CZ290301B6 - Pesticidní proteiny, kmeny které je obsahují, nukleotidové sekvence které je kódují a rostliny jimi transformované - Google Patents

Abstract

Popisuj se pesticidn kmeny Bacillus, kter jsou schopn v pr b hu vegetativn ho r stu produkovat pesticidn proteiny a pomocn proteiny. D le se popisuj tyto purifikovan proteiny, nukleotidov sekvence k duj c tyto proteiny a zp soby pou it uveden²ch kmen , protein a gen pro kontrolu k dc .\

Description

Pesticidní proteiny, kmeny které je obsahují, nukleotidové sekvence které je kódují a rostliny jimi transformované

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů a prostředků pro kontrolu rostlinných a jiných než rostlinných škůdců.

Dosavadní stav techniky

Hmyzí škůdci jsou hlavním faktorem podílejícím se na ztrátách světových komerčně důležitých zemědělských plodin. Pro kontrolu nebo hubení zemědělsky významných škůdců se používá široké spektrum chemických pesticidů. Existuje však velký zájem o vývoj účinných alternativních pesticidů.

Důležitou roli jako alternativa k chemické kontrole škůdců hrají mikrobiální pesticidy. Nejvíce používaný mikrobiální produkt je založen na bakterii Bacillus thuringiensis (Bt). Bt je gram-pozitivní druh rodu Bacillus tvořící spory, který v průběhu sporulace produkuje insekticidní krystalický protein (insecticidal crystal protein, ICP).

Je známá řada variet Bt, které produkují více než 25 odlišných ale příbuzných insekticidních krystalických proteinů. Insekticidní krystalické proteiny produkované Bt jsou toxické pro larvy některých druhů hmyzu z řádů Lepidoptera, Diptera a Coleoptera. Obecně, pokud citlivý hmyz přijme v potravě ICP, krystal je solubilizován a transformován na toxický zbytek střevními proteázami hmyzu. Žádný z insekticidních krystalických proteinů účinných proti larvám brouků nevykazoval podstatné účinky na rod Diabrotica, zejména Diabrotíca virgifera virgifera nebo Diabrotica longicomis barberi.

Bt je blízce příbuzný Bacillus cereus (Bc). Hlavním rozlišujícím znakem je nepřítomnost parasporálního krystalu u Bc. Bc je široce rozšířená bakterie, která se běžně nachází v půdě, a byla izolována z řady jídel a léčiv. Tento organismus se podílí na kažení potravin.

Ačkoli je Bt velmi užitečný pro kontrolu hmyzích škůdců, přetrvává potřeba rozšířit množství potenciálních biologických kontrolních činidel.

Podstata vynálezu

Vynález se týká prostředků a způsobů kontroly rostlinných a jiných než rostlinných škůdců. Konkrétně jsou popsány nové pesticidní proteiny, které lze izolovat z vegetativního růstového stadia Bacillus. Popisují se kmeny Bacillus, proteiny a geny kódující tyto proteiny.

Způsoby a prostředky podle vynálezu lze použít v řadě systémů pro kontrolu rostlinných a jiných než rostlinných škůdců.

Podrobný popis vynálezu:

Popisují se prostředky a způsoby kontroly rostlinných škůdců. Zejména se popisují nové pesticidní proteiny, které jsou produkovány v průběhu vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus. Tyto proteiny jsou vhodné jako pesticidní činidla.

Vynález zjišťuje, že v průběhu vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus jsou produkovány pesticidní proteiny. Pro účely vynálezu je vegetativní růst definován jako období před

-1 CZ 290301 B6 nastoupením sporulace. V případě Bt tento vegetativní růst probíhá před produkcí insekticidních krystalických proteinů. Geny kódující takové proteiny lze izolovat, klonovat a transformovat do různých nosičů pro použití v programech pro kontrolu škůdců.

Pro účely vynálezu mezi škůdce patří hmyz, houby, bakterie, háďátka, roztoči, klíšťata, patogenní prvoci, motolice parazitující na zvířatech a podobně, vynález se však na ně nijak neomezuje. Mezi hmyzí škůdce patří hmyz vybraný z řádů Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera atd.

Tabulky 1 až 10 uvádějí seznam škůdců na hlavních plodinách a škůdců s lékařským a veterinárním významem. Tito škůdci patří do rozsahu vynálezu.

Tabulka 1

Lepidoptera (motýli a můry)

Kukuřice

Ostrinia nubilalis

Agrotis ipsilon

Helicoverpa zea

Spodoptera frugiperda

Diatraea grandiosella

Elasmopalpus lignosellus

Diatraea saccharalis

Čirok

Chilo partellus

Spodoptera frugiperda

Helicoverpa zea

Elasmopalpus lignosellus

Feltia subterranea

Pšenice

Pseudaletia unipunctata

Spodoptera frugiperda

Elasmopalpus lignosellus

Agrotis orthogonia

Elasmopalpus lignosellus

Slunečnice

Suleima helianthana

Homoeosoma electellum

Bavlník

Heliothis virescens

Helicoverpa zea

Spodoptera exigua

Pectinophora gossypiella

Rýže

Diatraea saccharalis

Spodoptera frugiperda

Helicoptera zea

-2CZ 290301 B6

Sója

Pseudoplusia includens

Anticarsia gemmatalis

Plathypena scabra

Ostrinia nibilalis

Agrotis ipsilon

Spodoptera exgua

Heliothis virescens

Helicoverpa zea

Ječmen

Ostrinia nubilalis

Agrotis ipsilon

Tabulka 2

Coleoptera (brouci)

Kukuřice

Diabrotica virgifera virgifera

Diabrotica longicomis barberi

Diabrotica undecimpunctata howardi Melanotus spp.

Cyclocephala borealis

Cyclocephala immaculata Popiliajaponica

Chaetocnema pulicaria

Sphenophorus maidis

Čirok

Phyllophaga crinita

Eleodes, Conoderus a Aeolus spp.

Oulema melanopus

Chaetocnema pulicaria

Sphenophorus maidis

Pšenice

Oulema melanopus

Hypera punctata

Diabrotica undecimpunctata howardi

Slunečnice

Zygogramma exclamationis

Bothyrus gibbosus

Bavlník

Anthonomus grandis

Rýže

Colaspis brunnea

Lissorhoptrus oryzophilus Sitophilus oryzae

-3CZ 290301 B6

Sója Epilachna varivestis

Tabulka 3

Homoptera (molice, mšice apod.)

Kukuřice

Rhopalosiphum maidis

Anuraphis maidiradicis

Čirok

Rhopalosiphum maidis

Sipha flava

Pšenice mšice „Russian wheat aphid“ Schizaphis graminum Macrosiphum avenae

Bavlník

Aphis gossypii Pseudatomoscelis seriatus Trialeurodes abutilonea

Rýže

Nephotettis nigropictus

Sója

Myzus persicae

Empoasca fabae

Ječmen

Schizaphis graminum

Řepka olejka

Brevicoryne brassicae

Tabulka 4

Hemiptera (ploštice)

Kukuřice

Blissus leucopterus leucopterus

Čirok

Blissus leucopterus leucopterus

Bavlník

Lygus lineolaris

-4CZ 290301 B6

Rýže

Blissus leucopterus leucopterus

Acrostemum hilare

Sója

Acrostemum hilare

Ječmen

Blissus leucopterus leucopterus Acrostemum hilare

Euschistus servus

Tabulka 5

Orthoptera (kobylky, cvrčci a švábi)

Kukuřice

Melanoplus femurrubrum Melanoplus sanguinipes

Pšenice

Melanoplus femurrubrum Melanoplus differentialis Melanoplus sanguinipes

Bavlník

Melanoplus femurrubrum Melanoplus differentialis

Sója

Melanoplus femurrubrum Melanoplus differentialis

Stavby a domácnosti Periplaneta americana Blattella germanica Blatta orientalis

Tabulka 6

Diptera (mouchy a komáři)

Kukuřice

Hylemya platura

Agromyza parvicomis

Čirok

Contarinia sorghicola

-5CZ 290301 B6

Pšenice

Mayetiola destructor

Sitodiplosis mosellana

Meromyza americana

Hylemya coarctata

Slunečnice

Neolasioptera murtfeldtiana

Sója

Hylemya platura

Ječmen

Hylemya platura

Mayetiola destructor

Hmyz napadající člověka a zvířata a přenašeči nemocí

Aedes aegypti

Aedes albopictus

Phlebotomus papatasii

Musea domestica

Tabanus atratus

Cochliomyia hominivorax

Tabulka 7

Thysanoptera (třásněnky)

Kukuřice

Anaphothrips obscurus

Pšenice

Frankkliniella fusca

Bavlník

Thrips tabaci

Frankliniella fusca

Sója

Seriocothrips variabilis

Thrips tabaci

Tabulka 8

Hymenoptera (pilatky, mravenci, vosy atd.)

Kukuřice

Solenopsis milesta

Pšenice

Cephus cinctus

-6CZ 290301 B6

Tabulka 9

Další řády a reprezentativní druhy

Dermatoptera (škvoři) Forficula auricularia

Isoptera (termiti) Reticulitermes flavipes

Mallophaga (všenky) Cuclotogaster heterographa Bovicola bovis

Anoplura (vši)

Pediculus humanus

Siphonaptera (blechy) Ctenocephalides felis

Tabulka 10

Acari (roztoči a klíšťata)

Kukuřice

Tetranychus urticae

Čirok

Tetranychus cinnabarinus

Tetranychus urticae

Pšenice

Aceria tulipae

Bavlník

Tetranychus cinnabarinus

Tetranychus urticae

Sója

Tetranychus kurkestani

Tetranychus urticae

Ječmen

Petrobia latens

Důležití roztoči člověka a zvířat

Demacentor variabilis

Argas persicus

Dermatophagoides farinae

Dermotophagoides pteronyssinus

Nyní, když bylo zjištěno, že lze izolovat pesticidní proteiny z druhů rodu Bacillus ve vegetativní růstové fázi, lze za použití standardních postupů izolovat jiné kmeny a testovat jejich aktivitu proti konkrétním rostlinným a jiným než rostlinným škůdcům. Obecně lze kmeny Bacillus izolovat ze vzorku libovolného materiálu, ve kterém žijí, včetně půdy, rostlin, hmyzu, prachu ze zrnového dopravníku, a vzorků jiných materiálů, za použití způsobů známých v oboru, viz například Travers a kol. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1263 - 1266; Saleh a kol. (1969) Can J. Microbiol. 15: 1101 - 1104; DeLucca a kol. (1981) Can J. Microbiol. 27: 865- 870; aNonis a kol. (1981) „The genera Bacillus and Sporolactobacillus“ v Starr a kol. (eds.), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, svazek II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Po izolaci je možné u kmenů testovat pesticidní aktivitu v průběhu vegetativního růstu. Tímto způsobem lze identifikovat nové pesticidní proteiny a kmeny.

Mezi mikroorganismy rodu Bacillus, které nacházejí uplatnění ve vynálezu, patří Bacillus cereus a Bacillus thuringiensis, jakož i druhy rodu Bacillus uvedené v tabulce 11.

Tabulka 11

Seznam druhů rodu Bacillus

Morfologická skupina 1 B. megaterium B. cereus*

B. cereus var. mycoides B. thuringiensis* B. licheniformis B. subtilis* B. pumilis

B. firmus* B. coagulans

Morfologická skupina 2

B. polymyxa B. macerans B. circulans B. stearothermophilus B. alvei* B. laterosporus* B. brevis

B. pulvifaciens B. popilliae* B. lentimorbus* B. larvae*

Morfologická skupina 3 B. sphaericus* B. pasteurii

Nezařazené kmeny

Podskupina A

B. apiarus*

B. fílicolonicus

B. thiaminolyticus

B. alcalophilus

Podskupina B

B. cirroflagellosus

B. chitinosporus

B. lentus

Podskupina C

B. badius

B. aneurinolyticus

B. macroides

B. freundenreichii

Podskupina D

B. pantothenticus

B. Epiphytus

Podskupina El

B. aminovorans

B. globisporus

B. insolitus

B. psychrophilus

Podskupina E2

B. psychrosaccharolyticus

B. macquariensis

Legenda k tabulce 11:

* tyto kmeny Bacillus byly dříve nalezeny v

Rozdělení do skupin je provedeno podle práce Parry, J. M. a kol. (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, London.

Podle vynálezu lze z druhů rodu Bacillus izolovat pesticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Podle jednoho provedení lze izolovat insekticidní proteiny produkované

-8CZ 290301 B6 v průběhu vegetativního růstu, dále označované VIP (vegetativní insekticidní proteiny). Způsoby izolace proteinů jsou v oboru známé. Obecně lze proteiny purifikovat pomocí běžné chromatografie, včetně gelové filtrace, iontové výměny a imunoafinitní chromatografie, pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie, jako je vysoceúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi, vysoceúčinná kapalinová chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací vysoceúčinná kapalinová chromatografie, vysoceůčinný chromatofokusing a hydrofobní interakční chromatografie atd., pomocí elektroforetického rozdělení, jako je jednorozměrná gelová elektroforéza, dvourozměrná gelová elektroforéza atd. Tyto způsoby jsou známé v oboru, viz například Current Protocols in Molecular Biology, svazky 1 a 2, Ausubel a kol. (eds.), John Wiley and Sons, New York (1988). Dále lze připravit protilátky proti v podstatě čistým připraveným proteinům, viz například Radka a kol. (1983) J. Immunol. 128: 2804, a Radka a kol. (1984) Immunogenetics 19: 63. Pro purifíkaci proteinu vykazujícího pesticidní vlastnosti lze použít libovolnou kombinaci způsobů. Jak je postup vytvořen, stanovuje se po každém purifikačním stupni pesticidní aktivita.

Těmito purifíkačními stupni se získá v podstatě purifikovaná proteinová frakce. Termín „v podstatě purifíkovaný“ nebo „v podstatě čistý“ označuje protein, který v podstatě neobsahuje žádnou sloučeninu normálně doprovázející protein v jeho přírodním stavu. Skutečnost, že je připravený protein „v podstatě čistý“ lze stanovit z nepřítomnosti jiných detekovatelných proteinových pásů po elektroforéze v SDS-polyakrylamidovém gelu, což se určí vizuálně nebo denzitometricky. Alternativně může být stupeň čistoty indikován nepřítomností jiných amino-koncových sekvencí nebo N-koncových zbytků v purifikované látce. Čistotu lze ověřit novou chromatografii „čistých“ proteinů, kterou se zjistí nepřítomnost jiných píků při iontoměničové elektroforéze, elektroforéze s obrácenými fázemi nebo kapilární elektroforéze. Termíny „v podstatě čistý“ nebo „v podstatě purifíkovaný“ nejsou míněny tak, že by vylučovaly umělé nebo syntetické směsi proteinů s jinými sloučeninami. Tyto termíny rovněž nejsou míněny tak, že by vylučovaly přítomnost malého množství nečistot, které nejsou na překážku biologické aktivitě proteinu, a které mohou být přítomny například v důsledku neúplné purifikace.

Některé proteiny tvoří jediný polypeptidový řetězec, zatímco mnohé proteiny jsou tvořeny více než jedním polypeptidovým řetězcem. Jakmile je izolován purifíkovaný protein, je možné tento protein, nebo polypeptidy které jej tvoří, charakterizovat a sekvenovat pomocí standardních způsobů známých v oboru. Purifíkovaný protein, nebo polypeptidy které jej tvoří, lze například fragmentovat pomocí bromkyanu, nebo proteázami jako je papain, chymotrypsin, trypsin, lysyl— C-endopeptidasa atd. (Oike a kol. (1982) J. Biol. Chem. 257: 9751 - 9758, Liu a kol. (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215). Výsledné peptidy se oddělí, výhodně pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie, nebo roztavením gelů a elektroblotováním na poly(vinylidenfluoridové) membrány, a podrobí se aminokyselinovému sekvenování, při kterém se peptidy výhodně analyzují pomocí automatických sekvenátorů. Lze stanovit N-koncové, C-koncové nebo vnitřní aminokyselinové sekvence. Z aminokyselinové sekvence purifikovaného proteinu lze syntetizovat nukleotidovou sekvencí, kterou lze použít jako sondu při izolaci genu kódujícího pesticidní protein.

Proteiny se liší v molekulové hmotnosti, peptidech které je tvoří, aktivitě proti konkrétním škůdcům a dalších vlastnostech. Pomocí zde popsaných způsobů lze však izolovat a charakterizovat proteiny účinné proti řadě škůdců.

Jakmile je purifíkovaný protein izolován a charakterizován, je možno jej měnit různými způsoby, včetně substitucí, delecí a inzercí aminokyselin. Způsoby takových manipulací jsou obecně známé v oboru. Například lze připravit obměny pesticidních proteinů v aminokyselinové sekvenci pomocí mutací DNA. Takové obměny (varianty) vykazují požadovanou pesticidní aktivitu. Mutace prováděné v DNA kódující variantu samozřejmě nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a výhodně nevytvářejí komplementární oblastí, které by mohly produkovat sekundární strukturu mRNA, viz evropská patentová přihláška zveřejněná pod číslem 75 444.

-9CZ 290301 B6

Vynález takto zahrnuje pesticidní proteiny, jakož i jejich složky a fragmenty. Mohou být tedy vytvořeny složkové polypeptidy nebo fragmenty proteinů, které si zachovávají pesticidní účinnost. Mezi tyto fragmenty patří zkrácené sekvence, jakož i N-koncové, C-koncové, vnitřní a vnitřně deletované aminokyselinové sekvence proteinů.

Očekává se, že většina delecí, inzercí a substitucí proteinové sekvence nezpůsobuje zásadní změny v charakteristice pesticidního proteinu. Jelikož je však složité předvídat přesný vliv substituce, delece nebo inzerce před jejím provedením, odborníkovi je známé, že se vliv vyhodnotí pomocí běžných vyhledávacích testů.

Proteiny nebo jiné složkové polypeptidy, jak jsou zde popsány, lze použít samotné nebo v kombinaci. To znamená, že je možné použít několik proteinů pro kontrolu různých hmyzích škůdců. Některé proteiny podle vynálezu dále zvyšují aktivitu pesticidních proteinů. Tyto proteiny jsou zde označovány jako „pomocné proteiny“. Ačkoli není mechanismus jejich působení zcela jasný, jsou insekticidní vlastnosti pesticidního proteinu, pokud jsou spolu pomocný protein a zkoumaný pesticidní protein, několikrát zvýšeny.

Pesticidní proteiny podle vynálezu se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž jejich složkové polypeptidy mají molekulovou hmotnost nejméně 30 kDa nebo větší, výhodně přibližně 50 kDa nebo větší.

Pomocné proteiny podle vynálezu se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně přibližně 15 kDa nebo větší, výhodně přibližně 20 kDa nebo větší. Pomocné proteiny jako takové se mohou skládat ze složkových polypeptidů.

Je možné, že pesticidní protein a pomocný protein jsou složkami multimemího pesticidního proteinu. Takovéto pesticidní proteiny, které obsahují pomocné proteiny jako jeden nebo několik ze svých složkových polypeptidů, se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně 50 kDa až do nejméně 200 kDa, výhodně přibližně 100 kDa až 150 kDa.

