CN1787837A - 防止和治疗癌转移以及与癌转移相关的骨质损失的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了M－CSF拮抗剂，含有M－CSF拮抗剂的药物组合物，含有药物组合物的试剂盒，预防和治疗患有转移性癌症的病人中的骨质转移的方法，筛选M－CSF拮抗剂的方法，以及M－CSF拮抗剂在药物中的用途和M－CSF拮抗剂在制备防止和治疗骨质转移和肿瘤生长的药物中的用途。

Description

防止和治疗癌转移以及与癌转移相关的骨质损失的方法
本申请要求美国临时专利申请60/426781的利益，该申请提交于2002年11月15日。
技术领域
本发明涉及通过给对象施用M-CSF拮抗剂来防止和治疗癌转移以及与癌转移相关的骨质损失的方法。
发明背景
癌转移是癌症病人手术后或治疗后复发的主要原因。尽管对治疗方法的发展付诸了很大的努力，但是癌转移仍然很难治疗。骨骼是多种人类癌症(例如，***癌、肺癌、***癌和甲状腺癌)转移的最常发生的位置之一。溶骨性转移的发生会因难以控制的疼痛、对于骨折的高度易感性、神经压迫和高血钙症而引发严重的病症。尽管这些临床问题十分严重，但是目前几乎没有治疗与癌转移相关的骨质损失的疗法。
破骨细胞介导骨质的重吸收(readsorption)。破骨细胞是由造血细胞分化而来的多核细胞。通常认为，破骨细胞是由骨髓中的造血干细胞衍生而来的单核细胞前体融合形成的，而不是由不完全的细胞***形成的(Chambers，Boneand Mineral Research，6：1-25，1989；Gthling等人，Clin Orthop RelatR.120：201-228，1976；Kahn等人，Nature 258：325-327，1975，Suda等人，Endoer Rev 13：66-80，1992；Walker，Science 180：875，1973；Walker，Science 190：785-787，1975；Walker，Science 190：784-785，1975)。它们和单核细胞-巨嗜细胞细胞系拥有共同的干细胞(Ash等人，Nature 283：669-670，1980，Kerby等人，J.Bone Minver Res 7：353-62，1992)。破骨细胞前体向成熟的多核破骨细胞的分化需要各种不同的因素，包括激素的和局部的刺激(Athanasou等人，Bone Miner 3：317-333，1988；Feldman等人，Endocrinology107：1137-1143，1980；Walker，Scienee 190：784-785，1975；Zheng等人，Histochem J 23：180-188，1991)，而且活的骨骼和骨细胞也被证实在破骨细胞的发育中起到重要的作用(Hagenaars等人，Bone Miner 6：179-189，1989)。成骨细胞或骨髓基质细胞同样也是破骨细胞分化所需要的。这些细胞所产生的支持破骨细胞生成的因子之一就是巨嗜细胞集落刺激因子，M-CSF(Wiktor-Jedrzejczak等人，Proc Natl Acad Sci USA 87：4828-4832，1990；Yoshida等人，Nature 345：442-444，1990)。NF-κB配体的受体活化因子(RANKL，也称为TRANCE，ODF或OPGL)是另一个信号(Suda等人，Endoer Rev 13：66-80，1992)，通过该信号成骨细胞/基质细胞刺激破骨细胞的生成和通过位于破骨细胞和破骨细胞前体上的受体——RANK(TRANCER)——进行再吸收(Lacey等人，Cell93：165-176，1998；Tsuda等人，Biochem Biophys Res Co 234：137-142，1997；Wong等人，J Exp Med 186：2075-2080，1997；Wong等人，J Biol.Chem272：25190-25194，1997；Yasuda等人，Endocrinology 139：1329-1337，1998；Yasuda等人，Proc Natl Acad Sci US 95：3579-3602，1998)。成骨细胞还分泌出一种强烈抑制破骨细胞生成的蛋白，即骨保护素(osteoprotegerin，OPG，也称为OCIF)，该蛋白充当RANKL的假受体，因此抑制破骨细胞和成骨细胞之间通过RANK和RANKL传递的正向信号。
破骨细胞负责溶解矿物质和有机骨基质(Blair等人，J Cell Biol102：1164-1172，1986)。破骨细胞代表终末分化的且表现出独特极化形态的细胞，它具有特殊的细胞膜区域和几个细胞膜和胞质的标记，例如耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)(Anderson等人1997)，碳酸酐酶II(Vaananen等人，Histochemistry 78：481-485，1983)，降钙素受体(Warshafsky等人，Bone6：179-185，1985)和玻璃体结合蛋白受体(Davies等人，J Cell Biol109：1817-1826，1989)。尽管多核破骨细胞通常含有不到10个细胞核，但是它们可含有直径在10和100μm之间的多达100个细胞核(Gthling等人，ClinOrthop Relat R 120：201-228，1976)。这使它们在光学显微镜下相对容易辨认。处于活跃状态时，这些细胞具有很多液泡，而且还含有许多线粒体，这暗示着很高的新陈代谢率(Mundy，骨代谢疾病和矿物代谢疾病的初级读本(Primer onthe metabolic bone diseases and disorders of mineal metabolism)，18-22页，1990)。因为破骨细胞在溶骨性骨质转移中起主要作用，所以在本领域中需要新的药剂和方法来防止对破骨细胞的刺激作用。
因此，本领域一直需要确定新的药剂和方法，以便用于防止或治疗癌转移，包括溶骨性骨质转移(bone metastases)。
发明概述
本发明的组合物和方法填补了本领域中先前提到的和其它相关的需求。在本发明的一个实施例中，提供了一种防止骨质转移的方法，该方法包括：给忠有转移性癌症的对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂，从而防止与转移性癌症相关的骨质损失。在本发明的另一实施例中，提供了一种治疗转移到骨的转移性癌症的方法，该方法包括：给所述的对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂，从而降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重程度。在相关的实施例中，提供了上述的方法，其中所述的对象是哺乳动物，或所述的哺乳动物是人。
本发明的方法是通过抑制M-CSF和其受体(M-CSFR)之间的相互作用而达到治疗效果的。进一步，抑制M-CSF/M-CSFR的相互作用，就抑制了由肿瘤细胞所引起的破骨细胞的增殖和/或分化。在本发明的一个实施例中，先前所述方法的M-CSF拮抗剂选自下列各项所组成的组：包含抗-M-CSF抗体的多肽；包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
在本发明的另一实施例中，在所提供的上述方法中，M-CSF拮抗剂是抗-M-CSF抗体。在一个相关实施例中，M-CSF拮抗剂是包含抗-M-CSFR抗体的多肽。在又一实施例中，M-CSF拮抗剂是包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。在还有一个实施例中，M-CSF拮抗剂是包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
在另一个本发明的实施例中，M-CSF拮抗剂是一种抗体，该抗体选自下列各项构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和前述的抗体中任一个的突变蛋白。在又一实施例中，抗体结合的抗原表位和单克隆抗体5H4(ATCC保藏号HB10027)所结合的抗原表位相同。
有许多转移性癌症可用本申请揭示的方法进行治疗。在一个实施例中，转移性癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、***癌、腺癌、血细胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。
本发明同样包括施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂。在一个实施例中，M-CSF拮抗剂是一种抗体，其施用剂量在约0.01mg/kg和约100mg/kg之间。
在另一实施例中，提供与M-CSF相结合的非鼠源性抗体来治疗患有转移性癌症的对象，其中所述的抗体有效地降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重程度。
如本文所述，本发明的抗体抑制溶骨作用。在本发明的一个实施例中，提供了非鼠源性单克隆抗体，该抗体与M-CSF特异结合的抗原表位和5H4与M-SCF所结合的抗原表位相同。在另一实施例中，所提供的非鼠源性单克隆抗体和5H4竞争结合M-CSF。较佳地，该非鼠源性单克隆抗体和5H4竞争结合M-CSF的程度超过10％；较优地，该竞争结合程度超过25％；更优地，超过50％；更优地，超过75％；最优地，超过90％。
应理解，前述的任何一种抗体都可以施用于有需要的对象。因此，本发明的一个实施例提供一种药物组合物，它含有前述的任何一种抗体和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在本发明的一个实施例中，提供了一种用于治疗患有转移性癌症患者的非鼠源性抗体，其中该抗体有效地降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重程度。在一个相关实施例中，前述的抗体选自由下列各项所构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和前述的抗体中任一个的突变蛋白。在另一实施例中，抗体具有M-CSF特异性。在又一本发明的实施例中，抗体具有M-CSFR特异性。在其他实施例中，抗体是完全的人抗体或人源化抗体。在还有一个本发明的实施例中，提供了分泌前述抗体的杂交瘤细胞。
