CZ297815B6 - Syntetické polysacharidy, zpusob jejich prípravy a farmaceutické kompozice, které je obsahují - Google Patents

Abstract

Syntetické polysacharidy, tj. hexadekasacharidy, v kyselé forme a jejich farmaceuticky upotrebitelné soli, které obsahují tri odlisné sekvence: sulfatovanou pentasacharidovou sekvenci DEFGH, nesulfatovanou heptasacharidovou sekvenci Z(MN).sub.3.n. asulfatovanou tetrasacharidovou sekvenci VWXY. Tyto polysacharidy lze pouzít pri lécení chorob spojených s poruchami srázení krve.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových syntetických polysacharidů, které mají antikoagulační a antitrombotickou farmakologickou aktivitu heparinu.

Dosavadní stav techniky

Heparin patří do skupiny glykosaminoglykanů (GAG), což jsou heterogenní přírodní sulfatované polysacharidy.

Heparinové prostředky jsou směsi řetězců obsahujících řadu monosacharidových jednotek v počtu od 10 dolOO nebo více. Tato heterogenita molekulové velikosti je doprovázena strukturní heterogenitou, což platí nejen o povaze základních monosacharidů ale i o substituentech, které nesou (L. Rodén; „The Biochemistry of Glycoproteins and Glycosaminoglycans“, vydal Lennarz W. J., Plenům Press, New York a Londýn, strany 267-371,1980).

Každá skupina přírodních GAG má obecně několik farmakologických účinků. Všechny jsou kombinovány v prostředcích, které lze získat z přírodních produktů. Tak mají například hepariny a heparan-sulfáty antitrombotickou aktivitu, která je spojená se současným působením na několik koagulačních faktorů.

Heparin katalyzuje (zejména přes antitrombin III (AT III)) inhibici dvou enzymů, které se účastní kaskády srážení krve, tj. faktoru Xa a faktoru Ha (nebo trombinu). Prostředky obsahující hepariny s nízkou molekulární hmotností (LMWHS) obsahují řetězce tvořené 4 až 30 monosacharidy a působí na faktor Xa selektivněji než na trombin.

Některé syntetické oligosacharidy, zejména ty popsané v patentové přihlášce EP 0 084 999, selektivně inhibují, přes antitrombin III, faktor Xa bez jakéhokoliv účinku na trombin.

Je známo, že inhibice faktoru Xa vyžaduje vazbu heparinu na AT III přes antitrombinovou vazebnou doménu (ABD) a že inhibice faktoru Ha (trombin) vyžaduje vazbu na AT III přes ABD, a na trombin přes hůře definovanou vazebnou doménu (TBD).

Syntetické oligosacharidy korespondující s ABD heparinu jsou známé a vykazují antitrombotickou aktivitu při žilní trombóze. Tyto sloučeniny jsou popsané v patentové přihlášce EP 0 529 715 a EP 0 621 282 a v patentu CA 2 040 905.

Účinnost těchto oligosacharidů při prevenci tepenné trombózy je ale zmařena jejich neschopností inhibovat trombin.

Syntéza heparinových glykosaminoglykanů schopných inhibice trombinu přes aktivaci AT III je popsána v patentové přihlášce PCT/FR 97/01344.

Tato patentová přihláška popisuje nové biologicky aktivní polysacharidové deriváty. Zejména jsou to antikoagulanty a antitrombotika. Dále, protože se tyto polysacharidy získávají syntézou, je možné selektivně modifikovat jejich strukturu a zejména odstranit nežádoucí sulfátové substituenty, které se účastní interakce s některými bazickými proteiny, jako je faktor krevních destiček 4 (PF4), který se uvolňuje během aktivace destiček, což vede ke značné neutralizaci heparinu v oblasti sraženiny. Tak lze získat polysacharidy, které jsou účinnými antitrombotickými a anti

-1 CZ 297815 B6 koagulačními činidly a které mohou dále odolat in vivo působení proteinů, jako je PF4, které neutralizují účinek heparinu zejména na trombin.

Bylo dokázáno, že zejména tyto sulfatované a alkylované polysacharidy mohou být v závislosti na uspořádání alkylových skupin a sulfátových skupin vzniklém při tvorbě uhlovodíkového skeletu silnými antitrombotickými a antikoagulačními činidly.

Obecněji bylo objeveno, že je možné při výstavbě polysacharidových sekvencí přesně modifikovat GAG aktivitu za účelem získání velmi aktivních produktů, které mají vlastnosti heparinu.

Ale použití některých produktů popsaných v patentové přihlášce PCT/FR 97/01344 v humánní medicíně může být obtížné, zejména pokud mají dlouhý poločas rozpadu. Při prevenci nebo léčení trombózy výše uvedenými produkty musí být obnovena nebo udržována tekutost krve a současně se musí bránit indukci krvácení. Vitální povaha s tím spojených funkcí je taková, že je výhodné použít (za účelem udržení této rovnováhy) pouze sloučeniny, které mají krátký poločas rozpadu a se kterými se lépe pracuje.

Důvodem k tomu je dobře známý fakt, že u léčených pacientů se může při jakékoliv nehodě spouštět krvácení. Také může být nezbytné u léčeného pacienta provést chirurgický zákrok. I z těchto různých důvodů je vhodné použít sloučeniny s krátkým poločasem rozpadu.

Poločas rozpadu syntetických polysacharidů podle předkládaného vynálezu byl stanoven u krys, kde bylo neočekávaně pozorováno, že je ovlivněn strukturou molekuly a zejména ABD domény TBD (trombinová vazebná doména) a spacerem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se tak týká nových syntetických polysacharidů, které mají podobnou strukturu jako sloučeniny popsané v patentové přihlášce PCT/FR 97/01344, ale které mají specifické vlastnosti. Příčinou toho je, že tyto sloučeniny mají neočekávaně poločas rozpadu vyloučení (určený pomocí anti-Xa aktivity po intravenózním podání krysám) kratší než 1,5 hodiny.

Tyto sloučeniny jsou hexadekasacharidy obsahující tři odlišné sekvence: sulfatovanou pentasacharidovou sekvenci DEFGH, nesulfatovanou heptasacharidovou sekvenci Z(MN)₃ a sulfatovanou tetrasacharidovou sekvenci VWXY.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou syntetické polysacharidy v kyselé formě a jejich farmaceuticky upotřebitelné soli s farmaceuticky upotřebitelnými kationty, jejichž aniontová forma koresponduje s jedním ze vzorců (I), (II), (III), (IV) a (V) níže:

-2CZ 297815 B6

Aktivní struktury podle vynálezu

íT sf

af o

II II — o

CC. (E

-3CZ 297815 B6

-4CZ 297815 B6

Vynález zahrnuje polysacharidy v jejich kyselé formě nebo ve formě jakékoliv jejich farmaceuticky upotřebitelné soli. V kyselé formě jsou skupiny -COO a -SO₃ přítomny jako skupiny -COOHa-SO₃H.

Výraz „farmaceuticky upotřebitelná sůl polysacharidu podle předkládaného vynálezu“ se týká polysacharidu, ve kterém je jedna nebo několik skupin -COO a/nebo -SO₃ iontově vázána k farmaceuticky upotřebitelnému kationtu kovu. Výhodné soli podle předkládaného vynálezu jsou ty, kde je kation vybrán z kationtů alkalických kovů, výhodněji Na⁺ nebo K⁺.

Předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy polysacharidů podle předkládaného vynálezu.

Tento způsob v principu využívá di- nebo oligosacharidové synthony připravené tak, jak je uvedeno dříve v literatuře. Odkazujeme zejména na patentové přihlášky EP 0 300 099, EP 0 529 715, EP 0 621 282 a EP 0 649 854 a na práci C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, strany 1671-1690. Tyto synthony se pak spolu spojují za vzniku plně chráněného prekurzoru hexadekasacharidu podle předkládaného vynálezu, ze kterého se pak selektivně odstraní chránící skupiny a sulfatuje se za vzniku hexadekasacharidu podle předkládaného vynálezu.

Ve výše uvedené spojovací reakci reaguje „donor“ di- nebo oligosacharidu aktivovaný na svém anomemím uhlíku s „akceptorem“ di- nebo oligosacharidu obsahujícím volnou hydroxylovou skupinu.

Hexadekasacharidy podle předkládaného vynálezu lze syntetizovat následující sekvencí operací, která se týká sacharidových jednotek uvedených ve vzorci (I) výše.

Nejdřív se připraví chráněné prekurzory GH, pGH (který má v poloze 4' alkoholovou skupinu) a chráněný prekurzor EF, pEF (jehož anomemí atom uhlíku je aktivován). Intermediáty pGH a pEF spolu reagují za vzniku EFGH. Z polohy 4 nereduktivní koncové jednotky se pak odstraní chránící skupina za vzniku prekurzoru pEFGH.

Paralelně se stejným způsobem připraví prekurzor pYZ(MN)₃D části YZ(MN)₃D (jejíž anomemí atom uhlíku je aktivován).

Tetrasacharid pEFGH pak reaguje s pYZ(MN)₃D za získání YZ(MN)₃DEFGH. Nereduktivní koncová jednotka se ochrání za získání prekurzoru pYZ(MN)₃DEFGH.

Paralelně se připraví prekurzor pVWX látky VWX.

Reakce mezi pVWX a pYZ(MN)₃DEFGH tak poskytne přímý prekurzor hexadekasacharidu, který se ochrání a sulfatuje za získání očekávaného hexadekasacharidu.

Odborníkům v této oblasti je zřejmé, že je k dispozici několik syntetickým strategií (v závislosti na vybraném akceptoru a donoru). Například je možné připravit donor VWXYZ(MN)₃D a spojit jej s látkou EFGH za účelem získání prekurzoru požadovaného hexadekasacharidu. Odkázat se lze na výše uvedené reference a na práci Monosacharides, Their chemistry and their roles in natural products, P. M. Collins a R. J. Ferrier, J. Wiley & Sons, 1995 a na práci G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu byly podrobeny biochemickým a farmakologickým testům, které ukázaly, že mají navíc velmi výhodné vlastnosti jako produkty popsané v patentové přihlášce PCT/FR 97/01344.

-5CZ 297815 B6

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které se selektivně váží na AT III s afinitou stejnou nebo větší než heparin, mají antikoagulační a antitrombotické vlastnosti, které jsou lepší než u heparinu.

Všeobecná antitrombotická aktivita produktů vzorce (I) až (V) byla hodnocena po intravenózním nebo podkožním podání u krys, v modelu žilního městnání krve a indukce s tromboplastinem způsobem popsaným J. Reyersem a dalšími v práci Trombosis Research, 1980, 18, 669-674, a v modelu tepenné trombózy tvořeném výhybkou implantovanou krční tepnu a krční žílu u krys, jak popsal Umetsu a další, Tromb. Haemost., 1978, 39, 74-83. V těchto dvou experimentálních modelech je ED₅₀ sloučenin podle předkládaného vynálezu alespoň stejného řádu nebo menší než u jiných již známých syntetických heparinoidů (ED₅₀ mezi 1 a 50 nmol/kg). Sloučeniny podle předkládaného vynálezu tak mají zejména výhodnou specifičnost působení a zejména výhodnou antikoagulační aktivitu.