V kombinaci s pesticidními proteiny podle vynálezu lze použít pro zesílení aktivity pomocný protein. Pro stanovení, zda pomocný protein ovlivní aktivitu, je možné pesticidní protein exprimovat samotný nebo v kombinaci s pomocným proteinem a jednotlivé aktivity srovnat v požerových testech na zvýšenou pesticidní účinnost.

Při vyhledávání potenciální pesticidní aktivity u kmenů může být výhodné testovat aktivitu kmene samotného a v kombinaci s pomocným proteinem. V některých případech se kombinací pomocného proteinu s přirozenými proteiny kmenů dosáhne pesticidní aktivity i tehdy, kdy za nepřítomnosti pomocného proteinu žádná aktivita není pozorována.

Pomocný protein je možné modifikovat, jak je popsáno výše, pomocí různých způsobů známých v oboru. Pro účely vynálezu tudíž termín „vegetativní insekticidní protein“ (VIP) zahrnuje ty proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu, které lze použít buďto samotné, nebo v kombinaci k dosažení pesticidní aktivity. Zahrnuje tedy pesticidní proteiny, pomocné proteiny a proteiny, které vykazují aktivitu pouze za přítomnosti pomocného proteinu nebo polypeptidové složky těchto proteinů.

Je třeba vzít v úvahu, že pro získání nukleotidových a aminokyselinových sekvencí proteinů podle vynálezu jsou k dispozici i alternativní způsoby. Pro získání nukleotidová sekvence kódující pesticidní protein lze například izolovat z genomové knihovny kosmidové klony, které exprimují pesticidní protein. Z větších aktivních kosmidových klonů lze připravit menší subklony a testovat jejich aktivitu. Tímto způsobem lze sekvenovat pro stanovení nukleotidová sekvence genu klony, které exprimují aktivní pesticidní protein. Poté lze odvodit aminokyselinová sekvence proteinu. Obecné metody molekulární biologie jsou uvedené například v Molecular

-10CZ 290301 B6

Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, svazky 1-3, Sambrook a kol. (eds.), Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) a v publikacích citovaných v této práci.

Vynález rovněž zahrnuje nukleotidové sekvence z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, přičemž tyto nukleotidové sekvence jsou izolovatelné hybridizací s nukleotidovými sekvencemi z kmenů Bacillus podle vynálezu. U takových nukleotidových sekvencí lze testovat jejich pesticidní aktivitu. Vynález rovněž zahrnuje proteiny kódované těmito nukleotidovými sekvencemi. Vynález dále zahrnuje proteiny získané z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, přičemž tyto proteiny cross-reagují s protilátkami vytvořenými proti proteinům podle vynálezu. U izolovaných proteinů lze opět testovat jejich pesticidní aktivitu pomocí zde popsaných způsobů.

Jakmile se izolují nukleotidové sekvence kódující pesticidní proteiny podle vynálezu, lze s nimi manipulovat a použít je pro expresi proteinu v řadě hostitelů, včetně jiných organismů, včetně mikroorganismů a rostlin.

Pesticidní geny podle vynálezu lze optimalizovat pro zvýšenou expresi v rostlinách, viz například americká přihláška č. 07/951 715, EPA 0359472, EPA0385962, WO 91/16432, Perlak a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328, a Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498. Tímto způsobem lze syntetizovat geny za použití kodonů preferovaných rostlinami. Preferovaným kodonem pro konkrétního hostitele je jediný kodon, který nejčastěji kóduje v tomto hostiteli danou aminokyselinu. Například kodon preferovaný kukuřici pro konkrétní aminokyselinu lze odvodit ze známých genových sekvencí kukuřice. Použití kodonů kukuřicí pro 28 genů z rostlin kukuřice se nachází v práci Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498. Lze rovněž vytvořit syntetické geny na základě distribuce kodonů, kterou konkrétní hostitel používá pro konkrétní aminokyselinu.

Tímto způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolné rostlině. Je třeba vzít v úvahu, že je možné, aby byly optimalizovaná nebo syntetická celá genová sekvence nebo libovolná její část. To znamená, že je možné použít rovněž syntetické nebo částečně optimalizované sekvence.

Podobným způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolném mikroorganismu. Preferované použití kodonů pro rod Bacillus je uvedeno například v americkém patentu č. 5 024 837 a v práci Johansen a kol. (1988) Gene 65: 293 - 304.

Metodologie konstrukce expresívních kazet pro rostliny, jakož i zavedení cizí DNA do rostlin jsou popsány v oboru. Takovéto expresívní kazety mohou obsahovat promotory, terminátoiy, zesilovače, vedoucí sekvence, introny a jiné regulační sekvence operabilně spojené škodující sekvencí pesticidního proteinu.

Obecně se pro introdukci cizí DNA do rostlin používají vektoiy na bázi Ti-plazmidu, jakož i přímý příjem DNA, lipozómy, elektroporace, mikroinjekce a vstřelování mikročástic. Takové způsoby jsou popsány v oboru, viz například Guerche a kol., (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause a kol., (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30-36; Klein a kol. (1987) Nátuře 327: 70- 73; Howell a kol., (1990) Science 208: 1265; Horsch a kol., (1985) Science 227: 1229- 1231; DeBlock a kol., (1989) Plant Physiology 91: 694- 7012; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach a Weissbach, eds. Academie Press, lne. (1988); a Methods in Plant Molecular Biology (Schulůr a Zielinsku, eds.) Academie Press, lne. (1989), viz rovněž americká patentová přihláška č. 08/008 374, a rovněž EPA 0193259 a EPA 0451878A1. Je samozřejmé, že způsob transformace závisí na rostlinné buňce, která má být transformována.

Dále je složky expresívní kazety modifikovat pro zvýšení exprese. Lze například použít zkrácené sekvence, provést substituce nukleotidů nebo jiné modifikace, viz například Perlak a kol. (1991)

-11 CZ 290301 B6

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328; Murray a kol. (1989) Nucleis Acids Research

17: 477-498; a WO 91/16432.

Konstrukt může rovněž obsahovat libovolné jiné nutné regulátory, jako jsou terminátory (Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141 - 144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671 -674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev., 5: 141 - 149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1261 - 1271; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151 - 158; Ballas a kol., (1989), Nucleis Acids Res., 17: 7891- 7903; Joshi a kol., (1987), Nucleis Acid Res., 15: 9627-9639); rostlinné konvenční sekvence pro translaci (Joshi, C. P., (1987), Nucleic Acids Research, 15: 6643-6653), introny (Luehrsen a Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225: 81 -93) a podobně, operabilně spojené s nukleotidovou sekvencí. Může být výhodné zařadit do konstruktu expresívní kazety 5'-vedoucí sekvenci. Takové vedoucí sekvence mohou působit tak, že zvyšují translaci. Translační vedoucí sekvence jsou v oboru známé a patří mezi ně:

vedoucí sekvence picomaviru, například vedoucí sekvence EMCV (5'-nekódující oblast Encefalomyocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., a Moss, B. (1989) PNAS USA 86: 6126-6130);

vedoucí sekvence potyviru, například vedoucí sekvence TEV (tabákový virus Tobacco Etch Virus) (Allison a kol., (1986); vedoucí sekvence MDMV (virus zakrslé mozaiky kukuřice), Virology, 154: 9-20); a vazebný protein těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (BiP) (Macejak, D. G., a Samow, P., (1991), Nátuře 353: 90-94;

nepředkládaná vedoucí sekvence z mRNA obalového proteinu viru mozaiky vojtěšky (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., a Gehrke, L., (1987), Nátuře, 325: 622 - 625;

vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV), (Gallie, D. R. a kol., (1989), Molecular Biology of RNA, str. 237 - 256; a vedoucí sekvence viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) (Lommel, S. A. a kol., (1991), Virology, 81: 382 -385, viz rovněž Della-Cioppa a kol., (1987), Plant Physiology, 84: 965-968.

V expresivní kazetě lze použít rostlinný terminátor, viz například Rosenberg a kol., (1987), Gene 56: 125; Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141 - 144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671-674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev., 5: 141 - 149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1261 - 1272; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151 - 158; Ballas a kol., (1989), Nucleis Acids Res., 17: 7891 - 7903; Joshi a kol., (1987), Nucleis Acid Res., 15: 9627 - 9639.

Pro tkáňově specifickou expresi lze nukleotidové sekvence podle vynálezu operabilně spojit s tkáňově specifickými promotory, viz například americká přihláška č. 07/951 715.

Geny kódující pesticidní proteiny lze použít pro transformaci organismů patogenních pro hmyz. Mezi takové organismy patří Baculoviry, houby, prvoci, bakterie a háďátka.

Kmeny Bacillus podle vynálezu lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Alternativně lze gen kódující pesticid introdukovat pomocí vhodného vektoru do mikrobiálního hostitele, a tohoto hostitele aplikovat na životní prostředí, rostliny nebo zvířata. Je možné vybrat jako hostitele mikroorganismy, o kterých je známo, že obsahují „fytosféru“ (fyloplán, íylosféru, rhizosféru nebo/a rhizoplán) jedné nebo několika plodin, které jsou předmětem zájmu. Tyto mikroorganismy se vybírají tak, aby byly schopné úspěšně soutěžit v konkrétním prostředí s mikroorganismy divokého typu, aby v nich byl stabilně udržován

- 12CZ 290301 B6 aexprimován gen exprimující polypeptidový pesticid, a s výhodou aby zajišťovaly zlepšenou ochranu pesticidu před degradací a inaktivací způsobenou prostředím.

Mezi takovéto mikroorganismy patří bakterie, řasy a houby. Zejména zajímavými mikroorganismy jsou bakterie, například Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lectobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, zejména kvasinky, například Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Zvláště zajímavé jsou fytosfémí druhy bakterií, jako je Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli a Azotobacter vinlandii, a fytosfémí druhy kvasinek, jako je Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronoae, a Aureobasidium pollutans. Obzvláště zajímavé jsou pigmentované mikroorganismy.

Je dostupná řada způsobů introdukce genu exprimujícího pesticidní protein do mikroorganismu jako hostitele za podmínek, které umožňují stabilní udržení a expresi genu. Je například možné zkonstruovat expresívní kazety, které obsahují DNA-konstrukty, které jsou předmětem zájmu, operabilně spojené s transkripčními a translačními regulačními signály pro expresi DNA-konstruktů, a sekvenci DNA homologní se sekvencí v hostitelském organismu, jejímž prostřednictvím dojde k integraci, nebo/a replikační systém, který je funkční v hostiteli, jehož prostřednictvím dojde k integraci nebo stabilnímu udržení.

Mezi transkripční a translační regulační signály patří, aniž by se tím však jejich rozsah jakkoli omezoval, promotor, místo iniciace transkripce, operátory, aktivátory, enhancery, další regulační elementy, místa vázající se na ribozomy, iniciační kodon, terminační signály a podobně, viz například americký patent č. 5 039 523, americký patent č. 4 853 331, EPO 0480762A2, Sambrook a kol., viz výše; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis a kol. (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982); Advanced Bacterial Genetics, Davis a kol., (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980), a v nich citované odkazy.

Mezi vhodné hostitelské buňky, v případě že se buňky obsahující pesticid ošetří pro prodloužení aktivity toxinu v buňce a ošetřené buňky se poté aplikují na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni, patří buďto prokaryotní, nebo eukaryotní hostitelské buňky, normálně s omezením na ty buňky, které neprodukují látky toxické pro vyšší organismy, jako jsou savci. Je však možné použít organismy produkující látky toxické pro vyšší organismy v případě, že toxin je nestabilní nebo aplikační množství dostatečně nízké, aby bylo možné vyhnout se možnosti toxicity pro savčího hostitele. Jako hostitelé jsou zejména zajímaví prokaryotní hostitelé a nižší eukaryotní hostitelé, jako jsou houby. Mezi ilustrativní příklady prokaiyotních hostitelů patří jak gram-negativní tak gram-pozitivní hostitelé, a patří mezi ně Enterobacteriaceae, jako je Escherichia Erwinina, Shigella, Salmonella, a Próteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, jako je Rhizobium; Spirillaceae, jako je fotobakterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, jako je Pseudomonas a Acetobacter; Azotobacteraceae a Nitrobacteraceae. Mezi eukaryotní hostitele patří houby, jako jsou Phycomycetes a Ascomycetes, mezi které patří kvasinky, jako jsou Saccharomyces a Schizosaccharromyces, a kvasinky z třídy Basidiomycetes, jako je Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces a podobně.

Mezi zejména zajímavé charakteristiky při výběru hostitelské buňky pro účely produkce patří snadnost introdukce genu pro protein do hostitele, dostupnost systémů exprese, účinnost exprese, stabilita proteinu v hostiteli, a přítomnost pomocných genetických schopností. Mezi charakteristiky zajímavé pro použití jako pesticidní mikrokapsle patří ochranné vlastnosti pro

-13CZ 290301 B6 pesticid, jako jsou silné buněčné stěny, pigmentace a intracelulámí packaging nebo vytváření inkluzních tělísek; afinita k listům; nepřítomnost toxicity pro savce; atraktivita pro požer škůdci;

snadnost usmrcení a fixace bez poškození toxinu; a podobně. Dále je třeba brát v úvahu snadnost formulace a manipulace, ekonomická hlediska, stabilitu při skladování a podobně.

Mezi zejména zajímavé hostitelské organismy patří kvasinky, jako jsou Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. a Sporobolomyces sp., fyloplánové organismy jako jsou Pseudomonas sp., Erwinia sp. a Flavobacterium sp., nebo jiné organismy jako jsou Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp., a podobně. Mezi konkrétní organismy patří Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis a podobně.

Obecné způsoby pro použití kmenů podle vynálezu k pesticidní kontrole nebo při konstruování jiných organismů jako pesticidních činidel jsou známé v oboru, viz například americký patent č. 5 039 523 a EP 0480762A2.

Kmeny Bacillus podle vynálezu, nebo mikroorganismy, které byly geneticky změněny tak, aby obsahovaly pesticidní gen a protein, lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Podle jednoho provedení vynálezu se celé, tj. nelyžované, buňky organismu produkujícího toxin (pesticid) ošetří činidly, které prodlužují aktivitu toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni.

Alternativně se pesticidy produkují pomocí introdukce heterologního genu do buněčného hostitele. Exprese heterologního genu způsobuje přímo nebo nepřímo intracelulámí produkci a uchovávání pesticidu. Tyto buňky se poté ošetří za podmínek, které prodlužují aktivitu toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni. Výsledný produkt si uchovává toxicitu toxinu. Takové přirozeně enkapsulované pesticidy lze poté formulovat podle běžných technik pro aplikaci na prostředí obsahující škůdce, který má být kontrolován, například půdu, vodu, a listy rostlin, viz například EPA 0192319, a odkazy tam citované.

Účinné složky podle vynálezu se normálně aplikují ve formě prostředků, a lze je aplikovat na stanoviště plodiny nebo na rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně s jinými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo/a látky dodávající mikroprvky, nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematicidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami usnadňujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá.

Výhodnými způsoby aplikace účinné složky podle vynálezu nebo agrochemického prostředku podle vynálezu, který obsahuje alespoň jeden z pesticidních proteinů produkovaných bakteriálními kmeny podle vynálezu, jsou aplikace na listy, obalování semen a půdní aplikace. Počet dávek a aplikační dávka závisí na intenzitě zamoření odpovídajícím škůdcem.

Podle jednoho provedení vynálezu byl izolován mikroorganismus Bacillus cereus, který je schopen usmrcovat Diabrotica virgifera virgifera a Diabrotiaca longicomis barberi. Nový kmen Bacillus cereus AB78 byl uložen v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21058.

- 14CZ 290301 B6

Z tohoto kmene Bacillus cereus byl v podstatě purifíkován protein. Purifíkace proteinu byla ověřena pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu a biologické aktivity. Protein má molekulovou hmotnost přibližně 60 do přibližně 100 kDa, zejména přibližně 70 až přibližně kDa, konkrétněji přibližně 80 kDa.

Sekvenováním od konce svolnou aminoskupinou bylo zjištěno, že N-koncovou aminokyselinovou sekvencí je NH₂-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-AspSer-Ile-Pro- (SEQ ID č. 8), kde zbytek Asx představuje buďto Asp, nebo Asn. Celá aminokyselinová sekvence je uvedená v SEQ ID č. 7.

Byla vytvořena oligonukleotidová sonda pro oblast genu kódující aminokyselina 3-9 NH₂-konce. Sonda byla syntetizována na bázi použití kodonů genu pro δ-endotoxin Bacillus thuringiensis (Bt). Nukleotidová sekvence oligonukleotidové sondy použité pro Southemovu hybridizaci byla následující:

5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID č. 9) kde N představuje libovolnou bázi.

Kromě toho, zde popsaná DNA-sonda pro gen Bc AB78 VIP-1 umožňuje screening libovolného kmene Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen gen VIP-1 (nebo přítomný gen), nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje gen VIP-1.

Pro lepší pochopení vynálezu obecně popsaného výše slouží následující podrobné příklady, které jsou však uvedeny pouze pro ilustraci a vynález se jimi v žádném směru neomezuje, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace a charakterizace AB78

Kmen Bacillus cereus AB78 byl izolován jako mikroorganismus kontaminující destičky v laboratoři na médiu T3 (na litr: 3 g tryptonu, 2 g tryptosy, 1,5 g kvasničného extraktu, 0,05 M fosforečnanu sodného (pH 6,8) a 0,005 g chloridu manganatého; Travers, R. S., 1983). AB78 vykazuje podstatnou aktivitu proti Diabrotica virgifera virgifera. Byla rovněž zjištěna antibiotická aktivita proti gram-pozitivnímu Bacillus spp. (viz tabulka 12).

Tabulka 12

Antibiotická aktivita supematantu kultury AB78

Testovaná bakterie	AB78	zóna inhibice (cm) Streptomycin
E. coli	0,0	3,0
B. megaterium	1,1	2,2
B. mycoides	1,3	2,1
B. cereus CB	1,0	2,0
B. cereus 11950	1,3	2,1
B. cereus 14579	1,0	2,4
B. cereus AB78	0,0	2,2
Bt var. isrealensis	1,1	2,2
Bt var. tenebrionis	0,9	2,3

-15CZ 290301 B6

Morfologické charakteristiky AB78 jsou následující:

Vegetativní vlákna jsou rovná, dlouhá 3,1-5,0 mm a široká 0,5-2,0 mm. Buňky mají zakulacené konce, jsou jednotlivé v krátkých řetězcích. Na buňku se vytváří jediná subterminální válcovitě-oválná endospora. Nevytváří se parasporální krystal. Kolonie jsou neprůhledné, nepravidelně zoubkované, lalokovité a ploché. Nevytváří pigmenty. Buňky jsou pohyblivé. Jsou přítomné bičíky.

Růstové charakteristiky AB78 j sou následuj ící:

Mikroorganismus je fakultativně anaerobní s optimální teplotou pro růst 21-30 °C. Roste při teplotě 15,20,25,30 a 37 °C. Neroste při teplotě přes 40 °C. Roste v 5 - 7% chloridu sodném.

Tabulka 13 obsahuje biochemické údaje o AB78.