有许多转移性癌症可用本文揭示的抗体进行治疗。在一个实施例中，转移性癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、***癌、腺癌、血细胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。在一个相关实施例中，提供了一种药物组合物，它含有前述的抗体和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
对防止或治疗与癌转移相关的骨质损失具有潜在作用的M-CSF，可以用不同的试验进行筛选。在本发明的一个实施例中，提供了一种筛选M-CSF拮抗剂的方法，包括以下步骤：使转移性肿瘤细胞培养基、破骨细胞和候选拮抗剂相接触；检测破骨细胞的生成、增殖和/或分化；和将所述的候选拮抗剂确定为M-CSF拮抗剂，如果检测到破骨细胞的生成、增殖和/或分化有所减少。在一个相关实施例中，所构思的筛选方法中的转移性肿瘤细胞培养基包括肿瘤细胞。
在本发明的另一实施例中，所提供的方法中接触步骤在体内进行，所述的检测步骤包括检测骨质转移的大小和/或数目，并且如果检测到骨质转移的大小和/或数目有所降低，那么所述的候选拮抗剂则被确定为M-CSF拮抗剂。在一个相关实施例中，该方法进一步包括以下步骤：确定所述的候选拮抗剂是否与M-CSF相结合。在另一个相关实施例中，该方法进一步包括以下步骤：确定所述的候选拮抗剂是否抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。
应理解，使用本文所述的筛选方法可以确定许多不同的拮抗剂。在一个实施例中，所提供的方法中候选拮抗剂选自下列各项所构成的组：包含抗-M-CSF抗体的多肽；包含其抗M-CSFR抗体的多肽；包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；肽；或小分子。在一个相关实施例中，所提供的方法中所述的候选拮抗剂是M-CSF突变蛋白。在另一个相关实施例中，所提供的方法中候选拮抗剂是抗-M-CSF抗体。在又一个相关实施例中，候选拮抗剂是M-CSF突变蛋白。在另一实施例中，候选拮抗剂是抗-M-CSF抗体。在还有一个实施例中，候选拮抗剂是抗-M-CSFR抗体。
本发明的另一实施例提供一种确定可以防止或治疗向骨转移的转移性癌症的M-CSF拮抗剂的方法，它包括以下步骤：检测候选拮抗剂与M-CSF的结合；和测定所述候选拮抗剂在体外或体内防止或治疗向骨转移的转移性癌症的能力。在一个相关实施例中，提供了一种确定可以防止或治疗向骨转移的转移性癌症的M-CSF拮抗剂的方法，它包括以下步骤：检测候选拮抗剂与M-CSFR的结合；和测定所述候选拮抗剂在体外或体内防止或治疗向骨转移的转移性癌症的能力。在另一实施例中，提供一种确定可以防止或治疗向骨转移的转移性癌症的M-CSF拮抗剂的方法，它包括以下步骤：确定能够抑制M-CSF和M-CSFR之间相互作用的候选拮抗剂；和测定所述候选拮抗剂在体外或体内防止或治疗向骨转移的转移性癌症的能力。
更有利的是，将两种或更多种M-SCF拮抗剂混合在一起，从而提高药物对癌转移和/或与癌转移相关的骨质损失的疗效。因此，本发明的一个实施例提供了一种防止骨质转移和肿瘤生长的方法，该方法包括：给患有转移性癌症的对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂和治疗剂，从而防止与转移性癌症相关的骨质损失并防止肿瘤生长。类似地，本发明的另一实施例提供一种治疗患有转移性癌症的对象的方法，该方法包括：给所述对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂和治疗剂，从而降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重程度并抑制肿瘤生长。在相关方面，前述方法中的对象是哺乳动物。在另一实施例中，对象是人。
在本发明的另一实施例中，所提供的前述方法中的拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。在又一实施例中，拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。在还有一个实施例中，M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：包含抗-M-CSF抗体的多肽；包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
大量的M-CSF拮抗剂抗体在本发明的构思之中。在一个实施例中，所提供的前述方法中的抗体选自下列各项构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和前述抗体中任一个的突变蛋白。
在本发明的另一实施例中，所提供的前述方法中，治疗剂是二磷酸盐(bisphosphonate)。在另一实施例中，所述的二磷酸盐(bisphosphonate)是卓乐膦酸盐(zeledronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、氯膦酸盐(clodronate)、依替膦酸盐(etidronate)、替鲁膦酸盐(tilundronate)、阿伦膦酸盐(alendronate)或伊班膦酸盐(ibandronate)。在另一实施例中，所提供的治疗剂是化疗剂。应理解，一些对象可以不接受二磷酸盐治疗。作为例子，如果对象对于二磷酸盐没有足够的反应，如果对象不能耐受二磷酸盐治疗，或者如果二磷酸盐对于对象的特定症状(例如，肾衰竭)是禁忌使用的，那么该对象可以不接受二磷酸盐治疗。癌症化疗剂包括，但并不限于：烷化剂，例如卡铂和顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，例如卡莫司汀(carmustine，BCNU)；抗代谢物，例如氨甲喋呤；嘌呤类似物抗代谢物，巯嘌呤(mercaptopurine)；嘧啶类似物抗代谢物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(gemcitabine)；激素性抗肿瘤药(hormonal antineoplastics)，例如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)、它莫西芬(tamoxifen)；天然抗肿瘤物质，例如阿地白介素(aldesleukin)、白细胞介素-2、多西紫杉醇(docetaxel)、依托泊苷(etoposide，VP-16)、干扰素α、紫杉醇(paclitaxel)、和维甲酸(ATRA)；抗生素类天然抗肿瘤物质，例如博莱霉素、更生霉素、红必霉素、多柔比星、和丝裂霉素；以及长春花碱类天然抗肿瘤物质，例如长春花碱、长春花新碱、去乙酰长春酰胺；羟基脲；醋葡醛内酯、阿霉素、异磷酰胺(ifosfamide)、依诺他滨(enocitabine)、阿柔比星(aclarubicin)、安西他滨(ancitabine)、尼莫司汀(nimustine)、盐酸甲基苄肼、卡波醌(carboquone)、卡莫氟(carmofur)、色霉素A3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺、裂殖菌多糖(Schizophyllan)、阿糖胞苷、氮烯唑氨、硫肌苷、硫替派、替加氟(tegafur)、新抑癌蛋白(neocarzinostatin)、OK-432、博莱霉素、氟铁龙(furtulon)、溴尿苷(broxuridine)、白消安(busulfan)、二磷酸己烯雌酚四钠(honvan)、培洛霉素(peplomycin)、苯丁抑制素(Bestatin)(也称为乌苯美司ubenimex)、干扰素β、美雄烷(mepitiostane)、二溴甘露醇(mitobronitol)、马法兰(merphalan)、层粘连蛋白肽、采绒革盖菌(Coriolusversicolor)提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(estramustine)(***/氮芥(mechlorethamine))。
进一步，其它用作癌症病人附加疗法的药物包括EPO、G-CSF、更昔洛韦(ganciclovir)、抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；叠氮胸苷(AZT)；白细胞介素1到18、包括其突变物和类似物；干扰素或细胞因子，例如干扰素α、β和γ；激素，例如促***释放激素(LHRH)及其类似物以及***释放激素(GnRH)；生长因子，例如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)、和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α和β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形态发生蛋白1至7(BMP1-7)；生长抑素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原性物质；前体药物；生长因子受体激酶抑制剂；抗-Her2抗体；和VEGF中和抗体。
在一个相关实施例中，M-CSF拮抗剂有效地降低达到一定疗效时所需的治疗剂的施用剂量。因此，M-CSF拮抗剂可以提高另一种治疗剂的效果，或减少与施用另一种治疗剂有关的副作用，或提高另一种治疗剂的安全性。M-CSF拮抗剂还可以提高另一种治疗方式(诸如手术或放疗)的疗效、减少其副作用、或提高其安全性。在另一实施例中，上述方法进一步包括以下步骤：施用非M-CSF型集落刺激因子，例如G-CSF。在本发明的又一实施例中，提供了一种包含M-CSF拮抗剂和癌症治疗剂的药物组合物。
在本发明的另一实施例中，提供了一种包装、药瓶或容器，它包括：含有M-CSF拮抗剂的药物和使用说明(即药物应当与手术或放疗联合使用)。在本发明的另一实施例中，提供了一种防止或治疗向骨转移的转移性癌症的方法，该方法包括以下步骤：给对象施用M-CSF拮抗剂并用手术或放疗治疗所述对象。
M-CSF拮抗剂可用作有效的免疫治疗剂，这也在构思之中。因此，本发明的一个实施例提供了一种靶向在细胞表面上表达膜结合M-CSF的肿瘤细胞的方法，该方法包括以下步骤：施用一种特异结合于膜结合M-CSF的胞外部分[SEQID NO：2]的抗体。在另一实施例中，抗体偶联于放射性核素或其他毒素。在另一实施例中，抗体选自下列各项构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和前述抗体中任一个的突变蛋白。