Kvůli své biochemické a farmaceutické aktivitě jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu velmi výhodnými léčivy. Jejich toxicita je zcela kompatibilní s tímto použitím. Zároveň jsou velmi stabilní, a proto zejména vhodné jako aktivní složky farmaceutických specialit.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu nejsou dále neutralizovány vysokými dávkami kationtových destičkových proteinů jako PF4, které se uvolňují při aktivaci destiček během procesu trombózy. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou tak nej výhodnější pro léčení a prevenci trombózy tepenného nebo žilního původu.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze použít při různých patologických stavech následujících po modifikaci homeostázy koagulačního systému způsobených poruchami kardiovaskulárního a cerebrovaskulámího systému, jako jsou tromboembolické poruchy spojené s arteriosklerózou a diabetem, jako je nestálá angína, mrtvice, restenóza po angioplastice, endarterioktomie, instalace endovaskulámí protézy; nebo tromboembolické poruchy spojené s retrombózou po trombolýze, infarkt, demence ischemického původu, s poruchami periferních tepen, s haemodialýzou, s aurikulámí fibrilací nebo během použití aorto-koronámí můstkové vaskulámí protézy. Tento produkt podle předkládaného vynálezu lze dále použít pro léčení nebo prevenci tromboembolických patologických stavů žilního původu jako je plicní embolismus. Produkty podle předkládaného vynálezu lze použít pro prevenci nebo léčení trombotických komplikací vzniklých během chirurgického zákroku nebo v souvislosti s jiným patologickým stavem jako je rakovina a bakteriální nebo virová infekce. V případě použití během instalace protézy může sloučenina podle předkládaného vynálezu pokrýt protézu a tak ji učinit kompatibilní s krví. Zejména se sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou vázat na intravaskulámí protézy.

V tomto případě mohou být volitelně chemicky modifikovány zavedením vhodných ruček na nereduktivním nebo reduktivním konci, jak popisuje patentová přihláška EP 0 649 854.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze také použít jako pomocné látky během endarterioktomie prováděné porézními balónky.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou velmi stabilní a proto zejména vhodné pro ustavení aktivní složky léčiva.

Proto lze sloučeniny podle předkládaného vynálezu použít pro přípravu léčiv k léčení výše uvedených chorob.

V jiném aspektu vynálezu je tak jeho předmětem farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku syntetický polysacharid definovaný výše.

Vynález se výhodně týká farmaceutických prostředků obsahujících jako aktivní složku sloučeninu podle předkládaného vynálezu ve formě kyseliny nebo jedné z jejich farmaceuticky upotřebitelných solí, popřípadě v kombinaci s jedním nebo několika inertními a odpovídajícími přísa

-6CZ 297815 B6 dami. Obecně lze polysacharidy podle předkládaného vynálezu použít při léčení patologických stavů spojených s poruchami koagulace.

V každé jednotce dávky je aktivní složka přítomna v množství vhodném pro konkrétní denní dávku. Obecně se každá dávková jednotka upraví odpovídajícím způsobem podle konkrétní dávky a způsobu podávání, například jako tablety, želatinové kapsule apod., sáčky, ampule, sirupy apod., kapky, transdermální nebo sliznicové náplasti tak, že uvedená jednotka dávky obsahuje od 0,1 do 100 mg aktivní složky, výhodně 0,5 až 50 mg.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze také použít v kombinaci s jednou nebo několika dalšími aktivními složkami, které jsou vhodné pro požadovanou terapii, jako například antitrombotická činidla, antikoagulanty, činidla proti agregaci krevních destiček jako je například dipyridamol, aspirin, tiklopidin, klopidogrel nebo antagonisté glykoproteinového komplexu Ilb/IIIa.

Farmaceutické prostředky jsou formulovány pro podávání savcům včetně člověka za účelem léčení výše uvedených chorob.

Takto získané farmaceutické prostředky jsou výhodně v různých formách jako například roztoky pro injekce nebo nápoje, cukrem potažené tablety, běžné tablety nebo želatinové kapsule. Výhodnou formou jsou roztoky pro injekce. Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro preventivní nebo akutní léčení chorob cévních stěn jako je arterioskleróza, hyperkoagulabilita například po chirurgickém zákroku nebo na nádoru nebo po deregulaci koagulace způsobené bakteriálními, virovými nebo enzymatickými aktivátory. Dávkování se může lišit v rámci široké škály v závislosti na věku pacienta, hmotnosti, zdravotním stavu, povaze a závažnosti potíží a také způsobu podávání. Dávkování zahrnuje podání jedné nebo několika dávek 0,1 až 100 mg za den, výhodně 0,5 až 50 mg za den, a to intramuskulámě nebo podkožně, kontinuálně nebo v pravidelných intervalech.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou tak také farmaceutické prostředky, které obsahují jako aktivní složku jednu z výše uvedených sloučenin popřípadě v kombinaci s další aktivní složkou. Tyto prostředky jsou upraveny tak, aby je bylo možné podávat do trávicí soustavy nebo mimo trávicí soustavu.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu pro perorální, podjazykové, podkožní, intramuskulámí, intravenózní, transdermální, sliznicové, lokální nebo rektální podávání se podávají lidem nebo zvířatům jako jednotková dávka s aktivní složkou smíchanou se standardními farmaceutickými přísadami. Vhodné jednotkové formy pro podávání zahrnují perorální formy jako tablety, želatinové kapsule, prášky, granule a perorální suspenze nebo roztoky, podjazykové a ústní formy, podkožní, intramuskulámí, intravenózní, intranasální a oční formy a rektální formy.

Když se připravuje pevný prostředek ve formě tablet, smíchá se hlavní aktivní složka s farmaceutickým nosičem jako je želatina, škrob, laktosa, stearan hořečnatý, mastek, arabská guma apod. Tablety lze potahovat sacharosou nebo jinými vhodnými materiály nebo alternativně je lze upravit tak, že mají dlouhodobou nebo zpožděnou aktivitu a že plynule uvolňují předem stanovené množství aktivní složky.

Želatinové kapsule se získají smícháním aktivní složky s ředidlem a nalitím získané směsi do kapsulí z měkké nebo tvrdé želatiny.

Prášky, které se dispergují ve vodě, nebo granule mohou obsahovat aktivní složku ve směsi s disperzním, suspenzním nebo zvlhčujícím činidlem jako je polyvinylpyrrolidon, a se sladidly nebo příchutěmi.

-7CZ 297815 B6

Pro rektální podávání se připravují čípky, které se vyrábí z pojiv, která tají při teplotě rekta, například z kakaové másla nebo polyethylenglykolů.

Pro parenterální, intranasální nebo oční podávání se používají vodné suspenze, isotonické roztoky šalinu nebo roztoky pro sterilní injekce, které obsahují farmakologicky kompatibilní disperzní činidla a/nebo zvlhčující činidla například propylenglykol nebo butylenglykol.

Pro podávání přes sliznici může být aktivní složka ve formě směsi s promotérem jako je žlučová sůl, hydrofílní polymer jako například hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, ethylcelulóza, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylpyrrolidon, pektiny, škroby, želatina, kasein, akrylové kyseliny a estery a jejich kopolymery, vinylové polymery nebo kopolymery, vinylalkoholy, alkoxypolymery, polyethylenoxidové polymery, polyethery nebo jejich směsi.

Aktivní složka může být i ve formě mikrokapsulí, popřípadě s jednou nebo několika přísadami nebo nosiči.

Aktivní složka může být i ve formě komplexu s cyklodextrinem například α, β, nebo γ-cyklodextrinem, 2-hydroxypropyl-^-cyklodextrin nebo methyl^-cyklodextrinem.

Aktivní složka může být také uvolňována z balónků, které ji obsahují nebo z endovaskulámích roztahovačů zavedených do cév. Farmakologická účinnost aktivní složky není ovlivněna.

Výhodnou cestou podávání je podkožní způsob.

Následující způsoby, přípravy a schémata ilustrují syntézy různých intermediátů, které jsou vhodné pro získání polysacharidů podle předkládaného vynálezu.

Dále jsou použity následující zkratky:

TBDMS: t-butyldimethylsilylová skupina; Lev: levulinoylová skupina; Bn: benzylová skupina; Bz: benzoylová skupina; TLC: tenkovrstvá chromatografíe; Olm: trichloracetimidoylová skupina; LSIMS: kapalinová hmotnostní spektrometrie sekundárního iontu; ESIMS: elektron-sprejová ionizační hmotnostní spektrometrie; TMS: trimethylsilylová skupina; TSP: trimethylsilyltetradeuteriopropionát sodný; Tf: triflát; MS: molekulová síta; PMB: p-methoxybenzylová skupina; MP: p-methoxyfenylová skupina; TS: tosylová skupina; ET: ethylová skupina; Ph: fenylová skupina; Me: methylová skupina; Ac: acetylová skupina.

Dowex®, Sefadex®, Chelax® a Toyopearl® jsou registrované ochranné známky.

Ve způsobech, přípravách a příkladech popsaných níže se obecné postupy katalytického spojení imidátů, štěpení levulinových esterů, katalytické spojení thioglykosidů, zmýdelnění, methylace a selektivní odstranění chránící skupiny z p-methoxybenzylové skupiny, odstranění chránící skupiny a sulfatace oligo- a polysacharidů hydrogenolýzou benzylesterů nebo etherů, zmýdelnění esterů nebo sulfatace, provádí pomocí obecných postupů s příslušnými intermediáty.

Příklady provedení vynálezu

Dále jsou pouze pro ilustraci uvedeny příklady syntézy sloučenin podle předkládaného vynálezu.

-8CZ 297815 B6

Schéma 1 - Syntéza pentasacharidu 9

Příprava 1

Ethyl-0-(2,3-di-o-benzoyl-4,6-0-benzyliden-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-2,3,6-tri-Obenzoyl-l-thio-P-D-glukopyranosid (2)

K roztoku 16,7 g sloučeniny 1 (35,2 mmol) (J. Westman a M. Nilsson, J. Carbohydr. Chem., 1995, 14 (7), 949-960) ve 202 ml pyridinu chlazenému na 0 °C se po kapkách během 20 minut přidá 24,5 ml benzoylchloridu (211 mmol). Reakční směs se 20 hodin míchá při teplotě místnosti; podle tenkovrstvé chromatografie je konverze 50 %. Směs se zředí vodou a dichlormetha-9CZ 297815 B6 nem. Po extrakci se organická fáze promyje 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší síranem hořečnatým a zahustí. Zbytek reaguje s benzoylchloridem postupem popsaným výše. Surový produkt se chromatograficky čistí na silikagelu za získání 22 g sloučeniny 2.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,80, silikagel, 9/1 (objemový poměr) toluen/ethanol

Příprava 2

O-(2,3-di-O-benzoy W,6-O-benzy 1 iden-a-D-glukopyranosy l)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoyl-P-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)— 1,6-anhydro-2,3-di-O-methyl-P-D-glukopyranóza (4)

Směs 1,05 g thioglykosidu 2 (1,05 mmol), 200 mg sloučeniny 3 (1,05 mmol) (Jeanloza další, J. Org. Chem. 1961, 26, 3939-3944) a 1,1 g práškových molekulových sít 4A se v 18 ml toluenu míchá v atmosféře dusíku po dobu 15 minut. Směs se pak ochladí na -20 °C a přidá se čerstvě připravený roztok 1,11 mmol N-jodsukcinimidu a 1,25 mmol trifluormethansulfonové kyseliny v 6 ml směsi 1/1 (objemový poměr) dichlormethan/dioxan. Po 10 minutách se červená reakční směs zfíltruje, zředí díchlormethanem, extrahuje, důkladně promyje 10% roztokem thiosíranu sodného, 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší síranem hořečnatým a pak zahustí ve vakuu. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 1,25 g sloučeniny 4.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,55, silikagel, 4/6 (objemový poměr) heptan/ethylacetát

Příprava 3

O-(4,6-O-Benzyliden-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(P-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)—l,6— anhydro-2,3-di-O-methyl-p-D-glukopyranóza (5)

Do roztoku 1,24 g sloučeniny 4 (1,11 mmol) v 7 ml směsi 1/1 (objemový poměr) methanol/dioxan se přidá 50 mg t-butoxidu draselného. Směs se míchá 1 hodinu a pak se přidá dalších 50 mg t-butoxidu draselného. Směs se pak míchá dalších 60 minut a pak se neutralizuje pryskyřicí Dowex® 50WX8 H⁺, zfíltruje se a zahustí ve vakuu. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu a získá se 665 mg sloučeniny 5 ve formě oleje.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,50, silikagel, 85/15 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 4

