CN1904051A - 盐藻nadp－甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因克隆和蛋白表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种盐藻光合代谢途径关键酶NADP－甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因、编码蛋白及其克隆和蛋白表达方法。本发明的一种盐藻光合代谢途径关键酶NADP－甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因具有有SEQ NO 5所示的碱基序列，其编码蛋白具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。本发明将来源于衣藻的甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因的同源片段作为探针首次克隆到一个盐藻特异的甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因，并对其序列和编码的蛋白序列进行初步的分析，同时对该基因进行了初步功能分析，在此基础上探讨盐藻这个单细胞绿藻在植物从低等到高等植物进化过程中的地位；本发明在高盐胁迫情况下对其转录水平表达进行研究，以从分子水平上进一步明确这个基因及其编码的酶蛋白在参与光合作用卡尔文循环过程中的生物学功能的保守性，同时揭示这个基因在盐藻响应环境胁迫过程特别是在渗透胁迫过程中的生物学功能的特异性。

Description

盐藻NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆和蛋白表达方法

技术领域

本发明涉及一种盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及其蛋白表达方法。

背景技术

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是一种古老的而且分布广泛的酶。它普遍存在于原生生物、原核生物、真核生物中，与生物体的糖磷酸代谢途径密切相关(Fothergill-Gilmore等，1993)。

甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在生物体中主要参与细胞质中的糖酵解途径和植物叶绿体中卡尔文循环途径。糖酵解途径中的GAPDH(EC1.2.1.12)以NADH作为其电子供体催化磷酸二羟丙酮向3-磷酸甘油醛的转化；而叶绿体中的GAPDH(EC1.2.1.13)以NADPH或NADH作为其电子供体(Cerff R.等，1978，1982)催化1，3-二磷酸甘油酸(BPGA)向3-磷酸甘油醛可逆还原与去磷酸化，参与植物体内光合碳还原途径—卡尔文循环。由于糖酵解途径和卡尔文循环途径都是细胞有机体能量代谢的主要途径，因此，GAPDH一直以来受到众多科学家的关注，并将其作为一个糖磷酸代谢途径的经典模式蛋白从结构、酶学机理及表达调控等方面进行大量的研究工作(Cerff R.等，1979，1982)；另外，由于不同物种的基因序列、蛋白序列及高级结构的保守性，使得其在物种***演化的研究中具有极其特殊的地位，大量的基因序列和蛋白序列的释放为经典的线粒体和叶绿体内共生起源学说提供了充分的证据(Brinkmann H.等，1989；Cerff R.等，1995；Kwon HB等，1995；Martinez P.等，1989；Meyer-GauenG.等，1994；Meyer-Gauen G.等，1998)；

盐藻作为一种对盐、辐射和强光等极端环境具有高度耐受性的单细胞绿藻，一直以来被科学家们作为植物细胞对环境胁迫分子机制研究的模式生物。在高盐胁迫时，盐藻主要通过快速合成甘油来平衡细胞内外的渗透压，13C-NMR研究表明(Degani K等，1985)，在高盐胁迫刚开始时，盐藻细胞中的甘油主要通过降解淀粉产生，而在45分钟之后，甘油的持续合成则主要由光合作用来完成，叶绿体卡尔文循环途径的甘油醛-3-磷酸脱氢酶是这个代谢过程的关键酶之一(Goyal A.等，1987)。为了更好地从分子水平上对盐藻光合作用***与其高度耐盐机制关系的研究，本领域迫切需要地从分子水平上对盐藻光合作用***与其高度耐盐机制关系的研究，本领域迫切需要克隆其光合代谢途径的关键酶基因。但现有技术中还没有盐藻NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因及有关的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。

本发明的目的之二在于提供盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因所编码的氨基酸序列。

本发明的目的之三在于利用来源于与盐藻亲缘关系较近的衣藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因保守区段为探针，从盐藻cDNA文库中首次克隆到一个盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，并对该基因进行了初步功能分析。

本发明的目的之四在于提供了对盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在原核表达***中进行蛋白表达。

为了达到上述目的，本发明的采用如下技术方案：

一种盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，其特征在于该基因有SEQ NO 5所示的碱基序列。

