CN1300315C - 奶牛之犊牛前胸腺素基因及其克隆方法与应用 - Google Patents

Abstract

奶牛之犊牛前胸腺素基因及其克隆方法与应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明从奶牛胸腺组织中分离出编码奶牛前胸腺素的基因。设计了反转录和PCR扩增的特异性引物对，利用反转录-聚合酶链式反应，从奶牛中分离出编码前胸腺素的基因，基因序列长度330个碱基，进一步构建表达载体，转化宿主细胞。在该宿主细胞培养液中获得前胸腺素蛋白，获得的前胸腺素蛋白具有较高的活性。本发明的重组基因可用于医药产品-胸腺素的工业化生产。

Description

奶牛之犊牛前胸腺素基因及其克隆方法与应用

(一)技术领域

本发明涉及从奶牛胸腺组织中分离前胸腺素α基因及其克隆、重组及表达方法和表达产物的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

胸腺是机体免疫***的中枢器官，它所分泌的胸腺素是一组活性肽类物质，分为α和β族胸腺素。在疾病治疗中以α族胸腺素为主。胸腺素主要作用于T细胞，促进T细胞的分化和成熟，调节B细胞抗体产生水平，维持机体免疫***的平衡，提高杀伤细胞和巨噬细胞活性、促进白细胞介素-2和α干扰素的合成等作用。前胸腺素α与胸腺素α1一样具有多种和近似相同的作用，如治疗***性红斑狼疮、肿瘤、乙型和丙型肝炎、其他病毒性疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫缺陷病等。胸腺素(胸腺肽)联合乙肝疫苗具有免疫调节和抗病毒作用。作者认为胸腺素乙肝疫苗的应用增强了患者肝细胞抗凋亡的能力，减轻肝细胞的坏死程度，从而改善了患者的免疫功能，增强了对HBV的抑制作用，减轻了肝细胞的免疫损伤，促进了肝细胞修复，改善了蛋白代谢。目前，世界上还没有研究出一种比较理想的抗病毒药物，因此对病毒病只能采取提高机体抵抗力和疫苗特异性接种预防的办法，多年的临床实践证实胸腺素对病毒病均有一定的治疗和预防作用，也是目前与干扰素配伍使用的抗病毒治疗药物之一，它们在乙肝、丙肝和肿瘤的治疗中发挥了巨大的作用。

目前，国外主要采用化学合成法生产胸腺素α1。意大利Sciclone公司研制的合成胸腺素α1已投放市场，国内胸腺素α1仍没有形成产业化生产。市场出售的胸腺素α1均为人工合成，成本高。组织提取又受到材料来源的限制，且产量很低、价格比较昂贵，应用受到限制。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种奶牛的犊牛前胸腺素基因及其克隆方法和应用。本发明首次从奶牛中分离出编码奶牛前胸腺素的全长cDNA，连接到表达载体上，再转化酵母菌株，表达产物具有较高的活性。

奶牛之犊牛前胸腺素基因，具有如下序列：

1.SEQ ID NO.1：DNA序列

(1)序列特征

*长度：330个碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(2)分子类型：cDNA

(3)最初来源：奶牛胸腺组织

(4)序列描述：

ATGTCAGACG  CGGCCGTGGA  CAACAGCTCC  GAGATCACCA  CCAAGGACTT    50

AAAGGAGAAG  AAGGAAGTTG  TGGAGGAGGC  GGAGAATGGG  AGAGAGGCAC    100

CTGCAAATGG  GAATGCTAAT  GAGGAAAATG  GGGAGCAGGA  AGCAGACAAC    150

GAGGTAGACG  AAGAAGAGGA  GGAAGGTGGG  GAGGAAGAGG  AGGAGGAGGA    200

AGGTGACGGT  GAGGAAGAGG  ACGGAGATGA  AGATGAGGAG  GCCGAGGCAG    250

CTACGGGCAA  ACGGGCAGCT  GAAGATGACG  AGGATAACGA  TGTGGATACC    300

AAGAAGCAGA  AGACTGATAA  AGATGACTAG                            330

2.SEQ ID NO.2：氨基酸序列

(1)序列特征

*长度：109氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线型

(2)分子类型：蛋白质

(3)序列描述

Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Asn Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys

1                5                   10                 15

Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly

                 20                  25                 30

Arg Glu Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu

                 35                  40                 45

Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly

                 50                  55                 60

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly

                 65                  70                 75

Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ala Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala

                 80                  85                 90

Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr

                 95                  100                105

Asp Lys Asp Asp 109。

本发明奶牛之犊牛前胸腺素基因的克隆方法如下，包括如下步骤：

(1)设计特异性引物：

正向引物1：CCA TCT TTG CAT TGT TCC

反向引物2：CTC ATA CAA ACC AAC TCA TTA TAG TAC AGC

(2)从奶牛的犊牛胸腺组织中提取总RNA或mRNA，然后用反转录酶和反向引物2由前胸腺素基因的mRNA来产生双链的mRNA/cDNA杂合分子；

(3)用DNA聚合酶、正向引物1和反向引物2在步骤(2)后通过PCR反应产生双链的cDNA分子；

(4)将所得的双链的cDNA分子***载体内，转化宿主细胞；

(5)宿主细胞增殖后得到含有前胸腺素基因的质粒：

a)提取和确定质粒中前胸腺素基因，

b)将上述基因***到表达载体内，构建重组表达载体，

c)上述重组表达载体转化宿主细胞，

d)上述宿主细胞在介质中培养繁殖后，累积前胸腺素蛋白。

上述步骤(5)表达累积的前胸腺素蛋白被分离和纯化，得到的是犊牛前胸腺素蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

上述步骤(2)的反应组分如下：

反转录酶                    1ul

反向引物                    2ul

胸腺素基因的mRNA            13ul

5倍的RT-Buffer              5ul

10mM dNTP                   1ul

上述步骤(3)的的反应组分和反应条件如下：

10倍反应缓冲液              5μl

25mM MgCl2                  4μl

10mM dNTP                   1μl

正向引物1                   5p mol

反向引物2                   5p mol

模板cDNA                    2μl

DNA聚合酶                   0.5μl

灭菌无离子水                36.5μl

总体积                      50μl

PCR反应条件：

94℃4分钟；循环：94℃45秒，55℃50秒，72℃40秒，共30个循环，72℃延伸3分钟。

将PCR扩增产物纯化，连接到DNA载体上。将重组DNA载体转化感受态细胞。含有重组DNA载体的细胞在介质中培养增殖，筛选阳性培养物。将阳性培养物继续培养增殖后，提取质粒，进行电泳、酶切和PCR扩增鉴定，并进行序列测定。测序结果表明，本发明获得了一个330bp的DNA片段，经与基因库中的前胸腺素基因序列比较，证实该330bp的DNA片段为奶牛的犊牛前胸腺素基因。

本发明通过分离前胸腺素α基因，前胸腺素α基因的克隆、鉴定、序列测定；含有前胸腺素α基因的重组基因的构建；这种重组基因能在宿主细胞中累积表达前胸腺素蛋白；该重组基因被用于生产前胸腺素；基因技术表达的前胸腺素α蛋白具有天然产物的生物学活性。奶牛的犊牛前胸腺素α基因具有SEQ ID NO.1的特征，表达产生的奶牛前胸腺素α蛋白具有SEQ ID NO.2所示的特征。本发明的重组基因可用于医药产品-胸腺素的工业化生产。

本发明的前胸腺素基因序列长度330个碱基，比所公布的某些人和动物的前胸腺素基因缺失3个碱基。与人前胸腺素基因AF348514、BC003510、BC022433、BC051265、J04799和L21693的核苷酸差异率分别为9.8％，9.8％，10.5％，9.8％，10.6％，11.2％；与鸡BM486191前胸腺素基因的核苷酸差异率为18.5％，与鼠M20035和NM008972前胸腺素基因的核苷酸差异率为10.1％。

根据本发明获得的奶牛前胸腺素基因的核苷酸序列，设计下列引物，以构建表达载体。

正向引物1’：ATG TCA GAC GCG GCC GTG

反向引物2’：CTC GAG CTA GTC ATC TTT ATC AGT CTT C

以牛胸腺总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增出含全长编码框的序列，用XhoI和EcoRI酶切PCR产物，将酶切片段连接到表达载体上。利用热激法转化原核宿主细胞，挑选阳性克隆，进行测序鉴定。

