Phase, kann der Gefahr einer Denaturierung oder eines Aktivitätsverlustes unterliegen, es sollte daher im feuchten 1 Zustand gehalten werden. (

7-ADCA vird mit Phenylglycin oder einem Derivat davon in An- ' v;esenheit des festphasigen Enzympräparates umgesetzt. Obv/ohl f die Konzentration des Substrates in Abhängigkeit von der I

Enzymstärke oder der Ausfließrate aus der Kolonne schwanken \ kann, sollte sie vorzugsweise so festgelegt v/erden, daß eine ι "bestimmte Menge an nicht umgesetztem 7-ADCA und Phenylglycin · im Abstrom nicht erhöht wird. Im allgemeinen beträgt die »_%.

Konzentration an 7-ADCA 0,1-2 Gew./Vol.$, vorzugsweise ^_s

0,2-1 Gew./Vol.?» und das Phenylglycin oder das Derivat /

davon wird in 2 - 10 molarem Überschuß gegenüber dem 7-ADCA J verwendet. Die Acylierungsreaktion sollte bei dem für die Enzymaktivität günstigsten pH und der günstigsten temperatur * durchgeführt werden. Die Reaktionszeit kann im Falle der Um- j Setzung in einer Kolonne durch Änderung des Substrat-Abflußvolumens geregelt werden. Üblicherweise kann die Umsetzung beim Durchgang durch die Kolonne au3 festphasigem Enzym- |

präparat durchgeführt werden und kontinuierlicher Betrieb | kann leicht durch kontinuierliche Zugabe der Substrate er- \ reicht werden. Venn jedoch die Substrate im Abstrom gefunden j werden, wird die Abfließrate verringert oder der Abstrom in | die Kolonne zurückgeführt. Sobald die Enzymaktivität ab- /

nimmt oder verlorengeht eollte natürlich die Operation beendet werden. Das so hergestellte Cephalexin wird nach bekannten Ieolierungsverfahren abgetrennt. Beispielsweise v/ird die Reaktionsmiochung durch ein Anionenaustauscherharz oder durch Aktivkohle geschickt, mit wässriger saurer Lösung oder organischem Lösun^smittel/V/asser-Gemisch danach eluiert, das das Cephalexin enthaltende Eluat eingeengt und isoelektrisch ausgefällt. Oder die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf pH = 1 eingestellt, danach mit organischem Lösungsmittel, wie Kethylisotutylketon, extrahiert,

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wodurch nach Auflösen in saurem Wasser isoelektrisch aus-. gefällt wird. Außerdem wird die Reaktionsmischung mit Anidnenaüstauscherharz in,, Anwesenheit eines mit V/asser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels behandelt und die wässrige Schicht konzentriert oder der Gefriertrocknung unterworfen, um das Cephalexin als freie Säure zu isolieren.

Prüfung auf Cephalexin: ·

Eine Testlösung, die Cephalexin enthält, wird mikrobiologisch nach der Papierscheibenmethode oder nach der Schalenmethode mit Bacillus subtilis PCI-2'19 16 Stunden lang bei 37° C geprüft. Die sich ergebende Inhibierungszone wird gemessen, daraus läßt sich die Cephalexinstärke mit Hilfe der Standard-Cephalexinkurve berechnen.

Beispiel 1

100 ml wässriges Medium (pH 7,0), das 3$ Glukose, 1$ Hefeextrakt, 0,1$ K₂HPO₄, O_rO5# MgSO₄ · 7H₂P, 0,05$ KCl und 0,001$ PeSO₄ enthält, werden bei 120° C 20 Minuten lang sterilisiert.

Man impft mit Achromobaeter B-402-2, NRRL B-^5393 an und schüttelt die Kultur bei 26° C 72 Stunden lang hin und her. Bas Kulturmedium wird auf pH 6,5 eingestellt/dann gibt man 100 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH 6,5), der 2 mg/ml 7-AiCA und 20 mg/ml D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid enthält, hinzu, danach v/ird 3 Stunden lang bei 37° C enzymatisch umgesetzt. Man findet 100$ Cephalexin im Piltrat der Reaktionsmischung. Das Filtrat wird auf eine Kieselgel-Dünnschicht-Chromatographieplatte aufgetüpfelt, die fluoreszierendes Material enthält und mit Hilfe eines lösungsmittelsystemes aus n-Butanol : Essigsäure :'Wasser (3 ί 1 : 1) entwickelt. Die Untersuchung mit Hilfe von UV-licht von 2536'A zeigt einen purpurroten Fleck in der Nähe von Rf = 0,50, der auch

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mit dem biologisch geprüften Muster einer authertisehen Probe identisch ist.