一种根据权利要求1所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。

一种根据权利要求1所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.根据衣藻W80 NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA的保守序列合成了一对引物CRGAPAF及CRGAPAR：

CRGAPAF：1 AAGGGCACCA TGACCACC 18，

CRGAPAR：1 ATGCCGTTGA GCTTGCC 17；

b.通过RT-PCR的方法从衣藻CC2677的总RNA扩增得到cDNA片段，全长为176bp，将该基因片段命名为CRGAPAf；

c.将步骤b中得到的基因片段CRGAPAf用DIG进行探针标记，筛选盐藻的cDNA文库，即3.0M NaCl cDNA文库，经过两轮筛选，获得5个独立的噬菌体阳性克隆，然后通过体外切除转化为质粒；这样即得到盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因及其编码蛋白。

一种根据权利要求1所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的蛋白表达方法，其特征在于该方法为：将盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的编码区克隆到原核表达载体pTWIN1中，并在BL21(DE3)中进行蛋白表达。

上述的蛋白表达方法具体为：根据载体的多克隆位点和盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶A亚单位(DvGapA1)基因的酶谱，分别对原核表达载体pTWIN1(7375bp)和质粒pBlueSK(-)-DvGapA进行EcoR I/Xho I双酶切，利用QIAquick Gel Extraction Kit回收经双酶切的载体和目的基因片段；然后利用T4 DNA连接酶对适量的载体和目的基因片段在16℃进行连接过夜，再将连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂LB氨苄抗性平板，37℃过夜培养；挑选抗性克隆进行鉴定，煮沸法小量提取质粒进行酶切鉴定所挑选克隆是否有目的片段的***；将鉴定的目的克隆pWIN-DvGapA1转化BL21(DE3)宿主菌，并进行蛋白的诱导表达；在培养至OD₆₀₀为0.5的时候，加入1/1000于培养体积的IPTG(1M)在30℃继续振荡培养，并于不同时间(0，1，2，3，4，5，6hrs)取样进行SDS-PAGE检测以确定蛋白最高表达水平的时间，结果显示在诱导4小时表达水平最高。

本发明将来源于衣藻的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Miyasaka，H.等，1994)的同源片段作为探针首次克隆到一个盐藻特异的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，并对其序列和编码的蛋白序列进行初步的分析，同时对该基因进行了初步功能分析，在此基础上探讨盐藻这个单细胞绿藻在植物从低等到高等植物进化过程中的地位；更重要的是，本发明在高盐胁迫情况下对其转录水平表达进行研究，以从分子水平上进一步明确这个基因及其编码的酶蛋白在参与光合作用卡尔文循环过程中的生物学功能的保守性，同时揭示这个基因在盐藻响应环境胁迫过程特别是在渗透胁迫过程中的生物学功能的特异性。

附图说明

图1显示了不同物种甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA，GapB)蛋白序列比较。

图2显示了不同物种来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶***进化树。

图3显示了盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在恒定NaCl培养条件和NaCl高盐胁迫条件下的Northern表达分析。

图4显示了盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在NaCl高盐胁迫条件下的Northern表达分析。

图5显示了盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在原核表达***中的诱导表达。

具体实施方式：

实施例一：盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆

首先根据衣藻W80 NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA(AB035312)的保守序列合成了一对引物(CRGAPAF：(SEQ ID NO：1)；CRGAPAR(SEQ ID NO：2))，通过RT-PCR的方法从衣藻CC2677的总RNA扩增得到与预计大小相符的cDNA片段(176bp)(SEQ ID NO：3)。将得到的cDNA片段进行序列分析，发现与AB035312对应序列的同源性为89.2％，而对应氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的同源性为93.1％，只有4个氨基酸的序列不一样，我们将这个片段命名为CRGAPAf。然后，将上述得到的衣藻2677甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因片段CRGAPAf(SEQ ID NO：3)用DIG进行探针标记，筛选盐藻的cDNA文库(3.0M NaCl cDNA文库)，经过两轮筛选，获得5个独立的噬菌体阳性克隆，然后通过体外切除转化为质粒，通过PCR(引物：CRGAPAF，CRGAPAR)鉴定进一步证明，我们可能得到了来源于盐藻基因组中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。并且挑取了其中的1个克隆进行了进一步序列测定。序列测定结果表明，该克隆正确编码了一个盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶，我们将该基因和其编码的蛋白分别命名为DvGapA1(SEQ ID NO：5)和DvGapA1(1478bp)(SEQ ID NO：6)。