纯化的重组DNA载体酶切后线性化，用氯化铯法转化酵母细胞，在培养基介质中筛选抗性转化子。

在介质培养基中诱导前胸腺素的表达，每天取上清液1ml，诱导表达7天。样品经SDS-PAGE后，银染。根据标准蛋白确定表达产物的分子量为：1.3×10⁴D。

前胸腺素的生物活性测定采用³H-TdR掺入法，取小鼠脾脏在钢筛上研磨后用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用PBS洗后，悬于含10％FCS的1640培养液中，向96孔培养板中加入4×10⁵/孔的脾细胞和125ug/孔的ConA。在二氧化碳培养箱中于37℃培养6h，再加入不同浓度的融合蛋白和商品Tα1，继续培养72h，每孔加入³H-TdR185×10^-3GBq继续培养6h，收获细胞于玻璃纤维滤纸上，晾干后用液闪记数仪检测cpm值，按下列公式计算增殖率：

增殖率(％)＝(实验组cpm值-对照组cpm值)/对照组cpm值×100％

结果表明：前胸腺素对小鼠脾淋巴细胞具有明显的增殖效应。

本发明所获得的犊牛前胸腺素cDNA通过现有的基因工程技术方法，转入酵母菌并得以表达，可用来生产能提高人体免疫力，并具有抗癌作用的胸腺素，用于医药产品的生产制备。

本发明利用基因表达方法生产前胸腺素既解决了原料来源问题，也解决了工业化大量生产的瓶颈，同时可降低胸腺素现在的市场价格，开拓更广阔的应用范围。由于胸腺素蛋白在医学领域所起的作用，本发明从奶牛胸腺组织中分离出编码奶牛前胸腺素的基因，设计了反转录和PCR扩增的特异性引物对，利用反转录-聚合酶链式反应，从奶牛中分离出编码前胸腺素的基因。进一步构建表达载体，转化宿主细胞。在该宿主细胞培养液中获得前胸腺素蛋白，获得的前胸腺素蛋白具有较高的活性。

(四)附图说明

图1为前胸腺素基因编码区PCR电泳图谱，其中泳道1为100bp的标准DNA分子量Mark，泳道2和3为目的基因阳性PCR。

图2为编码区序列的质粒酶切图谱，其中泳道1为100bp的标准DNA分子量Mark，泳道2为1kb的标准DNA分子量Mark，泳道3-6为阳性质粒酶切结果。

图3为表达载体的酶切图谱，其中泳道1为1kb的标准DNA分子量Mark，泳道2为阴性对照，泳道3为阳性。从3切出的330bp大小的条带可以看出表达载体已经构建成功。

图4为前胸腺素的活性测定图即表达的前胸腺素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图。其中横坐标为作用时间，纵坐标为小鼠脾淋巴细胞的增殖率。“—▲—”表示转基因工程菌表达物的增殖率，“—■—”表示商品前胸腺素的增殖率。以前胸腺素先与淋巴细胞保温5小时左右，再加入ConA刺激，产生的促增殖效应最佳。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

一、奶牛之犊牛胸腺组织的采集与处理

从一头12日龄的犊公牛体采集胸腺组织，冷冻保存于-80℃冰箱。这头犊公牛系黑白花奶牛品系。取-80℃冰箱保存的胸腺组织3克剪碎后，放置在一无菌乳钵中，加入无菌石英砂研磨，按1∶3比例加入0.01M灭菌磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，于-20℃冰箱保存备用。

二、奶牛前胸腺素α基因反转录和PCR扩增的引物设计

由基因库下载了6个人、1个鸡和2个鼠的前胸腺素基因序列，登录编号分别为AF348514、BC003510、BC022433、BC051265、J04799、L21693和BM486191。用生物学软件比较分析了上述基因的序列差异或同源性，设计一对引物，这对引物在前胸腺素mRNA反转录和cDNA扩增获得前胸腺素α基因方面具有很重要的意义：