O-(4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-Omethy Ι-β-D-glukopyranosy l)-( 1 —>4)—1,6-anhydro-2,3-di-O-methy Ι-β-D-glukopyranóza (6)

K chlazenému (5 °C) roztoku 660 mg sloučeniny 5(1,1 mmol) v 8 ml suchého tetrahydrofuranu se v dusíkové atmosféře přidá 387 mg hydridu sodného (9,65 mmol). Pak se po kapkách přidá 0,51 ml methyljodidu (8,22 mmol) a směs se míchá 20 hodin při teplotě místnosti. Přebytek hydridu sodného se odstraní methanolem a směs se nalije do 50 ml směsi vody a ledu. Po extrakci ethylacetátem (3x20 ml) se organická fáze promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a zahustí za získání 690 mg sloučeniny 6.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf= 0,25, silikagel, 95/5 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

-10CZ 297815 B6

Příprava 5

0-(2,3-Di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-l ,6-anhydro-2,3-di-O-methyl-p-D-glukopyranóza (7)

690 mg sloučeniny 6 (1,03 mmol) se rozpustí v 7,3 ml 80% octové kyseliny a míchá se 20 hodin při teplotě 40 °C. Směs se zahustí ve vakuu odpaří s toluenem. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu, eluce směsí 8/1/1 dichlormethan/ethylacetát/methanol, a získá se 569 mg sloučeniny 7.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,40, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 6

O-(6-O-Benzoyl-2,3-di-O-methyl-oc-D-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-3D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)—1,6-anhydro-2,3-di-O-methy Ι-β-D-glukopyranóza (8)

227 mg 1-benzyloxy-lH-benzotriazolu (1,05 mmol) a 1,15 mmol triethylaminu (1,15 mmol) se přidá k roztoku 560 mg sloučeniny 7 (0,96 mmol) v dichlormethanu a směs pak míchá 20 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se pak zředí dichlormethanem a promyje 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Organická fáze se vysuší síranem hořečnatým, zfíltruje a odpaří do sucha. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu a získá se 600 mg sloučeniny 8.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,50, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 7

O-(2,3-Di-O-Benzoyl-4,6-O-benzy 1 iden-a-D-gl ukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoyl-3-D-glukopyranosyl)-(l ->4)-O-( 6-O-benzoyl-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)(1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-gl ukopyranosylý-f 1 —»4 )— 1,6-anhydro-2,3-di-O-methylβ-D-glukopyranóza (9)

Sloučenina 8 se převede na sloučeninu 9 postupem popsaným při přípravě sloučeniny 4. Spojovací reakce se provede při teplotě 5 °C.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,50, silikagel, 2/8 (objemový poměr) heptan/ethylacetát.

-11 CZ 297815 B6

Schéma 2 - Syntéza heptasacharidu 14

-12CZ 297815 B6

Příprava 8

0-(4,6-0-Benzyliden-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-( β-D-gl ukopyranosyl)-( 1 ->4)-O(2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-p-D-glukopyranosy 1)—( 1 ->4)-l ,6-anhydro-2,3-di-O-methy Ι-β-D-glukopyranóza (10)

Sloučenina 9 se převede na sloučeninu 10 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 5.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,35, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 9

O-(4,6-O-Benzyliden-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethy l-P-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-Ο-(2,3,6-tri-O-methyl-|3-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)O-(2,3,6-tri-O-methyl-P-D-glukopyranosyl)-l,6-anhydro-2,3-di-O-methyl-P-Dglukopyranóza (11)

Sloučenina 10 se převede na sloučeninu 11 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 6.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,50, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 10

O-(2,3-Di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-(l—>4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-P-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl3-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)— 1,6-anhydro-2,3-di-O-methyl-p-D-glukopyranóza (12)

Sloučenina 11 se převede na sloučeninu 12 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 7.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,35, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 11

0-(6-0-Benzoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-PD-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6tri-O-methyl-[3-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)—1,6-anhydro-2,3-di-O-methyl-P-D-glukopyranóza (13)

Sloučenina 12 se převede na sloučeninu 13 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 8.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,40, silikagel, 7,0/1,5/1,5 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 12

O-(2,3-Di-O-benzoyM,6-O-benzyl iden-a-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoyl-(3-D-glukopyranosyl)-(l->4)-0-(6-0-benzoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)(1 ->4)-0-2,3,6-tri-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -^-4)-0-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-Dglukopyranosyl)-( 1 —>4)—(2,3,6-tri-O-methyl-[3-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)— 1,6-anhydro-2,3di-O-methyl-p-D-glukopyranóza (14)

-13 CZ 297815 B6

Kondenzační reakce sloučeniny 13 s disacharidem 2 se provede postupem popsaným při přípravě sloučeniny 9 za získání sloučeniny 14.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf= 0,40, silikagel, 7,0/1,5/1,5 (objemový poměr) toluen/ethyl5 acetát/ethanol

Schéma 3 - syntéza nonasacharidu 19 l

l

- 14CZ 297815 B6

Příprava 13

O-(4,6-O-Banzyliden-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-( P~D-glukopyranosyl)-( 1 -»4)-O(2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-gl ukopyranosy 1)—(1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-methy l-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)—(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-Dglukopyranosyl)-( 1 —>4)— 1 ,6-anhydro-2,3-di-O-methyl^-D-glukopyranóza (15)

Sloučenina 14 se převede na sloučeninu 15 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 5.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,60, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 14

0-(4,6-0-Benzyliden-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethy l-β-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)O-(2,3,6-tri-O-methyl^-D-glukopyranosyl)-(l->4)]₂-l,6-anhydro-2,3-di-O-methyl^-Dglukopyranóza (16)

Sloučenina 15 se převede na sloučeninu 16 postupem popsaným pro příprav sloučeniny 6.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,70, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 15

O-(2,3-Di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-(l ^-4)-0-(2,3,6-tri-O-methyl^-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methylβ-Ο^1υ^ργΓ3ηο3γΙ)-( 1 ->4)] ₂-1,6-anhydro-2,3-di-O-methyl-β-D-glukopyranóza (17)

Roztok 5,05 g sloučeniny 16 (2,0 mmol) v 50 ml 80% octové kyseliny se míchá 20 hodin při teplotě 40 °C. Směs se zahustí ve vakuu a odpaří se s toluenem. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a extrahuje se vodou. Vodná fáze se extrahuje dichlormethanem a organická fáze se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a odpaří do sucha za získání 2,68 g sloučeniny 17.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,50, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 16

0-(6-0-Benzoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-βD-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6tri-O-methyl-β-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)] ₂— 1,6-anhydro-2,3-di-0-methyl^-D-glukopyranóza(18)

Sloučenina 17 se převede na sloučeninu 18 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 8.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,80, silikagel, 7,0/1,5/1,5 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

-15CZ 297815 B6

Příprava 17

O-(2,3-Di-O-benzoyl-4,6-O-benzyliden-a-E)-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoyl-P-D-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(6-O-benzoyl-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)(1 -+4)-0-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-gl ukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy l-a-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy l-p-D-g!ukopyranosyl)-( 1 —>4)]₂-l ,6-anhydro2,3-di-O-methyl-P-D-glukopyranóza (19)

Směs 1,97 g thioglykosidu 2 (2,0 mmol, 3,5 ekvivalentu), 0,86 g heptasacharidu 18 (0,57 mmol) a práškových molekulových sít 4A ve 22 ml toluenu se míchá v atmosféře dusíku po dobu 15 minut. Pak se po kapkách přidá při teplotě místnosti čerstvě připravený roztok 496 mg Njodsukcinimidu (2,2 mmol) a 0,808 mmol trifluormethansulfonové kyseliny (0,808 mmol) ve 12 ml směsi 1/1 (objemový poměr) dichlormethan/dioxan. Po 10 minutách se reakční směs zfiltruje, zředí dichlormethanem, extrahuje se, promyje 10% roztokem thiosíranu sodného a 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a zahustí ve vakuu. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 1,09 g sloučeniny 19.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf - 0,80, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

-16CZ 297815 B6

Schéma 4 - Syntéza nonasacharidu 25

1« l

- 17CZ 297815 B6

Příprava 18

0-(4,6-O-Benzyliden-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(P-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O(2,3-di-0-methyl-(3-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy l-a-D-glukopyranosy 1)—[( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-<x-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-3D-glukopyranosyl)]₂-( 1 ->4)-l ,6-anhydro-2,3-d i-O-methy Ι-β-D-glukopyranóza (20)

Sloučenina 19 se převede na sloučeninu 20 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 5.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,25, silikagel, 5,0/2,5/2,5 (objemový poměr)/v toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 19

0-(4,6-0-Benzyliden-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethy l-P-D-glukopyranosyl)-( 1 -+-4)-(0-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)O-(2,3,6-tri-O-methyl^-D-glukopyranosyl)-(lH>4)]₃-l,6-anhydro-2,3-di-O-methyl^-Dglukopyranóza (21)

Sloučenina 20 se převede na sloučeninu 21 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 6.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf=0,50, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 20

O-(2,3-Di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl^-D-glukopyranosyl)-[( 1 -+4)-(0-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethyl-β-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)]₃-l ,6-anhydro-2,3-di-0-methyl^-D-glukopyranóza (22)

Sloučenina 21 se převede na sloučeninu 22 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 7.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,20, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 21

0-(6-0-Benzoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1-+4)-0-(2,3,6-tri-O-methyl^D-glukopyranosyl)-( 1 -+4)-(0-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -+-4)-0-(2,3,6tri-O-methyl-(3-D-glukopyranosyl)-( 1 -+4)]₃1,6-anhydro-2,3-di-O-methyl^-D-glukopyranóza(23)

Sloučenina 22 se převede na sloučeninu 23 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 8.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,20, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

-18CZ 297815 B6

Příprava 22

O-(6-O-Benzoy l-4-0-levuoyl-2,3-di-0-methy l-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -+4)-0-(2,3,6-triO-methyl-p-D-glukopyranosyl)-( 1 -+4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy l-ct-D-glukopyranosyl)(1 -+4)-0-(2,3,6-tri-O-methyl-p-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)] ₃— 1,6-anhydro-2,3-di-Omethyl-P-D-glukopyranóza (24) mg hydrochloridu l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (0,25 mmol), 29 mg levulové kyseliny (0,25 mmol) a 4 mg dimethylaminopyridinu (0,033 mmol) se přidá k roztoku 320 mg sloučeniny 23 (0,167 mmol) v 1 ml dioxanu. Reakční směs se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Pak se přidá dichlormethan a voda po extrakci se promyje organická fáze vodou, vysuší síranem hořeěnatým, zfiltruje a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 312 mg sloučeniny 24.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,50, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 23

O-(6-O-Benzoyl-4-O-levuoyl-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -+4)-0-(2,3,6—tri— O-methyl-P-D-glukopyranosy l)-( 1 -+4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy 1-a-D-glukopyranosyI)(1 -+4)-0-(2,3,6-tri-O-methyl-p-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)] ₃— 1,6-di-O-acetyl-2,3-di-Omethyl-a,P-D-glukopyranóza (25)

Roztok 312 mg sloučeniny 24 (0,155 mmol) se míchá 4 hodiny při teplotě místnosti ve směsi 2,25 ml acetanhydridu, 50 μΐ octové kyseliny a 0,14 ml trifluoroctové kyseliny. Po přidání 10 ml toluenu se směs zahustí a odpaří s toluenem (3x10 ml). Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 324 mg sloučeniny 25.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,65, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Schéma 5 - Syntéza nanosacharidu 27

*1

- 19CZ 297815 B6

Příprava 24

O-(6-O-Benzoy Ι-4-O-levuoy 1-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-triO-methy Ι-β-D-glukopyranosy l)-( 1 —>4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy 1-a-D-glukopyranosyl)(1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-β-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)]₃-6-O-acety 1-2,3-di-O-methy Ια, β-D-glukopyranóza (26)