Tabulka 13

Biochemické charakteristiky kmene B. cereus AB78 kyselina z L-arabinózy- zpětná oxidace methylenové

plyn z L-arabinózy	- modři	+
kyselina z D-xylózy	-	redukce nitrátu	+
plyn z D-xylózy	-	redukce NO3 na NO2	+
kyselina z D-glukózy	+	VP	+
plyn z D-glukózy	-	rozklad H2O2	+
kyselina z laktózy	-	indol	-
plyn z laktózy	-	rozklad tyrosinu	+
kyselina ze sacharózy	-	dihydroxyaceton	-
plyn ze sacharózy	-	lakmusové mléko kyselé	-
kyselina z D-manitolu	-	lakmusové mléko koagulované	-
plyn z D-manitolu	-	lakmusové mléko alkalické	+
utilizace propionátu	+	lakmusové mléko peptonizované	-
utilizace citrátu	+	lakmusové mléko redukované	-
hydrolýza hypurátu	s	hydrolýza kaseinu	+
redukce methylenové modři	+	hydrolýza škrobu	+
		zkapalnění želatiny	+
		produkce lecitinázy	s

Legenda k tabulce 13:

s = slabá reakce

Příklad 2

Kultivace bakterií

Subkultura kmene Bc AB78 byla použita kinokulaci následujícího média, známého jako TB-médium (TB broth):

-16CZ 290301 B6 trypton 12g/1 kvasničný extrakt 24g /1 glycerol 4g /1

KH₂PO₄ 2,1g/1

K₂HPO₄ 14,7 g/1 pH7,4

K autoklávovanému médiu se po ochlazení přidá fosforečnan draselný. Baňky se inkubují při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin až 36 hodin.

Výše uvedený postup lze za použití procedur známých v oboru snadno upravit do rozsahu potřebného pro velké fermentory.

V průběhu vegetativního růstu, obvykle 24-36 hodin po započetí kultivace byly bakterie AB78 centrifugovány ze supematantu kultury. Supematant kultury obsahující aktivní protein byl použit v biologických testech.

Příklad 3

Biologické testy na hmyzu

Kmen B. cereus AB78 byl testován proti různým druhům hmyzu jak je popsáno níže.

Diabrotica virgifera virgifera, D. longicomis barberi a D. undecempunctata howardi: provedou se zředění supematantu kultury AB78 po kultivaci 24 - 36 hodin, zředěný supematant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Marrone a kol. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290 - 293) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do misek. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6 dnů.

Biologické testy s klony Escherichia coli: E. coli se nechá růst přes noc v L-Amp 100 při teplotě 37 °C. Každých 10 ml kultury se sonikuje 3x po dobu 20 sekund. 500 ml sonikované kultury se přidá k roztavené potravě Diabrotica virgifera virgifera.

Leptinotarsa decemlineata: provedou se naředění supematantu kultury AB78 pěstované po dobu 24- 36 hodin v přípravku Triton X-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. Kousky listů bramboru o ploše 5 cm² se ponoří do těchto roztoků, usuší se proudem vzduchu a umístí se na navlhčený filtrační papír v umělohmotných miskách. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na kousky listů a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-5 dnů.

Tenebrio molitor: provedou se zředění supematantu kultury AB78 po kultivaci 24 - 36 hodin, zředěný supematant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Bioserv č. F9240) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do umělohmotných misek. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6-8 dnů.

Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Maduca sexta a Spodoptera exigua: provedou se naředění supematantu kultury AB78 pěstované po dobu 24- 36 hodin v TX-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. 100 ml se pipetuje na povrch 18 cm² ztuhlé umělé potravy (Bioserv č. F9240) a nechá se uschnout na vzduchu. Čerstvě vylíhlé larvy se poté umístí na povrch potravy a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-6 dnů.

Culex pipiens: provedou se naředění supematantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 -36 hodin. 100 ml se pipetuje do 10 ml vody v umělohmotné nádobě o objemu 30 ml. Do

-17CZ 290301 B6 vody se přidají larvy třetího instaru a teplota se udržuje na teplotě místnosti. Mortalita se stanoví po uplynutí 24 - 48 dnů.

Spektrum entomocidní aktivity AB78 je uvedené v tabulce 14

Tabulka 14

Aktivita supematantu kultury AB78 proti různým hmyzím škůdcům

testovaný druh hmyzu	řád	aktivita
Diabrotica virgifera virgifera	Coleoptera	+++
Diabrotica longicomis barberi	Coleoptera	+++
Diabrotica undecimpunctata howardi	Coleoptera	-
Leptinotarsa decemíineata	Coleoptera	-
Tenebrio molitor	Coleoptera	-
Ostrinia nibilalis	Lepidoptera	-
Heliothis virescens	Lipidoptera	-
Manduca sexta	Lepidoptera	-
Spodoptera exigua	Lepidoptera	-
Agrotis ipsilon	Leidoptera	-
Culex pipiens	Diptera	-

Nově objevený kmen B. cereus AB78 vykazuje podstatně odlišné spektrum insekticidní aktivity ve srovnání se známými δ-endotoxiny zBt aktivními proti broukům AB78 zejména vykazuje selektivnější aktivitu proti broukům než známé kmeny Bt aktivní proti broukům, jelikož je specificky aktivní proti Diabrotica spp. Přesněji, je nejaktivnější proti Diabrotica virgifera virgifera a D. longicomis barberi, ale nikoli proti D. undecimpunctata howardi.

U řady kmenů Bacillus byla biologicky testována jejich aktivita v průběhu vegetativního růstu proti Diabrotica virgifera virgifera (Dw) - viz tabulka 15. Výsledky svědčí o tom, že AB78 je jedinečný svou aktivitou proti D. virgifera virgifera, která není obecným jevem.

Tabulka 15

Aktivita supematantů kultur různých kmenů Bacillus spp. proti Diabrotica virgifera virgifera (Dw)

kmen Bacillus	procento mortality Dw
B. cereus AB78 (Bat.l)	100
B. cereus AB78 (Bat.2)	100
B. cereus (Carolina Bio.)	12
B. cereus ATCC 11950	12
B. cereus ATCC 14579	8
B. myocides (Carolina Bio.)	30
B. popilliae	28
B. thuringiensis HD 135	41
B. thuringiensis HD 191	9
B. thuringiensis GC 91	4
B. thuringiensis isrealensis	24
voda (kontrola)	4

Specifická aktivita AB78 proti Diabrotica virgifera virgifera je uvedena v tabulce 16.

-18CZ 290301 B6

Tabulka 16

Aktivita supematantu kultury AB78 proti čerstvě narozeným larvám Diabrotica virgifera virgifera (Dw)

koncentrace supematantu kultury (μΐ / ml)	procento mortality Dw
100	100
25	87
10	80
5	40
2,5	20
1	6
0	0

Bylo vypočítáno, že hodnota LC₅₀ činí 6,2 μΐ supematantu kultury na ml potravy Diabrotica virgifera virgifera.

Příklad 4

Izolace a purifikace proteinu aktivního proti druhům rodu Diabrotica z AB78

Nasycení kultivačního média prostého buněk a zbytků buněk se upraví na 70 % přidáním 472 g /1 pevného síranu amonného. Rozpuštění se provede při teplotě místnosti, následuje ochlazení v ledové lázni a centrifugace při 10 000 g po dobu 30 minut, čímž se získá peleta vysrážených proteinů.

Supematant se odstraní a peleta se rozpustí v jedné desetině působného objemu 20mM TRIS-HC1 při pH 7,5.

Rozpuštěná peleta se odsolí buďto dialýzou v 20mM TRIS-HC1 při pH 7,5, nebo tak, že se nechá projít odsolovací kolonou.

Odsolený materiál se titruje na pH 3,5 20mM natrium-citrátem o pH 2,5. Po třicetiminutové inkubaci při teplotě místnosti se roztok centrifuguje při 3000 g po dobu 10 minut. Supematant v této době obsahuje největší množství aktivního proteinu.

Po neutralizaci pH na hodnotu 7,0 se supematant nanese na anexovou kolonu Mono-Q ekvilibrovanou s 20mM TRIS o pH 7,5, s rychlostí průtoku 300 ml / min. Kolona se promývá postupným a lineárním gradientem za použití 400mM chloridu sodného v 20mM TRIS o pH 7,5.

Pro stanovení aktivních frakcí se použijí biologické testy jednotlivých frakcí z kolony a elektroforéza v SDS-polyakrylamidovém gelu. Analýzou pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu se zjistí, že biologicky aktivní protein má molekulovou hmotnost v rozmezí okolo 80 kDa.

Příklad 5

Analýza sekvence proteinu aktivního proti druhům rodu Diabrotica

Protein o molekulové hmotnosti 80 kDa izolovaný pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu se Přenese na poly(vinylidenfluoridovou membránu a podrobí se N-koncovému

-19CZ 290301 B6 sekvenování prováděnému pomocí opakovaných Edmanových cyklů na sekvenátoru ABI 470 pulsed-liuqid sequencer. Přenos se provádí v lOmM CAPS-pufru s 10 % methanolu o pH 11,0 následujícím způsobem:

Po dobu 5 minut se provádí inkubace gelu po elektroforéze v přenosovém pufru.

Poly(vinylidenfluoridová) membrána ProBlott se krátce namočí 100% methanolem a poté se ekvilibruje v přenosovém pufru.

Materiál se vrstevnatě uspořádá mezi pěnovými houbami a čtverečky filtračního papíru s uspořádáním katoda-gel-membrána-anoda.

Po dobu 1 hodiny se provádí přenos konstantním napětím 70 V.

Po přenosu se membrána promyje vodou a barví se po dobu 2 minut 0,25% modří Coomassie Blue R.-250 v 50% methanolu.

Odbarvení se provede několikerým promytím směsi obsahující 50 % methanolu, 40 % vody a 10 % kyseliny octové.

Po odbarvení se membrána usuší proudem vzduchu poté se vyříznou pásy pro sekvenační analýzu. Pro dosažení maximální účinnosti a výtěžku se použije BlottCartridge a příslušné cykly. Provede se analýza údajů za použití softwaru model 610 Sequence Analysis pro identifikaci a kvantifikaci aminokyselin derivovaných fenylthiohydantoinem, v každém sekvenačním cyklu.

Bylo zjištěno, že N-koncová sekvence je následující:

NH2-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro(SEQ ID č. 8), kde Asx znamená Asp nebo Asn.

Příklad 6

Konstrukce DNA-sondy

Připraví se oligonukleotidová sonda pro oblast genu kódující aminokyseliny 3-9 N-koncové sekvence (příklad 5). Sonda se syntetizuje na základě znalosti použití kodonů genu δ-endotoxinu z Bacillus thuringiensis (Bt). Jako sonda v Southemových hybridizacích se použije nukleotidová sekvence

5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID č. 9)

Oligonukleotid se syntetizuje za použití standardních postupů a zařízení.

Příklad 7

Stanovení izoelektrického bodu proteinu aktivního proti druhům rodu Diabrotica

Purifikovaný protein ze stupně 5 purifikačního postupu se analyzuje na 3 - 9 pl izoelektrickém fokusačním gelu za použití elektroforézního systému Phastgel (Pharmacia). Standardní postupy ovládání jednotky se použijí jak při separaci, tak při vyvíjení stříbrného obarvení. Hodnota pl se stanoví přibližně 4,9.

-20CZ 290301 B6

Příklad 8

Údaje o analýze AB78 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR)

Pro ověření, že kmen B. cereus AB78 neobsahuje žádné geny insekticidních krystalických proteinů B. thuringiensis nebo B. sphaericus byla použita analýza pomocí polymerázové řetězové reakce (viz například americká patentová přihláška č. 08/008 006, a Carozzí a kol. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 (): 3057 - 3061. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka 17

Primery genů insekticidních krystalických proteinů Bacillus testované pomocí polymerázové řetězové reakce proti DNA z AB78

testované primery	produkován produkt
2 sady specifické pro CrylIIA	negativní
CrylIIB	negativní
2 sady specifické pro CrylA	negativní
CrylA(a)	negativní
CrylA(b) specifický	negativní
CrylB	negativní
CiylC specifický	negativní
CrylE specifický	negativní
2 sady specifické pro B. sphaericus	negativní
2 sady specifické pro CrylV	negativní
kontrola Bacillus (PI-PLC)	pozitivní

Příklad 9

Klonování pomocí kosmidů celkové DNA z kmene B. cereus AB78

Gen VIP-1 byl klonován z celkové DNA připravené z kmene AB78 následujícím způsobem:

Izolace DNA z AB78 se provede následovně:

1. Bakterie se nechají růst přes noc v 10 ml média L-broth (za použití sterilní centrifiigační zkumavky o objemu 50 ml).

2. Přidá se 25 ml čerstvého média L-broth a 30 mg / ml ampicilinu.

3. Buňky se nechají růst po dobu 2-6 hodin na třepačce při teplotě 30 °C.

4. Buňky se odstředí v polypropylenové kyvetě s oranžovým uzávěrem o objemu 50 ml ve stolní klinické centrifuze IEC při 3/4 rychlosti.

5. Peleta buněk se resuspenduje v 10 ml TES (2-[[tris(hydroxymethyl)methyl]amino]-lethansulfonová kyselina).

6. Přidá se 30 mg lyzozymu a provede se inkubace po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C.

7. Přidá se 200 ml 20% SDS (sodná sůl dodecylsulfátu) a 400 ml Proteinázy K (20 mg / ml) a provádí se inkubace při teplotě 37 °C.

-21 CZ 290301 B6

8. Přidá se 200 ml čerstvě Proteinázy K a provádí se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 55 °C. Přidá se 5 ml TES (TES = 50 mM, pH 8,0, 100 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 15 mM chloridu sodného) pro dosažení konečného objemu 15 ml.

9. Provede se dvakrát extrakce fenolem (10 ml fenolu, centrifugace se provádí při teplotě místnosti při 3/4 rychlosti ve stolní klinické centrifuze IEC). Supematant (vrchní část) se přenese do čisté zkumavky pomocí pipety s velkým průměrem.

10. Provede se jednou extrakce směsí, kterou tvoří v objemovém poměru 1 : 1 fenol a chloroform s izoamylalkoholem (v poměru 24 : 1).

11. DNA se vysráží stejným objemem studeného izopropanolu. Provede se centrifugace, kterou se vytvoří peleta DNA.

12. Peleta se resuspenduje v 5 ml TE.

13. DNA se vysráží 0,5 ml 3M octanu sodného o pH 5,2 a 11 ml 95% ethanolu. Směs se umístí na 2 hodiny do -20 °C.

14. DNA se vyjme ze zkumavky umělohmotným očkem, přenese se do kyvety pro mikrocentrifugaci, odstředí se, odpipetuje se nadbytek ethanolu, a vysuší se ve vakuu.

15. DNA se resuspenduje v 0,5 ml TE. Provede se inkubace po dobu 90 minut při teplotě 65 °C, pro usnadnění převedení DNA zpět do roztoku.

16. Za použití standardních postupů se stanoví koncentrace.

Klonování AB78 pomocí kosmidů:

Všechny postupy, pokud není uvedeno jinak, se provádějí podle instrukčního manuálu firmy Stratagene (Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, kat. č. 251301).

Obecně se provedou následující kroky:

A. DNA AB78 se částečně rozštěpí Sau 3A.

B. Připraví se vektorová DNA.

C. Provede se ligace a packaging (sbalení) DNA.

D. Vytvoří se kosmidová knihovna:

1. Vytvoří se kultura buněk HB101 tak, že se umístí 50 ml kultury pěstované přes noc do 5 ml TB s 0,2 % maltosy. Kultura se inkubuje po dobu 3,5 hodiny při teplotě 37 °C.

2. Buňky se odstředí a resuspendují v 0,5 ml lOmM síranu hořečnatého.

3. Smíchá se:

100 ml buněk,

100 ml naředěné směsi se sbalenou DNA,

100 ml lOmM síranu hořečnatého, ml TB.

4. Provede se adsorbce při teplotě místnosti po dobu 30 minut, přičemž se směs nemíchá.

-22CZ 290301 B6

5. Přidá se 1 ml TB a směs se mírně míchá. Provádí se inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C.

6. 200 ml se nanese na destičky L-amp. Provádí se inkubace při teplotě 37 °C přes noc.

Alespoň u 400 kosmidových klonů byla zkoumána aktivita proti Diabrotica virgifera virgifera jak je popsáno v příkladu 3. DNA z 5 aktivních klonů a 5 neaktivních klonů byla použita v Southemových hybridizacích. Výsledky svědčí o tom, že hybridizace za použití výše popsané oligonukleotidové sondy je v korelaci s aktivitou proti Diabrotica virgifera virgifera (viz tabulka 18).

Kosmidové klony P3-12 a P5-4 byly uloženy v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) a byla jim přidělena čísla B-21061 a B-21059.

Tabulka 18

Aktivita kosmidových klonů AB78 proti Diabrotica virgifera virgifera

klon	průměrné procento mortality (N=4)
klony které hybridizují se sondou
Pl-73	47
Pl-83	64
P2-2	69
P3-12	85
P5-4	97
klony které nehybridizují se sondou
Pl-2	5
P3-8	4
P3-9	12
P3-18	0
P4-6	9

Příklad 10

Identifikace oblasti o velikosti 6 kb aktivní proti Diabrotica virgifera virgifera

DNA zP3-12 byla částečně rozštěpena pomocí restrikčního enzymu Sau 3 A a ligována do vektoru pUC19 pro E. coli a transformována v E. coli. DNA-sonda specifická pro protein o molekulové hmotnosti 80 kDa byla syntetizována amplifikaci části DNA P3-12 pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Za použití částečné aminokyselinové sekvence proteinu o molekulové hmotnosti 80 kDa byly syntetizovány oligonukleotidy MK113 a MK117, které hybridizují s částmi VIP-1. Pomocí hybridizace na koloně sPCR-sondou byly identifikovány plazmidové subklony a testována jejich aktivita pro Diabrotica virgifera virgifera. Jeden z těchto klonů, PL2, hybridizuje s PCR-fragmentem, a je v dříve popsaném testu aktivní proti Diabrotica virgifera virgifera.

Restrikční fragment Cla I o velikosti 6 kb z PL2 byl klonován do místa Srna I kyvadlového vektoru (shuttle vector) pHT 3101 pro E. coli - Bacillus (Lereclus, D. a kol., 1989, FEMS

-23CZ 290301 B6

Microbiology Letters 60: 211 - 218), čímž byl získán pCIB6201. Tento konstrukt dodává aktivitu proti Diabrotica virgifera virgifera jak kmenům Bacillus tak E. coli, v libovolné orientaci.

pCIB6022 obsahuje stejný fragment Cla I o velikosti 6 kb ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene), produkuje ekvivalentní protein (stanoveno pomocí western blottingu) a je rovněž aktivní proti Diabrotica virgifera virgifera.

Nukleotidová sekvence pCIB6022 byla určena pomocí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, kteiý popsali Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977), za použití sekvenační soupravy PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenační soupravy PRISM Sequenase Terminátor DoubleStranded DNA Sequencing Kit, a analyzována na automatickém sekvenátoru AB1 373. Sekvence je uvedena jako SEQ ID č. 1. pCIB6022 byl uložen v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21222.

Příklad 11

Funkční štěpení oblasti DNA VIP-1

Pro ověření, že je otevřený čtecí rámec (ORF) VIP-1 nutný pro insekticidní aktivitu, byla v genu vytvořena mutace měnící translační rámec. Restrikční enzym Bgl II poznává jedinečné místo umístěné 1758 bp v kódující oblasti VIP-1. pCIB6201 byl rozštěpen Bgl II a jednovlákné konce doplněny DNA-polymerázou (Klenow fragmentem) a dNTPS. Plazmid byl zpětně ligován a transformován do E. coli. Výsledný plazmid, pCIB6203, obsahuje čtyři nukleotidové inzerce v kódující oblasti VIP-1. pCIB6203 nedodává insekticidní aktivitu, což potvrzuje, že VIP-1 je nezbytnou složkou aktivity proti Diabrotica virgifera virgifera.