正向引物1：CCA TCT TTG CAT TGT TCC

反向引物2：CTC ATA CAA ACC AAC TCA TTA TAG TAC AGC

反向引物2被用于前胸腺素mRNA的反转录；正向引物1和反向引物2一起被用于前胸腺素α基因的PCR扩增。

三、奶牛前胸腺素α基因的克隆方法

1.总RNA的提取

a)将-20℃冰箱保存的犊牛胸腺细胞悬液反复冻融2次。

b)于450μl胸腺细胞悬液中加入450μl含有β-巯基乙醇的细胞裂解液和450μl无水乙醇。

c)用硅胶柱吸附核酸。

d)用缓冲液洗涤硅胶柱。

e)用无RNase酶的灭菌水洗脱核酸，离心收集于试管中。

f)向上述RNA提取物中加入RNase抑制剂。

2.mRNA反转录形成mRNA/cDNA杂合链(第一链)：

首先设计下列引物：

正向引物1：CCA TCT TTG CAT TGT TCC

反向引物2：CTC ATA CAA ACC AAC TCA TTA TAG TAC AGC

取2ug总RNA，加入5倍RT缓冲液5μl，10mM的dNTP 1μl，反向引物21μl，反转录酶10u，42℃反应60分钟，72℃反应10分钟终止反应。

3.用PCR方法，以正向引物1、反向引物2和DNA聚合酶等合成犊牛前胸腺素基因的双链cDNA片段。

(1)反应体系

10倍反应缓冲液            5μl

25mM MgCl                 24μl

10mM dNTP                 1μl

正向引物1                 5p mol

反向引物2                 5p mol

模板cDNA                  2μl

Taq DNA聚合酶             0.5μl

无菌水                    36.5μl

总体积                    50μl

(2)PCR反应条件

94℃4分钟；循环：94℃45秒，55℃50秒，72℃40秒，共30个循环，72℃延伸3分钟。

4.基因克隆：取2μl PCR产物与pGEM-T easy载体进行连接，具体操作步骤按照Promega公司产品pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态菌株，在表面涂有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素的LB平板上生长过夜，挑取白色单菌落，在LB液体培养基中摇菌培养过夜。

5.质粒DNA的提取：取过夜培养菌液1-2ml，10000rpm离心1分钟。收集细胞，用美国Promega公司的微量DNA纯化试剂盒纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。

6.序列测定：取纯化的质粒用载体引物进行全自动测序。所测得的基因具有以下的序列信息：

(1)序列特征

*长度：330个碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(2)分子类型：cDNA

(3)最初来源：奶牛胸腺组织

(4)序列描述：

ATGTCAGACG  CGGCCGTGGA  CAACAGCTCC  GAGATCACCA  CCAAGGACTT    50

AAAGGAGAAG  AAGGAAGTTG  TGGAGGAGGC  GGAGAATGGG  AGAGAGGCAC     100

CTGCAAATGG  GAATGCTAAT  GAGGAAAATG  GGGAGCAGGA  AGCAGACAAC     150

GAGGTAGACG  AAGAAGAGGA  GGAAGGTGGG  GAGGAAGAGG  AGGAGGAGGA     200

AGGTGACGGT  GAGGAAGAGG  ACGGAGATGA  AGATGAGGAG  GCCGAGGCAG     250

CTACGGGCAA  ACGGGCAGCT  GAAGATGACG  AGGATAACGA  TGTGGATACC     300

AAGAAGCAGA  AGACTGATAA  AGATGAGTAG                             330

7.同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与GENEBANK中的序列进行比较。

比较结果：本发明前胸腺素基因序列长度330个碱基，比所公布的其它人和动物的前胸腺素基因缺失3个碱基。与人前胸腺素基因AF348514、BC003510、BC022433、BC051265、J04799和L21693的核苷酸序列差异率分别为9.8％，9.8％，10.5％，9.8％，10.6％，11.2％；与鸡BM486191前胸腺素基因的核苷酸差异率为18.5％，与鼠M20035和NM008972前胸腺素基因的核苷酸差异率为10.1％。

实施例2：表达载体的构建

1.根据实施例1获得的奶牛前胸腺素基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物1’：ATG TCA GAC GCG GCC GTG