Roztok 324 mg sloučeniny 25 (0,153 mmol) a 22,3 μΐ morfolinu (0,256 mmol) ve 2 ml toluenu se 4 hodiny míchá při teplotě 35 °C. Pak se přidá dalších 22,3 μΐ morfolinu a reakční směs se míchá 20 hodin při teplotě 35 °C. Směs se pak rychle ochladí vodou, extrahuje se dichlormethanem, organická fáze se důkladně promyje 0,lN chlorovodíkovou kyselinou a vodou, vysuší a odpaří do sucha. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 280 mg sloučeniny 26.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,45, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 25

Trichloracetimidát 0-(6-0-Benzoyl-4-0-levuoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)(1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-gl ukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-Dglukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl^-D-glukopyranosyl)-(l->4)]₃-6-O-acetyl2,3-di-O-methyl-a^D-glukopyranózy (27) μΐ trichloracetonitrílu (0,39 mmol) a 4,7 mg uhličitanu česného se přidá do roztoku 138 mg sloučeniny 26 (0,066 mmol) v 1,5 ml dichlormethanu. Směs se míchá 2 hodiny, pak se zfíltruje, zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 152 mg imidátu 27.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf=0,35, silikagel, 8/1/1 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

-20CZ 297815 B6

Schéma 6 - Syntéza disacharidu 33

Příprava 26

Methyl-O-(4,6-O-izopropyliden-3-O-methyl-a-L-idopyranosyl-(l -+4)-2,6-di-O-benzyl-3O-methyl-oc-D-glukopyranosid (29)

2,5 g sloučeniny 28 (3,53 mmol; M. Petitou a další, J. Med. Chem. 1997, 40, 1600) se nechá reagovat stejným způsobem jako při syntéze látky 5. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu (2/1 cyklohexan/ethylacetát) za získání 2,1 g látky 29 (98 %).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,32, silikagel, 2/1 (objemový poměr) cyklohexan/ethylacetát

Příprava 27

Methyl-0-(4,6-0-izopropyliden-2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyl-(l->4)-2,6-di-0-benzyl-3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (3 0)

-21 CZ 297815 B6

2,0 g sloučeniny 29 (3,3 mmol) se nechá reagovat stejně jako při syntéze sloučeniny 6. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu (5/1 cyklohexan/ethylacetát) za získání 1,83 g sloučeniny 30 (89 %).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,38, silikagel, 5/2 (objemový poměr) cyklohexan/ethylacetát

Příprava 28

Methyl-0-(2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyl-(l->4)-2,6-di-0-benzyl-3-0-methyl-a-Dglukopyranosid (31)

K roztoku 1,76 g sloučeniny 30 (2,84 mmol) v 16 ml dichlormethanu se přidá 3,14 ml vodného 70% roztoku trifluoroctové kyseliny. Po 50 minutách se reakční směs zředí dichlormethanem a pak promyje vodou do neutrální reakce. Organická fáze se pak vysuší síranem sodným, zfiltruje a pak zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 1,45 g sloučeniny 31 (88 %).

[oc]²°d = +10° (c = 1,0, dichlormethan).

Příprava 29

Methyl-O-(2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)-( 1 -+4)-2,6-di-O-benzyl3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (32)

3.3 mg 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxidu, 4 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 22 mg bromidu draselného (22 mg) a 29 mg tetrabutylamoniumchloridu se přidá k roztoku 1,16 g sloučeniny 31 v 6 ml dichlormethanu. Směs se ochladí na 0 °C a během 15 minut se přidá směs

4.4 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, 2,2 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 5 ml 1,3M roztoku chlornanu sodného. Směs se míchá 1 hodinu, pak se zředí vodou a extrahuje se třikrát dichlormethanem. Organická fáze se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří do sucha za získání 1,34 g surového sloučeniny 32.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,22, silikagel, 10/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol.

Příprava 30

Methyl-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronát)-(l->4)-2,6-di-O-benzyl-3O-methyl-a-D-glukopyranosid (33)

Sloučenina 32 se v atmosféře dusíku rozpustí v 11 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Pak se přidá 0,67 g hydrogenuhličitanu draselného a 1,07 ml benzylbromidu a směs se míchá 90 minut. Pak se přidá ethylacetát a voda po extrakci se organická fáze zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 0,99 g sloučeniny 33.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,58, silikagel, 1/4 (objemový poměr) toluen/diethylether

-22CZ 297815 B6

Schéma 7 - Syntéza tetrasacharidu 36

Příprava 31

Methyl-0-(benzyW-0-levuoyl-2,3-di-0-methyl-[3-D-glukopyranosyluronát-(l->4)-0(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-a1 o L-idopyranosyluronát)-( 1 —>4)-2,6-di-O-benzyl-3-O-methy i-a-D-glukopyranosid (35)

274 mg sloučeniny 34 (0,31 mmol; M. Petitou a další, J. Med. Chem., 1997, 40, 1600) a 200 mg sloučeniny 33 (0,29 mmol) v 10 ml toluenu se nechá reagovat v přítomnosti 220 mg molekulových sít při teplotě -20 °C s t-butyldimethylsilyltrifluormethansulfonátem (0,15 ml 1M roztoku 15 v toluenu). Směs se míchá 10 minut, pak se neutralizuje hydrogenuhličitanem sodným, zfiltruje

-23 CZ 297815 B6 se a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 334 mg sloučeniny 35 (80 %).

[oc]²⁰ _d = +31° (c = 0,76, dichlormethan)

Příprava 32

Methyl-O-(benzyl-2,3-di-C)-methyl-(3-D-glukopyranosyl-uronát)-( 1 ->4)-O-(3,6-di-O-ace1 o tyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-0-(benzyl-2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyluronát)-( 1 —>4)-2,6-di-O-benzyl-3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (36)

308 mg sloučeniny 35 (0,22 mmol) se rozpustí ve 43 ml směsi toluen/ethanol (1/2) a pak se přidá 101 mg hydrazinacetátu (5 ekvivalentů). Směs se míchá 45 minut, pak se zahustí a pak se zbytek 15 chromatografícky čistí na silikagelu za získání 162 mg sloučeniny 36 (89 %).

[a]²⁰ _D = +29° (c = 1,05, dichlormethan)

-24CZ 297815 B6

Schéma 8 - Syntéza polysacharidu 38 ♦

CM

o

Z

O

z o z

zo

xo

-25CZ 297815 B6

Příprava 33

Methyl-O-(6-O-benzoylM-O-levuoyl-2,3-di-O-methyl-p-D-glukopyranosyl)-(l—>4)-O(2,3,6-tri-O-methyl-P-D-glukopyranosyl)-(l->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)]₃-O-(6-O-acetyl-2,3-diO-methyl-a-D-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl^-D-glukopyranosyluronát)-( 1 ->4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(benzyl2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronát-( 1 ->4)-2,6-di-O-benzyl-3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (37)

177 mg imidátu 27 (76,6 pmol) a 201 mg akceptoru 36 (0,15 mmol) ve 2,8 ml směsi 2/1 diethylether/dichlormethan se nechá reagovat s 11,5 μΐ 1M roztoku t-butyldimethylsilyltrifluormethansulfonátu v dichlormethanu jako při syntéze sloučeniny 35. Sloučenina se čistí na chromatografícké koloně Sephadex® LH-20 ve směsi 1/1 dichlormetnan/ethanol a pak na koloně silikagelu ve směsi 3/0,5/1 toluen/aceton/ethanol a nakonec na koloně silikagelu ve směsi 3/2 diizopropylether/ethanol za získání 116 mg derivátu 37 (44 %).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf= 0,31, silikagel, 3/0,5/0,4 (objemový poměr) diizopropylether/aceton/ethanol.

Příprava 34

Methyl-O-(6-O-benzoy 1-2,3-d i-O-methy Ι-α-D-gl ukopyranosy lý-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethy l^-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)O-(2,3,6-tri-O-methyl^-D-glukopyranosyl)-(1^4)]₃-O-(6-O-acetyl-2,3-di-O-methyl-aD-gluko-pyranosyl)-(l->4)-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-β-D-glukopyranosyluronát)(1 ->4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(benzyl-2,3-di-Omethyl-a-L-idopyranosyluronát-(l->4)-2,6-di-O-benzyl-3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (38)

110 mg sloučeniny 37 (0,032 mmol) se převede na 95 mg sloučeniny 38 (89 %) postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 36.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,32, silikagel, 1/1 (objemový poměr) toluen/aceton

-26Schéma 9 - Syntéza trisacharidu 43

OH OH OH

-27CZ 297815 B6

Příprava 35

0-(2,3,4,6-Tetra-0-acetyl-a-D-glukopyranosyl)-(l ->4)-O-(2,3,6-tri-O-acetyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-l ,2,3,6-tetra-0-acetyl-3-D-glukopyranóza (40) g komerčně dostupné maltotriózy (13,9 mmol) se po částech přidá k suspenzi 7 g octanu sodného (85 mmol) v 70 ml acetanhydridu při teplotě 155 °C. Po 15 minutách se roztok ochladí a nalije do 700 ml směsi vody a ledu. Po extrakci ethylacetátem se organická fáze promyje vodou, vysuší síranem hořečnatým, zfíltruje a zahustí za získání 13,1 g sloučeniny 40.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf=0,53, silikagel, 7/3 (objemový poměr) dichlormethan/ethylacetát

Příprava 36

Ethyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-acety l-a-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-2,3,6-tri-O-acetyI-1 -th ίο-β-D-glukopyranosid (41) g sloučeniny 40 (13,5 mmol) se rozpustí v 80 ml toluenu. Pak se v dusíkové atmosféře přidá 1,97 ml ethanthiol (26,9 mmol) a 13,7 ml 1M roztoku diethyletherátu fluoridu boritého v toluenu. Směs se míchá 60 hodin, pak se zředí vodou a dichlormethanem a extrahuje se. Organická fáze se promyje 10% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší, zfíltruje a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 8,6 g sloučeniny 41.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf=0,60, silikagel, 7/3 (objemový poměr) dichlormethan/ethylacetát

Příprava 37

Ethyl-O-(a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(a-D-gluko-pyranosyl)-( 1 ->4)-l -thio-β-Οglukopyranosid (42)

Sloučenina 41 se převede na sloučeninu 42 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 5.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,80, silikagel, 13/7/1,6/4 (objemový poměr) ethylacetát/pyridin/octová kyselina/voda

Příprava 38

Ethyl-O-(2,3,4,6-tetra-0-benzoyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoyl-aD-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-2,3,6-tri-O-benzoyI-1 -thio^-D-glukopyranosid (43)

Sloučenina 42 se převede na sloučeninu 43 postupem popsaným pro přípravu sloučeniny 2.