Pro další definování oblasti nutné pro kódování VIP-1 byly zkonstruovány subklony z VIP-1 aVIP-2 (pomocný protein) a byla testována jejich schopnost doplnit mutaci vpCIB6203. pCIB6023 obsahuje fragment Xba I - EcoRV o velikosti 3,7 kb ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene). Analýza pomocí western blottingu svědčí o tom, že pCIB6023 produkuje protein VIP-1 o stejné velikosti a ve stejném množství jako klony PL2 a pCIB6022. pCIB6023 obsahuje celý gen pro protein o molekulové hmotnosti 80 kDa. pCIB6023 byl uložen v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21223.

pCIB6023 vykazuje určitou aktivitu proti Diabrotica virgifera virgifera. Úroveň aktivity je však nižší než aktivita pCIB6022. Směs buněk obsahujících pCIB6203 (VIP-1, mutovaný, a VIP-2) a buněk obsahujících pCIB6023 (pouze VIP-1) vykazuje vysokou aktivitu proti Diabrotica virgifera. pCIB6023 tedy musí produkovat funkční produkt genu VIP-1 a pCIB6203 musí produkovat funkční produkt genu VIP-2. Tyto výsledky svědčí o tom, že je pro dodání maximální aktivity proti Diabrotica virgifera virgifera nutný další genový produkt (nebo produkty) z oblasti VIP-2, v kombinaci s VIP-1 (viz tabulka 19).

-24CZ 290301 B6

4->

O $4 a <o

4-> •i“4 > H 4J Ať (15

μ Ať O

OJ OJ O <£>

Charakterizace pCIB 6022

ffl H n O) o (£> ca M

		m
o>	CO	04
o	o	o
OJ	OJ	(£>
<o	ΧΏ	ca
CQ	134	M
H O a	J—i	&

+

o—
ž—“			Γ	ri f
		V	<	: :·
		v.		• :·		£
pH		··	·;	;· >:	·'	£
říj —		•Λ	>	»* ‘l i >	i	£
3—Š 1	1	1 1	i ! !	1 1		i

-25CZ 290301 B6

Legenda k tabulce 19:

Dw = Diabrotica virgifera virgifera

Oblasti v rámečkách představují rozsah VIP-1. Světlejší stínování označuje oblasti kódující peptid o molekulové hmotnosti 80 kDa pozorovaný u Bacillus. Tmavší stínování představuje N-koncové aminokyseliny předpovídané DNA-sekvencí VIP-1. N-koncové aminokyseliny předpovídané DNA-sekvenci VIP-1. Velké „X“ představuje umístění mutace měnící čtecí rámec (posunové mutace) zavedené do VIP-1. Šipky představují konstrukty transkribované beta-galaktózidázovým promotorem.

Restrikční místa: C - Cla I;

X-Xba I;

S - Sca I;

RI-Eco RI;

B-BglII;

RV-EcoRV.

Příklad 12

Tvorba protilátek proti AB78

Ve 2 Lewisových krysách byla vyvolána tvorba protilátek jednak za účelem umožnit tvorbu hybridomatických buněčných linií, jednak rovněž vytvořit dostatečné množství séra pro omezený screening cDNA-knihovny. Dalším faktorem bylo velmi omezené dostupné množství antigenu a skutečnost, že jej bylo možné produkovat v čisté formě pouze pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a následného elektrotransferu na nitrocelulózu.

Vzhledem k omezené dostupnosti antigenu na nitrocelulóze byla nitrocelulóza emulgována v dimethylsulfoxidu a injikována do zadních tlapek zvířat pro vyvolání produkce B-buněk v podkolenních mízních uzlinách bezprostředně proti proudu krve. Pomocí westem-analýzy bylo při prvním produkčním odběru krve produkováno silné reakční sérum. Pomocí několika následných injekcí a odběrů krve bylo vytvořeno dostatečné množství séra pro provedení požadovaného screeningu.

Poté byla u jedné z krys vyvolána tvorba hybridomu. Podkolenní mízní uzlina byla vyříznuta, macerována, a výsledné buňky fúzovány s myším myelomem P3x63Ag8.653. Následující vyhledávací test buněk byl proveden jak je popsáno níže. Čtyři jamky, které vykazovaly nejvyšší reakci na emulgovaný antigen, byly vybrány pro přenesení k omezenému klonování ve zředění. Dalších 10 jamek bylo vybráno pro expanzi a kryoprezervaci.

Postup emulgace AB78 na nitrocelulóze v dimethylsulfoxidu pro screening pomocí ELISA-testu:

Po elektrotransferu vzorků AB78 rozdělených elektroforézou v polyakrylamidovém gelu na nitrocelulózu se použije pro vizualizaci veškerého přeneseného proteinu reverzibilní kmen Ponceaus. Pás odpovídající toxinu AB78, dříve identifikovaný a sekvenovaný od N-konce, se identifikuje a vyřízne z nitrocelulózy. Každý pás má přibližně rozměiy 1 mm x 5 mm za účelem minimalizace množství emulgované nitrocelulózy. Jediný pás se umístí do mikrocentrifugační kyvety s 250 μΐ dimethylsulfoxidu a maceruje se za použití umělohmotného tloučku (Kontes, Vineland, New Jersey). Pro usnadnění emulgace se směs s dimethylsulfoxidem zahřívá po dobu 2 až 3 minut na teplotu 37 °C až 45 °C. Po zahřátí může být nutná další macerace, všechnu nitrocelulózu je však třeba emulgovat. Jakmile je AB78 emulgován, umístí se vorek na led. Při přípravě k nanesení na mikrotitrační destičky s emulgovaným antigenem se vzorek musí naředit

-26CZ 290301 B6 v borátem pufrovaném fyziologickém roztoku v následujících poměrech: 1:5, 1 : 10, 1 : 15, : 20, 1 : 30, 1 : 50, 1 : 100, a 0. Antigen pro nanesení na destičky musí být připraven čerstvý bezprostředně před použitím.

Protokol ELISA-testu:

1. Nanese se AB78 v DMSO naředěný v borátem pufrovaném fyziologickém roztoku. Provede se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.

2. Destičky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

3. Provádí se blokování (1 % BSA (albumin hovězího séra) a 0,05 % povrchově aktivního činidla Tween 20 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem) po dobu 30 minut při teplotě místnosti.

4. Destičky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

5. Přidá se krysí sérum a provede se inkubace po dobu 1,5 hodiny při teplotě 37 °C.

6. Destičky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

7. Přidá se kozí protikrysí v koncentraci 2 pg / ml v ředidle pro ELISA-test. Provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.

8. Destičky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

9. Přidá se kozí protikrysí alkalická fosfatáza v koncentraci 2 pg/ml v ředidle pro ELISA-test. Provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.

10. Destičky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.

11. Přidá se substrát a provede se inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti.

12. Test se zastaví po 30 minutách 3N hydroxidem sodným.

Příklad 13

Aktivace insekticidní aktivity neaktivních kmenů Bt pomocí klonů VIP AB78

Přidání pCIB6203 spolu se supematantem kultury z kmene BtGC9I způsobuje 100% mortalitu u Diabrotica virgifera virgifera. Ani pCIB6203 ani GC91 není samotný aktivitní proti Diabrotica virgifera virgifera. Údaje jsou uvedeny níže:

testovaný materiál	procento mortality Diabrotica
pCIB6203	0
GC91	16
pCIB6203 + GC91	100
kontrola	0

-27CZ 290301 B6

Příklad 14

Izolace a biologická aktivita B. cereus AB8Q1

Druhý kmen B. cereus, označený AB81, byl izolován ze vzorků prachu z nádoby na obilí pomocí standardních postupů. Subkultura AB81 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Biologická aktivita byla vyhodnocena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následuj ící:

testované druhy hmyzu	procento mortality
Ostrinia nubilalis	0
Agrotis ipsilon	0
Diabrotica virgifera virgifera	55

Příklad 15

Izolace a biologická aktivita B. thuringiensis AB6

Kmen B. thuringiensis, označený AB6, byl izolován ze vzorků prachu z nádoby na obilí pomocí standardních postupů známých v oboru. Subkultura AB6 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Polovina vzorku byla autoklávována po dobu 15 minut pro testování přítomnosti β-exotoxinu.

Biologická aktivita byla vyhodnocena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:

testované druhy hmyzu	procento mortality
Ostrinia nubilalis	0
Agrotis ipsilon	100
Agrotis ipsilon (autoklávovaný vzorek)	0
Diabrotica virgifera virgifera	0

Kmen AB6 byl uložen v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21060.

Příklad 16

Izolace a biologická charakterizace B. thuringiensis AB88

Kmen B. thuringiensis, označený AB88, byl izolován ze vzorků prachu z nádoby na obilí pomocí standardních postupů. Subkultura AB88 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Polovina vzorku byla autoklávována po dobu 15 minut pro testování přítomnosti β-exotoxinu. Biologická aktivita proti řadě druhů hmyzu byla vyhodnocena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:

-28CZ 290301 B6

testované druhy hmyzu	řád	procento mortality supematantu kultury
neautoklávováno	autoklávováno
Agrotis ipsilon	Lepidoptera	100	5
Ostrinia nubilalis	Lepidoptera	100	0
Spodoptera frugiperda	Lepidoptera	100	4
Helicoverpa zea	Lepidoptera	100	12
Heliothis virescens	Lepidoptera	100	12
Leptinotarsa
decemlineata	Coleoptera	0	0
Diabrotica virgifera
virgifera	Coleoptera	0	5

Krystaly delta-endotoxinu byly purifikovány z kmene AB88 za použití standardních postupů. Při biologických testech proti Agrotis ipsilon nebyla u čistých krystalů pozorována žádná aktivita.

Příklad 17

Purifíkace vegetativních insekticidních proteinů z kmene AB88

Kapalná kultura bakterií byla nechána růst přes noc při teplotě 30 °C v TB-médiu. Buňky byly odcentrifugovány a byl odebrán supematant. Proteiny byly vysráženy síranem amonným (70% nasycení), centrifugovány a byla odebrána peleta. Tato peleta byla resuspendována v původním objemu 20mM Tris o pH 7,5 a dialyzována proti stejnému pufru. Dialyzát AB88 byl zakalenější než srovnatelný materiál zAB78. Po vyčeření byly separovány proteiny AB88 pomocí několika různých metod, včetně izoelektrické fokusace (Rotofor, BioRad, Hercules, Califomia), precipitace při pH 4,5, chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací chromatografie a ultrafiltrace.

Protein aktivní proti Ostrinia nubilalis zůstal v peletě získané pomocí precipitace dialyzátu při pH 4,5. Po provedení preparativní izoelektrické fokusace dialyzátu za použití amfolytů pH 3 - 10 byla nalezena insekticidní aktivita proti Ostronia nubilalis ve všech frakcích s pH 7 nebo vyšším. Pomocí elektroforézy těchto frakcí v SDS-polyakiylamidovém gelu byly nalezeny pásy proteinů o molekulové hmotnosti přibližně 60 kDa a přibližně 80 kDa. Pásy 60 kDa a 80 kDa byly odděleny pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie na anexu na koloně Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA). N-koncová sekvence byla získána ze dvou frakcí obsahujících proteiny které se mírně lišily molekulovou hmotností, oba však měly velikost přibližně 60 kDa. Získané sekvence si byly navzájem podobné a rovněž byly podobné některým δ-endotoxinům.

anexová frakce 23 (menší): xEPFVSAxxxQxxx (SEQ ID č. 10) anexová frakce 28 (větší): xEYENVEPFVSAx (SEQ ID č. 11)

Pokud byla aktivní peleta získaná precipitací dialyzátu při pH 4,5 dále dělena pomocí anexové kolony a kolony Poros-Q, byla aktivita nalezena pouze ve frakcích s hlavním pásem o molekulové hmotnosti přibližně 60 kDa.

Protein aktivní proti Agrotis ipsilon rovněž zůstával v peletě při okyselení dialyzátu AB88 na pH4,5. Při preparativní izoelektrické fokusaci za použití amfolytů pH 3- 10 aktivita nebyla zjištěna ve frakcích aktivních proti Ostrinia nubilalis, místo toho byla nejvyšší ve frakci o pH 4,5-5,0. Její hlavní složky měly molekulovou hmotnost přibližně 35 kDa a přibližně 80 kDa.

-29CZ 290301 B6

Peleta s pH 4,5 byla rozdělena pomocí vysoceůčinné kapalinové chromatografie na anexu, čímž byly získány frakce obsahující pouze materiál o velikosti 35 kDa a frakce obsahující jak pásy o velikosti 35 kDa tak o velikosti 80 kDa.

Příklad 18

Charakterizace vegetativních insekticidních proteinů AB88

Frakce obsahující vegetativní proteiny aktivní proti různým druhům motýlů byly vytvořeny jak je popsáno v příkladu 17. Analýza aktivních frakcí svědčí o tom, že za aktivitu proti různým druhům z řádu motýlů jsou zodpovědné různé vegetativní insekticidní proteiny (VIP).

Aktivita proti Agrotis ipsilon je způsobena proteinem o velikosti 80 kDa nebo/a proteinem o velikosti 35 kDa, podanými buď jednotlivě, nebo v kombinaci. Tyto proteiny nejsou příbuzné žádným δ-endotoxinům zBt, což dokazuje neexistence sekvenční homologie se známými sekvencemi δ-endotoxinů Bt. Tyto proteiny se rovněž nenacházejí v δ-endotoxinovém krystalu AB88. N-koncové sekvence hlavních δ-endotoxinových proteinů byly srovnány s N-koncovými sekvencemi VIP o velikosti 80 kDa a 35 kDa a nevykazují žádnou sekvenční homologii. Výsledky jsou shrnuty níže:

N-koncová sekvence VIP z Agrotis	N-koncová sekvence hlavních δ-endotoxinových proteinů
	130 kDa MDNNPNINE (SEQ ID č. 14)
80 kDa MNKNNTKLPTRALP (SEQ ID č. 12)	80 kDa MDNNPNINE (SEQ ID č. 15)
	60 kDa MNVLNSGRTTI (SEQ ID č. 16)
35 kDa ALSENTGKDGGYIVP (SEQ ID č. 13)

Aktivita proti Ostrinia nubilalis je způsobena VIP o velikosti 60 kDa a aktivita proti Spodoptera frugiperda je způsobena VIP neznámé velikosti.

Kmen Bacillus thuringiensis AB88 byl uložen v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21225.

Příklad 19

Izolace a biologická aktivita jiných druhů Bacillus sp.

Byly izolovány další druhy rodu Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu proteiny s insekticidní aktivitou. Tyto kmeny byly izolovány ze vzorků jejich životního prostředí pomocí standardních postupů. Byly připraveny izoláty pro biologické testy a byly testovány jak je popsáno v příkladech 2 respektive 3. Izoláty, které produkují v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny aktivní v biologickém testu proti Agrotis ipsilon jsou uvedeny v tabulce níže.

-30CZ 290301 B6

izolát Bacillus	přítomnost δ-endotoxinového krystalu	procento mortality
AB6	+	100
AB53	—	80
AB88	+	100
AB195		60
AB211	—	70
AB217	—	83
AB272	—	80
AB279	—	70
AB289	+	100
AB292	+	80
AB294	—	100
AB300	—	80
AB359	-	100

Izoláty AB289, AB294 a AB359 byly uloženy v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, y byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21227, NRRL B-21229 a NRRL B-21226.

Izoláty Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny aktivní proti Diabrotica virgifera virgifera jsou uvedeny v tabulce níže

izolát Bacillus	přítomnost δ-endotoxinového krystalu	procento mortality
AB52	—	50
AB59		71
AB68	+	60
AB78	-	100
AB122	—	57
AB218	—	64
AB256	-	64

Izoláty AB59 a AB256 byly uloženy v patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21228 a B-21230.

V patentové sbírce kultur střediska zemědělského výzkumu Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA byly uloženy následující kultury:

1. E. coli PL2

2. E. coli pCIB 6022

3. E. coli pCIB 6023

4. Bacillus thuringiensis HD73-78VIP

5. Bacillus thuringiensis AB88

6. Bacillus thuringiensis AB359

7. Bacillus thuringiensis AB289

8. Bacillus sp. AB59

9. Bacillus sp. AB294 přírůstkové číslo NRRL B-21221 přírůstkové číslo NRRL B-21222 přírůstkové číslo NRRL B-21223 přírůstkové číslo NRRL B-21224 přírůstkové číslo NRRL B-21225 přírůstkové číslo NRRL B-21226 přírůstkové číslo NRRL B-21227 přírůstkové číslo NRRL B-21228 přírůstkové číslo NRRL B-21229

-31 CZ 290301 B6 přírůstkové číslo NRRL B-21230 přírůstkové číslo NRRL B-21059 přírůstkové číslo NRRL B-21061 přírůstkové číslo NRRL B-2105 8 přírůstkové číslo NRRL B-21060

10. Bacillus sp. AB256

11. E. coli P5^4

12. E.coliP3-12

13. Bacillus cereus AB78

14. Bacillus thuringiensis AB6

Ačkoli byl vynález v příkladech výše popsán detailně z důvodů ilustrace a jasnosti, je zřejmé, že je možné provést určité změny a modifikace v rámci připojených nároků.

