CN102816816B

CN102816816B - 一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102816816B
Application number: CN201210312288.7A
Authority: CN
Inventors: 罗文娟; 韩蓓; 张瑞娟; 刘翠翠; 张�杰; 王嗣岑; 展颖转; 侯晓芳
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2012-08-29
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2032-08-29
Also published as: CN102816816A

Abstract

本发明公开了一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法及其应用，采用野生型的Bacillus sphaericus IAB 872进行培养，通过超声波处理、溶菌酶处理、DTT处理、复方泛影葡胺处理，提高了可溶性晶体蛋白的产量及活性，从而获得尽可能多的、较高功效的可溶性晶体蛋白。形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对人恶性肿瘤细胞具有一定抑制作用，可应用抗肿瘤药物的制备。球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对人肿瘤细胞增殖的抑制的结果包括：对肿瘤细胞的抑制率、对肿瘤细胞促凋亡的影响，能够影响细胞的G2/M期，使细胞阻滞在G2/M期。

Description

一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物代谢产物及其应用技术领域，涉及一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法及其应用。

背景技术

球形芽胞杆菌，为严格的好氧芽孢杆菌，生长周期可分为营养体期和芽孢期，其芽胞着生于细胞的末端或近末端，在芽胞形成的过程中引起菌体一端膨大，孢子囊呈鼓槌状。在球形芽胞杆菌生长的细胞内，伴随着芽胞的形成，有的菌株能产生一个或多个伴孢晶体，有的则不产生伴孢晶体，且伴孢晶体的形态大小和多寡也随着菌株的不同而不同。伴孢晶体与芽胞着生于细胞的同一端，孢子囊成熟后，晶体和芽胞仍结合在一起被包在芽胞外膜内。伴孢晶体的有无及其形态与球形芽胞杆菌的杀蚊活性相关，如在弱毒株SSII-1、1404-924B和1881中没有发现伴孢晶体，Kellen Q菌株中偶尔产生椭圆形或卵圆形伴孢晶体，没有菱形晶体；高毒力2297菌株主要产生菱形伴孢晶体，也产生卵圆形或椭圆形伴孢晶体。球形芽孢杆菌对不同属、或者同属不同种的蚊幼虫有不同的毒杀作用，不同血清型、同一血清型、或者含相同毒素蛋白的菌株间的杀蚊活性的差异也较大。

球形芽孢杆菌对不同蚊幼虫的毒杀作用主要是由其产生的杀蚊毒素实现的。现已证明在其生长发育过程中能产生两类不同毒素：一类是存在于所有高毒力菌株中的晶体毒素，由41.9和51.4kDa蛋白组成；另一类是存在于低毒力和部分高毒力菌株中的杀蚊毒素（Mosquitocidal Toxin,Mtx），如Mtx1(100kDa)、Mtx2(31.8kDa)和Mtx3(35.8kDa)等。

所有高毒力和部分中毒力菌株在其芽胞形成过程中能形成位于芽胞胞外膜内的伴胞晶体。该晶体是由等量的41.9和51.4kDa蛋白（分别记为BinA和BinB）组成。BinA和BinB合成于细菌芽胞形成期，并在芽胞形成III期通过两蛋白的相互作用和折叠而组装形成晶体。BinA和BinB的同时存在是形成伴胞晶体所必需的。Western Blot表明BinA和BinB蛋白间无交叉反应，说明它们之间无较强的同源性。

片段亚克隆实验表明，单独BinA蛋白对蚊幼虫有毒，但毒力比含两种蛋白的晶体的毒力低得多。单独的BinB对蚊幼虫无毒，但其存在明显增强BinA蛋白的毒性，只有两种蛋白的同时存在，毒素蛋白才能发挥出最大的毒杀活性，是一种二元毒素(Binary toxin,Bin)。这可能是由于蚊虫细胞系缺乏围食膜屏障、存在低亲合性的结合位点和不同的毒素细胞内摄机理所致。尽管两蛋白的同时存在是保证二元毒素完整活性所必需的，但BinA氨基酸的差异，特别是在100位置左右氨基酸决定其杀蚊活性和杀蚊谱。

Mtx1毒素：Mtx1毒素是一种100kDa的可溶性毒素，由870个氨基酸组成。它的N-末端有一个具有G+细菌信号肽特征的序列，与ADP-核糖基转移酶催化亚基同源。C-末端有三个末端重复序列。这种100kDa蛋白可被蚊幼虫中肠蛋白酶降解形成27和70kDa的蛋白。70kDa多肽有三个约90个氨基酸的重复序列，其功能不祥。而27kDa含有一个同转膜区相对应的区域，而且同几种ADP-核糖转移酶毒素有弱的同源性。缺失实验也证明，27kDa片段能自身ADP-核糖基化，70kDa片段能使蚊细胞发生病理反应，只有两种蛋白片段的同时存在，才对蚊幼虫表现出毒性。