-28CZ 297815 B6

Schéma 10 - Příprava polysacharidu 46

-29CZ 297815 B6

Příprava 39

Methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -^-4)-0-(2,3,6-tri-O-benzoy Ια-D-glukopy ranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoy Ι-β-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(6-Obenzoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-|3-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-gl ukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethyl-P-D-glukopyranosyl)-(l—>4)]₃-0-(6-0-acctyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosylH 1 —>4)-O-(benzyl-2,3-di-O-methy Ι-β-D-glukopyranosyl uronát)-( 1 ->4)-O-(3,6-di-Oacetyl-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosyl-(l->4)-2,6-di-O-benzyl-3-O-methyl-a-E)-glukopyranosid (44)

170 mg thioglykosidu 43 (106,7 pmol) a 90 mg akceptoru 38 (27 μπιοί) se spojí postupem popsaným pro sloučeninu 4. Produkt se nejdříve čistí chromatografií na Sephadex® LH 20 (eluce směsí 1/1 dichlormethan/ethanol), a pak chromatografií na koloně silikagelu (eluce směsí 12/10 (objemový poměr) cyklohexan/aceton) za získání 89,5 mg (68 %) sloučeniny 44.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,43, silikagel, (12/10 (objemový poměr) cyklohexan/aceton)

Příprava 40

Methyl-0-(2,3,4,6-tetra-0-benzoyl-a-D-glukopyranosyl)-(l->4)-0-(2,3,6-tri-0-benzoyla-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-benzoyl-3-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(6-Obenzoyl-2,3-di-O-methyl-a-D-gluko-pyranosyl)-( 1 ->4>-O-(2,3,6-tri-O-methyl-p-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-α-D-gl ukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethyl-3-D-gluko-pyranosyl)-(1^4)]3-0-(6-0-acetyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosy 1)—(1 ->4)-0-(2,3-di-0-methyl-P-D-glukopyranosyluronová kyselina)-( 1 —>4)-O-(3,6—di— O-acetyl-a-D-glukopyranosyl-(l->4)-O-(2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosy]uronová kyselina)-( 1 ->4)-3-0-methyl-a-D-glukopyranosid (45)

Roztok 80 mg sloučeniny 44 (0,0163 mmol) v 3 ml octové kyseliny se nechá reagovat v přítomnosti 160 g 10% palladia na uhlí s vodíkem při tlaku (10⁶ Pa resp. 10 bar). Po filtraci se roztok zahustí a poskytne sloučeninu 45, která se použije v následujícím kroku bez dalšího čištění.

Příprava 41

Methyl-O-(a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(a-D-gluko-pyranosyl)-( 1 ->4)-O-(P-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethy l-p-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)O-(2,3,6-tri-O-methyl-P-D-glukopyranosyl)-(l->4)]3-O-(2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3-di-O-methyl-p-D-glukopyranosy 1 uronová kyselina)-( 1 ->4)-O-(a-Dgluko-pyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3-di-O-methyl-a-D-idopyranosyluronová kyselina)-( 1 —>4)— 3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (46)

K 72 mg sloučeniny 45 (0,016 mmol) se přidá směs 2,8 ml methanolu (2,8 ml) a 0,69 ml 5N roztoku hydroxidu sodného. K roztoku esteru v methanolu (150ml/mmol) se přidá vodný 5M roztok hydroxidu sodného v takovém množství, aby byla výsledná koncentrace hydroxidu sodného na konci přidání 0,5 M. Po 2,5 hodině se přidá voda a směs se prolije přes kolonu Sephadex® G-25 (1,6 x 115 cm), eluce vodou. Vymytý roztok se zahustí a prolije přes kolonu Dowex® 50H⁺ (2 ml) a lyofilizuje se. V tomto stadiu se pomocí NMR potvrdí, že byly odstraněny

-30CZ 297815 B6 všechny chránící skupiny. V případě potřeby se produkt znovu podrobí hydrogenaci a/nebo hydrolýze. Tím se získá 34 mg sloučeniny 46 (68 % ve dvou krocích).

Schéma 11 - Příprava disacharidu 54

Příprava 42

Methyl-O-4,6-O-benzyliden-2-O-benzyl-a-D-glukopyranosid (48) g komerčně dostupné sloučeniny 47 se rozpustí v 858 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a 50,5 ml benzylbromidu. Roztok se ochladí na teplotu 10 °C a po kapkách se za míchání přidá 20% vodný roztok hydroxidu sodného. Po 1 hodině se reakční teplota zvýší na 20 °C a směs se míchá dalších 20 hodin. Roztok se pak nalije do směsi vody, ledu a toluenu a extrahuje se. Organická fáze se zahustí a surový produkt se čistí kiystalizací za získání 30,0 g sloučeniny 48 popsané J. M. Kiisterem a dalšími v článku Justus Liebigs Ann. Chem. 1975, 2179-2189.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,60, silikagel, 7/3 (objemový poměr) toluen/ethylacetát

Příprava 43

Methyl-O-(4,6-O-benzyliden-2-O-benzyl)-3-O-methyl-a—D-glukopyranosid (49)

-31 CZ 297815 B6

26.4 g sloučeniny 48 se rozpustí ve 211 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a ochladí se na 5 °C. Pak se v atmosféře dusíku přidá 3,2 g hydridu sodného a pak po kapkách 11,3 g jodmethanu. Směs se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti, pak se zředí ethylacetátem, promyje se dvakrát vodou a zahustí za získání 28 g surové sloučeniny 49 popsané v práci M. Petitou a další v J. Med. Chem. 1997,40, 1600-1607.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,70, silikagel (7/3 (objemový poměr) toluen/ethylacetát)

Příprava 44

Methyl-O-2-O-benzyl-3-O-methyl-a-D-glukopyranosid (5 0) g sloučeniny 49 se rozpustí v 468 ml methanolu a pak se přidá 1,35 g β-toluensulfonové kyseliny a směs se míchá 20 hodin při teplotě 20 °C. Směs se zředí toluenem a zahustí. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu a získá se 21 g sloučeniny 50.

Tenkovrstvá chromatografíe·. Rf = 0,07, silikagel (6/4 objemový poměr) toluen/ethylacetát)

Příprava 45

Methyl O-2-O-benzyl-3,6-di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (51)

11,8 g sloučeniny 50 se rozpustí v dusíkové atmosféře ve 160 ml dichlormethanu. Pak se při teplotě místnosti přidá 7,0 g trimethyloxoniumtetrafluorborátu a 10,6 g 2,6-di-t-butyl-4-methylpyridinu. Po 2 hodinách se směs nalije do směsi vody a ledu a extrahuje se dichlormethanem. Organická fáze se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 10,1 g sloučeniny 51.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,25, silikagel (7/3 (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 46

Ethyl-2,4,6-tri-O-acetyl-3-O-methyl-l -thio-a-L-idopyranóza (52)

48.4 g l,2,4,6-tetra-0-acetyl-3-0-methyl-a-L-idopyranózy (připravené podle postupu pro její peribenzoylovaný analog náhradou benzoylchloridu acetanhydridem; Jaura a další, Bio. Med. Chem. Lett, 1992, 2, 897-900) se rozpustí v 175 ml toluenu. Pak se v atmosféře dusíku přidá 20 ml ethanthiolu a 134 ml etherátu fluoridu boritého (1M roztok v toluenu). Směs se míchá 1 hodinu, pak se přidá 400 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného a směs se míchá 1 hodinu. Pak se nalije do ethylacetátu a organická fáze se promyje dvakrát vodou a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 29,6 g sloučeniny 52.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,45, silikagel (6/4 (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 47

Methyl-0-(2,4,6-tri-0-acetyl-3-0-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-0-benzyl-3,6-diO-methyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (53)

-32CZ 297815 B6

10.1 g sloučeniny 51 a 16,0 g sloučeniny 52 se rozpustí ve 304 ml toluenu v atmosféře dusíku. Po přidání práškových molekulových sít (4A) se reakční směs ochladí na teplotu -20 °C a po kapkách se v atmosféře dusíku přidá čerstvě připravený 0,lM roztok 10,1 g N-jodsukcinimidu a 0,80 ml trifluormethansulfonové kyseliny ve směsi 1/1 (objemový poměr) dioxan/dichlormethan. Po 10 minutách se reakční směs zfíltruje a promyje důkladně vodným thiosíranem sodným a nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 21,1 g sloučeniny 53.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,30, silikagel (6/4 (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 48

Methyl-0-(3-0-methyl-a-L-idopyranosyl)-( 1 ->4)-2-O-benzyl-3,6-di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (54)

21.1 g sloučeniny 53 se rozpustí v 295 ml směsi methanol/dioxan (1/1; objemový poměr) a přidá se t-butoxid draselný. Po 30 minutách se směs neutralizuje pryskyřicí Dowex® 50WX8 v H* formě a zahustí se ve vakuu. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 12,7 g sloučeniny 54.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,08, silikagel (3/7 (objemový poměr) toluen/ethylacetát)

-33CZ 297815 B6

Schéma 12 - Příprava tetrasacharidu 62

	MeO	OM·
HO	—/θ'	.
HO >	SX		'V'-.
	OM·	Μ·Ο-^	BnO
		ST

OM·

SO

: R H

Příprava 49

Methyl-O-(4,6-O-izopropyliden-3-O-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-O-benzyl-3,6di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (55)

12,7 g sloučeniny 54 se v dusíkové atmosféře rozpustí v 67 ml tetrahydrofuranu. Pak se přidá ml 2,2-dimethoxypropanu a β—toluensulfonová kyselina a směs se míchá 16 hodin při teplotě

-34CZ 297815 B6 místnosti. Směs se pak zředí nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje se ethylacetátem, organická fáze se odpařením zbaví rozpouštědla a zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu za získání 10,4 g sloučeniny 55.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,35, silikagel (1/1 (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 50

Methyl-O-(4,6-O-izopropyliden-2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-O-benzyl3,6-di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (56)

10,4 g sloučeniny 55 se rozpustí ve 140 ml tetrahydrofuranu a ochladí se na 10 °C. Pak se v atmosféře dusíku přidá 1,38 g hydridu sodného (60% disperze v oleji) a 1,84 ml jodmethanu. Po 4 hodinách se přebytek hydridu sodného rozloží methanolem a směs se extrahuje dichlormethanem a zahustí. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu za získání 11,1 g sloučeniny 56.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,55, silikagel (95/5 (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 51

Methyl-0-(2,3-di-C)-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-0-benzyl-3,6-di-0-methyl-aD-glukopyranosid (57)

11,1 g sloučeniny 56 se rozpustí ve směsi 7/3 (objemový poměr) octová kyselina/voda a směs se míchá přes noc. Pak se dvakrát odpaří s toluenem a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 9,2 g sloučeniny 57.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,09, silikagel (1/1; (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 52

Methyl-0-(2,3-di-0-methyl-oc-L-idopyranosyluronová kyselina)-) 1 to4)-2-O-benzyl-3,6di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (58)

K roztoku 4,7 g sloučeniny 57 ve 28 ml dichlormethanu se přidá 13 mg 2,2,6,6-tetramethyl-lpiperidinyloxidu. 16 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 88 mg bromidu draselného a 117 mg tetrabutylamoniumchloridu. Směs se ochladí na 0 °C a během 15 minut se přidá směs 17,8 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, 8,8 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 20 ml 1,3M roztoku chlornanu sodného. Směs se míchá 1 hodinu, pak se zředí ethylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří do sucha za získání 3,5 g surové sloučeniny 58.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf - 0,14, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 53

Methyl-O-(benzyl-2,3-di-C)-methyl-a-L-idopyranosyluronát)-( 1 ->4)-2-O-benzyl-3,6-diO-methyl-a-D-glukopyranosid (59)

-35CZ 297815 B6

3,5 g sloučeniny 58 se v atmosféře dusíku rozpustí ve 29 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Pak se přidá 1,76 g hydrogenuhličitanu draselného a 2,85 ml benzylbromidu a směs se míchá 4 hodiny. Pak se přidá ethylacetát a voda a po extrakci se organická fáze zahustí. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu za získání 3,4 g sloučeniny 59.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,43, silikagel, 4/6 (objemový poměr) toluen/ethylacetát

Příprava 54

Methyl-O-(beⁿzyl-4-O-leuvoyl-2,3-di-O-methyl-3-D-glukopyranosyluronát)-(l—>4)-O-(30-acetyl-2-0-benzyl-6-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(benzyl-2,3-di-Omethyl-a-L-idopyranosyluronát)-( 1 ->4)-2-O-benzyl-3,6-di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (61)

Směs 0,53 g sloučeniny 59 a 1,0 g sloučeniny 60 se odpaří v přítomnosti toluenu a v atmosféře dusíku rozpustí v 16,2 ml dichlormethanu. Po přidání práškových molekulových sít se směs ochladí na teplotu -20 °C. Pak se míchá 15 minut a pak se přidá 15 molámích % (vzhledem ke sloučenině 60) trimethylsilyltrifluormethansulfonátu. Po 15 minutách se přidá vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Po odfiltrování molekulových sít se filtrát zředí díchlormethanem, promyje vodou, zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 0,75 g sloučeniny 61.