在另一方面，本发明构思了一种基于免疫疗法的肿瘤治疗方法，该方法通过施用抗-M-CSF抗体来靶向在细胞表面上表达膜结合M-CSF的肿瘤细胞。本文的实施例表明，多种癌细胞会表达膜结合形式的M-CSF，其中包括但并不限于：***癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、骨肉瘤和甲状腺癌。因此，本发明包括杀死表达膜结合M-CSF的肿瘤细胞或抑制其生长的方法，该方法包括以下步骤：施用有效剂量的结合于M-CSF的抗体，该抗体可以是单独的，也可以偶联于细胞毒性分子。尽管优选的是特异地与膜结合M-CSF相结合的抗体，然而任何与膜结合M-CSF的胞外部分相结合的抗体都可用于这些方法。
本发明还包括，将本发明中任一种M-CSF拮抗剂都可用于治疗癌症，包括非转移性的癌症。在其它方面，本发明包括将本发明的任一种拮抗剂用于治疗高血钙症、佩吉特氏病或骨质疏松。
在本发明的一个实施例中，提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，其中组成所述癌症的细胞不分泌M-CSF，该方法包括以下步骤：施用M-CSF拮抗剂。在一个相关实施例中，提供了一种防止骨转移的方法，该方法包括给患有转移性癌症的对象施用一定剂量的M-CSF拮抗剂，使之有效地中和对象细胞所产生的M-CSF，该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF的剂量。在又一个实施例中，提供了一种治疗患有向骨转移的转移性癌症的对象的方法，该方法包括给该对象施用一定剂量的M-CSF拮抗剂，使之有效地中和对象细胞所产生的M-CSF，该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF的剂量。
本发明还包括多种用途。举例来说，本发明的一个实施例提供了将任何一种前述抗体用于药物。类似地，提供了一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，该药物用以防止患有转移性癌症的对象发生骨转移。在另一实施例中，提供了一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，该药物用以防止患有转移性癌症的对象发生与癌症相关的骨质损失。在又一个实施例中，提供一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，该药物用以治疗患有骨转移性的转移性癌症的对象。在还有一个实施例中，提供一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，该药物用以降低患有骨转移性的转移性癌症的对象中所发生的与癌症相关的骨质损失的严重程度。
很多对象可从本文所述的M-CSF拮抗剂的用途和方法中获益。在一个实施例中，对象是哺乳动物。在另一实施例中，哺乳动物是指人。
在本发明的另一实施例中，提供了前面所述的用途，其中拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。在另一实施例中，拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。在另一实施例中，M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：包含抗-M-CSF抗体的多肽；包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。在一个相关实施例中，抗体选自下列各项构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和上述任何一种抗体或片段的突变蛋白。
在本发明的另一实施例中，在所提供的前述用途中，所述的抗体对M-CSF具有特异性。在一个相关实施例中，抗体是抗体5H4。在又一个实施例中，所述的抗体对M-CSFR具有特异性。
应理解，很多种转移性癌症可作为本发明前述用途中相关的靶目标。在一个实施例中，转移性癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、***癌、腺癌、血细胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。在另一实施例中，前述用途中所述的M-CSF拮抗剂是一种抗体，该抗体的施用剂量在约0.01mg/kg和l00mg/kg之间。
本发明还构思了很多种药物。举例来说，所提供的前述用途用于药物生产，该药物用以治疗患有转移性癌症的对象。在另一实施例中，提供了将抗体用于药物制备的用途，该药物用以降低患有骨转移性的转移性癌症的对象所发生的与癌症相关的骨质损失的严重程度。在又一个实施例中，提供将M-CSF拮抗剂和一种治疗剂用于药物制备的用途，该药物用以防止发生在患有转移性癌症的对象中的骨转移和肿瘤生长。在还有一个实施例中，提供将M-CSF拮抗剂和一种治疗剂用于药物制备的用途，该药物用以防止发生在患有转移性癌症的对象身上的与癌症相关的骨质损失。
在另一实施例中，提供将M-CSF拮抗剂和一种治疗剂用于药物制备的用途，该药物用以治疗转移性癌症。在又一实施例中，提供将M-CSF拮抗剂和一种治疗剂用于药物制备的用途，该药物用以在患有骨转移性的转移性癌症的对象中降低所发生的与癌症相关的骨质损失的严重程度以及抑制肿瘤生长。在还有一个实施例中，提供包含一种M-CSF拮抗剂和一种治疗剂的产品的用途，该产品作为组合制剂，它们被同时、分别或依次用于癌症的治疗。
在本发明的另一实施例中，提供将M-CSF拮抗剂用于药物制备的用途，该药物用以防止或治疗骨转移性的转移性癌症，其中该药物同一种癌症治疗剂同时、分别或依次地施用。在又一个实施例中，提供将一种癌症治疗剂用于药物制备的用途，该药物用以防止或治疗骨转移性的转移性癌症，其中该药物同M-CSF拮抗剂同时、分别或依次地施用。在还有一个实施例中，提供一种包装、药瓶或容器，它包括：含有M-CSF拮抗剂的药物以及使用说明，即药物应当与手术或放疗联合使用。进一步，所提供的前述用途中，所述的对象是哺乳动物。更进一步，所提供的前述用途中，所述的哺乳动物是人。在另一实施例中，前述用途中的拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。在又一个实施例中，拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。
在另一实施例中，所提供的前述用途中，所述的M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：包含抗-M-CSF抗体的多肽；包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。另外，在另一实施例中，所提供的抗体选自下列各项构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和任何一个前述抗体的突变蛋白。
本发明还包括多种治疗剂。在一个实施例中，在所提供的前述用途中，所述的治疗剂是二磷酸盐(bisphosphonate)。另外，在另一实施例中，所述的二磷酸盐(bisphonate)是卓乐膦酸盐(zeledronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、氯膦酸盐(clodronate)、依替膦酸盐(etidronate)、替鲁膦酸盐(tilundronate)、阿伦膦酸盐(alendronate)或伊班膦酸盐(ibandronate)。在又一个实施例中，治疗剂是化疗剂。在一个相关实施例中，对象不接受二磷酸盐治疗。
在本发明的另一实施例中，提供M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于降低施用于对象用以治疗或防止骨转移和肿瘤生长的治疗剂的剂量。在另一实施例中，提供将M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子用于制备药物的用途，该药物用以防止在患有转移性癌症对象中发生的骨转移和肿瘤生长。在又一个实施例中，提供将M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子用于制备药物的用途，该药物用以防止在患有转移性癌症对象中发生的与癌症相关的骨质损失。
在本发明的另一实施例中，提供将M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子用于制备药物的用途，该药物用以治疗转移性癌症。在又一个实施例中，提供将M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子用于制备药物的用途，该药物用以在患有转移性癌症对象中降低与癌症相关的骨质损失的严重程度以及抑制肿瘤生长。在一个相关实施例中，提供前述的用途，其中非M-CSF型集落刺激因子是G-CSF。
本发明的另一实施例提供了一种特异地与膜结合M-CSF的胞外部分相结合的抗体在药物制备中的用途，该药物用以靶向在细胞表面上表达膜结合M-CSF的肿瘤细胞。在另一实施例中，提供了一种抗体在药物制备中的用途，其中该抗体(a)特异结合于膜结合M-CSF的胞外部分，并且(b)偶联于放射性核素或其它毒素，而该药物用于癌症的治疗。在一个相关实施例中，提供了前述的用途，其中所述的抗体选自下列各项构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；人源化抗体；人抗体；嵌合抗体；Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和上述任何一种抗体的突变蛋白。
在本发明的另一实施例中，提供了非鼠源性抗-M-CSF抗体在制备癌症治疗药物中的用途。在一个相关实施例中，癌细胞不分泌M-CSF。在本发明的另一实施例中，提供了将一定剂量的M-CSF拮抗剂(该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量)用于药物制备的用途，该药物用于防止骨转移。在又一个实施例中，提供了将一定剂量的M-CSF拮抗剂(该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量)用于药物制备的用途，该药物用于中和对象细胞所产生的M-CSF。在还有一个实施例中，提供了将一定剂量的M-CSF拮抗剂(该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量)用于药物制备的用途，该药物用于治疗患有骨转移性癌症(metastatic cancer to bone)的对象。在另外一个实施例中，提供了将一定剂量的M-CSF拮抗剂(该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量)用于药物制备的用途，该药物用于治疗癌症。