实施例二：盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的序列分析：DvGapA1 cDNA序列全长编码的蛋白序列为一个376个氨基酸的蛋白。根据序列推测，其分子量为40.5kDa，等电点为9.05的碱性蛋白。将推测得到的蛋白序列进行BlastP比较发现，其与来源于不同物种的定位于叶绿体上的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因编码的蛋白都具有高度的同源性，其中与衣藻的甘油醛3-磷酸脱氢酶(BAA94304)氨基酸序列的同源性高达72％。通过网上叶绿体转运肽预测( http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)发现，我们分离到的基因所编码蛋白前35个氨基酸为可能的转运肽，这与其它物种来源的定位于叶绿体的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的叶绿体转运肽的分布是一致的。上述数据表明，我们确实得到了位于盐藻叶绿体的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA，其编码的蛋白我们暂时命名为DvGapA1。

实施例四：不同物种甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapA，GapB)蛋白序列比较

将来源于菠菜、拟南芥和豌豆及盐藻的叶绿体型甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行序列比较，结果显示GapB类型的蛋白序列比GapA型的蛋白序列在C末端明显的多出一段，而且不同物种来源的这一C末端序列同源性还比较高。盐藻的甘油醛-3-磷酸脱氢酶DvGapA1明显属于GapA型，包含与NADP结合和酶蛋白催化结构域的保守氨基酸残基，参见图1，这显示盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶可能在高级结构的保守性。

实施例五：不同物种来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶***进化树

通过将从古细菌、裸藻、红藻、普生轮藻、蓝藻、衣藻、地钱、泥炭藓、拟南芥、辣椒、豌豆及玉米等来源的细胞质型和叶绿体型甘油醛-3-磷酸脱氢酶的蛋白序列(CAC80388：地钱GapA，CAC80393：泥炭藓GapA1，CAC80392：水绵GapA，CAC80372：辣椒GapCP1，CAC80373：辣椒GapCP2，CAA33264：豌豆GapA，CAA30152：玉米GapA，AAA32793：拟南芥GapA1，P25856：拟南芥GapA，T09668：松树GapA，CAC80391：绿藻Kf GapA，CAC81011：栅藻GapA，AAA86855：衣藻GapA1，BAA94304：衣藻GapA2，CAC80389：地钱GapB，CAC80390：鞘毛藻GapB，CAC80374：辣椒GapB，AAA32795：拟南芥GapB，CAC80378：普生轮藻GapB，BAA18633：集胞藻GapA，BAC88471：无类囊体蓝藻GapA，P30724：红藻GapA，AAD10216：裸藻GapA，Q48335：古细菌Gap，AAC37245：裸藻Gap1，BAA17609：集胞藻Gap1，BAB74265：鱼腥藻Gap1，BAC91266：无类囊体蓝藻Gap1，CAC80386：地钱GapC，CAC80387：葫芦藓GapC，CAC80384：泥炭藓GapC2，CAC80377：辣椒GapC，CAC80385：地钱GapC，AAB59010：卷柏GapC，CAC80381：鞘毛藻GapC，CAA55116：复苏植物GapC，CAC80375：辣椒GapC，AAA32796：拟南芥GapC，CAC80376：辣椒GapC，AAM92008：土豆GapC，AAA03442：台湾滨藜，Q39769：松树GapC，Q41595：松树GapC，AAA87880：玉米GapC，CAC80383：泥炭藓GapC，CAC80379：普生轮藻GapC，CAC80382：绿藻Kf GapC，P49644：衣藻GapC)和DvGapA1进行同源性比较，首先通过smart和Pfam，预测了两个domain的位置，把两头无关的序列去掉，以古细菌(Q48335)为外群，采用ClustalX软件将上述同源序列进行多序列匹配排列，通过Gene Doc对多序列匹配结果进行校正，然后利用MEGA3.1软件进行***进化树的构建，它是根据Neighbor-joining法，通过Poissondistance法经过1000次bootstrap分析。结果表明(图5)DvGapA1明显的分布在GapA一类，与衣藻和栅藻的亲缘关系最近，这进一步证明我们得到了参与盐藻光合作用卡尔文循环的关键酶基因之一的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由于古细菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以非选择性的以NAD或NADP为辅基，因此被认为是较为原始的进化类型，而细质型和叶绿体型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶也就从古细菌开始分化，从图2可以看出叶绿体型甘油醛-3-磷酸脱氢酶的进化路线为：古细菌GapA→裸藻GapA→蓝藻(无类囊体蓝藻，集胞藻)GapA→红藻GapA，然后由红藻GapA又开始分支，其中分支一进一步向绿藻(绿藻Kf)、低等陆生植物(地钱、狭叶泥炭藓)和高等陆生植物(松树、拟南芥、玉米、豌豆)GapA进化，同时分支二进一步向绿藻(盐藻、衣藻、栅藻)GapA和低等植物(普生轮藻、鞘毛藻、地钱)及高等植物(拟南芥、辣椒)的GapB进化。从这里可以看出，GapA和GapB应该是进化到红藻GapA以后才开始分化的，而且在一部分绿藻中保持GapA进化类型的同时，一部分低等植物(普生轮藻)和高等植物出现了由GapA进化来的一种新型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapB)，迄今为止在其它单细胞绿藻中还没有发现GapB类型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，这表明普生轮藻可能是水生藻类向低等陆生植物进化的一个过渡类型。