Rf = 0,45, silikagel, (3/7 (objemový poměr) toluen/ethylacetát).

Příprava 55

Methyl-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-p-D-glukopyranosyluronát)-(l->4)-O-(3-O-acetyl-2O-benzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-a-Lidopyranosyluronát)-( 1 —>4)-2-O-benzyl-3,6-di-O-methyl-a-D-glukopyranosid (62)

0,74 g sloučeniny 61 se rozpustí v 3,0 ml pyridinu a při teplotě místnosti se přidá směs 4,1 ml octové kyseliny a 0,47 ml hydrátu hydrazinu ve 3,0 ml pyridinu. Směs se míchá 9 hodin a pak se přidá dichlormethan a voda. Organická fáze se oddělí a důkladně promyje l,0N roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, pak se zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 0,66 g sloučeniny 62.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,25, silikagel (98/2 (objemový poměr) dichlormethan/methanol).

Níže uvedený tetrasacharid 68 se připraví stejným postupem podle reakčního schématu 13 níže, vychází se z disacharidu 55.

-36CZ 297815 B6

Schéma 13 - Příprava tetrasacharidu 68

OM· z S7: R«L«v

W:R«H

-37CZ 297815 B6

Schéma 14 - Příprava disacharidu 75

Příprava 56

Methyl-2-0-benzyl-4,6-di-0-benzyliden-3-0~p-methoxy-benzyl-a-D-glukopyranosid (69)

26,4 g sloučeniny 48 se rozpustí ve 211 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a ochladí se na teplotu 5 °C. Pak se v atmosféře dusíku přidá 2,5 g hydridu sodného a pak se po kapkách 13,3 g 4-methoxybenzylchloridu. Směs se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti, pak se zředí ethylacetátem, dvakrát promyje vodou a zahustí za získání 40,7 g sloučeniny 69.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,80, silikagel, 7/3 (objemový poměr) toluen/ethylacetát

Příprava 57

Methyl-2-0-benzyl-3-0-p-methoxybenzyl-a-D-glukopyranosid (70)

34,9 g sloučeniny 69 se rozpustí v 60% vodné octové kyselině a míchá se 4 hodiny při teplotě 60 °C. Směs se zředí toluenem a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 26,4 g sloučeniny 70.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,07, silikagel, 7/3 (objemový poměr) toluen/ethylacetát

-38CZ 297815 B6

Příprava 58

MethyΙ-2-O-benzyl-3-O-p-methoxybenzyl-6-O-methyΙ-α-D-gl ukopyranosid (71)

26.4 g sloučeniny 70 se v atmosféře dusíku rozpustí v 263 ml dichlormethanu. Pak se při teplotě místnosti přidá ll,6g trimethyloxoniumtetrafluorborátu a 17,4 g 2,6-di-t-butyl^l-methylpyridinu. Po 4 hodinách se směs nalije do směsi vody a ledu a extrahuje se dichlormethanem. Organická fáze se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 18,5 g sloučeniny 71.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,25, silikagel, 7/3 (objemový poměr) toluen/ethylacetát

Příprava 59

Methyl-0-(2,4,6-tri-0-acetyl-3-0-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-0-benzyl-3-0-Pmethoxybenzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (72)

17.5 g sloučeniny 71 a 28,2 g sloučeniny 52 (28,2 g) se v atmosféře dusíku rozpustí v 525 ml toluenu.. Po přidání molekulových sít 4A se reakční směs ochladí na teplotu -20 °C. Pak se za plynulého zavádění dusíku po kapkách přidá čerstvě připravený 0,lM roztok 17,4 g N-jodsukcinimidu a 1,38 g trifluormethansulfonové kyseliny ve směsi 1/1 (objemový poměr) dioxan/dichlormethan. Po 10 minutách se červená reakční směs zfíltruje a důkladně promyje vodným thiosíranem sodným a nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáze se zahustí ve vakuu a získá se 30,0 g sloučeniny 72.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,45, silikagel, 8/2 (objemový poměr) dichlormethan/ethylacetát

Příprava 60

Methyl-2-(3-0-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-0-benzyl-3-0-p-methoxybenzyl-6O-methyl-a-D-glukopyranosid (73)

30,0 g sloučeniny 72 se rozpustí ve 460 ml směsi 1/1 (objemový poměr) methanol/dioxan a přidá se t-butoxid draselný. Po 15 minutách se směs neutralizuje pryskyřicí Dowex® 50WX8H⁺ a zahustí se ve vakuu. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 17,4 g sloučeniny 73.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf=0,25, silikagel, 95/5 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 61

Methyl-2-(4,6-O-izopropyliden-3-O-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2-O-benzyl-3-O3-methoxybenzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (74)

17,4 g sloučeniny 73 (17,4 g) se v atmosféře dusíku rozpustí v 77 ml N,N-dimethylformamidu. Pak se přidá 26 ml 2,2-dimethoxypropanu a β-toluensulfonová kyselina a směs se pak míchá 30 minut. Směs se zředí nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a pak extrahuje ethylacetátem. Po odpaření rozpouštědla se získá 19,7 g sloučeniny 74.

-39CZ 297815 B6

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,45, silikagel, 95/5 (objemový poměr) dichlormethan/methanol

Příprava 62

Methyl-2-(4,6-O-izopropyliden-2,3-di-C)-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l—>4)-2-O-benzyl-6O-methyl-a-D-glukopyranosid (75)

18,5 g sloučeniny 74 se rozpustí ve 24,4 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a ochladí se na teplotu °C. Pak se v atmosféře dusíku přidá 1,47 g hydridu sodného (60% disperze v oleji) a 2,36 ml jodmethanu. Po 1 hodině se přebytek hydridu sodného rozloží methanolem a směs se extrahuje dichlormethanem a zahustí se za získání 20,0 g sloučeniny 75.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf=0,85, silikagel, 95/5 (objemový poměr) dichlormethan/methanol.

-40CZ 297815 B6

Schéma 15 - Syntéza disacharidu 60

-41 CZ 297815 B6

Příprava 63

Methy 1-2-(4,6-O-izopropyliden-2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l—>4)-2-O-benzy 1-6O-methyl-a-D-glukopyranosid (76)

18,4 g sloučeniny 75 se rozpustí v 838 ml dichlormethanu a 168 ml vody. Pak se přidá 7,1 g 2,3dichlor-5,6-dikyano-l,4-benzochinonu a směs se míchá 18 hodin při teplotě 4 °C. Pak se nalije do nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného se a extrahuje se dichlormethanem. Zahuštění organické fáze poskytne 12,7 g sloučeniny 76.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,40, silikagel, 95/5 (objemový poměr) dichlormethan/methanol.

Příprava 64

Methyl-2-(4,6-0-izopropyliden-2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l->4)-2,3-di-0-benzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (77)

10,5 g sloučeniny 76 se rozpustí ve 178 ml suchého Ν,Ν-dimethylformamidu a pak se v atmosféře dusíku ochladí na 0 °C. Pak se přidá 1,91 g hydridu sodného (60% disperze v oleji) a pak po kapkách 3,3 ml benzylbromidu. Po 30 minutách se reakce ukončí a přebytek hydridu sodného se rozloží methanolem. Přidá se voda a směs se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Odpaření rozpouštědla poskytne 13,6 g sloučeniny 77.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,50, silikagel, 1/1 (objemový poměr) toluen/ethylacetát.

Příprava 65

Methyl-0-(2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyl)-(l —>4)—2,3-di-O-benzyl-6-O-methyl-aD-glukopyranosid (78)

Sloučenina 77 se rozpustí ve směsi 77/33 (objemový poměr) octová kyselina/voda a míchá se přes noc. Směs se dvakrát odpaří s toluenem a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 11,5 g sloučeniny 78.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,09, silikagel, 1/1 (objemový poměr) toluen/ethylacetát. Rf = 0,68, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol.

Příprava 66

Methyl-0-(2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-2,3-di-O-benzyl6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (79) mg 2,2,6,6-tetramethyl-l-piperidinyloxidu, 40 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (40 ml), 218 mg bromidu draselného a 289 mg tetrabutylamoniumchloridu (289 mg) se přidá k roztoku 11,6 g sloučeniny 78 v 60 ml dichlormethanu. Směs se ochladí na teplotu 0 °C a během 15 minut se přidá 44 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, 21,8 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 50 ml chlornanu sodného (1,3M roztok). Směs se míchá 1 hodinu, pak se zředí vodou a extrahuje (třikrát) dichlormethanem. Organická fáze se promyje

-42CZ 297815 B6 nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a odpaří do sucha za získání 13,4 g surové sloučeniny 79.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf=0,14, silikagel, 9/1 (objemový poměr) dichlormethan/methanol.

Příprava 67

Methyl-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-a-D-idopyranosyluronát)-(l^4)-2,3~di-O-benzyl-6O-methyl-a-D-glukopyranosid (80)

Sloučenina 79 se v dusíkové atmosféře rozpustí ve 110 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Pak se přidá 6,7 g hydrogenuhličitanu draselného a 10,7 ml benzylbromidu a směs se míchá 90 minut. Pak se přidá ethylacetát a voda a po extrakci se organická fáze zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 9,9 g sloučeniny 80.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,43, silikagel, 4/6 (objemový poměr) toluen/ethylacetát.

Příprava 68

Methyl-0-(benzyl-2,3-di-0-methyl-P-D-glukopyranosyluronát)-(l—>4)-2,3-di-O-benzyl-6O-methyl-a-D-glukopyranosid (81)

9,9 g sloučeniny 80 se rozpustí v 300 ml methanolu a v atmosféře dusíku se zahřívá k varu. Pak se po kapkách přidá 65,2 ml 1M roztoku methoxidu sodného v methanolu a směs se míchá a zahřívá k varu další 3 hodiny. Pak se ochladí na teplotu místnosti, přidá se 22,2 ml IN roztoku hydroxidu sodného a směs se míchá dalších 90 minut. Po neutralizaci pryskyřicí Dowex® 50WX8FT a filtraci se směs zahustí. Čistý produkt se rozpustí ve 192 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a v atmosféře dusíku se přidají molekulová síta. Pak se přidá 3,2 g hydrogenuhličitanu draselného a 4,8 ml benzylbromidu a směs se míchá 5 hodin. Po přidání ethylacetátu a vody a extrakci se oddělí fáze a organická se zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 6,19 g sloučeniny 81 a 1,88 g výchozí sloučeniny 80.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,55, silikagel, 4/6 (objemový poměr) toluen/ethylacetát.

Příprava 69

Methyl-0-(benzyl-4-0-levuoyl-2,3-di-0-methyl-p-D-glukopyranosyluronát)-(l->4)-2,3di-O-benzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (82)

6,2 g sloučeniny 81 se rozpustí ve 40 ml dioxanu. Pak se přidá 2,1 g levulové kyseliny, 3,75 g dicyklohexylkarbodiimidu a 0,2 g 4-dimethylaminopyridinu a směs se míchá 2 hodiny v atmosféře dusíku, pak se přidá 95 ml diethyletheru a odfiltruje se vzniklá sraženina. Filtrát se promyje vodným hydrogensíranem draselným, vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a zahustí. Krystalizace ze směsi ether/heptan poskytne 6,2 g sloučeniny 82.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,26, silikagel, 95/5 (objemový poměr) dichlormethan/aceton.