Mtx2毒素Mtx3毒素：Mtx2毒素和Mtx3毒素都是从SSII-1菌株中分离出的由292和326个氨基酸组成，分子量分别为31.8和35.8kDa的毒素蛋白，它们同100kDa毒素和晶体毒素无同源性，而同产气夹膜羧菌(Clostridiumperfrigens)的33kDa的-毒素及绿浓杆菌(Pseudomonas aeruginos)的31.68kDa细胞毒素有同源性(Liu et al,1993,Thanabalu&Porter,1996)。Mtx2和Mtx3间有38%的同源性，都含有一个G+细菌的信号肽和假定的转膜区。对从6个不同B.s有毒菌株中分离的Mtx2毒素蛋白的比较分析，证明224位置的氨基酸决定了该毒素杀蚊活性和杀蚊谱。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法及其应用，通过球形芽孢杆菌菌株的伴胞晶体蛋白提取，所提取的伴胞晶体蛋白可应用于治疗和/或抑制肿瘤或肿瘤辅助诊断。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法，包括以下步骤：

1）将Bacillus sphaericus IAB 872菌株在LB固体培养基上活化后，接种于LB液体培养基中30℃过夜培养，次日转接入MBS培养基中，震荡培养至芽胞和晶体从母细胞中完全释放；

2）收集发酵液，离心，沉淀用NaCl溶液离心洗涤后，用超声波处理悬液使晶体、芽胞、细胞碎片充分分散，然后充分震荡混匀，除去泡沫，离心，取沉淀；

3）将沉淀加水制成悬液，加入溶菌酶至终浓度为0.1～0.5mg/ml，37℃处理2～3h，期间轻柔混匀数次，然后离心收集沉淀；

4）将沉淀加水制成悬液，加入DTT至其浓度为50～100mM，充分混匀后，于27～30℃静置1h，离心收集沉淀；

5）将沉淀在-20℃与室温下冻融一次，加入质量浓度42～44%复方泛影葡胺，充分混匀后离心，收集上清，并将上清在无菌水中透析24～48h；

6）将透析后的上清低温真空冷冻条件下制成冻干粉，得到球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白。

所述在MBS培养基中培养70～74h，培养温度为28～30℃。

所述的超声波处理时超声波发生器的设定为：温度为4℃、频率为20kHz、功率为200W；超声程序为：超声5s，停止5s，共循环25min。

所述步骤5）的冻融为：在-20℃下保持过夜，室温下至其溶解；所述的离心为10000r/min离心20min。

球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872的伴胞晶体蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的伴胞晶体蛋白包括51kDa和42kDa的蛋白多肽所组成的BinA和BinB二元毒素。

所述的抗肿瘤药物为促肿瘤细胞凋亡的药物。

所述的抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物。

所述的抑制肿瘤细胞增殖的药物将肿瘤细胞阻滞在G2/M期的药物。

所述的抗肿瘤药物为抗***、抗肝癌、抗胃癌、抗肺癌的药物中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法，采用野生型的Bacillus sphaericus IAB 872进行培养，尤其是提高了包含二元毒素的可溶性晶体蛋白。在现有技术中，菌株在培养提取时，存在芽胞破碎不充分，晶体蛋白和芽孢包裹在芽胞外膜内[J.Invertebr Pathol.2009,101:106–111.]，不能充分提取蛋白，对可溶性晶体蛋白的功效也有所降低的缺陷，本发明通过超声波处理、溶菌酶处理、DTT处理、复方泛影葡胺处理，提高了可溶性晶体蛋白的产量及活性，从而获得尽可能多的、较高功效的可溶性晶体蛋白。所获得的可溶性晶体蛋白可达2.09mg/ml。

本发明制备的球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白中包含有在芽孢生长后期产生的51kDa和42kDa的二元毒素，且二元毒素的基因序列与用作商业化杀蚊幼制剂菌株Bacillus sphaericus 2362（血清型H5a5b）高度一致；而营养体生长期不产生任何MTX毒素。

本发明首次提供了球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对人恶性肿瘤细胞具有一定抑制作用，可应用抗肿瘤药物的制备。球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对人肿瘤细胞增殖的抑制的结果包括：