Beispiel 2

Man wiederholt Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß die in der folgenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen anstelle von Achromobacter B-402-2, HRRL B-5393, zur Erzielung der unten beschriebenen Ergebnisse verwendet werden.

Stamm Cephalexin gebildet

Alcaligenee faecalis ATCC 8750 15

Flavabacterium aquatile KRRL B 5394 24 Beneckea hiperoptica ATCC 15003 100

Beispiel 3

1,3 1 eines Mediums (pH 7,0) das aus 3$ Glukooe, Yj» Hefeextrakt, 0,1* K₂HPO₄, 0,055* MgSO. . 7H₂O, 0,055* KCl und 0,001$ PeSO₄ besteht, werden bei 120° C 20 Minuten lang sterilisiert, aseptisch in jeweils 100 ml Portionen unterteilt und in 500 ml Kolben gegeben, mit einem Stamm von Achromobacter B 402-2 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung gezüchtet.

1 1 der Kulturbrühe wird zentrifugiert und die so erhaltenen feuchten nativen Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 1,2 1 einer 0,1 m Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 400 ml wässrige Lösung, die 5 mg/ml 7-ADCA und 50 mg/ml D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid enthält und stellt die Mischung bei 37° C 2 Stunden lang in den Brutschrank. Man stellt fest, daß in der Reaktionsmiachung 98,8> Cephalexin gebildet worden sind.

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Beispiel 4

Man wiederholt Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß die nachfolgend angegebenen Mikroorganismen anstelle von Achromobacter B 402-2, KRRL B-5393, zur Erzielung der in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Ergebnisse verwendet werden.

Stamm Cephalexin gebildet (#)

Alcaligenes faecalis ATCC 8750 15

Flavabacterium aquatile IJRRL B-5394 23 Beneckea hiperoptica ATCC 15803 · 99 - ^:

Beispiel 5

Bin wässriges Medium (pH 7,0), das % Glukose, 1$ Hefeextrakt, 0,153 K₂HPO₄, 0,05^ HgSO. . 7H₂O, 0,05 KCl und O_tÖO1$S PeSO₄ enthält, v/ird mit einem Stamm Beneckea hiperoptica ATCC 15803 angeimpft und "bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. 11 der Kulturbrühe wird zentrifugiert und die isolierten nativen feuchten Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, danach zentrifugiert und in 1 1 destilliertem Wasser suspendiert. Man gibt 8 1 Aseton hinzu und erhält dabei durch Azeton gepulverte Zellen. 165 mg des Azetonpulvers werden in 5 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers (pH 6,5) suspendiert, dazu gibt man eine wässrige Lösung von 2 ml 7-ADCA"(5 mg/ml) und 2ml D-Phenj-lglycinraethylester-hydrochlorid (50 mg/ml) und 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,5), so daß sich eine Reaktionsmischung von 100 nl ergibt; diese Reaktionsniischung wird, bei 37° C 90 Hinuten lang in den Brutschrank gestellt. Das in der erhaltenen Reaktionsmicchung gebildete Cephalexin v/ird quantitativ bestimmt, man findet 90,5£.

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Beispiel 6

500 mg mit Azeton gepulverte Zellen von Achromobacter B-402-2, IiRIiL B-5393, erhalten nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren, v/erden in 100 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 50 ml wässrige 7-ADCA-Lösung (4 mg/ml) und 50 ml wässrige D-Phenylglycinjnethylester-Lösung (20 mg/ml). Nach zweistündigem Bebrüten bei 37 C wird die Reaktionsmischung zentrifugiert und man erhält einen Überstand der 1260y/ml Cephalexin enthält, Acylierungsausbeute 80,3$. -