-43CZ 297815 B6

Příprava 70

O-(Benzyl-4-O-levuoyl-2,3-di-O-methy l-fí-D-glukopyranosyluronát)-( 1 ->4)-l ,3-di-Oacety l-2-O-benzyl-6-O-methyl-a, β-D-glukopyranóza (83)

6,1 g sloučeniny 82 se v atmosféře dusíku rozpustí ve 256 ml acetanhydridu a ochladí na teplotu -20 °C. Pak se během 30 minut po kapkách přidá směs 4,9 ml kyseliny sírové ve 49 ml acetanhydridu. Po 60 minutách se přidá octan sodný v takovém množství, aby pH směsi bylo neutrální. Pak se přidají ethylacetát a voda a organická fáze se zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 4,2 g sloučeniny 83.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,24, silikagel, 8/2 (objemový poměr) dichlormethan/ethylacetát

Příprava 71

O-(Benzyl^l-O-levuoyl-2,3-di-O-methyl-P-D-glukopyranosyluronát)-(l->4)-3-O-acetyl2-O-benzyl-6-O-methyl-a,β-D-glukopyranóza (84)

4,2 g sloučeniny 83 se rozpustí ve 42 ml tetrahydrofuranu a přidá se 4,1 ml piperidinu. Směs se přes noc míchá při teplotě místnosti. Pak se přidá ethylacetát a směs se promyje 0,5N chlorovodíkovou kyselinou. Organická fáze se zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 3,2 g sloučeniny 84.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf= 0,33, silikagel, 1/1 (objemový poměr) dichlormethan/ethylacetát.

Příprava 72

Trichloracetimidát 0-(benzyl-4-0-levuoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-giukopyranosyluronát)(1 ->4)-3-O-acetyl-2-O-benzyl-6-O-methyl-a, β-D-glukopyranóza (60)

1,59 g sloučeniny 84 se v atmosféře dusíku rozpustí v suchém dichlormethanu. Přidá se 1,1 ml trichloracetonitrilu a 72 mg uhličitanu česného a směs se míchá 1 hodinu. Uhličitan česný se odfiltruje a filtrát se zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 1,57 g sloučeniny 60.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,60, silikagel, 3/7 (objemový poměr) toluen/ethylacetát.

-44CZ 297815 B6

Schéma 16 - Syntéza tetrasacharidu 86 * 80

08n0M·

Příprava 73

Methyl-0-(benzyM-0-levuoyl-2,3-di-0-methyl-P-D-glukopyranosyluronát)-(l->4)-0-(3O-acety l-2-O-benzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -»4)-O-(benzyl-2,3-di-Omethyl-a-L-idopyranosyluronát)-(l->4)-2,3-di-O-benzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (85)

Směs 300 mg sloučeniny 80 a 455,6 mg sloučeniny 60 se odpaří s toluenem a v atmosféře dusíku se rozpustí v 6 ml dichlormethanu. Po přidání molekulových sít 4A se směs ochladí na teplotu 20 °C a míchá se 20 minut. Pak se přidá 15 % molámích (vzhledem ke sloučenině 60) trimethylsilyltrifluormethansulfonátu a po 10 minutách se směs neutralizuje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Po odfiltrování molekulových sít se filtrát zředí dichlormethanem, promyje vodou, zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 560 mg sloučeniny 85.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,50, silikagel, 3/7 (objemový poměr) toluen/ethylacetát.

Příprava 74

Methyl-O-(benzyl-2,3-di-O-methyl-3-D-glukopyranosyluronát)-(l—>4)-O-(3-O-acetyl-20-benzyl-6-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-(l->4)-0-(benzyl-2,3-di-0-methyl-a-L-idopyranosyluronát)_( 1 ->4)-2,3-di-O-benzyl-6-O-methyl-a-D-glukopyranosid (86)

-45CZ 297815 B6

532,6 mg sloučeniny 85 se rozpustí v 1,9 ml pyridinu a při teplotě místnosti se přidá směs 2,4 ml octové kyseliny a 0,3 ml hydrátu hydrazinu v 1,9 ml pyridinu. Směs se míchá 9 minut a pak se přidá dichlormethan a voda. Organická fáze se oddělí a důkladně promyje O,1M chlorovodíkovou kyselinou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, zahustí se a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 451 mg sloučeniny 86.

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,45, silikagel, 3/7 (objemový poměr) toluen/ethylacetát.

Schéma 17 - Syntéza monosacharidu 93

Příprava 75

1,6-Anhydro-4-O-3-methoxyfenyl-2-O-tosyl-P-D-gluko-pyranóza (88)

Směs 20 g epoxidu 87 (67 mmol; M. Cemy a další, Collect. Czech. Chem. Commun, 1961, 26, 2542) a 33,3 g β-methoxyfenolu (268 mmol) se v atmosféře argonu zahřívá na teplotu 90 °C. Když je směs kapalná, přidá se po částech 0,3 g chloridu hlinitého (2,35 mmol). Směs se míchá 30 minut a pak se ochladí zpět na teplotu místnosti, zředí se 600 ml dichlormethanu, neutralizuje

-46CZ 297815 B6 se 0,5 ml triethylaminu, promyje se 120 ml 1M vodného roztoku hydroxidu sodného, 3x60 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, 50 ml vodného 10% roztoku hydrogensíranu draselného a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická fáze se pak vysuší síranem sodným, zfiltruje a zahustí. Zbytek se čistí srážením z etheru a chromatografícky na silikagelu za získání 19,4 g sloučeniny 88 (69 %).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,37, silikagel, 6/1 (objemový poměr) dichlormethan/ethylether

Příprava 76

1.6- Anhydrido-4-O-[3-methoxyfenyl-3-O-methyl-2-O-tosyl-P-D-glukopyranóza (89)

K roztoku 3,36 g sloučeniny 88 (7,95 mmol) v 8 ml suchého Ν,Ν-dimethylformamidu se přidá 54 ml methyljodidu (954 mmol) a 18,4 g oxidu stříbrného (79,5 mmol). Směs se míchá 16 hodin, zfiltruje se přes křemelinu, zředí 300 ml ethylacetátu, promyje 3x100 ml vody, vysuší síranem sodným, zfiltruje, zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 3,23 g sloučeniny 89 (80 %).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,36, silikagel, 2/3 (objemový poměr) cyklohexan/ethylether

Příprava 77

1.6- Anhydro-4-O-P-methoxyfenyl-3-O-methyl-2-O-benzoyl-P-D-mannopyranóza (90)

27,4 g sloučeniny 89 (62,7 mmol) se rozpustí ve 315 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Pak se přidá 341 g tetrabutylamoniumbenzoátu (940 mmol) a roztok se 3 hodiny zahřívá na teplotu 150 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se směs zředí ethylacetátem (300 ml), promyje vodou do neutrální reakce, vysuší a zahustí. Zbytek odpovídající sloučenině 90 se přímo použije v dalším kroku.

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,53, silikagel, 10/1 (objemový poměr) dichlormethan/ethylether

Příprava 78

1.6- Anhydro-4-O-P-methoxyfenyl-3-O-methy Ι-β-D-mannopyranóza (91)

K roztoku výše uvedené surové sloučeniny 90 v 540 ml směsi dichlormethan/methanol (1/1) se přidá 13,5 g methoxidu sodného (250 mmol). Směs se 1 hodinu míchá, pak se zředí 500 ml dichlormethanu a promyje 3% vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou. Po vysušení, filtraci a zahuštění se zbytek chromatografícky čistí na silikagelu za získání 10,5 g sloučeniny 91 (59 % ve dvou krocích).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,29, silikagel, 1/1 (objemový poměr) toluen/ethylether

Příprava 79

1.6— Anhydro—2—O—benzyl-4-O—β-methoxyfenyl—3—O-methyl—β-D-mannopyranóza (92)

K roztoku 9,8 g sloučeniny 91 (34,6 mmol) ve 180 ml Ν,Ν-dimethylformamidu se přidá 6,2 ml benzylbromidu (51,9 mmol) a pak při teplotě 0 °C 1,16 g 95% hydridu sodného (48,4 mmol).

-47CZ 297815 B6

Směs se míchá 16 hodin, při teplotě 0 °C se přidají 3 ml methanolu a reakční směs se zředí 200 ml ethylacetátu. Pak se promyje vodou, vysuší, zfíltruje a zahustí. Zbytek odpovídající sloučenině 92 se přímo použije bez dalšího čištění v následujícím kroku. Na silikagelu se ale izoluje analytická frakce: [a]²⁰ _D = -49° (c = 0,73, dichlormethan).

Příprava 80

1,6-Anhydro-2-O-benzyl-3-O-methy Ι-β-D-mannopyranóza (93)

Výše uvedená surová sloučenina 92 se rozpustí v 311 ml směsi tetrahydrofuran/voda (17/1) a při teplotě 0 °C se přidá 76 g dusičnanu ceričitoamonného (138 mmol). Směs se míchá 30 minut, pak se zředí 1 litrem dichlormethanu a pak promyje vodným 2% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a pak vodou. Po vysušení, filtraci a zahuštění se zbytek chromatografícky čistí na silikagelu za získání 6,63 g sloučeniny 93 (72 % ve dvou krocích). [a]²⁰ _D = -68° (c = 1,02, dichlormethan).

Nonasacharid 94 uvedený níže se připraví z monosacharidu 93 reakční sekvencí jako u nonasacharidu 24 z monosacharidu 3.

Schéma 18 - Syntéza nonasacharidu 96

-48CZ 297815 B6

Příprava 81

0-(6-0-Benzoyl-M-0-levuoyl-2,3-di-o-methyl-a-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Omethyl-p-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)O-(2,3,6-tri-O-methyl-3-D-glukopyranosyl)-(l—>4)]3-l,6-anhydro-3-O-methyl-3-Dmannopyranóza (95)

K roztoku 759 mg sloučeniny 94 (0,36 mmol) v 3,3 ml směsi dichlormethan/t-butanol (1/2) se přidá 109 mg 5% palladia na uhlí. Směs se míchá 16 hodin v atmosféře vodíku (10⁶Pa resp. 10 bar) při teplotě 55 °C, pak se zfíltruje a zahustí. Sloučenina 95 se použije v následujícím kroku bez dalšího čištění a charakterizace.

Příprava 82

O-(6-O-Benzoyl-4-O-levuoyl-2,3-di-O-methy Ι-α-D-gl ukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— O-methy l-3-D-glukopyranosyl)-( 1 -a4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-α-D-gl ukopyranosyl)(l->4)-0-(2,3,6-tri-O-methyl-p-D-glukopyranosyl)-(l->4)]3-l,6-anhydro-2-O-benzoyl-3O-methyl-P-D-mannopyranóza (96)

K roztoku 726 mg sloučeniny 95 (0,36 mmol) v 5,4 ml bezvodého pyridinu se přidá 62 μΐ benzoylchloridu (0,54 mmol) a 9 mg dimethylaminopyridinu (0,073 mmol). Směs se míchá 2 hodiny při teplotě 60 °C a pak se ještě jednou přidá stejné množství benzoylchloridu a po 35 minutách se roztok zahustí, zbytek se rozpustí v dichlormethanu, promyje vodným 10% roztokem hydrogensíranu draselného, vodným 2% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Organická fáze se vysuší síranem sodným, zfíltruje a zahustí. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 684 mg sloučeniny 96 (90 % ve dvou krocích).