对肿瘤细胞的抑制率：球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872提取的伴胞晶体蛋白对HELA、肝癌7721、7402、胃癌7901、肺癌A549等五种肿瘤细胞均显示较好的抑制作用，抑制率分别为：78%、61%、56%、53%、79%。选择抑制率较高的HELA及A549肿瘤细胞，作药物浓度梯度发现其具有一定的浓度依赖性。

对肿瘤细胞促凋亡的影响：虽然小浓度给药组（0.167mg/mL）早凋与晚凋的细胞共计43.8%，与阴性对照组相比有所增多,但是没有明显的差异；但是中浓度给药组(0.25mg/mL)给药处理后，凋亡率为58.8%。大浓度给药组(0.375mg/mL)凋亡率为62.2%，与阴性对照组相比均有显著性差异；表明(0.25mg/mL)给药量及以上的伴胞晶体蛋白能够促进肿瘤细胞的凋亡。

对肿瘤细胞周期的影响：流式细胞仪检测结果表明，阴性组G2期细胞为6.11%，小浓度给药组（0.167mg/mL）G2期细胞为7.74%，中浓度给药组（0.25mg/mL）为8.09%，大浓度给药组（0.375mg/mL）为16.18%，伴胞晶体蛋白能够影响细胞的G2/M期，使细胞阻滞在G2/M期。

附图说明

图1为球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872Bradford蛋白浓度测定标准曲线；

图2为流式细胞术检测球形芽孢杆菌提纯的伴胞晶体蛋白作用A549细胞48h Annexin V-FITC/PI双染进行凋亡分析结果；其中，Q3：正常细胞；Q4：早凋细胞；Q2：晚凋细胞；Q1：坏死细胞a：阴性对照组；b：0.167mg/mL；c：0.25mg/mL；d：0.375mg/mL。

图3为流式细胞术检测球形芽孢杆菌提纯的伴胞晶体蛋白作用A549细胞48h对细胞周期的影响结果，其中，a：阴性对照组；b：0.167mg/mL；c：0.25mg/mL；d：0.375mg/mL。

具体实施方式

本发明提供的球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法及其应用，通过野生型球形芽杆孢菌的分批发酵，对其细胞进行裂解离心等处理，获得其代谢产物伴胞晶体蛋白，首次将该蛋白应用于抗人肿瘤细胞，结果表明可应用抗肿瘤药物的制备。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872菌株：

Bacillus sphaericus IAB 872是一种现有的球形芽孢杆菌，其所产生的毒素常用于杀蚊。具体的，本发明是从土壤样品上分离出的一株Bacillussphaericus IAB 872来具体进行说明，当然本领域技术人员也可以采用其他渠道获得Bacillus sphaericus IAB 872来完成本发明。

2、球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872产伴胞晶体蛋白的提取：

（1）将Bacillus sphaericus IAB 872菌株在LB固体培养基上活化后，挑取单菌落于LB液体培养基中30℃过夜培养，次日以1:100的比例转接入大摇瓶的MBS培养基中于30℃震荡培养(200rpm)72h左右至芽胞和晶体从母细胞中完全释放；

（2）收集发酵液，10000g离心10min，沉淀用0.5M的NaCl离心洗涤一次，用超声波处理悬液，超声波发生器的设定为：温度为4℃、频率为20kHz、功率为200W；超声程序为：超声5s，停止5s，共循环25min；使晶体、芽胞、细胞碎片尽量分散，再在漩涡混合器上不断震荡混匀，同时除去产生的泡沫，离心，取沉淀；

（3）按70mg沉淀/ml双蒸水制成悬液，按终浓度0.1mg/ml加入溶菌酶(10mM EDTA配置)，37℃处理2hr，期间每半小时拿出来轻柔混匀数次，离心收集沉淀；

（4）按70mg沉淀/ml双蒸水制成悬液，加入50mM DTT（二硫苏糖醇），充分混匀后，27℃静置处理1hr，离心收集沉淀；

（5）将沉淀在-20℃与室温下冻融一次，加入42%复方泛影葡胺，混匀后离心可充分分离芽孢和营养体，使芽孢纯度提高，10000rpm离心20min，收集上清，并在无菌水中透析48h，然后检测可溶性伴胞晶体蛋白的浓度；

（6）将透析后的上清低温真空冷冻条件下制成冻干粉，得到球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白，与-4℃下保存。

伴胞晶体是指在芽孢生长后期产生51kDa和42kDa的蛋白多肽（BinA和BinB）所组成的二元毒素（Binary Toxin，Bin）形成，且二元毒素的基因序列与用作商业化杀蚊幼制剂菌株Bacillus sphaericus 2362（血清型H5a5b）高度一致。