在本发明的范围内，还包括试剂盒。典型的试剂盒包括一个含有本发明拮抗剂的包装、容器或药瓶以及使用说明(例如产品插页或标签)，其中使用说明用于指导用户按本发明任一方法来使用药剂。
附图简述
图1是显示出截短的二聚体M-CSF中二硫键位置的拓扑结构图。
图2是C-α骨架的立体图，其中每10个残基都被标出，而非结晶学对称轴则用虚线表示。
图3对比显示了纯化的M-CSF和来自MDA 23l细胞和MCF7细胞的条件培养基(CM)对破骨细胞的诱导活性。
图4对比显示了与来自MDA231细胞的条件培养基(CM)相比，单克隆抗体5H4对于纯化的M-CSF的中和活性。
图5显示出5H4和其它抗人M-CSF抗体的中和活性。
图6显示了在各实验动物组中，平均溶骨值≥2.5的动物数目在接受了5A1+5H4抗体联合治疗的动物组中是最低的。
图7表明在各实验动物组中，平均溶骨值≥2.5的动物数目在接受了5A1+5H4抗体联合治疗的动物组中是最低的。
图8显示M-CSF-特异性抗体结合于***癌细胞系MDA231或多发性骨髓瘤细胞系ARH77。
图9显示M-CSF普遍存在于多种肿瘤细胞的表面。
详细描述
具有转移能力是癌症的定义性特征。转移是指癌细胞向身体的其它部分扩散，或者是指由这样的扩散所造成的状况。转移是一个复杂的多步骤过程，包括细胞遗传物质的改变、改变的细胞发生不受控制的增殖从而形成原发性肿瘤、发展出用于原发性肿瘤的新血液供给、来自原发性肿瘤的细胞侵入循环***、小簇的原发性肿瘤细胞扩散至身体的其它部分、和在那些部位的继发性肿瘤的生长。
骨骼是人***癌、肺癌、***癌和甲状腺癌以及其它癌症最常发生转移的位置之一，而且尸体解剖发现多达60％的癌症病人发生骨转移。溶骨性骨转移表现出独特的破骨细胞骨质重吸收步骤，这在转移至其它器官的癌症中并未发现。与癌转移相关的骨质损失是由破骨细胞(具有重新吸收矿化组织能力的多核巨大细胞)所介导的，而破骨细胞似乎是被肿瘤产物所激活的。
已经发现，集落刺激因子(CSF1)，也被称为巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)，对于破骨细胞的形成至关重要。此外，已经证实，通过与其它可溶性因子协同作用以及成骨细胞和成纤维细胞之间的细胞间相互作用，M-CSF可调控成熟破骨细胞的破骨功能、这些细胞的迁移以及存活(Fixe和Praloran，Cytokine 10：3-7，1998；Martin等人，真核基因表达的重要回顾(Critical Rev.in Eukaryotic Gene Expression)8：107-23(1998))。
全长的人M-CSF mRNA编码具有554个氨基酸的前体蛋白(SEQ ID NO：4)。通过可变mRNA剪接和不同的翻译后蛋白水解加工，M-CSF或者作为一种糖蛋白或含有蛋白聚糖的硫酸软骨素而被分泌进入循环***，或者在产生M-CSF的细胞表面表达成为跨膜糖蛋白。细菌表达的人M-CSF氨基末端的150个氨基酸(这是要使该蛋白在体外仍保持完全的生物学活性所必需的最短序列)的三维结构，暗示此蛋白是一个通过二硫键相连的二聚体，而每个单体则由4个α螺旋束和一个反平行β折叠构成(Pandit等人，Science 258：1358-62(1992))。通过可变剪接，产生三种不同的M-CSF。这三种多肽前体是具有256个氨基酸的M-CSFα(DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO：1和2)、具有554个氨基酸的M-CSFβ(DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO：3和4)、具有438个氨基酸的M-CSFγ(DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO：5和6)。M-CSFβ是一种分泌蛋白，它不以膜结合形式出现。M-CSFα表达为整合膜蛋白，并且由于蛋白水解切割而缓慢释放。M-CSFα在SEQ ID NO：2中191-197位氨基酸处被切开。膜结合形式的M-CSF能与邻近细胞上的受体相互作用，并由此介导特异的细胞-细胞接触。
多种形式的M-CSF都是通过与靶细胞上的受体M-CSFR相结合而发挥其功能的。M-CSFR(其DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO：7和8)是一种跨膜分子，它包含5个胞外免疫球蛋白样结构域、一个跨膜域和一个膜内不连续的Src相关酪氨酸激酶结构。M-CSFR是由c-fms原癌基因所编码的。M-CSF与M-CSFR的胞外结构域相结合导致受体的二聚体化，这就激活了胞浆内的激酶域，引起其自磷酸化和其它细胞蛋白的磷酸化(Hamilton J.A.，J LeukocBiol.，62(2)：145-55(1997))；Hamilton J.A.，Immuno Today.，18(7)：313-7(1997)。
磷酸化的细胞蛋白引发了一系列生化事件的级联反应，并导致细胞做出反应：有丝***、分泌细胞因子、细胞膜褶皱、和调控它自身受体的转录(Fixe和Praloran，Cytokine 10：32-37(1998))。
M-CSF在基质细胞、破骨细胞和其它细胞中表达。它还在***、子宫和卵巢肿瘤细胞中表达。这些肿瘤组织中的表达程度与高评分等级和较差的预后相关(Kacinski Ann.Med.27：79-85(1995))；Smith等人，Clin.CancerRes.1：313-25(1995))。在***癌中，M-CSF主要在侵袭性的肿瘤细胞中表达，这和管内(侵入前)癌症恰恰相反(Scholl等人，J.Natl.Cancer Inst.86：120-6(1994))。除此以外，M-CSF显示能够加快哺乳动物肿瘤向恶性转化的进程(Lin等人，J.Exp.Med.93：727-39(2001))。对于***癌和卵巢癌，M-CSF的产生似乎导致巨嗜细胞被募集到肿瘤组织。
目前，没有关于M-CSF拮抗剂用于防止或治疗癌症转移或与癌转移相关的骨质损失的报道。作为本发明的一部分，已经发现M-CSF拮抗剂能够中和由转移性癌细胞所诱发的破骨细胞。因此，本发明提供了用于治疗或防止癌症转移和与癌转移相关的骨质损失的组合物和方法。
如本文所用，“肿瘤”指各种肿瘤细胞的生长和增殖，不论是恶性的还是良性的，以及所有癌变前的和癌变的细胞和组织。
术语“癌症”和“癌变的”意指或用于描述哺乳动物中以不受调控的细胞生长为典型特征的生理情况。癌症的例子包括但并不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病。这些癌症的更具体例子包括，***癌、***癌、结肠癌、鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌症、胰腺癌、胶质母细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾腺癌、肾癌、肝癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种不同类型的头部和颈部癌症。
“治疗”是一种旨在防止疾病症状的发展或改变疾病症状的病理特征的干预手段。因此，“治疗”不仅指治疗性措施，也指预防性或防止性措施。那些需要接受治疗的对象包括已经表现出疾病症状的对象和有必要防止疾病症状出现的对象。在肿瘤(例如，癌症)治疗中，治疗剂可以直接降低肿瘤细胞的病理情况，或者使肿瘤细胞对其它治疗剂(例如，放疗和/或化疗)更加敏感。癌症的“病理症状”包括危及病人健康的所有状况。这包括，但并不限于：不正常的或不受控制的细胞生长、转移、干预邻近细胞的正常功能、以失常水平释放细胞因子或其它分泌物质、抑制或加重炎症应答或免疫应答等。
如本文所用，短语“转移性癌症”的定义是有能力向身体其它部分(尤其是骨)扩散的癌症。大量癌症能够转移至骨，但是最常见的转移性癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌和***癌。举例来说，其它能转移至骨的癌症包括，但并不限于：腺癌、血细胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。
本发明特别构思了对由肿瘤所引发的溶骨性病变的防止和治疗。
I.拮抗剂
如本文所用，术语“拮抗剂”通常是指一个分子、化合物或其它试剂所具有的特性，例如干扰一种分子与另一种分子相结合的特性或干扰一种细胞被另一种细胞激活的特性，其中这种干扰可以通过空间位阻、构象改变或是其它生化机制来实现。一方面，术语拮抗剂是指一种制剂所具备的阻止受体与其配体相结合的特性，例如，阻止M-CSF与M-CSFR的结合，从而抑制由M-CSF引发的信号传导途径。拮抗剂这一术语不局限于任何特定的作用机制，而是泛指本文所定义的功能特性。本发明的拮抗剂包括，但并不限于：M-CSF抗体和片段以及其突变蛋白和修饰形式，可溶性的M-CSF和其片段、突变蛋白以及修饰形式，以及与M-CSF或M-CSFR相结合的多肽以及其它化合物和分子，和抑制M-CSF和M-CSFR表达的反义化合物。任选地，本发明的拮抗剂可不包括靶向M-CSF的反义分子。本发明的任一种拮抗剂可以用本领域已知的任何方式施用。例如，M-CSF突变蛋白、M-CSFR突变蛋白或结合于M-CSF或M-CSFR的抗体片段可以通过基因治疗的方法施用。
在合适的情况下，本发明的M-CSF拮抗剂包括功能等价物。例如，分子的长度、结构、组分等可以不同，但是它们仍可能保留一种或多种所定义的功能。更具体地，本发明的抗体、抗体片段或肽的功能等价物可以包括模拟化合物，也就是设计用于模拟适当的抗原结合构象和/或取向的结构体(constructs)。