实施例六：DvGapA1在恒定NaCl培养条件和NaCl高盐胁迫条件下的Northern表达分析

以往的研究已经证明，多数参与卡尔文循环途径的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因通常为组成型表达的基因，不受外界环境因子的调控。为了进一步验证我们分离到的DvGapA1在转录水平上是否也是组成型表达，我们提取了长期生长在不同NaCl浓度培养条件下的盐藻细胞的总RNA，以DvGapA1全长cDNA为探针，进行了Northern分析，参见图3。结果显示，不同NaCl培养条件下所获得的杂交信号并没有明显的差别，表明DvGapA1的表达不受环境中NaCl的影响。

经过1.0M NaCl→2.0M NaCl震荡培养后的盐藻细胞Northern分析结果表明，DvGapA1不受NaCl渗透震荡的诱导，参见图4，其表达也为组成型。

实施例7盐藻DvGapA1在原核表达***中的诱导表达

根据载体的多克隆位点和盐藻甘油醛3-磷酸脱氢酶A亚单位(DvGapA1)基因的酶谱，分别对原核表达载体pTWIN1(7375bp)和质粒pBlueSK(-)-DvGapA进行EcoR I/XhoI双酶切，利用QIAquick Gel Extraction Kit回收经双酶切的载体和目的基因片段。然后利用T4DNA连接酶对适量的载体和目的基因片段在16℃进行连接过夜，再将连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂LB氨苄抗性平板，37℃过夜培养。挑选抗性克隆进行鉴定，煮沸法小量提取质粒进行酶切鉴定所挑选克隆是否有目的片段的***。将鉴定的目的克隆pWIN-DvGapA1转化BL21(DE3)宿主菌，并进行蛋白的诱导表达。在培养至OD₆₀₀为0.5的时候，加入1/1000于培养体积的IPTG(1M)在30℃继续振荡培养，并于不同时间(0，1，2，3，4，5，6hrs)取样进行SDS-PAGE检测以确定蛋白最高表达水平的时间，结果显示在诱导4小时表达水平最高，参见图5。

                               序列表

<110>上海大学

<120>盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及其蛋白表达方法

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>1

aagggcacca tgaccacc                                                  18

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>2

atgccgttga gcttgcc                                                   17

<210>3

<211>176

<212>DNA

<213>衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)