部分高毒力菌株和所有低毒力菌株还产生一种营养期表达的对蚊幼虫具有毒杀作用的溶解型毒素蛋白，为营养期杀蚊毒素蛋白（Mosquitocidal Toxin,MTX）。所有高毒力菌株都能产生二元毒素，其中有些菌株也能同时产生Mtx毒素，而Bacillus sphaericus IAB 872营养体生长期不产生任何MTX毒素。

3、Bradford蛋白浓度测定：

G-250在酸性条件下呈棕红色，与蛋白质结合后为蓝色，且蛋白质在一定浓度范围内符合比尔定律，在595nm处比色，2-5min呈最大光吸收，稳定1hr（0.01-1.0mg蛋白范围），比色杯不可用石英杯。

具体的所采用的试剂包括：

染色液：G-250100mg溶于95%乙醇，加85%磷酸100ml，加水稀释到1000ml。（染液保存数月，不加水可以长期保存）；

标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白BSA；

具体方法：

标准蛋白溶液

依次加入0ml，0.05ml，0.10ml，0.15ml，0.20ml，0.25ml，0.30ml，0.35ml，0.40ml，0.45ml，0.50ml的标准蛋白溶液，加3ml染液，以及摇匀，置于室温20-25℃15min，与595nm处测定光吸收值。

以A595值为Y，BSA含量为X，制作标准曲线，求出线形方程，标注曲线的检测结果图1所示，再结合光吸收值可知未知蛋白浓度。

伴胞晶体蛋白浓度的检测结果为2.09mg/ml。

4、肿瘤细胞培养及抑制率检测：

1）肝癌7721、7402、胃癌7901、肺癌A549、***HELA五种细胞均购自美国ATCC细胞库，于含10%胎牛血清的1640培养液中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

2）将生长状态良好，于对数期生长的MCF7、7721、7402、7901、A549、HELA细胞以10⁵接种于96孔板，过夜待细胞自然贴壁。将上述细胞中加入0.5mg/ml浓度的球形伴胞晶体蛋白提取物，然后将细胞置37℃、5%CO₂中培养48h。

3）MTT法测定细胞生长：培养48h后,待测孔每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续培养4h。终止培养后，小心吸尽待测孔中培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶体充分溶解，于酶标仪490nm波长处测定吸光度。每组设5个平行孔，每组实验均重复三次。

细胞生长的抑制率（%）=（1-细胞的存活率）×100%

球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872提取的伴胞晶体蛋白对HELA、肝癌7721、7402、胃癌7901、肺癌A549等五种肿瘤细胞均显示较好的抑制作用，抑制率分别为：78%、61%、56%、53%、79%，具体如表1所示。选择抑制率较高的HELA及A549肿瘤细胞，作药物浓度梯度发现其具有一定的浓度依赖性，具体如表2所示。

表1伴胞晶体蛋白0.5mg/mL对不同肿瘤细胞的抑制率

肿瘤细胞种类	7901	A549	7721	7402	HELA
						抑制率%	70.93	78.12	59.53	56.32	78.10

表2伴胞晶体蛋白不同浓度对肿瘤细胞A549及HELA的抑制率

晶体蛋白浓度mg/mL	0.0625	0.125	0.25	0.375	0.5
						对A549的抑制率%	12.41	14.21	36.01	53.20	74.73
对HELA的抑制率%	24.50	34.08	49.72	58.43	73.93

5、伴胞晶体蛋白对肿瘤细胞凋亡的影响：

1）取对数生长期A549细胞，平行接种，24h后待融合度达约50%,使用0.125mg/mL、0.187mg/mL、0.25mg/mL浓度组的伴胞晶体蛋白进行诱导凋亡，阴性对照组加入等体积的1640培养基。

2）诱导凋亡48h后将给药组与阴性对照组细胞先用PBS洗一遍，再用0.25%胰蛋白酶消化解离细胞，获得细胞。

3）细胞消化下来后，加入步骤（2）中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1500r/min离心5min，弃去上清，收集细胞，再用PBS轻轻重悬细胞洗涤，并计数。

4）取1~5×10⁵细胞悬浮液，1500rpm,离心5分后弃上清，加入500μl的1×Binding Buffer(用蒸馏水1:9稀释10×Binding Buffer)。

5）加入5μL AnnexinV-FITC，再加入10μLPropidium Iodide,轻轻混匀。

6）在室温下，避光染色5~15min。

7）在1小时内进行流式细胞仪检测。激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm。Annexin V-FITC的绿色荧光FITC通道为FL1，PI红色荧光通过PI通道为FL2。使用未经凋亡诱导的正常细胞作为对照，进行荧光补偿调节。