优选的M-CSF拮抗剂可任选地通过添加侧基等方式进行修饰，例如，通过氨基端的酰化作用、羧基端的酰胺化作用或通过向氨基酸侧链偶联额外的基团。拮抗剂还可以含有一个或多个保守的氨基酸置换。“保守的氨基酸置换”是指在氨基酸序列中保留了被置换氨基酸的总电荷、疏水性/亲水性和/或立体构象(steric bulk)的那些置换氨基酸。例如，以下各组中的氨基酸置换是保守的：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Cys/Thr、和Phe/Trp/Tyr。这样的置换基本上不会降低M-CSF拮抗剂的功效，而且还可能表现出一些有利的特性，例如在体内半衰期的延长或毒性的降低。
本发明还包括具有除了氨基酸的***、缺失、或置换以外的修饰的多肽。举例来说，修饰本质上可以是共价的，并且包括如与聚合物、脂类、其它有机和无机部分之间的化学键。制备这些衍生物可以提高多肽的循环半衰期，或者可以设计改善多肽对希望靶向的细胞、组织、或器官的靶向能力。类似地，本发明还包括这样的M-CSF或M-CSFR多肽，它们可以经过共价修饰后含有一个或多个水可溶性聚合物附加体，例如聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
如本文所用，术语“治疗有效剂量”是指一定剂量的治疗或预防用M-CSF拮抗剂，该剂量适合本发明的例子，并且根据期望的治疗方法施用后可以获得期望的治疗或预防的效果或应答。
如本文所用，人“M-CSF”是指与成熟的人M-CSFα、M-CSFβ或M-CSFγ多肽基本具有基本同样的氨基酸序列的人多肽。M-CSFα、M-CSFβ或M-CSFγ多肽描述于Kawasaki等人，Science 230：291(1985)，Cerretti等人，MolecularImmunology，25：761(1988)，或Ladner等人，EMBO Journal 6：2693(1987)中，每一篇都引入本文作为参考。这样的术语反映了这样的认识，即三种成熟的M-CSF具有不同的氨基酸序列(如上所述)，而且M-CSF的活性形式是以二硫键相连的二聚体形式；因此，当术语“M-CSF”指的是生物活性形式时，所指的是二聚体形式。“M-CSF二聚体”是指已经成为二聚体的2个M-CSF多肽单体，并且包括同二聚体(由2个相同类型的M-CSF单体构成)和异二聚体(由2种不同的单体构成)。M-CSF单体可以在体外转化成M-CSF二聚体，参见美国专利号4,929,700的描述，该文献引入本文作为参考。
M-CSF抗体
术语“抗体”采用其最广义的含义，包括完全装配的抗体、能够结合抗原的抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、二体(diabodies))、以及含有上述抗体或片段的重组多肽。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从本质相同的抗体群中所得到的抗体，也就是组成该群体的单独抗体都是相同的，除了可能少量出现的自发突变之外。单克隆抗体是高度特异的，指向单一的抗原性位置。而且，传统(多克隆)的抗体制剂一般包含指向不同决定簇(表位)的不同抗体，与此相反，每个单克隆抗体都指向抗原上的单一决定簇。除了特异性以外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过均一的培养而制备，不会被具有不同特异性和特征的其它免疫球蛋白所污染。
修饰语“单克隆”代表该抗体是从本质相同的抗体群中得到的这一特征，而并不能解释成需要采用某种特殊的方法生产该抗体。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人，Nature，256：495(1975)最早描述的杂交瘤方法进行制备，也可以用重组DNA的方法来制备(参见，例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可以用如Clackson等人，Nature，352：624628[1991]中描述的方法从噬菌体抗体库中分离得到。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二体；线性化抗体(Zapata等人，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生2个完全相同的抗体结合片段，称为“Fab”片段和一个残留的“Fc”片段，每个“Fab”片段都有一个抗体结合区，而“Fc”片段的命名则反映出它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)2片段，该片段具有2个包含抗体的VH和VL结构域的“单链Fv”或“sFv”抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽进一步在VH和VL之间含有一个多肽接头，使Fv能够形成有利于抗原结合的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的“单克隆抗体的药理学”(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“二体”是指具有2个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一个多肽链中包含相连的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。所用的接头太短至使同一条链上的两个区域无法配对，于是这些区域只能和另一条肽链上的互补区域相配对，从而产生两个抗原结合区。二体在例如EP404,097；WO93/11161和30 Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中有更详尽的描述。
“分离的”抗体是指已从存在于自然环境下的组分中识别、分离和获得的抗体。自然环境中的污染组分是指会对该抗体的诊断和治疗作用起干扰作用的物质，这些物质可包括酶、激素、和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选的实施例中，抗体被纯化至(1)由Lowry法测得的纯度超过抗体的95wt％，更佳地超过99wt％，(2)其纯度足以采用旋杯测序仪测定的N-末端或内部的氨基酸序列的至少15个残基，或者(3)在还原和非还原条件下，在SDS-PAGE中表现出均一性，其染色方法采用考马斯蓝染色或更佳地银染。分离的抗体包括存在于重组细胞内的原位抗体，因为至少有一种抗体自然环境中的组分不存在。然而，制备分离抗体通常需要至少一个纯化步骤。
“Fv”是包含一个完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一区域是由一条重链可变区和一条轻链可变区通过紧密、非共价的缔合所组成的二聚体。正是在这种构象下，每个可变区的三个CDR才相互作用并在VH VI二聚体表面界定一个抗原结合位点。六个CDR共同将特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变区(或仅含有三个抗原特异性CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，不过其亲和力要比整个结合区的亲和力低很多。
Fab片段还包含轻链的恒定区以及重链的第一恒定区(CH1)。Fab片段与Fab’片段的差异在于：Fab片段多了重链CH1区羧基端的一些残基，这些残基包含一个或多个抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定区中半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab’片段。最初产生的F(ab’)2抗体片段是在两个Fab’片段之间含有铰链半胱氨酸的Fab’片段配对物。
“中和抗体”是指能够消除或大大减弱与其结合的靶抗原的效应子功能的抗体分子。因此，“中和”的抗靶向抗体能够消除或大大减弱效应子功能，例如酶活性、配体结合、或细胞内信号传导。
如本文所提供，在用于治疗癌症转移和/或与癌症转移相关的骨质损失的组合物和方法中，可使用一种或多种抗体，它们可以单独使用或与其它疗法联合使用而达到所需效果。本发明的抗体可以从动物中分离获得，该动物因为与环境中的抗原直接接触或用抗原进行免疫而产生抗体。或者，抗体可以使用本领域熟知的抗体表达***通过重组DNA方法生产(参见，例如：Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1998))。这样的抗体可以包括重组IgG、含有免疫球蛋白衍生序列的嵌合融合蛋白或“人源化”抗体，这些都可以根据本发明用于治疗癌症转移和/或与癌症转移相关的骨质损失。除了完整的、全长的分子之外，术语“抗体”还指其片段(例如，scFv、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab)’2片段)或与M-CSF(或M-CSFR)结合的完整分子和/或片段的多聚体或集合体。这些抗体片段结合于抗原，并可以衍生化以具有有利于清除和摄取的结构特征，例如，通过掺入半乳糖残基。
在本发明的一个实施例中，M-CSF拮抗剂是单克隆抗体，其制备方法基本上描述于Halenbeck等人的美国专利：5,491,065(1997)，该文献在此作为参考引入。M-CSF拮抗剂的典型实例包括结合于表观结构抗原表位(该抗原表位和重组或天然的二聚体M-CSF相关)的单克隆抗体，并且还伴随有中和的生物活性。这些抗体实质上并不与无生物活性形式的M-CSF(包括M-CSF单体和化学衍生的M-CSF二聚体)起反应。
在本发明的其它实施例中，提供了人源化的抗-M-CSF单克隆抗体。短语“人源化抗体”是指从非人类的抗体(典型的是鼠单克隆抗体)衍生而来的抗体。或者，人源化抗体可以由嵌合抗体衍生而来，该抗体保留了或基本保留了亲代、非人类抗体的抗原结合特性，但是在施用于人类时，它所表现的免疫原性与亲代抗体相比有所减弱。如本文所用，短语“嵌合抗体”是指所包含的序列来源于两个不同抗体的抗体(参见，例如美国专利号：4,816,567)，这两个不同的抗体通常源自两个不同的物种。最典型地，嵌合抗体包含人和鼠的抗体片段，通常是人抗体的恒定区和鼠抗体的可变区。
短语“互补决定区”是指这样的氨基酸序列，这些序列共同界定了天然免疫球蛋白结合区的天然Fv区域的结合亲和力和特异性(参见，例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Kabat等人，美国健康和人类服务部NIH出版物(U.S.Dept of Health and Human Services NIH Publication)No.913242(1991))。短语“恒定区”是指抗体分子中赋予效应子功能的部分。在本发明中，鼠抗体恒定区优先用人抗体恒定区替换。该人源化抗体的恒定区可来源于人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自5种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。