Der überstand wird auf eine Kolonne (2 · 20 cm) eines Anionenaustauscherharzes, Dov/ex 2 (Acetatform), (Produkt der Dov/ Chemical Co., USA.) nach dem Waschen mit Wasser, .gegeben, 400 ml der durchgelaufenen Lösung v/erden auf pH 8,0 eingestellt und erneut in eine Kolonne (2 · 15 cm) mit einem Anionenaustauscherharc Dowex 2 (Acetatform) gegeben und anschließend mit 0,05 m Essigsäure eluiert. Jede Fraktion (etwa 15 ml) wird dünnschichtehromatographisch geprüft,die cephalexinhaltigen Traktionen werden aufgefangen und man erhält 490 mg Cephalexinpulver aus der Gefriertrocknung. Die UV-spektroehcnleche Untersuchung zeigt, daß das Pulver 60$£ige Reinheit besitzt. Dieses getrocknete Pulver v/ird durch ieoelektrische Ausfällung gereinigt, man erhält 294 mg weißes Pulver (Aus beute 90?ä, Reinheit 98$, Gesamtausbeute 88$).

Beispiel 7

A. 20 1 irässrises Medium (pH 7,0), das % Glukuse,

1£ Hefeextrakt, 0,15S KpHPO₄, 0,05# MgSO₄ · 7H₂O, 0,055^ KCl und 0_t00i5ö PeSO. enthält, gibt man in ein 30 1 Permentationsgefäfl, steriliniert 20 Minuten lang bei 120° C und gibt daau aseptisch 400 ml Saatkultur, die zuvor im gleichen Hediun

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gezüchtet worden ist, von Achromobacter B-402-2, MRL 3-5393 (FERM-PNo. 1095) und kultiviert unter aeroben Bedingungen "bei einer Belüftung von 20 l/min., einer Rührung von 300 Upm 72 Stunden lang bei 26° C. Nach der Fermentation werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren isoliert, zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, wobei man 170 g feuchte native Zellen erhält.

B. 3 g der oben in A erhaltenen nativen Zellen werden in 100 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) suspendiert. Dieser Suspension gibt man unter Rühren ZU'18Q^; g DEAE-Cellulose in 1,5 1 einer 0,1 m Acetatpufferlößung bei O⁰C. Nach 6-stündigem Stehen gewinnt man das Enzympräparat auf fester Phase.

Das Enzympräparat wird in eine Kolonne (3,5 ♦ 47,5 cm) gefüllt, danach mit 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen, dann werden 12 1 einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0), die 0,1$ 7-ADCA und 0,5$ D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid enthält, innerhalb 24 Stunden hindurchgeschickt. '

Die so erhaltenen 12 1 Eluat schickt mandurch „eine Kolonne _ mit 120 g Aktivkohle (7»2 · 15 cm)_t um dae Cephalexin asu absorbieren, dann wäscht man mit Wasser und elüiert^ mit einem Löaungsinittelgemiech aus Azeton/0,5 n-Essigeäure (1 : 1).

1 1. cephalexinhaltige aktive Fraktionen wird im Vakuum eingeengt xxn§ der Rückstand wird mit einer Mischung aus Wasser und Acetonitril umkristallisiert, um das Cephalexin, abzutrennen, das mit warmem Wasser gewaschen und dann getrocknet wird, w obei man 12,3 g Kristalle erhält, Ausbeute 6O|£,

Das Produkt zeigt einen einzigen Fleck bei einer dünnschichtchromatographischen Prüfung auf Kieselgel, Das NMR-Spektrum zeigt die Identität der beiden Verbindungen, Reinheit: 90$ aufgrund der Bioa\itographie und UV-Absorption.

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Beispiel 8

40 g native Zellen, erhalten im Verfahren dea Beispieles 7 A, v/erden in 30 ml destilliertem V/asser suspendiert und zu 1 1 Azeton gegeben, v/obei man durch Filtration 10 g azetongetrockneter Zellen erhält.

160 mg der getrockneten Zellen von Achromobacter B-402-2, KRRI B-5393 (FHiIl-P Hr. 1095) suspendiert man in 4 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) und gibt Die unter Rühren zu 10 g DEAE-Cellulose in 20 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0). Nach 6-stündigem Stehen wird der Träger, der die Hikroorganismenzellen absorbiert hat, das heißt das Enzympräparat auf fester Pnase, in eine Kolonne (1 · 26 cm) gefüllt, mit 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen, dann schickt man 100 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0), die 0,1$ 7-ADOA und 0,5# D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, innerhalb 5 Stunden hindurch. Die Acylierung, geprüft als Cephalexin im Eluat, beträgt 855».