使用0.167mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL伴胞晶体蛋白作用A549细胞48小时之后，使用AnnexinV-FITC/PI双染进行凋亡分析，考察凋亡细胞所占的比例。考察提取物对胃细胞系A549凋亡诱导的情况。

检测结果如图2所示，流式细胞仪测定的结果显示散点图各区分别代表如下的含义：Q3（Annexin-/PI-）为正常活细胞；Q4（Annexin+/PI-）为早期凋亡细胞；Q1（Annexin+/PI+）为晚期凋亡细胞；Q2（Annexin-/PI+）为机械性损伤细胞以及坏死的细胞。阴性对照组早凋与晚凋的细胞共计40.1%。小浓度给药组（0.167mg/mL）早凋与晚凋的细胞共计43.8%，与阴性对照组相比有所增多,但是没有明显的差异。中浓度给药组(0.25mg/mL)给药处理后，凋亡率为58.8%。大浓度给药组(0.375mg/mL)凋亡率为62.2%，与阴性对照组相比均有显著性差异。

6、伴胞晶体蛋白对肿瘤细胞周期的影响：

1）取对数生长期A549细胞，平行接种，24h后待融合度达约50%,使用0.125mg/mL、0.187mg/mL、0.25mg/mL浓度组的4#芽孢杆菌晶体蛋白进行诱导凋亡，阴性对照组加入等体积的1640培养基。

4）取1×10⁶细胞悬浮液，1500rpm,离心5分后弃上清，加入500μl的试剂A（含50μg/mL的PI,50μg/mL的RNase）,5μl试剂B（通透液），涡旋5~10s,室温避光反应30min。

5）在1小时内进行流式细胞仪检测。检测前样品用200目筛网过滤，以免堵塞。

使用0.167mg/mL、0.25mg/mL、0.375mg/mL伴胞晶体蛋白作用A549细胞48小时之后，使用PI单染进行细胞周期分析，考察提取物对细胞周期各时期所占的比例的影响。

流式细胞仪测定的结果如图3，阴性组G2期细胞为6.11%，小浓度给药组（0.167mg/mL）G2期细胞为7.74%，中浓度给药组（0.25mg/mL）为8.09%，大浓度给药组（0.375mg/mL）为16.18%，伴胞晶体蛋白能够影响细胞的G2/M期，使细胞阻滞在G2/M期。

综上所述，Bacillus sphaericus IAB 872的伴胞晶体蛋白对人恶性肿瘤细胞具有一定抑制作用，包括***、肝癌、胃癌细胞；而且对人肺癌细胞A549及***细胞HELA具有较高的抑制率，分别为78%、79%。对抑制率较高的肿瘤细胞进一步检测，选择伴胞晶体蛋白不同浓度对肿瘤细胞A549及HELA的抑制率，结果表明具有一定的浓度依赖性。

而且鉴于伴胞晶体蛋白对肿瘤细胞促凋亡的影响和抑制肿瘤细胞增殖，将其阻滞在G2/M期，那么Bacillus sphaericus IAB 872的伴胞晶体蛋白就可应用于抗肿瘤药物的制备。

Claims

1.一种球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将Bacillus sphaericus IAB 872菌株在LB固体培养基上活化后，接种于LB液体培养基中30℃过夜培养，次日转接入MBS培养基中，震荡培养至芽胞和晶体从母细胞中完全释放；

2. 如权利要求1所述的球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法，其特征在于，所述在MBS培养基中培养70～74h，培养温度为28～30℃。

3. 如权利要求1所述的球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法，其特征在于，所述的超声波处理时超声波发生器的设定为：温度为4℃、频率为20kHz、功率为200W；超声程序为：超声5s，停止5s，共循环25min。

4. 如权利要求1所述的球形芽孢杆菌伴胞晶体蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤5）的冻融为：在-20℃下保持过夜，室温下至其溶解；所述的离心为10000r/min离心20min。

5. 球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus IAB 872的伴胞晶体蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的伴胞晶体蛋白包括51kDa和42kDa的蛋白多肽所组成的BinA和BinB二元毒素；所述的抗肿瘤药物为抗***、抗肝癌、抗胃癌、抗肺癌的药物中的一种或几种。

6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为促肿瘤细胞凋亡的药物。

7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物。

8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抑制肿瘤细胞增殖的药物是将肿瘤细胞阻滞在G2/M期的药物。