反向引物2’：CTC GAG CTA GTC ATC TTT ATC AGT CTT C

2.获得完整的前胸腺素基因

以含奶牛前胸腺素基因的重组质粒为模板，进行聚合酶链反应。

(1)反应体系：

10倍反应缓冲液            5μl

25mM MgCl2                4μl

10mM dNTP                 1μl

正向引物1’                                 5p mol

反向引物2’                                 5p mol

质粒DNA                   2μl

Taq DNA聚合酶             0.5μl

无菌水                    36.5μl

总体积                    50μl

(2)PCR反应条件：94℃3分钟。循环：94℃45秒，51℃50秒，72℃40秒，共计30个循环。72℃延伸5分钟。

3.取600μg酶切的PCR产物与100μg载体连接，连接产物转化大肠杆菌，在含G418的LB平板上筛选抗性转化子。提取质粒后进行酶切和序列测定。将测序正确的菌株甘油保存。

4.大量提取重组载体质粒，纯化后，进行线性化，用LiCl转化法转化酵母菌株，在含G418的YPD平板上筛选抗性转化子。提取质粒后分别以PCR、酶切等方法进一步鉴定抗性转化子。含重组载体的酵母菌株甘油保存。

实施例3：在真核酵母细胞中诱导蛋白表达和表达产物的鉴定

1.在含20ml/L甲醇的BMGY培养基中诱导前胸腺素的表达，每天取细胞培养液1ml，诱导表达7天，样品保存备用。

2.前胸腺素蛋白的分离与纯化

将收集到的细胞培养液9000rpm离心20分钟，收集上清后过Ni²⁺-chelatingSepharose亲和柱层析纯化蛋白，收集洗脱峰进行活性测定。

3.分子量测定：SDS-PAGE尿素法。样品经SDS聚丙酰氨电泳和银染后，根据标准蛋白确定表达产物的分子量为1.3×10⁴D。

4.蛋白含量测定  以Lowry法进行，用牛血清白蛋白作标准蛋白。

5.纯度鉴定  采用10％和16％两个梯度的PAGE。在垂直电泳槽中，依次加入16％和10％的分离胶聚合，然后再加入浓缩胶，***样品梳。上样、电泳。电流20mA。电泳完毕后，胶板用50％～0.054％甲醛溶液固定1h，再用0.25％考马斯亮蓝G250染液染2h，以15％甲醇～7.5％乙酸溶液中脱色。

实施例4：生物活性测定

1.淋巴细胞增殖实验(³H-TdR掺入法)

无菌采集小鼠脾脏，在加有无菌石英砂的乳钵中研磨粉碎后，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，以0.01M PBS pH7.2洗涤两次，离心。沉淀重悬于含10％犊牛血清的1640培养液中。分别于不同时间向96孔培养板中加入脾细胞4×10²/孔和不同浓度的前胸腺素，于37℃ CO₂孵箱中培养6h，再加入终浓度为5μg/ml的ConA，并设对照组。培养板于37℃，5％CO₂条件下培养72h后，每孔加入³H-TdR18.5×10^-3GBq继续培养6h，收获细胞于玻璃纤维滤纸上，晾干后，用液闪计数仪检测cpm值。按下式计算增殖率：

增殖率(％)＝(实验组cpm值-对照组cpm值)/对照组cpm值×100％

试验结果：

脾细胞和前胸腺素预作用6h时，60-120μg/ml剂量的前胸腺素对淋巴细胞的增殖效果最为明显。高剂量的前胸腺素(＞680μg/ml)会有一定的抑制作用。

2.NK细胞活性测定

实验组：小鼠脾淋巴细胞与不同浓度的前胸腺素于37℃作用3h。

对照组：小鼠脾淋巴细胞与培养液于37℃作用3h。

然后用培养液洗涤，沉淀丸重悬于培养液中作为效应细胞。用⁵¹Cr释放法测定NK活性。于96孔培养板中分别加入100μl不同浓度的效应细胞和100μl ⁵¹Cr标记的YAC-1靶细胞，用培养液代替效应细胞作为自然释放对照。1000rpm离心5min，37℃，5％CO₂条件下作用6h，按下式计算细胞毒活性：