如果本发明的抗体结合到抗原的Ka大于或等于约104M-1，较佳地大于或等于约105M-1，更佳地大于或等于约106M-1，更佳地大于或等于约107M-1，最佳地大于或等于约108M-1、109M-1、或1010M-1，那么就称这些抗体具有免疫特异性或是特异结合的。例如，合适的抗-M-CSF/M-CSFR特异性抗体结合于抗原的亲和度至少为104M-1，较佳地大于或等于约105M-1，更佳地大于或等于约106M-1，更佳地大于或等于约107M-1，最佳地大于或等于约108M-1、109M-1、或1010M-1。抗M-CSF/M-CSFR抗体结合于不同的天然存在形式的M-CSF/M-CSFR，包括宿主/对象组织以及肿瘤所表达的M-CSF/M-CSFR。本文揭示的单克隆抗体对M-CSF和M-CSFR具有亲和性，并且其特征是解离平衡常数(Kd)至少为10-4M，优先为至少约10-7至约10-8M，更优先为至少约10-8M至约10-12M。适用于本发明方法的单克隆抗体和其抗原结合片段，能够特异地与M-CSF/M-CSFR结合。这样的亲和度可以很容易地用传统技术进行测定，例如：应用平衡透析；应用BIAcore2000仪器，采用制造商给出的通用程序；应用125I标记的M-CSF进行放射免疫测定；或使用技术人员已知的其他方法。亲和数据的分析可以用例如Scatchard等，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)中给出的方法。因此，很显然，优选的M-CSF拮抗剂可表现出对M-CSF的高度特异性，而对其它分子的亲和力则要低很多。
用于生产抗体的抗原可以是，例如，完整的M-CSF或是保留了所需抗原表位的M-CSF片段，并且可以任选地与另一多肽相融合，而该多肽要容许抗原表位仍表现出其天然构象。
多克隆抗体
优选地，通过在皮下(sc)或腹腔内(ip)多次注射相关抗原和佐剂，从而在动物中产生多克隆抗体是。要提高抗体反应，可以将相关抗原偶联于对免疫物种具有免疫原性的蛋白上，例如，钥孔虫戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，偶联可以用双功能剂或衍生剂来完成，例如，马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimideester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基偶联)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其他制剂。
动物用抗原、免疫原性的偶联物或衍生物进行免疫，通过将例如：100μg或5μg的蛋白或偶联物(分别用于免疫兔或小鼠)和3倍体积的Freund氏完全佐剂混合，然后将该溶液皮内注射于多处部位。一个月后，这些动物用1/5至1/10原数量的多肽或偶联物(在Freund氏佐剂中)，通过多处皮下注射而进行加强免疫。在加强免疫注射后7-14天，给动物放血，并检测血清抗体的效价。对动物进行加强免疫，直到效价达到平台值。优选地，采用相同抗原的偶联物来加强免疫动物，但是该偶联物偶联于不同蛋白和/或通过不同的交联剂而偶联。偶联物还可以在重组细胞培养中作为融合蛋白产生。同样地，诸如明矾之类的聚集剂适合用来增强免疫应答。
单克隆抗体
单克隆抗体可用杂交瘤方法制得，该方法首次由Kohler等人描述于Nature，256：495(1975)，或可用重组DNA的方法制备。
在杂交瘤方法中，使用本文所述的方法免疫小鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，从而诱生出淋巴细胞，该细胞生产或能够生产特异地与用于免疫的蛋白相结合的抗体。或者，淋巴细胞可以在体外进行免疫。然后，用适当的融合剂，例如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
这样制得的杂交瘤细胞可接种并生长于合适的培养基中，该培养基优先包含一种或多种抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的典型培养基则含有次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，而这些物质阻碍HGPRT-缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是融合效率高、支持选出的产生抗体的细胞稳定而高水平地生产抗体、并且对于培养基敏感的骨髓瘤细胞。人骨髓瘤和鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系均被描述已用于生产人单克隆抗体(Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
对杂交瘤细胞在其中生长的培养基进行检测，以分析是否产生针对抗原的单克隆抗体。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性是用免疫沉淀或体外结合分析(诸如，放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。单克隆抗体结合的亲和性可用例如Scatchard分析法加以确定(Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980))。
在杂交瘤细胞中识别出能够产生具有所期望的特异性、亲和性、和/或活性的抗体的杂交瘤之后，这些克隆可以用限制稀释程序进行亚克隆化，并用标准方法培养生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤而在动物体内生长。亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养基、腹水、或血清中，用传统的免疫球蛋白纯化程序进行合适的分离，例如，蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。
编码单克隆抗体的DNA可以用常规程序(例如，使用能够特异地与编码单克隆抗体重链和轻链的基因相结合的寡核苷酸探针)，从杂交瘤细胞中分离出并测序。一旦分离，DNA可以置于表达载体中，然后，再将该载体转染宿主细胞，诸如E.coli细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或原本不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。抗体的重组生产在本领域是熟知的。
可以用如下方法获得所需抗体的氨基酸序列变异体：通过向编码DNA中引入合适的核苷酸改变，或通过肽链合成。这些变异包括，例如，抗体的氨基酸序列中出现的残基的缺失、和/或***、和/或置换。可以实施任何缺失、***、和置换的组合来完成最终的构建，只要最终的构建物具有期望的特征。氨基酸的变化还可以改变人源化或变异抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
编码抗体变异序列的核酸分子，可用本领域已知的各种不同方法制备。这些方法包括但并不限于，从天然来源中分离(在天然存在氨基酸序列变异的情况下)，或对先前制备的变异形式或非变异形式的抗体采用寡核苷酸介导的(或定点)突变、PCR突变、和盒式突变的方法来制备。
因为嵌合的或人源化抗体在人体中所具有的免疫原性不如其亲代鼠单克隆抗体的免疫原性强，所以它们可以用于人类治疗而发生过敏反应的危险性却低得多。因此，在治疗应用涉及体内施用于人体时，优选使用这些抗体。
嵌合的单克隆抗体(其中鼠单克隆抗体的可变Ig区与人的恒定Ig区相融合)，能够用本领域已知的标准程序生产(参见Morrison，S.L.，等人(1984)嵌合的人抗体分子；小鼠抗原结合区和恒定区结构域，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，6841-6855；和，Boulianne，G.L.，等人，Nature 312，643-646.(1984))。尽管已经证实，一些嵌合的单克隆抗体在人中的免疫原性较低，但是鼠可变Ig区仍能引起显著的人抗-鼠反应。
人源化抗体可以用各种不同方法制备，其中包括例如：(1)将非人互补决定区(CDRs)嫁接到人的骨架和恒定区上(这一过程在本领域中称为通过“CDR嫁接”进行人源化)，或者，(2)移植整个非人可变区，但是通过表面残基的置换用人样(human-like)的表面“覆盖”该区域(这一过程在本领域中称为“贴面”(veneering))。在本发明中，人源化抗体包括“人源化的”和“贴面的”抗体。这些方法揭示于，例如，Jones等人，Nature 321：522 525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：6851 6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65 92(1988)；Verhoeyer等人，Science 239：15341536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489 498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169 217(1994)；和Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng.4(7)：73383(1991)，以上每一文献都引入本文作为参考。
CDR嫁接包括将鼠重链和轻链可变Ig域内6个CDR中的一个或多个CDR引入人可变Ig域中合适的四个框架区域中，这也称为CDR移植。这一技术(Reichmann，L.，等人，Nature 332，323(1998))，应用保守的框架区域(FR1-FR4)作为支架来支持CDR环，这些CDR环是与抗原主要接触的部分。然而，CDR嫁接的一个缺点是，这一方法会导致人源化抗体的结合亲和力大大低于原始的鼠抗体的结合亲和力，这是因为框架区的氨基酸能对抗原结合有贡献，以及因为CDR环的氨基酸能影响两个可变Ig域的结合。要保持人源化单克隆抗体的亲和力，CDR嫁接可以通过选择与原始鼠抗体的框架区最相似的人框架区加以改进，或者由计算机模拟抗原结合位点进行协助，通过框架区或CDRs中单个氨基酸的定点突变加以改进(例如，Co，M.S.，等人(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)。