Tenkovrstvá chromatografíe: Rf = 0,5, silikagel, 1/1 (objemový poměr) toluen/aceton

-49CZ 297815 B6

Schéma 19 - Syntéza nonasacharidu 99

M*O

ΟΑβ Οβ£

O

UtO

Příprava 83

O-(6-O-BenzoylM-O-levuoy 1-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— O-methyl-p-D-glukopyranosy l)-( 1 p4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-α-D-gl ukopyranosy I)(1 p4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-gl ukopyranosy l)-( 1 —>4)] ₃— 1 ,6-di-O-acetyl-2-O-benzoyl-3-O-methyl-p-D-mannopyranóza (97)

657 mg sloučeniny 96 (0,31 mmol) se nechá reagovat se směsí 4,5 ml acetanhydridu, 100 μΐ octové kyseliny (100 ml) a 0,19 ml trifluoroctové kyseliny jako v příkladu 23. Zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 432 mg sloučeniny 97 (92 %).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,53, silikagel, 1/1 (objemový poměr) toluen/aceton

Příprava 84

O-(6-O-Benzoyl-4-O-levuoyl-2,3-di-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri0-methyl-P~D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)(1 ->4)-0-(2,3,6-tri-0-methyl-P-D-glukopyranosylX 1 ->4)]₃-6-O-acetyl-2-O-benzoyl-3O-methyl-a,P-D-mannopyranóza (98)

Připraví se roztok 382 mg sloučeniny 97 (0,17 mmol) a 736 μΐ benzylaminu (6,74 mmol) v 6 ml tetrahydrofuranu a míchá se 5 hodin. Směs se nalije na led a po extrakci ethyletherem se organická fáze důkladně promyje 3% chlorovodíkovou kyselinou a vodou, vysuší a zahustí. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu za získání 241 mg sloučeniny 98.

-50CZ 297815 B6

Tenkovrstvá chromatografie: Rf= 0,37, silikagel, 6/2/2 (objemový poměr) toluen/ethylacetát/ethanol

Příprava 85

Trichloracetimidát 0-(6-0-benzoyl-4-0-levuoyl-2,3-di-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)(1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-D-gl ukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy l^-D-glukopyranosyl)-( 1 -»4)]₃-6-O-acetyl2-O-benzoy 1-3-O-methyl-cc, β-D-mannopyranózy (99)

K roztoku 241 mg sloučeniny 98 v 2,2 ml dichlormethanu se přidá 57 μΐ trichloracetonitrilu (0,56 mmol) a 58 mg uhličitanu česného. Směs se míchá 1 hodinu, zfíltruje se, zahustí a zbytek se chromatografícky čistí na silikagelu za získání 221 mg imidátu 99 (56 % ve dvou krocích).

Tenkovrstvá chromatografie: Rf = 0,19, silikagel, 3/2 (objemový poměr) cyklohexan/aceton

Příklad 1

Sodná sůl methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Osulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-0-(2,3,6-tri-0-sulfo-β-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O(2,3-di-0-methyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -^4)-0-(2,3,6-tri-o-methy Ι-β-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-OΓηεί1ιγ1-β-Ε)^1ηΚοργΓΗηο8γ1)-(1->4)]₃-Ο-(2,3^ί-Ο-ιη6ί1ιγ1-6-Ο-8η1ίο-α-Ο^1η^ργΓ3ηοsy 1)—(1 ->4)-0-(2,3-di-0-methyl-β-D-glukopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)—(1 ->4)-3-O-methyl-2,6-di-O-sulfo-a-D-glukopyranosidu (I) mg hexadekasacharidu 46 (11 pmol) se rozpustí v 1 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Pak se přidá 180 mg komplexu oxid sírový/triethylamin (0,89 mmol) a směs se míchá 20 hodin při teplotě 55 °C. K roztoku 5 mg/ml sulfatované sloučeniny v Ν,Ν-dimethylformamidu se pak přidá 5 mol/mol hydroxylových skupin komplexu triethylamin/oxid sírový. Po 1 hodině při teplotě 55 °C se roztok nanese na kolonu Sephadex® G-25 (1,6 x 115 cm) a vymývá se 0,2M roztokem chloridu sodného. Frakce obsahující produkt se zahustí a zbaví soli na stejné koloně za vymývání vodou. Po lyofílizaci se získá 47 mg sloučeniny I (87 %) ve formě bílého prášku.

[oc]²⁰ _d = +65° (c = 1,0 voda).

Příklad 2

Sodná sůl methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-Osulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -^4)-0-(2,3,6-tri-O-su Ifo^-D-gl ukopyranosy l)-( 1 ->4)-O(2,3-di-0-methyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4 )—O—(2,3,6—tr i O-methyl^-D-glukopyranosyl)-(I->4)]₃-O-(2,3-di-O-methyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3-di-O-methyl^-D-glukopyranosyluronová kyselina)-( 1 -^4)-0-(6-0methyl-2,3-di-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(l —>4)-O-(2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)-(l ->4)-3,6-di-O-methyl-2-O-sulfo-a-D-glukopyranosidu (II)

-51 CZ 297815 B6

Příklad 3

Sodná sůl methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-Osulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo^-D-glukopyranosyl}-( 1 ->4)-O(2,3-di-O-methyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-0-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— Ο-Γηεΐ1ιγ1-β-Ο^^οργΓ3ηο5γΙ)-(Ι—>4)]₃-0-(3-0-methyl-2,6-di-0-sulfo-a-D-mannopyranosyl)-( 1 ->4)-0-(2,3-di-0-methyl^-D-glukopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-O-(6-Omethyl-2,3-di-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(l —>4)-O-(2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)-( 1 —>4)-6-O-methyl-2,3-di-O-sulfo-a.-D-glukopyranosid (III)

Příklad 4

Sodná sůl methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Osulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-0-sulfo^-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O(2,3-di-O-methyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 -α·4)-Ο-(2,3,6-tri-O-methy Ι-β-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— Ο-τη6ΐ1ιγ1-β-Ο-^1ιΑοργΓ3ηο5γΙ)-(1^·4)]₃-Ο-(3-Ο-ιηεΙΙιγΙ-2,6-ύί-Ο-3ΐιΙίο-α.-Ο-Γη3ηηοργ™nosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3-di-O-methyl^-D-gl ukopyranosy I uronová kyselina)-( 1 ->4)-O-(6-Omethyl-2,3-di-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(l -^4)-0-(2,3-di-O-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-3,6-di-O-methyl-2-O-sulfo-a-D-glukopyranosidu (IV)

Příklad 5

Sodná sůl methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-Osulfo-oc-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-0-sulfb^-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O(2,3-di-0-methyl-6-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 —>4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl^-Dglukopyranosyl)-( 1 ->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methy l-a-D-glukopyranosy l)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— O-methyl^-D-glukopyranosyl)-(l—>4)]₃-O-(2,3-di-O-methyl-6-O-siilfb-a-D-mannopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3-di-O-methyΙ-β-D-glukopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-O-(6-Omethyl-2,3-di-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(l->4)-0-(3-0-methyl-2-0-sulfo-a-L-idopyranosyluronovákyselina)-(l->4)-3,6-di-0-methyl-2-0-sulfo-a-D-glukopyranosidu (V)

Sloučenina příkladů 2 až 5 se připraví podobným spojením příslušných tetrasacharidů s příslušnými nonasacharidy a pak spojením s trisacharidem 41 nebo 43 (jako popisuje příprava 36 nebo 38). Následuje obvyklé odchránění a sulfatační reakce.

V případě příkladu 2 je použitý tetrasacharid popsán v přípravě 55 (sloučenina 62) a použitý nonasacharid popsán v přípravě 25 (sloučenina 27).

V případě příkladu 3, je použitý tetrasacharid popsán v přípravě 74 (sloučenina 86) a použitý nonasacharid popsán v přípravě 85 (sloučenina 99).

V případě příkladu 4, je použitý tetrasacharid popsán v přípravě 55 (sloučenina 62) a použitý nonasacharid popsán v přípravě 85 (sloučenina 99).

V případě příkladu 5, je použitý tetrasacharid sloučeninou 68 a použitý nonasacharid je popsán v přípravě 25 (sloučenina 27).

-52CZ 297815 B6

Tabulka I 'H-NMR (D₂O, 4,80 ppm) δ H-l protonů (ppm): jednotka 1 = jednotka s redukujícím koncem jednotka 16 = jednotka s neredukujícím koncem

Jednotka	Příklad 2	Příklad 3	Příklad 4	Příklad 5
1	5,08	4,68	5,07	5,08
2	4,93	5,02	5,02	4,93
3	5,37	5,41	5,43	5,37
5	5,49	5,57	5,48	5,57
6	4,66	4,71	4,65	4,70
7, 9, 11	5,67	5,67	5,68	5,67
4, 8, 10, 12	4,39-4,49	4,39-4,49	4,37-4,47	4,39-4,39
13	5,61	5,61	5,60	5,61
14	4,8	4,94	4,93	4,93
15	5,59	5,59	5,59	5,59
16	5,69	5,69	5,69	5,68

Tabulka II

Molekulový pík metodou „elektronsprejové ionizace negativního iontu“ (ESI)

Příklad	Vzorec	Vypočteno	Nalezeno
2		4304,1	4304,5
3	CmRjaoOiwSiT	4436,2	4436,2
4		4370,1	4370,4
5		4370,1	4370,S

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Syntetický polysacharid v kyselé formě a ve formě jeho farmaceuticky upotřebitelné soli, jehož aniontová forma odpovídá jednomu ze vzorců I až V z následujících vzorců aktivních struktur:

   -53CZ 297815 B6 OS »tB ‘Η3=.Β

   -54CZ 297815 B6

   I ? v í >

   -55CZ 297815 B6
2. 2. Polysacharid podle nároku 1 ve formě sodné nebo draselné soli.
3. 3. Polysacharid podle nároků 1 a 2, kterým je sodná sůl methyl-O-(2,3,4,6-tetra-O-sulfo-a-

   D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6-tri-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3,6—tri— O-sulfo-[3-D-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3-di-O-methyl-6-O-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-p-D-glukopyranosyl)-(l->4)-[O-(2,3,6-tri-O-methyl-aD-glukopyranosyl)-(l->4)-O-(2,3,6-tri-O-methyl-P-D-glukopyranosyl)-(l->4)]3-O-(2,3-diO-methyl-6-O-sulfo-a-D~glukopyranosyl)-(l—>4)-O-(2,3—di-O-methyl-P_D-glukopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-0-(2,3,6-tri-0-sulfo-a-D-glukopyranosyl)-( 1 ->4)-O-(2,3—di— O-methyl-a-L-idopyranosyluronová kyselina)-( 1 ->4)-3-O-methyl-2,6-di-O-sulfo-a-Dglukopyranosidu.
4. 4. Farmaceutické kompozice, vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahují polysacharid podle kteréhokoliv nároku 1 až 3 ve formě soli s farmaceuticky upotřebitelnou bází nebo v kyselé formě, v kombinaci nebo ve směsi s inertní, netoxickou, farmaceuticky upotřebitelnou přísadou.
5. 5. Farmaceutická kompozice podle nároku 4 v jednotkové dávkové formě, vyznačující se t í m , že je v ní aktivní složka smíchána s alespoň jednou farmaceutickou přísadou.
6. 6. Farmaceutická kompozice podle nároku 5,vyznačující se tím, že v každé dávkové jednotce obsahuje 0,1 až 100 mg aktivní složky.
7. 7. Farmaceutická kompozice podle nároku 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že v každé dávkové jednotce obsahuje 0,5 až 50 mg aktivní složky.
8. 8. Použití polysacharidu podle kteréhokoliv nároku 1 až 3 pro přípravu léčiva vhodného pro léčení patologických stavů spojených s poruchami srážení krve.
9. 9. Použití polysacharidu podle kteréhokoliv nároku 1 až 3 pro přípravu léčiva vhodného pro léčení a prevenci onemocnění kardiovaskulárního a cerebrovaskulámího systému, tromboembolických onemocnění spojených s arteriosklerózou a diabetem nebo tromboembolických onemocnění spojených s retrombózou po trombolýze, s infarktem, s demencí ischemického původu, s poruchami periferních artérií, s hemodialýzou nebo s aurikulámími fíbrilacemi nebo alternativně během použití aortokoronámí můstkové vaskulámí protézy.
10. 10. Použití podle nároku 9, přičemž se připravené léčivo použije při prevenci nebo léčení tromboembolických chorob.
11. 11. Použití podle nároku 10, přičemž se připravené léčivo použije při prevenci nebo léčení nestabilní angíny, mrtvice, restenózy po angioplastice, endarterektomii nebo instalaci endovaskulámí protézy.

    Konec dokumentu