<400>3

aagggcacga tgaccaccac ccactcctac accggtgacc agcgcctgct ggacgcgtcc  60

caccgcgacc tgcgccgcgc ccgcgccgcc gccctgaaca ttgtgcccac caccaccggt 120

gccgccaagg ccgtgtcgct ggtgctgccc agcctgaagg gcaagctgaa cggcat     176

<210>4

<211>58

<212>PRT

<213>衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)

<400>4

Lys Gly Thr Met Thr Thr Thr His Ser Tyr Thr Gly Asp Gln Arg Leu

1               5                   10                  15

Leu Asp Ala Ser His Arg Asp Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala Ala Leu

            20                  25                  30

Asn Ile Val Pro Thr Thr Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Ser Leu Val

        35                  40                  45

Leu Pro Ser Leu Lys Gly Lys Leu Asn Gly

    50                  55

<210>5

<211>1478

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<220>

<221>CDS

<222>(13)..(1143)

<400>5

cgccagcgaa aa atg gcc acc tca atg gcg aag tcc gcc ttc acc ggc 48

              Met Ala Thr Ser Met Ala Lys Ser Ala Phe Thr Gly

              1               5                   10

aac atg gcc ggc ctg aag aac ttc cag cgc gtg cag ccc gcc agg ggc     96

Asn Met Ala Gly Leu Lys Asn Phe Gln Arg Val Gln Pro Ala Arg Gly

        15                  20                  25

gcc gtg aag atg gag gtt gtg gcg cag aag aag gtg cgc gtg gcc atc    144

Ala Val Lys Met Glu Val Val Ala Gln Lys Lys Val Arg Val Ala Ile

    30                  35                  40

aac ggc ttc ggc cgc att ggc cgc aac ttc ctg cgc tgc tgg gag ggc    192

Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Asn Phe Leu Arg Cys Trp Glu Gly

45                  50                  55                  60

cgc aag gac tcc ctg ctg gac gtg gtg tgc gtg aac gac tcc ggc ggt    240

Arg Lys Asp Ser Leu Leu Asp Val Val Cys Val Asn Asp Ser Gly Gly

                65                  70                  75

gtg aag cag gcc tct cac ctg ctg aag tac gac acc acg ctg ggc aag    288

Val Lys Gln Ala Ser His Leu Leu Lys Tyr Asp Thr Thr Leu Gly Lys

            80                  85                  90

ttc gac gct gat gtc aag gcc gtg gac gac aag acc atc agc gtg aac    336

Phe Asp Ala Asp Val Lys Ala Val Asp Asp Lys Thr Ile Ser Val Asn

        95                  100                 105

ggc aag aac atc gcc gtg gtg tcc agc cgc gac ccc acc cag ctg ccc    384

Gly Lys Asn Ile Ala Val Val Ser Ser Arg Asp Pro Thr Gln Leu Pro

    110                 115                 120

tgg aag gcc atg gac atc gac ctg gtc atc gag ggc acc ggc gtg ttc    432

Trp Lys Ala Met Asp Ile Asp Leu Val Ile Glu Gly Thr Gly Val Phe

125                 130                 135                 140

gtg gac acc ccc ggc gct ggc aag cac atc cag gcc ggc gcc aag aag    480

Val Asp Thr Pro Gly Ala Gly Lys His Ile Gln Ala Gly Ala Lys Lys

                145                 150                 155

gtg ctg atc acc gcc ccc gcc aag ggc aac gac atc ccc acc ttc gtg    528

Val Leu Ile Thr Ala Pro Ala Lys Gly Asn Asp Ile Pro Thr Phe Val

            160                 165                 170

gtc ggc gtg aac tgc gac ggc tac aac cac tcc tac ccc atc atc tcc    576

Val Gly Val Asn Cys Asp Gly Tyr Asn His Ser Tyr Pro Ile Ile Ser

        175                 180                 185

aac gcc tcc tgc acc acc aac tgc ctg gca ccc ttc gtc aag gtg ctg    624

Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Phe Val Lys Val Leu

    190                 195                 200

cac gag aag ttc cgc atc gtg aag ggc acc atg acc acc acc cac tcc    672

His Glu Lys Phe Arg Ile Val Lys Gly Thr Met Thr Thr Thr His Ser

205                 210                 215                 220

tac act ggt gac cag cgt ctg ctg gat gct tct cac cgg gac ctg cgc    720

Tyr Thr Gly Asp Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ser His Arg Asp Leu Arg