一种对抗体进行人源化方法包括：比对非人的和人的重链和轻链序列，根据这样的比对选择出人的框架，并用它来置换非人的框架，分子模拟预测人源化序列的构象并与亲代抗体的构象比较。这一过程以后就是对CDR区域残基(所述的残基干扰CDRs的结构)进行回复突变，直至所预测的人源化序列模型的构象十分接近于亲代非人抗体的非人CDR构象。这样的人源化抗体可以进一步衍生化，从而利于摄取和清除，例如，通过Ashwell受体(参见，例如，美国专利号：5,530,101和5,585,089，这些专利引入本文作为参考)。
已经报道了很多鼠单克隆抗体经过合理的设计而获得人源化产物(参见，例如，出版于2002年6月11日的20020091240，WO92/11018和美国专利号，5,693,762，美国专利号，5,776,886)。
一种识别抗体中作为优先突变位置的特定残基或区域的有用方法，被称为“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所述。在此，一个或一组靶残基被识别(例如，带电荷的残基如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)，并用中性的或带负电荷的氨基酸(最优选的是丙氨酸或多聚丙氨酸)置换，从而影响氨基酸与抗原的相互作用。那些对置换表现出功能敏感性的氨基酸位点，再通过在该置换位点进一步引入变异或引入其它变异而得到更精细化。因此，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先确定的，但是突变本身的性质却不需要预先确定。例如，为了分析在一个给定位点突变的效果，可对靶密码子或靶区域进行丙氨酸扫描或随机突变，再对表达的变异抗体筛选所需的活性。
氨基酸序列***包括氨基端和/或羧基端的融合(其长度从一个残基到含有100个或甚至更多残基的多肽不等)，以及序列间一个或多个氨基酸残基的***。末端***的例子包括具有N-端甲硫氨酸残基的抗体或与表位标签融合的抗体。其它抗体分子的***变异包括与可延长抗体半衰期的多肽的融合。
另一个类型的变异是氨基酸取代变异。这些变异中，抗体分子内至少去除了一个氨基酸残基，并且在该位置***另一个不同的残基。可以在任何高变区或Cdr区或框架区内的进行取代突变。表1中以“优选取代”为标题列出了保守性取代。如果取代引起生物学活性的改变，那么可引入会产生更根本的变化(这些取代在表1中命名为“代表性取代”)，或者可进一步按下文所述的氨基酸类别的引入取代，并对产物进行筛选。
                            表1
                 最初的代表性优选残基取代形式
Ala(A)val；leu；ile val Arg(R)lys；gln；asn lys Asn(N)gln；his；asp，lys；gln arg Asp(D)glu；asn glu Cys(C)ser；ala ser Gln(Q)asn；glu asn Glu(E)asp；gln asp Gly(G)ala His(H)asn；gln；lys；arg Ile(I)leu；val；met；ala；leu phe；正亮氨酸Leu(L)正亮氨酸；ile；val；ile met；ala；phe Lys(K)arg；gln；asn arg Met(M)leu；phe；ileleu Phe(F)leu；val；ile；ala；tyr Pro(P)ala Ser(S)thr Thr(T)serser Trp(W)tyr；phe tyr Tyr(Y)trp；phe；thr；ser phe Val(V)ile；leu；met；phe；leu ala；正亮氨酸
抗体生物学特性的重大改变，是通过选用在以下一些方面上有很大区别的取代基团而实现的：(a)在取代区域仍然维持多肽的骨架结构，例如，仍然维持片层或螺旋结构；(b)仍然维持靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)仍然维持侧链的体积。天然存在的残基根据其共同的侧链特性可分为以下几组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中度亲水的：Cys，Ser，Thr；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；和
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代涉及用一个类别中的氨基酸成员置换另一类别中的成员。
任何对维持人源化或变异抗体的正确构型不起作用的半胱氨酸残基，也可以被取代，通常是用丝氨酸进行取代，来提高分子氧化稳定性，并且避免异常的交联。相反地，在抗体中可以加入半胱氨酸键，从而改善其稳定性(尤其当抗体是抗体片段如Fv片段时)。
亲和成熟化包括制备和筛选在亲代抗体的CDR内含有取代的抗体变异体，并选出生物学特性有所改善的突变体，例如，与亲代抗体相比其结合的亲和度有所提高。生产这样的取代变异体的方便方法，是使用噬菌体展示的亲和成熟法。简而言之，对多个高可变区的位点(如6-7个)进行突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的变异抗体以非共价结合的形式展示在丝状噬菌体颗粒的表面，作为与包装在每个噬菌体颗粒内的M13基因III产物相融合的融合蛋白。然后，再根据其生物学活性(如，结合的亲和度)来筛选噬菌体展示的变异体。
丙氨酸扫描诱变可以用来识别对抗原结合起很大作用的高可变区残基。作为替换形式，或者额外地，对抗原-抗体复合物结晶结构的进行分析，从而识别出抗原和抗体之间的接触位点是有利的。根据本文所述的技术，这些接触残基以及邻近残基作为取代的候选位点。这样的突变一旦产生，那么就可用本文所述的方法对变异体群进行筛选，并选出在一个或多个有关测试中表现出优越特性的抗体，用于进一步的开发。
抗体变异体还可以通过对亲代抗体的糖基化模式进行修饰而产生，例如去除抗体中一个或多个碳水化合物分子，和/或在抗体中加入一个或多个原先不存在的糖基化位点。
通常，抗体的糖基化为N-连接或O-连接。N-连接是指将碳水化合物组分连在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸，是酶催化在天冬酰胺侧链上加上碳水化合物组分的识别序列。多肽中存在任一种这样的三肽序列即构成潜在的糖基化位点。因此，可通过改变氨基酸序列使其包含一个或更多个这样的三肽序列，从而在抗体中引入N-连接的糖基化位点。O-连接糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖连于羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以连在5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸上。可以通过在最初抗体序列中***或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，从而在抗体中引入O-连接的糖基化位点。
人源化的或人M-SCF抗体也可以用转基因动物来制备，这些转基因动物不产生内源性的免疫球蛋白，并且经过基因工程改造而含有人免疫球蛋白基因座。例如，WO 98/24893揭示了具有一个人Ig基因座的转基因动物，其中这些动物由于内源性的重链和轻链基因座失活而不能产生具有功能的内源性免疫球蛋白。WO 91/741也揭示了转基因的非灵长类哺乳动物宿主能对免疫原产生免疫应答，其中抗体具有灵长类的恒定区和/或可变区，而且其中的内源性免疫球蛋白编码基因座被取代或失活。WO 96/30498揭示了使用Cre/Lox***修饰哺乳动物体内的免疫球蛋白基因座，例如替换恒定区或可变区的全部或一部分从而形成修饰的抗体分子。WO 94/02602揭示了具有失活的内源性Ig基因座和功能性的人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利No.5,939,598揭示了转基因鼠的制备方法，该转基因鼠缺乏内源性的重链，并且表达含有一个或多个异源恒定区的外源免疫球蛋白基因座。
使用上述转基因动物，能够对选定的抗原分子产生免疫应答，从该动物中取出产生抗体的细胞，并用来制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤。免疫方案和佐剂等在本领域中是已知的，并用来免疫例如WO 96/33735所述的转基因鼠。这一出版物揭示了针对各种不同抗原分子(包括IL6、IL8、TNFα、人CD4、L选择蛋白、gp39、和破伤风毒素)的单克隆抗体。可以检测单克隆抗体针对相应蛋白质活性或生理效应的抑制或中和能力。WO 96/33735揭示了抗IL-8的单克隆抗体，该抗体来源于用IL-8免疫的转基因鼠的免疫细胞，该抗体可封闭IL-8引发中性粒细胞的功能。在WO 96/34096和美国专利申请2003019440以及美国专利申请20030031667中，还揭示了对用于免疫转基因动物的抗原具有特异性的人单克隆抗体。
还可参见，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)和美国专利No5,591,669，美国专利No.5,589,369，美国专利No.、5,545,807；和美国专利申请No.20020199213。美国专利申请No.20030092125描述了将动物的免疫应答引向所需抗原表位的方法。人抗体也可以通过体外激活B细胞的方法来产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
重组人抗体基因库制备技术的发展以及将编码的抗体片段在丝状噬菌体表面进行展示技术，为直接制备人抗体提供了方法。用噬菌体技术产生的抗体作为细菌中的抗原结合片段产生，通常是Fv或Fab片段，也因此缺乏效应子功能。可以用以下两种策略之一来引入效应子功能：提供基因工程使片段在哺乳动物细胞中表达出完整的抗体，或使片段表达成为双特异性的抗体片段而其第二结合区能够引发效应子功能。