细胞毒活性(％)＝cpm(实验组-自然释放组)cpm(最大释放组-自然释放组)×100％。

结果表明剂量在10～1000μg/ml范围内的前胸腺素与淋巴细胞作用后可明显增强NK细胞的杀伤作用。

3.IL-1活性检测

实验前3d以TG培养基诱导老龄鼠pMφ，按常规法收集pMφ。以RPM1640培养液配置浓度为2×106/ml的细胞悬液，加至培养板各孔，随后加入LPS及不同浓度的待测药物，作用24h，收获上清，即为含IL-1培养液。以实验小鼠的胸腺细胞为靶细胞，设立三复孔，采用常规3H-TdR掺入法测量IL1活性。设空白对照和阴性对照。

结果表明前胸腺素在LPS的刺激下能明显提高老龄鼠pMφ分泌的IL1的活性。

实施例7：犊牛前胸腺素cDNA的重组应用

将实施例1所获得的犊牛前胸腺素cDNA通过现有的基因工程技术方法，转入酵母菌并得以表达，可用来生产能提高人体免疫力，并具有抗癌作用的胸腺素，用于医药产品的生产制备。

实施例8：胸腺素的临床应用

1.恶性肿瘤

恶性肿瘤在进行化疗和放疗时，对机体免疫功能具有副面影响。李秀清等(1991)将胸腺素用于放疗和化疗肿瘤患者的辅助治疗，经与未使用胸腺素的对照组比较认为：胸腺素能调节和增强肿瘤患者的免疫功能，减轻化疗和放疗的副面作用，提高疗效，延长存活期。动物试验表明胸腺素处理的饿淋巴细胞能明显抑制肺黑色素瘤的转移。郑金娣等(1994)报道胸腺素治疗肺癌的有效率达64％，能增强患者的抵抗力，减轻化疗的反应，该药几乎没有刺激性和毒副反应。

2.病毒性肝炎和肝硬化

胸腺素可以促进IL-2的生成，调节免疫功能，对肝细胞具有直接或间接的保护作用。例涤新等(1989)用胸腺素治疗慢性重症肝炎的研究结果表明治疗组患者的存活率比未治疗组高一倍。高涛等(1997)报道胸腺素具有调节人体细胞免疫功能，能抑制和消除乙肝病毒、***的作用，能使乙肝患者HbeAg的阴转率达到72.27％，乙肝病毒DNA清除率达到54.55％，而且未见任何毒副作用。

3.肾病

胸腺素可增加T细胞绝对数，活化吞噬细胞，可抵消免疫抑制剂治疗的副作用。向毅等(1991)用胸腺素治疗20例肾病患者，发现胸腺素能改善临床症状。

4.扁平疣

芮建新等(1991)用胸腺素治疗扁平疣患者45例，与用左旋咪唑比较，治愈率高21/3倍，有效率高14/6倍。

5.儿童反复呼吸道感染

郑金娟等(1990)应用胸腺素治疗100例呼吸道反复感染患儿，每周1-3次肌注注射，2-3周为一疗程，结果表明总有效率88％，治愈率59％，明显优于对照组。治疗组治疗后免疫功能增前，体重增加，副作用极小。

                        序列表

<110>山东省科学院生物研究所

<120>奶牛之犊牛前胸腺素基因及其克隆方法与应用

<140>

<141>

<160>2

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>330

<212>DNA

<213>奶牛胸腺组织

<400>1

atgtcagacg cggccgtgga caacagctcc gagatcacca ccaaggactt aaaggagaag      60

aaggaagttg tggaggaggc ggagaatggg agagaggcac ctgcaaatgg gaatgctaat     120

gaggaaaatg gggagcagga agcagacaac gaggtagacg aagaagagga ggaaggtggg     180

gaggaagagg aggaggagga aggtgacggt gaggaagagg acggagatga agatgaggag     240

gccgaggcag ctacgggcaa acgggcagct gaagatgacg aggataacga tgtggatacc     300

aagaagcaga agactgataa agatgactag                                      330

<210>2

<211>109

<212>PRT

<213>奶牛胸腺组织

<400>2

Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Asn Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys

1                5                   10                 15

Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Va1 Glu Glu Ala Glu Asn Gly

                 20                  25                 30

Arg Glu Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu

                 35                  40                 45

Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly

                 50                  55                 60

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly

                 65                  70                 75

Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ala Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala

                 80                  85                 90

Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr

                 95                  100                105

Asp Lys Asp Asp 109

Claims (5)

1、奶牛的犊牛前胸腺素基因，其特征在于，序列如下：

ATGTCAGACG CGGCCGTGGA CAACAGCTCC GAGATCACCA CCAAGGACTT  50

AAAGGAGAAG AAGGAAGTTG TGGAGGAGGC GGAGAATGGG AGAGAGGCAC  100

CTGCAAATGG GAATGCTAAT GAGGAAAATG GGGAGCAGGA AGCAGACAAC  150

GAGGTAGACG AAGAAGAGGA GGAAGGTGGG GAGGAAGAGG AGGAGGAGGA  200

AGGTGACGGT GAGGAAGAGG ACGGAGATGA AGATGAGGAG GCCGAGGCAG  250

CTACGGGCAA ACGGGCAGCT GAAGATGACG AGGATAACGA TGTGGATACC  300

AAGAAGCAGA AGACTGATAA AGATGACTAG 330。

2、权利要求1所述的奶牛的犊牛前胸腺素基因的克隆方法，包括如下步骤：

(1)设计特异性引物：

正向引物1：CCA TCT TTG CAT TGT TCC

反向引物2：CTC ATA CAA ACC AAC TCA TTA TAG TAC AGC

(2)从奶牛的犊牛胸腺组织中提取总RNA或mRNA，然后用反转录酶和反向引物2由上述前胸腺素基因的mRNA来产生双链的mRNA/cDNA杂合分子；

(3)用DNA聚合酶、正向引物1和反向引物2在步骤(2)后通过PCR反应产生双链的cDNA分子；

(4)将所得的双链的cDNA分子***载体内，转化宿主细胞；

(5)宿主细胞增殖后得到含有前胸腺素基因的质粒：

a)提取和确定质粒中前胸腺素基因，

b)将上述基因***到表达载体内，构建重组表达载体，构建表达载体时获得***的目的基因PCR反应所用的引物如下：

正向引物1’：ATG TCA GAC GCG GCC GTG

反向引物2’：CTC GAG CTA GTC ATC TTT ATC AGT CTT C

c)上述重组表达载体转化宿主细胞，

d)上述宿主细胞在介质中培养繁殖后，累积前胸腺素蛋白；累积的前胸腺素蛋白被分离和纯化，得到的是犊牛前胸腺素蛋白，该蛋白具有如下的氨基酸序列：

Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Asn Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys

1                5                   10                 15

Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly

                 20                  25                 30

Arg Glu Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu

                 35                  40                 45

Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly

                 50                  55                 60

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly

                 65                  70                 75

Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ala Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala

                 80                  85                 90

Glu Asp Asp Glu Asp Asn Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr

                 95                  100                105

Asp Lys Asp Asp

          109。

3、如权利要求2所述的奶牛的犊牛前胸腺素基因的克隆方法，其特征在于，所述步骤(2)的反应组分如下：

反转录酶                 1ul

反向引物2                1ul

胸腺素基因的mRNA         13ul

5倍的RT-Buffer           5ul

10mM dNTP                1ul。

4、如权利要求2所述的奶牛的犊牛前胸腺素基因的克隆方法，其特征在于，所述的步骤(3)反应组分和条件如下：

10倍PCR Buffer           5μl

25mM MgCl2               4μl

10mM dNTP                1μl

正向引物                 15p mol

反向引物2                5p mol

模板cDNA                 2μl

DNA聚合酶                0.5μl

灭菌无离子水             36.5μl

总体积                   50μl

PCR反应条件：

94℃4分钟；循环：94℃ 45秒，55℃ 50秒，72℃ 40秒，共30个循环，72℃延伸3分钟。

5、权利要求1所述的奶牛的犊牛前胸腺素基因用于制备胸腺素医药产品。

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