Beispiel 9 ^f

Man wiederholt Beispiel 8, mit der Ausnahme, daß die folgen· den Träger anstelle von DEAB-Cellulose für die Herstellung ▼on Cephalexin verwendet werden.

Träger Gebildetes Cephalexin

CM-Cellulose	40
TEAE-Cellulose	80
Beispiel 10

Zu einer Suspension von 4 g getrockneter ΖβΤΓβη von Achroiaobacter B-402-2, PERH-P Nr. 1095, erhalten in Beispiel 8, in 500 ml einer 0^1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gibt man 50 mg

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Lyeozym, inkubiert 60 Stunden lang bei 37° C und gibt 2 mg Desoxyribonuelease hinzu und inkubiert weitere 10 Minuten lang.

Die Reaktionsmischung wird zentrifugiert, man gibt 10 g Hydroxyapatit zu 200 ml des Überstandes und läßt danach eine Stunde lang stehen.

Das Enzympräparat auf fester Phase wird in eine Kolonne gefüllt und die Enzymreaktion wird wie in Beispiel 8 durchgeführt, wobei man 90$ Cephalexinbildung findet. · =

Beispiel 11 ·

1,3 1 wässriges Medium (pH 7,0), daß 1$ Polypepton, 1$ Fleischextrakt und 0,5$ NaCl enthält, sterilisiert 20 Minuten lang bei 120° C, v/erden in jeweils 100 ml Portionen unterteilt und in 500 ml Kolben gegeben. Jedes Medium wird mit dem Stamm Bacillus megaterium IHlRL B-5385 angeimpft und bei 30° C 48 Stunden lang kultiviert, flach der Kultivierung werden die Bakterienzellen entfernt und 1 1 des Filtrates vriid auf pH 6 eingestellt. Man gibt 10 g Gelite (ein Produkt der JohnB-Manville Sales Co., USA.) hinzu und rührt etv/a 30 Minuten lang.

Das Enzympräparat wird*in eine Kolonne (1 cm Durchmesser) gefüllt, mit 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, dann schickt man 100 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 0,1$ 7-ADCA und 1^ D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, innerhalb 5 Stunden hindurch. Die er-, haltenen 100 ml Eluat zeigen 80$ Cephalexinbildung.

Beispiel 12

Jeweils 100 ml wässriges Medium, das yß> Glukose, 1$ Hefeesttrakt, , 0,05'/° MgSO₄ - 7H₂O, 0,05# KCl ünd_ O,

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enthält, ν/er den 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert. Nach dem Abkühlen v/erden die Medien mit Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Flavabacterium aquatile IiRKL D 5394 bzw. Beneckea hipercptica ATCG 15803 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. Jede Kulturbrühe wird auf pH 6,5 eingestellt, die !Bakterien seil en v/erden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 isoliert, wobei man jeweils 200 mg trockene Zellen erhält. Dann werden die in Beispiel 8 verwendeten getrockneten Mikroorganismen Achromobacter B-402-2, UlHlL B-5393, durch jeweils 200 mg der oben erhaltenen getrockneten ilikroorganicraenzellen ersetzt, um mit ihnen das Cephalexin herzustellen; man erhält folgende Ergebnisse:

Stamm Gebildetes Cephalexin (</£)