                225                 230                 235

cgc gct cgt gcc gcc gcc ctg aac att gtg ccc acc acc act ggt gcg    768

Arg Ala Arg Ala Ala Ala Leu Asn Ile Val Pro Thr Thr Thr Gly Ala

            240                 245                 250

gcc aag gct gtg gcc ctg gtg ctg cct gac ctg aag ggc aag ctg aac    816

Ala Lys Ala Val Ala Leu Val Leu Pro Asp Leu Lys Gly Lys Leu Asn

        255                 260                 265

ggt gtg gcc ctg cgt gtg ccc acc ccc aac gtg tcc att gtg gat ctg    864

Gly Val Ala Leu Arg Val Pro Thr Pro Asn Val Ser Ile Val Asp Leu

    270                 275                 280

gtg gtg cag gtc gag aag aag acc ttc gct gag gag gtg aac aac gcc    912

Val Val Gln Val Glu Lys Lys Thr Phe Ala Glu Glu Val Asn Asn Ala

285                 290                 295                 300

ttc cgc gag gcc gcc gct ggc ccc atg agc aac gtg ctg gcc gtg gct    960

Phe Arg Glu Ala Ala Ala Gly Pro Met Ser Asn Val Leu Ala Val Ala

                305                 310                 315

gat gag cct ctg gtg tcc gct gac ttc aag ggc atg gac cag agc aca   1008

Asp Glu Pro Leu Val Ser Ala Asp Phe Lys Gly Met Asp Gln Ser Thr

            320                 325                 330

gcc atc gac tct gcc ctg acc atg gtc atg ggt gat gac atg gtc aag   1056

Ala Ile Asp Ser Ala Leu Thr Met Val Met Gly Asp Asp Met Val Lys

        335                 340                 345

gtg gtc gcc tgg tac gac aac gag tgg ggc tac tcc cag cgt gtg gtg   1104

Val Val Ala Trp Tyr Asp Asn Glu Trp Gly Tyr Ser Gln Arg Val Val

    350                 355                 360

gac ctg gct gag ctg acc gct cag cga tgg gcc gca taa gcagctaac     1152

Asp Leu Ala Glu Leu Thr Ala Gln Arg Trp Ala Ala

365                 370                 375

ttggctgcac gcgcgttgag tagctagttt gtcggacttc gccatcacct cttccttcct    1212

gttagctttc cataggtctc taatgatgta gattagacgc tgcacccaca caaacacagc    1272

ctgcgccagc catcagcggc actcttccca acgatttttc ttccgtactt gggctgggtc    1332

ataggttgat ggctgccaca tatgtcctgc ggccgcgcac tgcagcagtg cttgcgtgct    1392

gtaagactgt gcaaggctgg ctgtatttca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1452

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                         1478

<210>6

<211>376

<212>PRT

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>6

Met Ala Thr Ser Met Ala Lys Ser Ala Phe Thr Gly Asn Met Ala Gly

1               5                   10                  15

Leu Lys Asn Phe Gln Arg Val Gln Pro Ala Arg Gly Ala Val Lys Met

            20                  25                  30

Glu Val Val Ala Gln Lys Lys Val Arg Val Ala Ile Asn Gly Phe Gly

        35                  40                  45

Arg Ile Gly Arg Asn Phe Leu Arg Cys Trp Glu Gly Arg Lys Asp Ser

    50                  55                  60

Leu Leu Asp Val Val Cys Val Asn Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Ala

65                  70                  75                  80

Ser His Leu Leu Lys Tyr Asp Thr Thr Leu Gly Lys Phe Asp Ala Asp

                85                  90                  95

Val Lys Ala Val Asp Asp Lys Thr Ile Ser Val Asn Gly Lys Asn Ile

            100                 105                 110

Ala Val Val Ser Ser Arg Asp Pro Thr Gln Leu Pro Trp Lys Ala Met

        115                 120                 125

Asp Ile Asp Leu Val Ile Glu Gly Thr Gly Val Phe Val Asp Thr Pro

    130                 135                 140

Gly Ala Gly Lys His Ile Gln Ala Gly Ala Lys Lys Val Leu Ile Thr

145                 150                 155                 160

Ala Pro Ala Lys Gly Asn Asp Ile Pro Thr Phe Val Val Gly Val Asn

                165                 170                 175

Cys Asp Gly Tyr Asn His Ser Tyr Pro Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys

            180                 185                 190

Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Phe Val Lys Val Leu His Glu Lys Phe

        195                 200                 205

Arg Ile Val Lys Gly Thr Met Thr Thr Thr His Ser Tyr Thr Gly Asp

    210                 215                 220

Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ser His Arg Asp Leu Arg Arg Ala Arg Ala

225                 230                 235                 240

Ala Ala Leu Asn Ile Val Pro Thr Thr Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val

                245                 250                 255

Ala Leu Val Leu Pro Asp Leu Lys Gly Lys Leu Asn Gly Val Ala Leu

            260                 265                 270

Arg Val Pro Thr Pro Asn Val Ser Ile Val Asp Leu Val Val Gln Val

        275                 280                 285

Glu Lys Lys Thr Phe Ala Glu Glu Val Asn Asn Ala Phe Arg Glu Ala

    290                 295                 300

Ala Ala Gly Pro Met Ser Asn Val Leu Ala Val Ala Asp Glu Pro Leu

305                 310                 315                 320

Val Ser Ala Asp Phe Lys Gly Met Asp Gln Ser Thr Ala Ile Asp Ser

                325                 330                 335

Ala Leu Thr Met Val Met Gly Asp Asp Met Val Lys Val Val Ala Trp

            340                 345                 350

Tyr Asp Asn Glu Trp Gly Tyr Ser Gln Arg Val Val Asp Leu Ala Glu

        355                 360                 365

Leu Thr Ala Gln Arg Trp Ala Ala

    370                 375

Claims (5)

1.一种盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，其特征在于该基因有SEQ NO 5所示的碱基序列。

2.一种根据权利要求1所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。

3.一种根据权利要求1所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.根据衣藻W80NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA的保守序列合成一对引物CRGAPAF及CRGAPAR：

CRGAPAF：1  AAGGGCACCA TGACCACC  18，

CRGAPAR：1  ATGCCGTTGA GCTTGCC   17；

b.通过RT-PCR的方法从衣藻CC2677的总RNA扩增得到cDNA片段，全长176bp，将该cDNA片段命名为CRGAPAf；

c.将步骤b中得到的cDNA片段CRGAPAf用DIG进行探针标记，筛选盐藻的cDNA文库，即3.0M NaCl cDNA文库，经过两轮筛选，获得5个独立的噬菌体阳性克隆，然后通过体外切除转化为质粒；这样即得到盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。

4.一种根据权利要求1所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的蛋白表达方法，其特征在于该方法为：将盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的编码区克隆到原核表达载体pTWIN1中，并在BL21(DE3)中进行蛋白表达。

5.根据权利要求4所述的盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的蛋白表达方法，其特征在于所述的蛋白表达方法具体为：根据载体的多克隆位点和盐藻光合代谢途径关键酶NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶A亚单位(DvGapA1)基因的酶谱，分别对原核表达载体pTWIN1(7375bp)和质粒pBlueSK(-)-DvGapA进行EcoRI/XhoI双酶切，利用QIAquick Gel Extraction Kit回收经双酶切的载体和目的基因片段；然后利用T4DNA连接酶对适量的载体和目的基因片段在16℃进行连接过夜，再将连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂LB氨苄抗性平板，37℃过夜培养；挑选抗性克隆进行鉴定，煮沸法小量提取质粒进行酶切鉴定所挑选克隆是否有目的片段的***；将鉴定的目的克隆pWIN-DvGapA1转化BL21(DE3)宿主菌，并进行蛋白的诱导表达；在培养至OD₆₀₀为0.5的时候，加入1/1000于培养体积的IPTG(1M)在30℃继续振荡培养，并于不同时间(0，1，2，3，4，5，6hrs)取样进行SDS-PAGE检测以确定蛋白最高表达水平的时间，结果显示在诱导4小时表达水平最高。

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