Zobrazení sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 6106 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1082..1810 (D) další informace: produkt = „VIP-2“, označení = ORF-1 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1925..2470 (D) další informace: produkt = „VIP-2“, označení = ORF-2 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:

ATCGATACAA TGTTGTTTTA CTTAGACCGG CTTTACTTTG ATACATTTTA ATAGCCATTT CTCCTTTTTT TCCACGAGCT CTAGCTGCGT TATCTCTTTC TAATTCTGCA atacttgcca tagaggtatc aatgttgtca tgaatagaaa CACTTAACTC AATTAGGTGT TTTGTAGAGC

TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT60

CAACCTTATC AGTATGTTTT TGTGGTCTTC120

TTAATCCTGT TTTGGTACGT TCGCTAATAA180

TCATTCGAAA GAAGAATTTC CCCATAGCAT240

TAAAATCTAC ACCTAGCTCT TTGAATTTTT300

GAGAAATTCG ATCAAGTTTG TAAACAACTA360

-32CZ 290301 B6

TCTTATCGCC TTTACGTAAT ACTTTTAGCA ACTCTTCGAG TTGAGGGCGC TCTTTTTTTA	420
TTCCTGTTAT TTICTCCTGA TATAGCCTTT CTACACCATA TTGTTGCAAA GCATCTATTT	480
GCATATCGAG ATTTTGTTCT TCTGTGCTGA CACGAGCATA ACCAAAAATC AAATTGGTTT	540
CACTTCCTAT CTAAATATAT CTATTAAAAT AGCACCAAAA ACCTTATTAA ATTAAAATAA	600
GGAACTTTGT TTTTGGATAT GGATTTTGGT ACTCAATATG GATGAGTTTT TAACGCTTTT	660
GTTAAAAAAC AAACAAGTGC CATAAACGGT CGTTTTTGGG ATGACATAAT AAATAATCTG	720
TTTGATTAAC CTAACCTTGT ATCCTTACAG CCCAGTTTTA TTTGTACTTC AACTGACTGA	780
ATATGAAAAC AACATGAAGG TTTCATAAAA TTTATATATT TTCCATAACG GATGCTCTAT	840
CTTTAGGTTA TAGTTAAATT ATAAGAAAAA AACAAACGGA GGGAGTGAAA AAAAGCATCT	900
TCTCTATAAT TTTACAGGCT CTTTAATAAG AAGGGGGGAG ATTAGATAAT AAATATGAAT	960
ATCTATCTAT AATTGTTTGC TTCTACAATA ACTTATCTAA CTTTCATATA CAACAACAAA	1020
ACAGACTAAA TCCAGATTGT ATATTCATTT TCAGTTGTTC CTTTATAAAA TAATTTCATA	1080
A ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA	1126

Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu 1 S 10 15

CAA Gin

GTA GTT

ACT Thr

AAA ACT GTA

TTG CTT AGT ACA GTT TTC

TCT ATA

TCT Ser

1174

Val

Val

Lys 20

Thr

val

Leu Leu

Ser 25

Thr

Val

Phe

Ser

Ile 30

TTA

TTA

AAT

AAT

GAA

GTG

ATA

AAA

GCT

GAA

CAA

TTA

AAT

ATA

AAT

TCT

1222

Leu

Leu

Asn

Asn

Glu

Val

Ile

Lys

Ala

Glu

Gin

Leu

Asn

Ile

Asn

Ser

35

40

45

CAA

AGT

AAA

TAT

ACT

AAC

TTG

CAA

AAT

CTA

AAA

ATC

ACT

GAC

AAG

GTA

1270

Gin

Ser

Lys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr

Asp

Lys

Val

50

55

60

GAG

GAT

TTT

AAA

GAA

GAT

AAG

GAA

AAA

GCG

AAA

GAA

TGG

GGG

AAA

GAA

1318

Glu

ASp

Phe

Lys

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

65

70

75

AAA

GAA

AAA

GAG

TGG

AAA

CTA

ACT

GCT

ACT

GAA

AAA

GGA

AAA

ATG

AAT

1366

Lys

GlU

Lys

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

80

85

90

95

AAT

TTT

TTA

GAT

AAT

AAA

AAT

GAT

ATA

NAG

ACA

AAT

TAT

AAA

GAA

ATT

1414

Asn

Phe

Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Xaa

Thr

Asn

Tyř

Lys

G1U

Ile

100

105

110

ACT

TTT

TCT

ATG

GCA

GGC

TCA

TTT

GAA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAT

TTA

AAA

14 62

Thr

Phe

Ser

Met

Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

115

120

125

GAA

ATT

GAT

AAG

ATG

TTT

GAT

AAA

ACC

AAT

CTA

TCA

AAT

TCT

ATT

ATC

1510

Glu

Ile

ASP

Lys

Met

Phe

Asp

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

130

135

140

33CZ 290301 B6

ACC TAT

AAA AAT GTG GAA CCG ACA ACA ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA

Thr

Tyr 145

Lys Asn Val

Glu

Pro Thr 150

Thr Ile

Gly

Phe 155

Asn Lys

Ser

Leu

ACA

GAA

GGT

AAT

ACG

ATT

AAT

TCT

GAT

GCA

ATG

GCA

CAG

TTT

AAA

GAA

Thr

Glu

Gly

Asn

Thr

ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

160

165

170

175

CAA

TTT

TTA

GAT

AGG

GAT

ATT

AAG

TTT

GAT

AGT

TAT

CTA

GAT

ACG

CAT

Gin

Phe

Leu

Asp

Arg

ASp

Ile

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

180

185

190

TTA

ACT

GCT

CAA

CAA

GTT

TCC

AGT

AAA

GAA

AGA

GTT

ATT

TTG

AAG

GTT

Leu

Thr

Ala

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

195

200

205

ACG

GTT

CCG

AGT

GGG

AAA

GGT

TCT

ACT

ACT

CCA

ACA

AAA

GCA

GGT

GTC

Thr

Val

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly

Val

210

215

220

ATT

TTA

AAT

AAT

AGT

GAA

TAC

AAA

ATG

CTC

ATT

GAT

AAT

GGG

TAT

ATG

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

A3n

Gly

Tyr

Met

225

230

235

1558

1506

1654

1702

1750

1798

GTC CAT GTA GAT TAAGGTATCA AAAGTGGTGA AAAAAGGGGG TGGAGTGCCT 1850

Val His Val Asp

240

TACAAATTGA AGGGACTTTA AAAAAGAGTC TTGACTTTAA AAATGATATA AATGCTGAAG

1910

CGCATAGCTG GGGT ATG AAG

AAT TAT GAA GAG TGG GCT AAA GAT TTA ACC

1960

Met 1

Lys

Asn Tyr

Glu 5

Glu Trp Ala Lys

Asp Leu 10

Thr

GAT

TCG

CAA

AGG

GAA

GCT

TTA

GAT

GGG

TAT

GCT

AGG

CAA

GAT

TAT

AAA

2008

Asp

Ser

Gin

Arg

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys

15

20

25

GAA

ATC

AAT

AAT

TAT

TTA

AGA

AAT

CAA

GGC

GGA

AGT

GGA

AAT

GAA

AAA

2056

Glu

Ile

Asn

Asn

Tyr

Leu

Arg

Α3Π

Gin

Gly

Gly

Ser

Gly

Asn

G1U

Lys

30

35

40

CTA

GAT

GCT

CAA

ATA

AAA

AAT

ATT

TCT

GAT

GCT

TTA

GGG

AAG

AAA

CCA

2104

Leu

Asp

Ala

Gin

ile

Lys

Asn

Ile

Ser

Asp

Ala

Leu

Gly

Lys

Lys

Pro

45

50

55

60

ATA

CCG

GAA

AAT

ATT

ACT

GTG

TAT

AGA

TGG

TGT

GGC

ATG

CCG

GAA

TTT

2152

Ile

Pro

Glu

Asn

Ile

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

Met

Pro

Glu

Phe

65

70

75

GGT

TAT

CAA

ATT

AGT

GAT

CCG

TTA

CCT

TCT

TTA

AAA

GAT

TTT

GAA

GAA

2200

Gly

Tyr

Gin

ile

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu

80

85

90

CAA

TTT

TTA

AAT

ACA

ATC

AAA

GAA

GAC

AAA

GGA

TAT

ATG

AGT

ACA

AGC

2248

Gin

Phe

Leu

Asn

Thr

Ile

LyS

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Met

Ser

Thr

Ser

95

100

105

TTA

TCG

AGT

GAA

CGT

CTT

GCA

GCT

TTT

GGA

TCT

AGA

AAA

ATT

ATA

TTA

2296

-34CZ 290301 B6

Leu Ser

Ser

Glu Arg

Leu Ala 115

Ala Phe

Gly

Ser Arg Lys 120

Ile Ile

Leu

110

CGA

TTA

CAA

GTT

CCG

AAA

GGA

AGT

ACG

GGT

GCG

TAT

TTA

AGT

GCC

ATT

2344

Arg

Leu

Gin

val

Pro

Lys

Gly

Ser

Thr

Gly

Ala

Tyr

Leu

Ser

Ala

Ile

125

130

135

140

GGT

GGA

TTT

GCA

AGT

GAA

AAA

GAG

ATC

CTA

CTT

GAT

AAA

GAT

AGT

AAA

2392

Gly

Gly

Phe

Ala

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

145

150

155

TAT

CAT

ATT

GAT

AAA

GTA

ACA

GAG

GTA

ATT

ATT

AAA

GGT

GTT

AAG

CGA

2440

Tyr

His

ile

Asp

Lys

Val

Thr

G1U

Val

Ile

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Arg

160

165

170

TAT

GTA

GTG

GAT

GCA

ACA

TTA

TTA

ACA

AAT

TAAGGAGATG AAAAATATGA

2490

Tyr

Val

Val

Asp

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

175 180

AGAAAAAGTT	AGCAAGTGTT	GTAACGTGTA	CGTTATTAGC	TCCTATGTTT	TTGAATGGAA	2550
ATGTGAATGC	TGTTTACGCA	GACAGCAAAA	CAAATCAAAT	ttctacaaca	CAGAAAAATC	2510
AACAGAAAGA	GATGGACCGA	AAAGGATTAC	TTGGGTATTA	TTTCAAAGGA	AAAGATTTTA	2670
GTAATCTTAC	TATGTTTGCA	CCGACACGTG	ATAGTACTCT	TATTTATGAT	CAACAAACAG	2730
CAAATAAACT	ATTAGATAAA	AAACAACAAG	AATATCAGTC	TATTCGTTGG	ATTGGTTTGA	2790
TTCAGAGTAA	AGAAACGGGA	GATTTCACAT	TTAACTTATC	TGAGGATGAA	CAGGCAATTA	2850
TAGAAATCAA	TGGGAAAATT	ATTTCTAATA	AAGGGAAAGA	AAAGCAAGTT	GTCCATTTAG	2910
aaaaaggaaa	ATTAGTTCCA	ATCAAAATAG	AGTATCAATC	AGATACAAAA	TTTAATATTG	2970
ACAGTAAAAC	ATTTAAAGAA	CTTAAATTAT	TTAAAATAGA	TAGTCAAAAC	CAACCCCAGC	3030
AAGTCCAGCA	AGATGAACTG	AGAAATCCTG	AATTTAACAA	GAAAGAATCA	CAGGAATTCT	3090
TAGCGAAACC	ATCGAAAATA	AATCTTTTCA	CTCAAMAAAT	GAAAAGGGAA	ATTGATGAAG	3150
ACACGGATAC	GGATGGGGAC	TCTATTCCTG	ACCTTTGGGA	AGAAAATGGG	TATACGATTC	3210
AMAATAGAAT	CGCTGTAAAG	TGGGACGATT	CTCTAGCAAG	TAAAGGGTAT	ACGAAATTTG	3270
TTTCAAATCC	actagaaagt	CACACAGTTG	GTGATCCTTA	TACAGATTAT	GAAAAGGCAG	3330
CAAGAGATCT	AGATTTGTCA	AATGCAAAGG	AAACGTTTAA	CCCATTGGTA	GCTGCTTTTC	3390
CAAGTGTGAA	TGTTAGTATG	GAAAAGGTGA	TATTATCACC	AAATGAAAAT	TTATCCAATA	3450
GTGTAGAGTC	TCATTCATCC	ACGAATTGGT	CTTATACAAA	TACAGAAGGT	GCTTCTGTTG	3510
AAGCGGGGAT	TGGACCAAAA	GGTATTTCGT	TCGGAGTTAG	CGTAAACTAT	CAACACTCTG	3570
AAACAGTTGC	ACAAGAATGG GGAACATCTA	CAGGAAATAC	TTCGCAATTC	AATACGGCTT	3630
CAGCGGGATA	TTTAAATGCA	AATGTTCGAT	ATAACAATGT	AGGAACTGGT	GCCATCTACG	3690
ATGTAAAACC	TACAACAAGT	TTTGTATTAA	ATAACGATAC	TATCGCAACT	ATTACGGCGA	3750

-35CZ 290301 B6

AATCTAATTC	TACAGCCTTA	AATATATCTC	CTGGAGAAAG	ttacccgaaa	AAAGGACΑΆΑ	3310
ATGGAATCGC	AATAACATCA	ATGGATGATT	TTAATTCCCA	TCCGATTACA	TTAAATAAAA	3870
AACAAGTAGA	TAATCTGCTA	AATAATAAAC	CTATGATGTT	GGAAACAAAC	CAAACAGATG	3930
GTGTTTATAA	GATAAAAGAT	ACACATGGAA	ATATAGTAAC	TGGCGGAGAA	TGGAATGGTG	3990
TCATACAACA	AATCAAGGCT	AAAACAGCGT	CTATTATTGT	GGATGATGGG	GAACGTGTAG	4050
CAGAAAAACG	TGTAGCGGCA	AAAGATTATG	AAAATCCAGA	AGATAAAACA	CCGTCTTTAA	4110
CTTTAAAAGA	TGCCCTGAAG	CTTTCATATC	CAGATGAAAT	AAAAGAAATA	GAGGGATTAT	4170
TATATTATAA	AAACAAACCG	ATATACGAAT	CGAGCGTTAT	GACTTACTTA	GATGAAAATA	4230
CAGCAAAAGA	AGTGACCAAA	CAATTAAATG	ATACCACTGG	GAAATTTAAA	GATGTAAGTC	4290
ATTTATATGA	TGTAAAACTG	ACTCCAAAAA	TGAATGTTAC	AATCAAATTG	TCTATACTTT	4350
ATGATAATGC	TGAGTCTAAT	GATAACTCAA	TTGGTAAATG	GACAAACACA	AATATTGTTT	4410
CAGGTGGAAA	TAACGGAAAA	AAACAATATT	CTTCTAATAA	TCCGGATGCT	AATTTGACAT	4470
TAAATACAGA	TGCTCAAGAA	AAATTAAATA	AAAATCGTGA	CTATTATATA	AGTTTATATA	4530
TGAAGTCAGA	AAAAAACACA	CAATGTGAGA	TTACTATAGA	TGGGGAGATT	TATCCGATCA	4590
CTACAAAAAC	AGTGAATGTG	AATAAAGACA	ATTACAAAAG	ATTAGATATT	ATAGCTCATA	4650
ATATAAAAAG	TAATCCAATT	TCTTCACTTC	ATATTAAAAC	GAATGATGAA	ATAACTTTAT	4710
TTTGGGATGA	TATTTCTATA	ACAGATGTAG	CATCAATAAA	ACCGGAAAAT	TTAACAGATT	4770
CAGAAATTAA	ACAGATTTAT	AGTAGGTATG	GTATTAAGTT	AGAAGATGGA	atccttattg	4830
ATAAAAAAGG	TGGGATTCAT	TATGGTGAAT	TTATTAATGA	AGCTAGTTTT	AATATTGAAC	4890
CATTGCCAAA	TTATGTGACC	AAATATGAAG	TTACTTATAG	TAGTGAGTTA	GGACCAAACG	4950
TGAGTGACAC	ACTTGAAAGT	GATAAAATTT	ACAAGGATGG	GACAATTAAA	TTTGATTTTA	5010
CCAAATATAG	TAAAAATGAA	CAAGGATTAT	TTTATGACAG	TGGATTAAAT	TGGGACTTTA	5070
AAATTAATGC	ÍATTACTTAT	GATGGTAAAG	AGATGAATGT	TTTTCATAGA	TATAATAAAT	5130
agttattata	TCTATGAAGC	TGGTGCTAAA	GATAGTGTAA	AAGTTAATAT	ACTGTAGGAT	5190
TGTAATAAAA	GTAATGGAAT	tgatatcgta	CTTTGGAGTG	GGGGATACTT	TGTAAATAGT	5250
TCTATCAGAA	ACATTAGACT	AAGAAAAGTT	ACTACCCCCA	CTTGAAAATG	AAGATTCAAC	5310
TGATTACAAA	CAACCTGTTA	AATATTATAA	GGTTTTAACA	AAATATTAAA	CTGTTTATGT	5370
TAATACTGTA	atataaagag	TTTAATTGTA	TTCAAATGAA	GCTTTCCCAC	AAAATTAGAC	5430
TGATTATCTA	ATGAAATAAT	CAGTCTAATT	TTGTAGAACA	GGTCTGGTAT	TATTGTACGT	5490
GGTCACTAAA	AGATATCTAA	TATTATTGGG	CAAGGCGTTC	CATGATTGAA	TCCTCGAAŤG	5550

-36CZ 290301 B6

TCTTGCCCTT	TTCATTTATT	TAAGAAGGAT	TGTGGAGAAA	TTATGGTTTA	GATAATGAAG	5610
AAAGACTTCA	CTTCTAATTT	TTGATGTTAA	ATAAATCAAA	ATTTGGCGAT	TCACATTGTT	5670
TAATCCACTG	ATAAAACATA	CTGGAGTGTT	CTTAAAAAAT	CAGCTTTTTT	CTTTATAAAA	5730
TTTTGCTTAG	CGTACGAAAT	TCGTGTTTTG	TTGGTGGGAC	CCCATGCCCA	TCAACTTAAG	5790
AGTAAATTAG	TAATGAACTT	TCGTTCATCT	GGATTAAAAT	AACCTCAAAT	TAGGACATGT	5850
TTTTAAAAAT	AAGCAGACCA	AATAAGCCTA	GAATAGGTAT	CATTTTTAAA	AATTATGCTG	5910
CTTTCTTTTG	TTTTCCAAAT	CCATTATACT	CATAAGCAAC	ACCCATAATG	TCAAAGACTG	5970
TTTTTGTCTC	ATATCGATAA	GCTTGATATC	GAATTCCTGC	AGCCCGGGGG	ATCCACTAGT	6030
TCTAGAGCGG	CCGCCACCGC	GGTGGAGCTC	CAGCTTTTGT	TCCCTTTAGT	GAGGGTTAAG	6090
TTCGAGCTTG	TCGTGG					6106

Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 243 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:

Met 1

Lys

Arg

Met

Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu Gin

5

10

15

Val

Val

Thr

Lys

Thr

Val

Leu

Leu

Ser

Thr

Val

Phe

Ser

Ile

Ser

Leu

20

25

30

Leu

Asn

Asn

Glu

Val

Ile

Ly3

Ala

Glu

Gin

Leu

Asn

Ile

Asn

Ser

Gin

35

40

45

Ser

Lys

Tyr

Thr

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Lys

Ile

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

50

55

60

Asp

Phe

Lys

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Ala

Lys

Glu

Trp

Gly

Lys

Glu

Lys

65

70

75

80

Glu

Lys

Glu

Trp

Lys

Leu

Thr

Ala

Thr

Glu

Lys

Gly

Lys

Met

Asn

Asn

85

90

95

Phe

Leu

Asp

Asn

Lys

Asn

Asp

Ile

Xaa

Thr

Asn

Tyr

Lys

Glu

Ile

Thr

100

105

110

Phe

Ser

Met

Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

Asp

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Glu

115 120 125

-37CZ 290301 B6

ile

Asp 130

Lys

Met

Phe

Asp

Lys 135

Thr

Asn

Leu

Ser

Asn 140

Ser

Ile

Ile

Thr

Tyr

Lys

Asn

Val

Glu

Pro

Thr

Thr

Ile

Gly

Phe

Asn

Lys

Ser

Leu

Thr

145

150

155

160

Glu

Gly

Asn

Thr

Ile

Asn

Ser

Asp

Ala

Met

Ala

Gin

Phe

Lys

Glu

Gin

165

170

175

Phe

Leu

Asp

Arg

Asp

ile

Lys

Phe

Asp

Ser

Tyr

Leu

Asp

Thr

His

Leu

180

185

190

Thr

Ala

Gin

Gin

Val

Ser

Ser

Lys

Glu

Arg

Val

Ile

Leu

Lys

Val

Thr

195

200

205

val

Pro

Ser

Gly

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Pro

Thr

Lys

Ala

Gly.Val

Ile

210

215

220

Leu

Asn

Asn

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met

Leu

Ile

Asp

Asn

Gly

Tyr

Met

Val

225

230

235

240

His Val Asp

Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 182 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein o

(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:

Met 1

Lys Asn

Tyr Glu 5

Glu Trp Ala

Lys

Asp 10

Leu Thr Asp

Ser Gin Arg 15

Glu

Ala

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ala

Arg

Gin

Asp

Tyr

Lys

Glu

Ile

Asn

Asn

20

25

30

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gin

Gly

Gly

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

Leu

Asp

Ala

Gin

35

40

45

Ile

Lys

Asn

Ile

Ser

Asp

Ala

Leu

Gly

Lys

Lys

Pro

Ile

Pro

Glu

Asn

50

55

60

Ile

Thr

Val

Tyr

Arg

Trp

Cys

Gly

Met

Pro

Glu

Phe

Gly

Tyr

Gin

Ile

65

70

75

80

Ser

Asp

Pro

Leu

Pro

Ser

Leu

Lys

Asp

Phe

Glu

Glu

Gin

Phe

Leu

Asn

85

90

95

Thr

Ile

Lys

Glu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Met

Ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Ser

Glu

100

105

110

Arg

Leu

Ala

Ala

Phe

Gly

Ser

Arg

Lys

Ile

Ile

Leu

Arg

Leu

Gin

Val

115

120

125

-38CZ 290301 B6

Pro Lys Gly 130

Ser Thr

Gly

Ala Tyr Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala

135

140

Ser

Glu

Lys

Glu

Ile

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Ser

Lys

Tyr

His

Ile

Asp

145

150

155

160

Lys

Val

Thr

Glu

Val

Ile

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Arg

Tyr

Val

Val

Asp

165

170

175

Ala

Thr

Leu

Leu

Thr

Asn

180

Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-2105 8 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1..2652 (C) způsob identifikace: experimentální (D) další informace: produkt = „protein VIP-1 o velikosti 100 kDa“, důkaz = experimentální (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:

ATG AAA AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACG TGT ACG TTA 48

Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu AXa Ser Val Val Thr Cys Thr Leu

10 15

-39CZ 290301 B6

TTA GCT CCT ATG TTT Leu Ala Pro Met Phe 20

TTG AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT TAC GCA GAC

96

Leu

Asn Gly Asn 25

Val Asn Ala

Val Tyr 30

Ala Asp

AGC

AAA

. ACA

. AAT

CAA

ATT

TCT

ACA

ACA

CAG

AAA

AAT

CAA

CAG

AAA

GAG

144

Ser

Lys

Thr

Asn

Gin

ile

Ser

Thr

Thr

Gin

Lys

Asn

Gin

Gin

Lys

Glu

35

40

45

ATG

GAC

CGA

AAA

GGA

TTA

CTT

GGG

TAT

TAT

TTC

AAA

GGA

AAA

GAT

TTT

192

Met

Asp

Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly

Lys

Asp

Phe

50

55

60

AGT

AAT

CTT

ACT

ATG

TTT

GCA

CCG

ACA

CGT

GAT

AGT

ACT

CTT

ATT

TAT

240

Ser

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser

Thr

Leu

Ile

Tyr

65

70

75

80

GAT

CAA

CAA

ACA

GCA

AAT

AAA

CTA

TTA

GAT

AAA

AAA

CAA

CAA

GAA

TAT

288

Asp

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin

Gin

Glu

Tyr

85

90

95

CAG

TCT

ATT

CGT

TGG

ATT

GGT

TTG

ATT

CAG

AGT

AAA

GAA

ACG

GGA

GAT

336

Gin

Ser

Ile

Arg

Trp

Ile

Gly

Leu

Ile

Gin

Ser

Lys

Glu

Thr

Gly

Asp

100

105

110

TTC

ACA

TTT

AAC

TTA

TCT

GAG

GAT

GAA

CAG

GCA

ATT

ATA

GAA

ATC

AAT

384

Phe

Thr

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Asp

Glu

Gin

Ala

Ile

Ile

Glu

Ile

Asn

115

120

125

GGG

AAA

ATT

ATT

TCT

AAT

AAA

GGG

AAA

GAA

AAG

CAA

GTT

GTC

CAT

TTA

432

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

His

Leu

130

135

140

GAA

AAA

GGA

AAA

TTA

GTT

CCA

ATC

AAA

ATA

GAG

TAT

CAA

TCA

GAT

ACA

480

Glu

Lys

Gly

Lys

Leu

Val

Pro

Ile

Lys

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr

145

150

155

160

AAA

TTT

AAT

ATT

GAC

AGT

AAA

ACA

TTT

AAA

GAA

CTT

AAA

TTA

TTT

AAA

523

Lys

Phe

Asn

Ile

Asp

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Phe

Lys

165

170

175

ATA

GAT

AGT

CAA

AAC

CAA

CCC

CAG

CAA

GTC

CAG

CAA

GAT

GAA

CTG

AGA

576

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin

Val

Gin

Gin

Asp

Glu

Leu

Arg

180

185

190

AAT

CCT

GAA

TTT

AAC

AAG

AAA

GAA

TCA

CAG

GAA

TTC

TTA

GCG

AAA

CCA

624

Asn

Pro

Glu Phe

Asn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu

Ala

Lys

Pro

195

200

205

TCG

AAA

ATA

AAT

CTT

TTC

ACT

CAA

MAA

ATG

AAA

AGG

GAA

ATT

GAT

GAA

672

Ser

Lys

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr

Gin

xaa

Met

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp

Glu

210

215

220

GAC

ACG

GAT

ACG

GAT

GGG

GAC

TCT

ATT

CCT

GAC

CTT

TGG

GAA

GAA

AAT

720

ASp

Thr

Asp

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

225

230

235

240

GGG

TAT

ACG

ATT

CAM

AAT

AGA

ATC

GCT

GTA

AAG

TGG

GAC

GAT

TCT

CTA

7 68

Gly

Tyr

Thr

Ile

Xaa

Asn

Arg

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Asp

ASp

Ser

Leu

245

250

255

-40CZ 290301 B6

GCA AGT AAA

GGG TAT ACG AAA TTT GTT TCA AAT CCA CTA GAA AGT CAC

816

Ala

Ser Lys

Gly 260

Tyr Thr Lys

Phe

Val Ser 265

Asn Pro Leu

Glu 270

Ser

His

ACA

GTT

GGT

GAT

CCT

TAT

ACA

GAT

TAT

GAA

AAG

GCA

GCA

AGA

GAT

CTA

864

Thr

Val

Gly

ASp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu

275

280

285

GAT

TTG

TCA

AAT

GCA

AAG

GAA

ACG

TTT

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT

GCT

TTT

912

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

val

Ala

Ala

Phe

290

295

300

CCA

AGT

GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA

AAG

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA

AAT

GAA

960

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

305

310

315

320

AAT

TTA

TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT

CAT

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG

TCT

TAT

1008

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

325

330

335

ACA

AAT

ACA

GAA

GGT

GCT

TCT

GTT

GAA

GCG

GGG

ATT

GGA

CCA

AAA

GGT

1056

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly

340

345

350

ATT

TCG

TTC

GGA

GTT

AGC

GTA

AAC

TAT

CAA

CAC

TCT

GAA

ACA

GTT

GCA

1104

Ile

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

355

360

365

CAA

GAA

TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA

AAT

ACT

TCG

CAA

TTC

AAT

ACG

GCT

1152

Gin

Glu

Trp Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

370

375

380

TCA

GCG

GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT

GTT

CGA

TAT

AAC

AAT

GTA

GGA

ACT

1200

Ser

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

385

390

395

400

GGT

GCC

ATC

TAC

GAT

GTA

AAA

CCT

ACA

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA

AAT

AAC

1248

Gly

Ala

ile

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

405

410

415

GAT

ACT

ATC

GCA

ACT

ATT

ACG

GCG

AAA

TCT

AAT

TCT

ACA

GCC

TTA

AAT

1296

Asp

Thr

Ile

Ala

Thr

ne

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

420

425

430

ATA

TCT

CCT

GGA

GAA

AGT

TAC

CCG

AAA

AAA

GGA

CAA

AAT

GGA

ATC

GCA

1344

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile

Ala

435

440

445

ATA

ACA

TCA

ATG

GAT

GAT

TTT

AAT

TCC

CAT

CCG

ATT

ACA

TTA

AAT

AAA

1392

Ile

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

450

455

460

AAA

CAA

GTA

GAT

AAT

CTG

CTA

AAT

AAT

AAA

CCT

ATG

ATG

TTG

GAA

ACA

1440

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn

Lys

Pro

Met

Met

Leu

Glu

Thr

465

470

475

480

AAC

CAA

ACA

GAT

GGT

GTT

TAT

AAG

ATA

AAA

GAT

ACA

CAT

GGA

AAT

ATA

1488

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly

val

Tyr

Lys

Ile

Lys

Asp

Thr

His

Gly

Asn

Ile

485

490

495

-41 CZ 290301 B6

GTA ACT GGC GGA GAA TGG AAT GGT GTC ATA CAA CAA ATC AAG GCT

AAA Lys

1536

Val Thr

Gly Gly 500

Glu

Trp

Asn

Gly

Val 505

Ile

Gin

Gin

Ile

Lys 510

Ala

ACA

GCG

TCT

ATT

ATT

GTG

GAT

GAT

GGG

GAA

CGT

GTA

GCA

GAA

AAA

CGT

1584

Thr

Ala

Ser

ile

Ile

Val

Asp

Asp

Gly

Glu

Arg

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

515

520

525

GTA

GCG

GCA

AAA

GAT

TAT

GAA

AAT

CCA

GAA

GAT

AAA

ACA

CCG

TCT

TTA

1632

Val

Ala

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Ser

Leu

530

535

540

ACT

TTA

AAA

GAT

GCC

CTG

AAG

CTT

TCA

TAT

CCA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAA

1680

Thr

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asp

Glu

Ile

Lys

Glu

545

550

555

560

ATA

GAG

GGA

TTA

TTA

TAT

TAT

AAA

AAC

AAA

CCG

ATA

TAC

GAA

TCG

AGC

1728

Ile

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

Asn

Lys

Pro

Ile

Tyr

G1U

Ser

Ser

565

570

575

GTT

ATG

ACT

TAC

TTA

GAT

GAA

AAT

ACA

GCA

AAA

GAA

GTG

ACC

AAA

CAA

1776

Val

Mez

Thr

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Gin

580

585

590

•TTA

AAT

GAT

ACC

ACT

GGG

AAA

TTT

AAA

GAT

GTA

AGT

CAT

TTA

TAT

GAT

1824

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

595

600

605

GTA

AAA

CTG

ACT

CCA

AAA

ATG

AAT

GTT

ACA

ATC

AAA

TTG

TCT

ATA

CTT

1872

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

Thr

Ile

Lys

Leu

Ser

ile

Leu

610

615

620

TAT

GAT

AAT

GCT

GAG

TCT

AAT

GAT

AAC

TCA

ATT

GGT

AAA

TGG

ACA

AAC

1920

Tyr Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Ile

Gly

Lys

Trp

Thr

Asn

625

630

635

640

ACA

AAT

ATT

GTT

TCA

GGT

GGA

AAT

AAC

GGA

AAA

AAA

CAA

TAT

TCT

TCT

1968

Thr

Asn

Ile

Val

Ser

Gly

Gly

Asn

Asn

Gly

Lys

Lys

Gin

Tyr

Ser

Ser

645

650

655

AAT

AAT

CCG

GAT

GCT

AAT

TTG

ACA

TTA

AAT

ACA

GAT

GCT

CAA

GAA

AAA

2016

Asn

Asn

Pro

ASP

Ala

Asn

Leu

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

660

665

670

TTA

AAT

AAA

AAT

CGT

GAC

TAT

TAT

ATA

AGT

TTA

TAT

ATG

AAG

TCA

GAA

2064

Leu

Asn

Lys

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr

Ile

Ser

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser

Glu

675

680

685

AAA

AAC

ACA

CAA

TGT

GAG

ATT

ACT

ATA

GAT

GGG

GAG

ATT

TAT

CCG

ATC

2112

Lys

Asn

Thr

Gin

Cys

G1U

Ile

Thr

Ile

Asp

Gly

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ile

690

695

700

ACT

ACA

AAA

ACA

GTG

AAT

GTG

AAT

AAA

GAC

AAT

TAC

AAA

AGA

TTA

GAT

2160

Thr

thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Asn

Lys

Asp

Asn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

705

710

715

720

ATT

ATA

GCT

CAT

AAT

ATA

AAA

AGT

AAT

CCA

ATT

TCT

TCA

CTT

CAT

ATT

2208

Ile

Ile

Ala

His

Asn

Ile

Lys

Ser

Asn

Pro

Ile

Ser

Ser

Leu

His

Ile

725 730 735

-42CZ 290301 B6

AAA ACG AAT GAT

GAA ATA ACT TTA TTT TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA

2256

Lys

Thr

Asn Asp 740

Glu

Ile

Thr

Leu Phe 745

Trp

ASp

ASp

Ile

Ser 750

Ile

Thr

GAT

GTA

GCA

TCA

ATA

AAA

CCG

GAA

AAT

TTA

ACA

GAT

TCA

GAA

ATT

AAA

2304

Asp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

Asn

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile

Lys

755

760

765

CAG

ATT

TAT

AGT

AGG

TAT

GGT

ATT

AAG

TTA

GAA

GAT

GGA

ATC

CTT

ATT

2352

Gin

ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys

Leu

Glu

ASp

Gly

Ile

Leu

Ile

770

775

780

GAT

AAA

AAA

GGT

GGG

ATT

CAT

TAT

GGT

GAA

TTT

ATT

AAT

GAA

GCT

AGT

2400

Asp

Lys

Lys

Gly

Gly

Ile

HÍS

Tyr

Gly

Glu

Phe

Ile

Asn

Glu

Ala

Ser

785

790

795

800

TTT

AAT

ATT

GAA

CCA

TTG

CCA

AAT

TAT

GTG

ACC

AAA

TAT

GAA

GTT

ACT

2448

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

Val

Thr

805

810

815

TAT

AGT

AGT

GAG

TTA

GGA

CCA

AAC

GTG

AGT

GAC

ACA

CTT

GAA

AGT

GAT

2496

Tyr

Ser

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

820

825

830

AAA

ATT

TAC

AAG

GAT

GGG

ACA

ATT

AAA

TTT

GAT

TTT

ACC

AAA

TAT

AGT

2544

Lys

Ile

Tyr

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Lys

Phe

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr

Sex

835

840

845

AAA

AAT

GAA

CAA

GGA

TTA

TTT

TAT

GAC

AGT

GGA

TTA

AAT

TGG

GAC

TTT

2592

Lys

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

Asp

Phe

850

855

860

AAA

ATT

AAT

GCT

ATT

ACT

TAT

GAT

GGT

AAA

GAG

ATG

AAT

GTT

TTT

CAT

2640

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

865

870

875

880

AGA

TAT

AAT

AAA

TAG

2655

Arg Tyr Asn Lys

Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 884 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární io (i i) typ molekuly: protein

-43CZ 290301 B6 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:

Met

Lys

Asn

Met

Lys

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

Val

Val

Thr

Cys

Thr

Leu

1

5

10

15

Leu

Ala

Pro

Met

Phe

Leu

Asn

Gly

Asn

Val

Asn

Ala

val

Tyr

Ala

Asp

20

25

30

Ser

Lys

Thr

Asn

Gin

Ile

Ser

Thr

Thr

Gin

Lys

Asn

Gin

Gin

Lys

Glu

35

40

45

Met

Asp Arg

Lys

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Gly Lys

Asp

Phe

50

55

60

Ser

Asn

Leu

Thr

Met

Phe

Ala

Pro

Thr

Arg

Asp

Ser

Thr

Leu

Ile

Tyr

65

70

75

80

Asp

Gin

Gin

Thr

Ala

Asn

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

Lys

Gin

Gin

Glu

Tyr

85

90

95

Gin

Ser

Ile

Arg

Trp

ile

Gly

Leu

Ile

Gin

Ser

Lys

Glu

Thr

Gly

Asp

100

105

110

Phe

Thr

Phe

Asn

Leu

Ser

Glu

Asp

Glu

Gin

Ala

Ile

Ile

Glu

Ile

Asn

115

120

125

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

His

Leu

130

135

140

Glu

Lys

Gly

Lys

Leu

val

Pro

Ile

Lys

Ile

Glu

Tyr

Gin

Ser

Asp

Thr

145

150

155

160

Lys

Phe

Asn

Ile

Asp

Ser

Lys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Leu

Phe

Lye

165

170

175

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin

Val

Gin

Gin

Asp

Glu

Leu

Arg

180

185

190

Asn

Pro

Glu

Phe

Asn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

Leu

Ala

Lys

Pro

195

200

205

Ser

Lys

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr

Gin

Xaa

Met

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp

Glu

210

215

220

Asp

Thr

Asp

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

225

230

235

240

Gly Tyr

Thr

Ile

Xaa

Asn

Arg

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

245

250

255

-44CZ 290301 B6

Ala Ser

Lys Gly 260

Tyr

Thr Lys

Phe

Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser

His

265

270

Thr

val

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu

275

280

285

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

290

295

300

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

30S

310

315

320

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

325

330

335

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly

340

345

350

Ile

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr

val

Ala

355

360

365

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

370

375

380

Ser

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

385

390

395

400

Gly

Ala

Ile

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

405

410

415

Asp

Thr

Ile

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

420

425

430

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys

Gly

Gin

Asn Gly

Ile

Ala

435

440

445

Ile

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

450

455

460

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn

Lys

Pro

Met

Met

Leu

Glu

Thr

4 65

470

475

480

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly

Val

Tyr

Lys

Ile

Ly3

Asp

Thr

His

Gly

Asn

Ile

485

490

495

val

Thr

Gly

Gly

G1U

Trp

Asn

Gly

Val

Ile

Gin

Gin

Ile

Lys

Ala

Lys

500

505

510

Thr

Ala

Ser

Ile

Ile

Val

Asp

Asp

Gly

Glu

Arg

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

515

520

525

Val

Ala

Ala

Lye

ASp

Tyr

Glu

Asn

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Ser

Leu

530

535

540

Thr

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asp

G1U

Ile

Lys

Glu

545

550

555

560

ile

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

Asn

Lys

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser

Ser

565

570

575

-45CZ 290301 B6

Val

Met

Thr

Tyr 580

Leu Asp Glu

Asn Thr 585

Ala Lys Glu

Val Thr 590

Lys Gin

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

595

600

605

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

Thr

Ile

Lys

Leu

Ser

Ile

Leu

610

615

620

Tyr

Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Ile

Gly

Lys

Trp

Thr

Asn

625

630

635

640

Thr

Asn

Ile

val

Ser

Gly

Gly Asn

Asn

Gly

Lys

Lys

Gin

Tyr

Ser

Ser

645

650

655

Asn

Asn

Pro

Asp

Ala

Asn

Leu

Thr

Leu

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

660

665

670

Leu

Asn

Lys

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr

Ile

Ser

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser

Glu

675

680

685

Lys

Asn

Thr

Gin

Cys

Glu

Ile

Thr

Ile

Asp

Gly

Glu

Ile

Tyr

Pro

ile

690

695

700

Thr

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Asn

Lys

Asp

Asn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

705

710

715

720

Ile

Ile

Ala

His

Asn

Ile

Lys

Ser

Asn

Pro

Ile

Ser

Ser

Leu

His

Ile

725

730

735

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile

Thr

Leu

Phe

Trp

Asp

Asp

Ile

Ser

Ile

Thr

740

745

750

Asp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

Asn

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile

Lys

755

760

765

Gin

Ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys

Leu

Glu

Asp

Gly

Ile

Leu

Ile

770

775

780

Asp

Lys

Lys

Gly

Gly

Ile

His

Tyr

Gly

Glu

Phe

Ile

Asn

Glu

Ala

Ser

785

790

795

800

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

val

Thr

805

810

815

Tyr

Ser

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

ASn

Val

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

820

825

830

Lys

Ile

Tyr

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Lys

Phe

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr

Ser

835

840

845

Lys

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp Asp

Phe

850

855

860

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

865

870

875

880

Arg Tyr Asn Lys

-46CZ 290301 B6

Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2004 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-2105 8 (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 1..2001 (C) způsob identifikace: experimentální (D) další informace: produkt = „protein VIP-1 o velikosti 80 kDa“, důkaz = experimentální (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:

ATG AAA AGG GAA ATT Met Lys Arg Glu Ile

GAT GAA

GAC ACG

GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile

48

Asp

Glu

ASp

Thr

1

5

10

15

CCT

GAC

CTT

TGG

GAA

GAA

AAT

GGG

TAT

ACG

ATT

CAM

AAT

AGA

ATC

GCT

96

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr

Thr

Ile

Xaa

Asn

Arg

Ile

Ala

20

25

30

GTA

AAG

TGG

GAC

GAT

TCT

CTA

GCA

AGT

AAA

GGG

TAT

ACG

AAA

TTT

GTT

144

Val

Lys

Trp

ASp

ASp

Ser

Leu

Ala

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

35

40

45

TCA

AAT

CCA

CTA

GAA

agt

CAC

ACA

GTT

GGT

GAT

CCT

TAT

ACA

GAT

TAT

192

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Val

Gly Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

50

55

60

-47CZ 290301 B6

GAA Glu 65

AAG GCA GCA

AGA GAT CTA GAT TTG TCA

AAT GCA

AAG GAA

ACG TTT

240

Lys Ala

Ala

Arg

Asp Leu Asp Leu 70

Ser

Asn 75

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe 80

AAC

CCA

TTG

GTA

GCT

GCT

TTT

CCA

AGT

GTG

AAT

GTT

AGT

ATG

GAA

AAG

238

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Phe

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

85

90

95

GTG

ATA

TTA

TCA

CCA

AAT

GAA

AAT

TTA

TCC

AAT

AGT

GTA

GAG

TCT

CAT

336

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

100

105

110

TCA

TCC

ACG

AAT

TGG

TCT

TAT

ACA

AAT

ACA

GAA

GGT

GCT

TCT

GTT

GAA

384

Ser

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val

G1U

115

120

125

GCG

GGG

ATT

GGA

CCA

AAA

GGT

ATT

TCG

TTC

GGA

GTT

AGC

GTA

AAC

TAT

432

Ala

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly

Ile

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn

Tyr

130

135

140

CAA

CAC

TCT

GAA

ACA

GTT

GCA

CAA

GAA

TGG

GGA

ACA

TCT

ACA

GGA

AAT

480

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

145

150

155

160

ACT

TCG

CAA

TTC

AAT

ACG

GCT

TCA

GCG

GGA

TAT

TTA

AAT

GCA

AAT

GTT

528

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

165

170

175

CGA

TAT

AAC

AAT

GTA

GGA

ACT

GGT

GCC

ATC

TAC

GAT

GTA

AAA

CCT

ACA

576

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

Gly

Ala

Ile

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

180

185

190

ACA

AGT

TTT

GTA

TTA

AAT

AAC

GAT

ACT

ATC

GCA

ACT

ATT

ACG

GCG

AAA

624

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

Asp

Thr

Ile

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

195

200

205

TCT

AAT

TCT

ACA

GCC

TTA

AAT

ATA

TCT

CCT

GGA

GAA

AGT

TAC

CCG

AAA

672

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

210

215

220

AAA

GGA

CAA

AAT

GGA

ATC

GCA

ATA

ACA

TCA

ATG

GAT

GAT

TTT

AAT

TCC

720

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile

Ala

Ile

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

225

230

235

240

CAT

CCG

ATT

ACA

TTA

AAT

AAA

AAA

CAA

GTA

GAT

AAT

CTG

CTA

AAT

AAT

768

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn

245

250

255

AAA

CCT

ATG

ATG

TTG

GAA

ACA

AAC

CAA

ACA

GAT

GGT

GTT

TAT

AAG

ATA

816

Lys

Pro

Met

Met

Leu

Glu

Thr

Asn

Gin

Thr

Asp

Gly

Val

Tyr

Lys

Ile

260

265

270

AAA

GAT

ACA

CAT

GGA

AAT

ATA

GTA

ACT

GGC

GGA

GAA

TGG AAT

GGT

GTC

864

Lys

Asp

Thr

His

Gly

Asn

Ile

Val

Thr

Gly

Gly

Glu

Trp

Asn

Gly

Val

275

280

285

ATA

CAA

CAA

ATC

AAG

GCT

AAA

ACA

GCG

TCT

ATT

ATT

GTG

GAT

GAT

GGG

912

Ile

Gin

Gin

Ile

Lys

Ala

Lys

Thr

Ala

Ser

Ile

Ile

Val

Asp

Asp

Gly

290

295

300

GAA

CGT

GTA

GCA

GAA

AAA

CGT

GTA

GCG

GCA

AAA

GAT

TAT

GAA

AAT

CCA

960

Glu

Arg

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

Val

Ala

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro

305

310

315

320

-48CZ 290301 B6

GAA GAT AAA ACA CCG TCT TTA Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu

ACT TTA AAA GAT GCC

CTG AAG CTT Leu Lys Leu 335

TCA Ser

1008

Thr

Leu

Lys 330

Asp

Ala

325

TAT

CCA

GAT

GAA

ATA

AAA

GAA

ATA

GAG

GGA

TTA

TTA

TAT

TAT

AAA

AAC

1056

Tyr

PrO

Asp

Glu

Ile

Lys

Glu

Ile

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

Asn

340

345

350

AAA

CCG

ATA

TAC

GAA

TCG

AGC

GTT

ATG

ACT

TAC

TTA

GAT

GAA

AAT

ACA

1104

Lys

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

355

360

365

GCA

AAA

GAA

GTG

ACC

AAA

CAA

TTA

AAT

GAT

ACC

ACT

GGG

AAA

TTT

AAA

1152

Ala

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Gin

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

370

375

380

GAT

gta

AGT

CAT

TTA

TAT

GAT

GTA

AAA

CTG

ACT

CCA

AAA

ATG

AAT

GTT

1200

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

Val

Lys

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

395

390

395

400

ACA

ATC

AAA

TTG

TCT

ATA

CTT

TAT

GAT

AAT

GCT

GAG

TCT

AAT

GAT

AAC

1248

Thr

ne

Lys

Leu

Ser

Ile

Leu

Tyr

Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

405

410

415

TCA

ATT

GGT

AAA

TGG

ACA

AAC

ACA

AAT

ATT

GTT

TCA

GGT

GGA

AAT

AAC

1296

Ser

ile

Gly

Lys

Trp

Thr

Asn

Thr

Asn

ile

Val

Ser

Gly

Gly

Asn

Asn

420

425

430

GGA

AAA

AAA

CAA

TAT

TCT

TCT

AAT

AAT

CCG

GAT

GCT

AAT

TTG

ACA

TTA

1344

Gly

Lys

Lys

Gin

Tyr

Ser

Ser

Asn

Asn

Pro

Asp

Ala

Asn

Leu

Thr

Leu

435

440

445

AAT

ACA

GAT

GCT

CAA

GAA

AAA

TTA

AAT

AAA

AAT

CGT

GAC

TAT

TAT

ATA

1392

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

Leu

Asn

Ly3

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr

ile

450

455

460

AGT

TTA

TAT

ATG

AAG

TCA

GAA

AAA

AAC

ACA

CAA

TGT

GAG

ATT

ACT

ATA

1440

Ser

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser

Glu

Lys

Asn

Thr

Gin

Cys

Glu

Ile

Thr

Ile

465

470

475

480

GAT

GGG

GAG

ATT

TAT

CCG

ATC

ACT

ACA

AAA

ACA

GTG

AAT

GTG

AAT

AAA

1488

Asp

Gly

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ile

Thr

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Asn

Lys

485

490

495

GAC

AAT

TAC

AAA

AGA

TTA

GAT

ATT

ATA

GCT

CAT

AAT

ATA

AAA

AGT

AAT

1536

ASp

Asn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

Ile

Ile

Ala

His

Asn

Ile

Lys

Ser

Asn

500

505

510

CCA

ATT

TCT

TCA

CTT

CAT

ATT

AAA

ACG

AAT

GAT

GAA

ATA

ACT

TTA

TTT

1584

Pro

Ile

Ser

Ser

Leu

His

Ile

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

ne

Thr

Leu

Phe

515

520

525

TGG

GAT

GAT

ATT

TCT

ATA

ACA

GAT

GTA

GCA

TCA

ATA

AAA

CCG

GAA

AAT

1632

Trp Asp Asp

Ile

Ser

Ile

Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

Asn

530

535

540

TTA

ACA

GAT

TCA

GAA

ATT

AAA

CAG

ATT

TAT

AGT

AGG

TAT

GGT

ATT

AAG

1680

Leu

Thr Asp

Ser

Glu

Ile

Lys

Gin

Ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys

545

550

555

560

-49CZ 290301 B6

TTA GAA GAT GGA

ATC CTT ATT GAT

AAA AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly

1728

Leu Glu

Asp Gly

Ile 565

Leu

Ile

Asp

570

575

GAA

TTT

ATT

AAT

GAA

GCT

AGT

TTT

AAT

ATT

GAA

CCA

TTG

CCA

AAT

TAT

1776

Glu

Phe

Ile

Asn

Glu

Ala

Ser

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

580

585

590

GTG

ACC

AAA

TAT

GAA

GTT

ACT

TAT

AGT

AGT

GAG

TTA

GGA

CCA

AAC

GTG

1824

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

Val

Thr

Tyr

Ser

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

595

600

605

AGT

GAC

ACA

CTT

GAA

AGT

GAT

AAA

ATT

TAC

AAG

GAT

GGG

ACA

ATT

AAA

1872

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

Lys

Ile

Tyr

Ly5

Asp

Gly

Thr

Ile

Lys

610

615

620

TTT

GAT

TTT

ACC

AAA

TAT

AGT

AAA

AAT

GAA

CAA

GGA

TTA

TTT

TAT

GAC

1920

Phe

Asp

Phe

Thr

lys

Tyr

Ser

Lys

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp

625

630

635

640

AGT

GGA

TTA

AAT

TGG

GAC

TTT

AAA

ATT

AAT

GCT

ATT

ACT

TAT

GAT

GGT

1968

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

Asp

Phe

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

645

650

655

AAA

GAG

ATG

AAT

GTT

TTT

CAT

AGA

TAT

AAT

AAA

TAG

2004

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

Arg

Tyr

Asn

Lys

660

665

Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 667 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein o

(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:

Met

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp

Glu

Asp

Thr

Asp

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

Ile

1

5

10

15

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr

Thr

ile

Xaa

Asn

Arg

Ile

Ala

20

25

30

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala

Ser

Lys

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

35

40

45

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Val

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

50

55

60

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg Asp

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

65

70

75

80

-50CZ 290301 B6

Asn

Pro Leu Val

Ala Ala Phe Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys

85

90

95

Val

lle

Leu

Ser

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

100

105

110

Sex

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

115

120

125

Ala

Gly

lle

Gly

Pro

Lys

Gly

lle

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

Val

Asn

Tyr

130

135

140

Gin

HiS

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

Gin

Glu

Trp

Gly

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

145

150

155

160

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

165

170

175

Arg

Tyr

Asn

Asn

val

Gly

Thr

Gly

Ala

lle

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

180

185

190

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

Asn

Asn

Asp

Thr

lle

Ala

Thr

lle

Thr

Ala

Lys

195

200

205

Ser

Asn

Ser

Thr

Ala

Leu

Asn

lle

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

210

215

220

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

lle

Ala

lle

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

Ser

225

230

235

240

His

Pro

lle

Thr

Leu

Asn

Lye

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Asn

Asn

245

250

255

Lys

PrO

Met

Met

Leu

Glu

Thr

Asn

Gin

Thr

Asp Gly

Val

Tyr

Lys

lle

260

265

270

Lys

Asp

Thr

His

Gly

Asn

lle

Val

Thr

Gly

Gly

Glu

Trp

Asn

Gly

val

275

280

285

lle

Gin

Gin

lle

Lys

Ala

Lys

Thr

Ala

Ser

lle

lle

Val

ASp

Asp

Gly

290

295

300

Glu

Arg

Val

Ala

Glu

Lys

Arg

Val

Ala

Ala

Lye

ASp

Tyr

Glu

Asn

Pro

305

310

31S

320

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys

ASp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

325

330

335

Tyr

Pro

Asp

Glu

iie

Lys

Glu

lle

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

Asn

340

345

350

Lys

Pro

lle

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp

Glu

Asn

Thr

355

360

365

Ala

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Gin

Leu

Asn

Asp

Thr

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

370

375

380

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

val

Lys

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

335

390

395

400

Thr

lle

Lys

Leu

Ser

lle

Leu

Tyr

Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

405

410

415

-51 CZ 290301 B6

Ser Ile Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn Ile Val Ser Gly Gly Asn Asn

420

425

430

Gly

Lys

Lys

Gin

Tyr

Ser

Ser

Asn

Asn

Pro

Asp

Ala

Asn

Leu

Thr

Leu

435

440

445

Asn

Thr

Asp

Ala

Gin

Glu

Lys

Leu

Asn

Lys

Asn

Arg

Asp

Tyr

Tyr

ile

450

455

460

Ser

Leu

Tyr

Met

Lys

Ser

Glu

Lys

Asn

Thr

Gin

Cys

Glu

Ile

Thr

Ile

465

470

475

480

Asp

Gly

Glu

Ile

Tyr

Pro

Ile

Thr

Thr

Lys

Thr

Val

Asn

Val

Asn

Lys

485

490

495

Asp

Asn

Tyr

Lys

Arg

Leu

Asp

Ile

Ile

Ala

His

Asn

Ile

Lys

Ser

Asn

500

505

510

Pro

Ile

Ser

Ser

Leu

His

Ile

Lys

Thr

Asn

Asp

Glu

Ile

Thr

Leu

Phe

515

520

525

Trp

Asp

Asp

Ile

Ser

Ile

Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Ile

Lys

Pro

Glu

Asn

530

535

540

Leu

Thr

Asp

Ser

Glu

Ile

Lys

Gin

Ile

Tyr

Ser

Arg

Tyr

Gly

Ile

Lys

545

550

555

560

Leu

Glu

Asp

Gly

ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Lys

Gly

Gly

Ile

His

Tyr

Gly

565

570

575

Glu

Phe

Ile

Asn

Glu

Ala

Ser

Phe

Asn

Ile

Glu

Pro

Leu

Pro

Asn

Tyr

580

585

590

Val

Thr

Lys

Tyr

Glu

Val

Thr

Tyr

Ser

Ser

Glu

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

595

600

605

Ser

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Asp

Lys

Ile

Tyr

Lys

Asp

Gly

Thr

Ile

Lys

610

615

620

Phe

Asp

Phe

Thr

Lys

Tyr

Ser

Lys

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp

625

630

635

640

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

Asp

Phe

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

645

650

655

Lys

Glu

Met

Asn

Val

Phe

His

Arg

Tyr

Asn

Lys

660 665

Informace o sekvenci SEQ ID č. 8:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není ¹⁵ (v) typ fragmentu: N-koncový

-52CZ 290301 B6 (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-2105 8 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..16 (D) další informace: poznámka = „N-koncová sekvence proteinu purifikovaného z kmene AB78“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:

Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly Asp Ser Ile Pro 15 10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..21 (D) další informace: poznámka = „oligonukleotidová sonda na bázi aminokyselin 3 až 9 v SEQ ID č. 8, s využitím znalosti použití kodonů Bacillus thuringiensis“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:

GAAATTGATC AAGATACNGA T 21

Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový

-53CZ 290301 B6 (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (B) kmen: AB88 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1 ..14 (D) další informace: poznámka = „N-koncová aminokyselinová sekvence proteinu známého jako anexová frakce 23 (menší)“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:

Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa 15 io

Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 13 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (B) kmen: AB88 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..13 (D) další informace: poznámka = „N-koncová aminokyselinová sekvence proteinu známého jako anexová frakce 23 (větší)“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:

Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa 15 10

Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid

-54CZ 290301 B6 (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (B) kmen: AB88 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..14 (D) informace: poznámka = „N-koncová sekvence VIP o velikosti 80 kDa aktivního proti Agrotis ipsilon“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro 15 10

Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (B) kmen: AB88 (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..15 (D) další informace: poznámka = „N-koncová aminokyselinová sekvence VIP o velikosti 35 kDa aktivního proti Agrotis ipsilon“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:

Ala Leu Ser Glu Asn Thr Gly Lys Asp Gly Gly Tyr Ile Val Pro

10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 14:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová

-55CZ 290301 B6 (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..9 (D) další informace: poznámka = „N-koncová sekvence delta-endotoxinu o velikosti 130 kDa (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14:

Met Asp Asn Asn Pro Aen Ile Asn Glu

5

Informace o sekvenci SEQ ID č. 15:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..9 (D) další informace: poznámka = „N-koncová sekvence delta-endotoxinu o velikosti 80 kDa“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15:

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu

5

Informace o sekvenci SEQ ID č. 16:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 11 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární

-56CZ 290301 B6 (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Bacillus thuringiensis (ix) vlastnosti:

(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..11 (D) další informace: poznámka = „N-koncová sekvence delta-endotoxinu o velikosti 60 kDa“ (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16:

Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile 15 10

Informace o sekvenci SEQ ID č. 17:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není

-57CZ 290301 B6 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17:

ATGAAGAACA	TGAAGAAGAA	GCTGGCCAGC	GTGGTGACCT	GCACCCTGCT	GGCCCCCATG	60
TTCCTGAACG	GCAACGTGAA	CGCCGTGTAC	GCCGACAGCA	AGACCAACCA	GATCAGCACC	120
ACCCAGAAGA	ACCAGCAGAA	GGAGATGGAC	cgcaagggcc	TGCTGGGCTA	CTACTTCAAG	190
GGCAAGGACT	TCAGCAACCT	GACCATGTTC	GCCCCCACGC	GTGACAGCAC	CCTGATCTAC	240
GACCAGCAGA	CCGCCAACAA	GGTGCTGGAC	AAGAAGCAGC	AGGAGTACCA	GAGCATCCGC	300
TGGATCGGCC	TGATCCAGAG	CAAGGAGACC	GGCGACTTCA	CCTTCAACCT	GAGCGAGGAC	360
GAGCAGGCCA	TCATCGAGAT	CAACGGCAAG	ATČATCAGCA	acaagggcaa	GGAGAAGCAG	420
GTGGTGCACC	TGGAGAAGGG	CAAGCTGGTG	CCCATCAAGA	TCGAGTACCA	GAGCGACACC	490
AAGTTCAACA	TCGACAGCAA	GACCTTCAAG	GAGCTGAAGC	TTTTCAAGAT	CGACAGCCAG	540
AACCAGCCCC	AGCAGGTGCA	GCAGGACGAG	CTGCGCAACC	ccgagttcaa	CAAGAAGGAG	600
AGCCAGGAGT	TCCTGGCCAA	GCCCAGCAAG	ATCAACCTGT	TCACCCAGCA	GATGAAGCGC	660
GAGATCGACG	AGGACACCGA	CACCGACGGC	GACAGCATCC	CCGACCTGTG	GGAGGAGAAC	720
GGCTACACCA	tccagaaccg	CATCGCCGTG	AAGTGGGACG	ACAGCCTGGC	TAGCAAGGGC	780
TACACCAAGT	TCGTGAGCAA	CCCCCTGGAG	AGCCACACCG	TGGGCGACCC	CTACACCGAC	840
TACGAGAAGG	CCGCCCGCGA	CCTGGACCTG	AGCAACGCCA	AGGAGACCTT	CAACCCCCTG	900
GTGGCCGCCT	TCCCCAGCGT	gaacgtgagc	ATGGAGAAGG	TGATCCTGAG	CCCCAACGAG	960
aacctgagca	ACAGCGTGGA	GAGCCACTCG	AGCACCAACT	GGAGCTACAC	CAACACCGAG	1020
GGCGCCAGCG	TGGAGGCCGG	CATCGGTCCC	AAGGGCATCA	GCTTCGGCGT	GAGCGTGAAC	1080
TACCAGCACA	GCGAGACCGT	GGCCCAGGAG	TGGGGCACCA	GCACCGGCAA	CACCAGCCAG	1140
TTCAACACCG	CCAGCGCCGG	CTACCTGAAC	GCCAACGTGC	gctacaacaa	CGTGGGCACC	1200
GGCGCCATCT	ACGACGTGAA	GCCCACCACC	AGCTTCGTGC	TGAACAACGA	CACCATCGCC	1260
accatcaccg	CCAAGTCGAA	TTCCACCGCC	CTGAACATCA	GCCCCGGCGA	GAGCTACCCC	1320
AAGAAGGGCC	AGAACGGCAT	CGCCATCACC	AGCATGGACG	ACTTCAACAG	CCACCCCATC	1380

-58CZ 290301 B6

ACCCTGAACA	AGAAGCAGGT	GGACAACCTG	CTGAACAACA	AGCCCATGAT	GCTGGAGACC	1440
AACCAGACCG	ACGGCGTCTA	CAAGATCAAG	GACACCCACG	GCAACATCGT	GACCGGCGGC	1500
GAGTGGAACG	GCGTGATCCA	GCAGATCAAG	GCCAAGACCG	CCAGCATCAT	CGTCGACGAC	1560
GGCGAGCGCG	TGGCCGAGAA	GCGCGTGGCC	GCCAAGGACT	ACGAGAACCC	CGAGGACAAG	1620
ACCCCCAGCC	TGACCCTGAA	GGACGCCCTG	AAGCTGAGCT	ACCCCGACGA	GATCAAGGAG	1680
ATCGAGGGCC	TGCTGTACTA	CAAGAACAAG	CCCATCTACG	AGAGCAGCGT	GATGACCTAT	1740
ctagacgaga	ACACCGCCAA	GGAGGTGACC	AAGCAGCTGA	ACGACACCAC	CGGCAAGTTC	1800
AAGGACGTGA	GCCACCTGTA	CGACGTGAAG	CTGACCCCCA	AGATGAACGT	GACCATCAAG	1860
CTGAGCATCC	TGTACGACAA	CGCCGAGAGC	AACGACAACA	GCATCGGCAA	GTGGACCAAC	1920
ACCAACATCG	TGAGCGGCGG	CAACAACGGC	AAGAAGCAGT	ACAGCAGCAA	CAACCCCGAC	1980
GCCAACCTGA	CCCTGAACAC	CGACGCCCAG	GAGAAGCTGA	ACAAGAACCG	CGACTACTAC	2040
ATCAGCCTGT	ACATGAAGAG	CGAGAAGAAC	ACCCAGTGCG	AGATCACCAT	CGACGGCGAG	2100
ATATACCCCA	TCACCACCAA	GACCGTGAAC	GTGAACAAGG	ACAACTACAA	GCGCCTGGAC	2160
ATCATCGCCC	ACAACATCAA	GAGCAACCCC	ATCAGCAGCC	TGCACATCAA	GACCAACGAC	2220
GAGATCACCC	TGTTCTGGGA	CGACATATCG	ATTACCGACG	TCGCCAGCAT	CAAGCCCGAG	2280
AACCTGACCG	ACAGCGAGAT	CAAGCAGATA	TACAGTCGCT	ACGGCATCAA	GCTGGAGGAC	2340
GGCATCCTGA	TCGACAAGAA	GGGCGGCATC	CACTACGGCG	AGTTCATCAA	CGAGGCCAGC	2400
TTCAACATCG	AGCCCCTGCA	GAACTACGTG	ACCAAGTACG	AGGTGACCTA	CAGCAGCGAG	2460
CTGGGCCCCA	ACGTGAGCGA	CACCCTGGAG	AGCGACAAGA	TTTACAAGGA	CGGCACCATC	2520
AAGTTCGACT	TCACCAAGTA	CAGCAAGAAC	GAGCAGGGCC	TGTTCTACGA	CAGCGGCCTG	2580
AACTGGGACT	TCAAGATCAA	CGCCATCACC	TACGACGGCA	AGGAGATGAA	CGTGTTCCAC	2640
CGCTACAACA	AGTAG					2655

Informace o sekvenci SEQ ID č. 18:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2010 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není

-59CZ 290301 B6 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 18:

GGATCCATGA AGCGCGAGAT cgacgaggac accgacaccg acggcgacag catccccgac	60
CTGTGGGAGG AGAACGGCTA CACCATCCAG AACCGCATCG CCGTGAAGTG GGACGACAGC	120
CTGGCTAGCA AGGGCTACAC CAAGTTCGTG agcaaccccc TGGAGAGCCA CACCGTGGGC	180
GACCCCTACA CCGACTACGA GAAGGCCGCC CGCGACCTGG ACCTGAGCAA CGCCAAGGAG	240
ACCTTCAACC CCCTGGTGGC CGCCTTCCCC AGCGTGAACG TGAGCATGGA GAAGGTGATC	300
.CTGAGCCCCA ACGAGAACCT GAGCAACAGC GTGGAGAGCC ACTCGAGCAC CAACTGGAGC	360
TACACCAACA CCGAGGGCGC CAGCGTGGAG GCCGGCATCG GTCCCAAGGG CATCAGCTTC	420
GGCGTGAGCG TGAACTACCA GCACAGCGAG ACCGTGGCCC AGGAGTGGGG CACCAGCACC	480
GGCAACACCA GCCAGTTCAA CACCGCCAGC GCCGGCTACC TGAACGCCAA CGTGCGCTAC	540
AACAACGTGG GCACCGGCGC CATCTACGAC GTGAAGCCCA CCACCAGCTT CGTGCTGAAC	600
AACGACACCA TCGCCACCAT CACCGCCAAG TCGAATTCCA CCGCCCTGAA CATCAGCCCC	660
GGCGAGAGCT ACCCCAAGAA GGGCCAGAAC GGCATCGCCA TCACCAGCAT GGACGACTTC	720
AACAGCCACC CCATCACCCT GAACAAGAAG caggtggaca acctgctgaa caaúaagccc	780
ATGATGCTGG AGACCAACCA GACCGACGGC GTCTACAAGA TCAAGGACAC CCACGGCAAC	840
ATCGTGACCG GCGGCGAGTG gaacggcgtg atccagcaga tcaaggccaa gaccgccagc	900
AICATCGTCG ACGACGGCGA GCGCGTGGCC GAGAAGCGCG TGGCCGCCAA GGACTACGAG	960
AACCCCGAGG acaagacccc CAGCCTGACC CTGAAGGACG ccctgaagct gagctacccc	1020
GACGAGATCA AGGAGATCGA GGGCCTGGTG TACTACAAGA ACAAGCCCAT CTACGAGAGC	1060
AGCGTGATGA CCTATCTAGA CGAGAACACC GCCAAGGAGG TGACCAAGCA GCTGAACGAC	1140
ACCACCGGCA AGTTCAAGGA CGTGAGCCAC CTGTACGACG TGAAGCTGaC CCCCAAGATG	1200
AACGTGACCA TCAAGCTGAG CATCCTGTAC GACAACGCČG AGAGCAACGA CAACAGCATC	1260
ggcaagtgga ccaacaccaa catcgtgagc ggcggcaaca acggcaagaa GCAGTACAGC	1320
AGCAACAACC CCGACGCCAA CCTGACCCTG AACACCGACG CCCAGGAGAA GCTGAACAAG	1380

-60CZ 290301 B6

AACCGCGACT	ACTACATCAG CCTGTACATG AAGAGCGAGA AGAACACCCA GTGCGAGATC	1440
accatcgacg	GCGAGATATA CCCCATCACC ACCAAGACCG TGAACGTGAA CAAGGACAAC	1500
TACAAGCGCC	tggacatcat cgcccacaac atcaagagca ACCCCATCAG CAGCCTGCAC	1560
ATCAAGACCA	ACGACGAGAT CACCCTGTTC TGGGACGACA TATCGATTAC CGACGTCGCC	1520
AGCATCAAGC	CCGAGAACCT GACCGACAGC GAGATCAAGC AGATATACAG TCGCTACGGC	1680
ATCAAGCTGG	aggacggcat CCTGATCGAC AAGAAGGGCG gcatccacta CGGCGAGTTC	1740
ATCAACGAGG	ccagcttcaa CATCGAGCCC ctgcagaact acgtgaccaa gtacgaggtg	1800
ACCTACAGCA	GCGAGCTGGG CCCCAACGTG AGCGACACCC TGGAGAGCGA CAAGATTTAC	1860
AAGGACGGCA	CCATCAAGTT CGACTTCACC AAGTACAGCA AGAACGAGCA GGGCCTGTTC	1920
TACGACAGCG	GCCTGAACTG GGACTTCAAG ATCAACGCCA TCACCTACGA CGGCAAGGAG	1980
ATGAACGTGT	TCCACCGCTA CAACAAGTAG	2010

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (62)

1. V podstatě purifikovaný kmen Bacillus, který produkuje v průběhu vegetativního růstu pesticidní protein izolovatelný z kapalného kultivačního média, přičemž tento protein je kódován nukleotidovou sekvencí, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí SEQ ID č. 1,4, 6,9,17 nebo 18, nebo přičemž tento protein cross-reaguje s protilátkami vytvořenými proti proteinům se sekvencemi uvedenými v SEQ ID č. 2, 3, 5, 7, 8 nebo 10 až 16.

2. Kmen Bacillus podle nároku 1, který je vybrán z druhů rodu Bacillus uvedených v tabulce 11.

3. Kmen Bacillus podle nároku 1, kde uvedený protein je schopen usmrcovat škůdce vybrané ze souboru zahrnujícího hmyz, houby, bakterie, háďátka, roztoče, klíšťata, patogenní prvoky a parazity zvířat.

4. Kmen Bacillus podle nároku 3, kde uvedený protein je schopen usmrcovat škůdce z řádů Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Anoplura, Siphonaptera nebo Trichoptera.

5. Kmen Bacillus podle nároku 4, kde uvedeným druhem z řádu Coleoptera je druh rodu Diabrotica.

6. Kmen Bacillus podle nároku 5, kde uvedeným druhem rodu Diabrotica je Diabrotica virgifera virgifera nebo Diabrotica longicomis barberi.

7. Kmen Bacillus podle nároku 4, kde uvedeným druhem z řádu Lepidoptera je druh rodu Agrotis.

8. Kmen Bacillus podle nároku 7, kde uvedeným druhem rodu Agrotis je Agrotis ipsilon.

9. Kmen Bacillus podle nároku 2, kde uvedeným druhem rodu Bacillus je Bacillus cereus.

-61 CZ 290301 B6

10. Kmen Bacillus podle nároku 9, kde uvedeným Bacillus cereus je Bacillus cereus s přírůstkovým číslem NRRL B-21058.

11. Kmen Bacillus podle nároku 2, kde uvedeným druhem rodu Bacillus je Bacillus thuringiensis.

12. Kmen Bacillus podle nároku 11, kde uvedeným Bacillus thuringiensis je Bacillus thuringiensis s přírůstkovým číslem NRRL B-21060.

13. Kmen Bacillus podle nároku 2, kde uvedený protein má molekulovou hmotnost 30 000 nebo vyšší.

14. Kmen Bacillus podle nároku 13, kde uvedený protein má molekulovou hmotnost od přibližně 60 000 do přibližně 100 000.

15. Kmen Bacillus podle nároku 14, kde uvedený protein má molekulovou hmotnost přibližně 80 000.

16. Kmen Bacillus podle nároku 15, kde uvedený protein má sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 7.

17. Kmen Bacillus podle nároku 14, kde uvedený protein má molekulovou hmotnost přibližně 100 000.

18. Kmen Bacillus podle nároku 17, kde uvedený protein má sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 5.

19. V podstatě čistý pesticidní protein, izolovatelný v průběhu fáze vegetativního růstu Bacillus spp., nebo jeho analogy a aktivní fragmenty, přičemž tento protein je izolovatelný z kapalného kultivačního média a přičemž tento protein je kódován nukleotidovou sekvencí, která hybridizuje s nukleotidovou sekvencí SEQ ID č. 1, 4, 6, 9, 17 nebo 18, nebo přičemž tento protein cross-reaguje s protilátkami vytvořenými proti proteinům se sekvencemi uvedenými v SEQ ID č. 2, 3, 5, 7, 8 nebo 10 až 16.

20. Pesticidní protein podle nároku 19, kde uvedený Bacillus je vybrán z druhů rodu Bacillus uvedených v tabulce 11.

21. Pesticidní protein podle nároku 20, kde uvedený hmyz je z řádů Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Mallophaga, Anoplura, Siphonaptera nebo Trichoptera.

22. Pesticidní protein podle nároku 21, kde uvedeným druhem z řádu Coleoptera je druh rodu Diabrotica.

23. Pesticidní protein podle nároku 22, kde uvedeným druhem rodu Diabrotica je Diabrotica virgifera virgifera nebo Diabrotica longicomis barberi.

24. Pesticidní protein podle nároku 21, kde uvedeným druhem z řádu Lepidoptera je druh rodu Agrotis.

25. Pesticidní protein podle nároku 24, kde uvedeným druhem rodu Agrotis je Agrotis ipsilon.

26. Pesticidní protein podle nároku 19, kde uvedeným druhem rodu Bacillus je Bacillus cereus.

27. Pesticidní protein podle nároku 26, kde uvedeným Bacillus cereus je Bacillus cereus s přírůstkovým číslem B-2105 8.

-62CZ 290301 B6

28. Pesticidní protein podle nároku 19, kde uvedeným druhem rodu Bacillus je Bacillus thuringiensis.

29. Pesticidní protein podle nároku 28, kde uvedeným Bacillus thuringiensis je Bacillus thuringiensis s přírůstkovým číslem vybraným ze skupiny zahrnující přírůstková čísla NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226 a NRRL B-21227.

30. Pesticidní protein podle nároku 19, který má molekulovou hmotnost 30 000 nebo vyšší.

31. Pesticidní protein podle nároku 30, kteiý má molekulovou hmotnost od přibližně 60 000 do přibližně 100 000.

32. Pesticidní protein podle nároku 31, který má molekulovou hmotnost přibližně 80 000.

33. Pesticidní protein podle nároku 32, který má sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 7.

34. Pesticidní protein podle nároku 31, který má sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 5.

35. Pesticidní protein podle nároku 19, který obsahuje N-koncovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 10 nebo 11.

36. V podstatě čistá nukleotidová sekvence, která kóduje protein podle nároku 19.

37. V podstatě čistá nukleotidová sekvence, která kóduje protein podle nároku 33.

38. V podstatě čistá nukleotidová sekvence, která kóduje protein podle nároku 34.

39. V podstatě Čistá nukleotidová sekvence, která kóduje protein podle nároku 35.

40. Nukleotidová sekvence podle nároku 36, která byla optimalizována pro expresi v rostlině.

41. Nukleotidová sekvence podle nároku 40, kde uvedená rostlina je vybraná ze skupiny zahrnující kukuřici, sóju, bavlník, pšenici, slunečnici, rajče, brambor a řepku olejku.

42. Nukleotidová sekvence podle nároku 37, která byla optimalizována pro expresi v rostlině.

43. Nukleotidová sekvence podle nároku 42, kde uvedená rostlina je vybraná ze skupiny zahrnující kukuřici, sóju, bavlník, pšenici, slunečnici, rajče, brambor a řepku olejku.

44. Nukleotidová sekvence podle nároku 38, která byla optimalizována pro expresi v mikroorganismu.

45. Nukleotidová sekvence podle nároku 44, která je uvedená v SEQ ID č. 18.

46. Nukleotidová sekvence podle nároku 39, která byla optimalizována pro expresi v mikroorganismu.

47. Nukleotidová sekvence podle nároku 46, která je uvedená v SEQ ID č. 17.

48. Nukleotidová sekvence podle nároku 36, která byla optimalizována pro expresi v mikroorganismu.

-63CZ 290301 B6

49. Nukleotidová sekvence podle nároku 48, kde uvedený mikroorganismus je vybrán ze skupiny zahrnující druhy rodu Bacillus, Pseudomonas, Saccharomyces, Clavibacter, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Agrobacterium a viry, houby, prvoky a háďátka patogenní pro hmyz.

50. Rostlina, stabilně transformovaná nukleotidovou sekvencí podle libovolného z nároků 36-47.

51. Rostlina podle nároku 48, kterou je rostlina kukuřice.

52. Nukleotidová sekvence podle nároku 36, kterou je v podstatě sekvence z klonu Escherichia coli P5-4 s přírůstkovým číslem NRRL B-21059.

53. Nukleotidová sekvence podle nároku 36, kterou je v podstatě sekvence z klonu Escherichia coli P3-12 s přírůstkovým číslem NRRL B-21061.

54. Nukleotidová sekvence podle nároku 36, která je obsažena v klonu Escherichia coli pCIB 6022 s přírůstkovým číslem NRRL B-21222.

55. Nukleotidová sekvence podle nároku 54, která je znázorněná jako VIP-1 v SEQ ID č. 1.

56. Kmen Bacillus podle nároku 1, kterým je AB88 s přírůstkovým číslem NRRL B-21225.

57. Kmen Bacillus podle nároku 1, kterým je AB289 s přírůstkovým číslem NRRL B-21227.

58. Kmen Bacillus podle nároku 1, kterým je AB294 s přírůstkovým číslem NRRL B-21229.

59. Kmen Bacillus podle nároku 1, kterým je AB359 s přírůstkovým číslem NRRL B-21226.

60. Kmen Bacillus podle nároku 1, kterým je AB59 s přírůstkovým číslem NRRL B-21228.

61. Kmen Bacillus podle nároku 1, kterým je AB256 s přírůstkovým číslem NRRL B-21230.

62. Způsob výroby pesticidního proteinu podle nároku 19, vy z n a č uj í c í se tím, že se

a) buňky Bacillus spp. pěstují v kultivačním médiu,

b) v průběhu vegetativního růstu se buňky odstraní, a

c) z kapalného kultivačního média se izoluje a purifikuje pesticidní protein.