Alcaligenes faecslis ATCC 8750 18

Plavabacterium aquatile NKRL B-5393 25 Beneckea hiperoptica ATCC 15803 80

Beispiel 13

600 1 eine3 Mediums (pH 7,0), das 4# Glukose, 1,2$ Hefeextrakt, 0,153* K₂HrO₄, 0,05$ MgSO₄ · 7H₂O, 0,05# KCl und 0,001/' FeSO₄ enthält, werden mit 30 1 Achromobacter B-402-2, 101RL B-5393 Saatkultur angeicipft \ind submers kultiviert, wobei man 72 Stunden lang bei 26 C belüftet. Nach der Fermentierung v/erden die Bakterienζeil cn durch Abzentrifugieren aus 570 1 Brühe isoliert. Die nätiven, fexichten i'tjllen, die 970 3 trockenen Zellen entsprechen, 'werden in 27 1 einer 0,1 m Acetat pufferlösung (pH 6,5) suspendiert, dann gibt man 1,18 kg 7-ADCA (Reinheit 84,8·/) und 30 kg D-Phery^glycinmethylester-hydrohlorid hinzu und gibt schließlich 0,1 m Acetatpuffer (pH 6,5) hinzu_/biü das Volumen der Reakticru;mir.ehung 200 1 betrugt. Die Reaktionsininchung wird Voi ?7""⁾ C ? Stunden lang unter

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Rühren "bebrütet. In der Reaktionsmischmiß v/erden 1,28 kg Cephalexin aufgrund des UV-A.bsorption£ spektrums ermittelt (Acylierung 80?ί). Die Lösung wird zentrifugiert und filtriert. Zur klaren Lösung gibt man 4 kg Aktivkohle und nach der Filtration wird die wässrige Schicht im Vakuum eingeengt, wobei man 1,03 kg Cephalexin erhält (Ausbeute 64/*, Reinheit 98%).

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Claims (8)

1. CASS: KP-4725

   PATENTANSPRÜCHE

   Yerfaliren zur Herstellung von Cephalexin 7-(D-oC-Aminophenylacetcunid)-(le3acetoxy-cephalo3poriü:säiireJ , dadurch gekennzeichnet, daß 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure mit D—Fhenylglycin oder einem Derivat davon in einem wässrigen Medium in Anwesenheit eines aeylierenden Enzymes, das von
   einem Mikroorganisinua des Genus Alcaligeneß, Genus Achromobaeter, Genus rlavabacterlum, Genua Bacillus oder Genus
   Beneckea stammt, umgesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Stamm von Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter B-402-2, NRRL B-5393, Flavabacterium aquatile KRRL B-5394, Bacillus megaterium NRRL B-5305 oder Beneckea hiperoptica ATCC 15ΘΟ3 verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aeylierende Enzym in Form von Mikroorganismenseilen eines Stammes von Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter B-402-2, IJRRI B-5393, Flavabacteriura aquatile IiRRL
   B-5394, Bacillus megaterium IJRRL B-5385 oder Beneckea
   hiperoptica ATCC 15803, in Form der KulturbrUhe dieser St&maie, in Form von behandelten Zellen oder als daraus extrahiertes Enzym verv/endet v/ird.

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4. 4. Verfachen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als D-Phenylglycinderivat P-Phenylglyciri-methylester, D-Phenylglycin-äthylester, D-Phenylglycinamid, D-Phenylglycylglycin oder D-Phenylglycyl-leucin verwendet wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als acylierendes Enzym ein unlöslich gemachtes Enzympräparat verwendet v/ird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem unlöslich gemachten Enzympräparat' um einen Träger handelt, der KuI tür "brühe der Mikroorganismen Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter 15-402-2,, IiRRL B-5393, Flavabacterium äquatile KRRL B-5394, Bacillus megaterium IIRRL B-5383 oder Beneckea hiperoptica ATCC 15803, Mikroorganismenzellen dieser Stämme oder daraus hergestelltes Enzym absorbiert enthält.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Diatomeenerde, saurer Ton, aktiver Ton, Aluminiumoxyd, Kaolin, Kalziumphosphat, Hydroxyapatit, GM-Cellulose, DEAE-Cellulose, TEAE-Cellulose oder Carboxymethyl-vernetztes Dextran verwendet wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei 20 - 45° C, vorzugsv/eise 30 - 37° C, bei pH 5,5 - 7,5, vorzugsweise bei 6,0 - 6,5, 0,5 bis 3 Stunden lang durchgeführt wird, wobei die Konzentration an 7-Aminocephalosporanaäure 0,1 — 20 mg/ml, vorzugsv/eise 2-10 mg/ml beträgt und D-Phenylglycinester in 2 - 20 molarem Überschuß gegenüber 7-Arainocephtxlonporansä.urc, vorztigsweise in 2 - 10 molarem Überschuß,verwendet wird.

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