通常，抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)分别用PCR法进行克隆，并在组合噬菌体展示库中随机重组，然后再选择出可以与特定抗原结合的抗体。Fab片段在噬菌体表面表达，也就是与编码它们的基因物理连接。这样，通过抗原结合来选择Fab，同时也共选择到了Fab编码序列，随后，该序列可以进行扩增。通过几轮抗原结合和再扩增(该过程称为淘洗)，抗原特异性的Fab得到了富集，并最终被分离。
1994年，描述了一种抗体的人源化方法，称为“导向选择(guidedselection)”。导向选择利用了噬菌体展示技术对鼠单克隆抗体进行人源化的功能(参见Jespers，L.S.，等人，Bio/Technology 12，899-903(1994))。为此，鼠单克隆抗体的Fd片段可以和人轻链库联合展示，所得的杂交Fab库可以再用抗原进行选择。因此，鼠Fd片段充当了指导该选择的模板。随后，选出的人轻链与人Fd片段库相结合。选择所得的库就能得到完整的人Fab。
已经描述了多种从噬菌体展示库中获得人抗体的程序(参见，例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol，222：581-597(1991)；美国专利5,565,332和5,573,905；Clackson，T.，和Wells，J.A.，TIBTECH 12，173-184(1994))。特别地，源自噬菌体展示库的抗体的体外选择和演变已经成为了一个强有力的工具(参见，Burton，D.R.，和Barbas III，C.F.，Adv.Immunol.57，191-280(1994)；和，Winter，G.，等，Annu.Rev.Immunol.12，433-455(1994)；美国专利申请20020004215和WO92/01047；出版于2003年10月9日的美国专利申请20030190317以及美国专利6,054,287；美国专利5,877,293)。
Watkins的“通过捕捉提升法筛选噬菌体表达的抗体库”，分子生物学方法，抗体的噬菌体展示：方法和协议178：187-193，和2003年3月6日出版的美国专利200120030044772，描述了用捕捉提升法筛选噬菌体表达的抗体库或其它结合分子的方法，该方法包括将候选的结合分子固定在固相载体上。
可以采用本文中以“筛选方法”为标题的部分中所述的试验或采用任何本领域已知的合适的试验进行筛选，从而筛选出具有MCSF拮抗剂活性以及适用于本发明所述的治疗方法的抗体产物。
M-SCF突变蛋白
本发明进一步提供了可根据本发明的方法用作MCSF拮抗剂的M-CSF突变蛋白。
如本文所用，“片段”是指完整的天然分子的一部分；例如，多肽片段是天然多肽的一个片段，其中缺失了N-末端或C-末端的一个或多个氨基酸。
如本文所用，涉及多肽的“突变蛋白”是指完整的天然分子的变异体或天然分子片段的变异体，其中取代、***或缺失了一个或多个氨基酸，这样的取代、***或缺失可以发生在N-末端、C-末端或分子内部，因此，术语“突变蛋白”的范围也包括天然分子的片段。***的突变蛋白包括N-末端或C-末端的融合，例如，融合于免疫球蛋白的Fc部分，从而增加其半衰期。
根据本发明，用Smith-Waterman同源性检索算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997))确定时，优选的突变蛋白至少表现出与天然多肽之间具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高的序列同一性(同源性)，这可用MSPRCH程序(Oxford Molecular)采用仿射缺口(gap)检索法进行，其中采用如下的参数：开口罚值12，以及缺口延伸罚值1。其它熟知的和常规使用的同源性/同一性扫描算法程序包括：Pearson和Lipman，PNASUSA，85：2444-2448(1998)；Lipman和Pearson，Science，222：1435(1985)；Devereaus等人，Nuc.Acids Res.，12：387-395(1984)；或Altschul等人的BLASTP、BLASTN或BLASTX算法，Mol.Biol.，215：403-410(1990)。使用这些算法的计算机程序也可购买获得，这些程序包括，但并不限于：GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，它们都可以从遗传计算组(GCG)软件包(第8版，Madison.Wis.，USA)中购得；也可用Intellegenetics，Mountain View Calif的PC/gene程序中的CLUSTAL程序。优选地，序列同一性的百分比采用程序中给出的缺省参数来确定。
本文使用的“修饰”是指天然多肽、片段或突变蛋白的任何形式的修饰，例如：糖基化、磷酸化、多聚物偶联(例如与聚乙二醇偶联)，或加入其它的外来组分，只要其仍保持所需的活性(激动剂或拮抗剂)。
在美国专利6,025,146和Koths，Mol.Reprod.Dev.1997年1月；46(1)：31-38(这两篇文献均全文引入本文作为参考)中，描述了M-SCF单独结晶和M-CSF同M-CSFR的复合物结晶情况，并且表征了M-CSF以及其参与受体结合的残基的三维结构。美国专利6,025,146还描述了，根据结构信息在M-CSF中选择候选的取代氨基酸的方法。图1是一张拓朴图，显示了截短的二聚体M-CSF中的二硫键位置；图2是C-α骨架的立体图，其中每10个残基均被标注，而非-结晶学对称轴用虚线表示。图1所示的M-CSF形式的总体拓朴结构是反平行的四α-螺旋束，其中的螺旋方向为上-上-下-下，而不同于大多数的四α-螺旋中观察到的上-下-上-下连接。螺旋A和螺旋B通过一个长的交叉连接相连，而类似的连接也在螺旋C和D之间发现。在以二硫键相连的二聚体形式中，螺旋束尾-尾相连，形成一个很扁长的结构(大致尺寸为85×35×25)。每个单体中有3个分子内二硫键(Cys7-Cys90，Cys48-Cys139，Cys102-Cys146)，所有的二硫键都位于分子的远端。如图2所示，一个链间的二硫键(Cys31-Cys31)位于二聚体的交界处，非晶体学2次折叠对称轴穿过该二硫键。突变实验表明，此M-CSF形式中所有的半胱氨酸残基对其具备完全的生物学活性是必须的。本文描述的结构表明它们的作用主要是结构上的，并不与受体识别相关。美国专利6,025,146提供了截短的重组M-CSFα二聚体的三维结构，该结构是通过识别序列中氨基酸残基的α-C位置而得到的。
螺旋A、C和D中的特定残基似乎涉及受体结合相互作用的特异性。由于M-CSFβ含有涉及Cys157和/或Cys159的链内二硫键，M-CSF的C-末端区可能从结构的背部延伸出来，为膜结合形式的M-CSF提供长度可变的“系链”。因此，M-CSF的“前部”或受体结合区域位于分子的背面，由螺旋A、C和D内或附近的溶剂可及残基组成，分别含有天然M-CSF中大致从6-26、71-90和110-130的残基。通过定点突变来改变这些区域的溶剂可及残基来增强或减弱侧链与受体之间的相互作用，可以产生M-CSF激动剂或拮抗剂。根据在三肽gly-x-gly中可及氨基酸的表面积的归一化结果，优选的氨基酸残基所含有的溶剂可及表面积大于约0.25，更佳地表面积大于约0.4(Kabsch，W.等人，Biopolymers 22：2577(1983))。优选的氨基酸残基不与蛋白质的其它部分(如：二聚体交界面)发生相互作用，以便维持单体的相关取向并避免干扰蛋白质的折叠过程。另外，可以考虑的是选择在人和鼠之间不保守的残基，这些残基不识别人的M-CSF受体。候选的氨基酸优选用非保守的氨基酸取代，以便破坏与MCSF-R残基之间的氢键和/或疏水作用。例如，将一个或多个组氨酸换成大小相似的非氢供体型氨基酸，这可以产生受体结合能力改变的M-CSF。优选的氨基酸取代包括(但并不限于)：H15、Q79、R86、E115、E41、K93、D99、L55、S18、Q20、I75、V78、L85、D69、N70、H9、N63和T34。据信，在受体信号转导中起重要作用的M-CSF残基是由M-CSF中的不连续区域所组成的。为了使针对可能施用的基于M-CSF的蛋白质药物形成抗体的可能性降至最低，最好在任何可能的情况下，保留溶剂可及的亲代M-CSF残基(以便使其与天然分子相似)。
对N-末端/A螺旋区的H15和H9氨基酸突变后，所得突变蛋白的生物学活性以及与MCSF-R的结合能力都大大降低。这些结构表明，与受体结合的亲和度降低是引起生物学活性降低的原因；因此，这些组氨酸的接触作用对M-CSF受体结合的亲和度十分重要，所以如果要保持完全的受体结合能力，应当不对这些组氨酸作任何改变。邻近的溶剂可及残基，如Y6和S13及其它残基，也可能是M-CSF受体的接触残基。构建了一个M-CSF的双突变受体(Q20A，V78K)来检测螺旋A和C内中央部分溶剂可及残基的重要性。这一双突变蛋白的生物学活性略有降低(8-10倍)，并且相应地其受体结合活性也有所降低。对残基Q17、R21、E115和E119的突变，改变了感兴趣区域内溶剂可及氨基酸的侧链特性，但并不影响特异的生物学活性，这就表示在设计具有拮抗剂活性的突变蛋白时，并不需要对这些残基作任何改变。
在一个实施例中，本发明提供了将螺旋A和/或C和/或D中对受体结合起作用的残基(例如，氨基酸6-26位，71-90位和/或110-130位)进行非保守突变而得到的M-CSF突变蛋白。优选地，这些突变蛋白与螺旋A、C或D内的天然序列至少保持65％，70％，75％，80％，85％或90％的相似性(也就是氨基酸具有相同的或相似的特性)，而多肽的其余部分的天然序列则具有更高的相似性，例如，至少具有95％、98％或99％的相似性。此外，支持受体结合区三维构型的残基可以进行非保守突变。
在另一实施例中，M-CSF突变蛋白是M-CSF的单体形式。M-CSF的二聚体形式是具有生物活性的形式，而M-CSF的单体形式通常不具备活性。单体间的二硫键似乎通过Cys31-Cys31链间连接而实现。因此，M-CSF的单体形式可适用作拮抗剂。这样的形式包括Cys31的半胱氨酸缺失和/或半胱氨酸置换(例如，用丙氨酸取代半胱氨酸)，或半胱氨酸(尤其是Cys31)因经过化学修饰而不能形成二硫键的突变蛋白。
在又一个实施例中，M-CSF突变蛋白含有一个或多个螺旋A、C或D、或其参与受体结合的部分(单独的或与其它多肽相融合)，从而容许该片段展示出正确的三维构型。
可以用本领域熟知的技术，方便地制备含有任何所需的保守和/或非保守突变的突变蛋白，这些技术包括重组生产或化学合成。
保守取代，尤其是在直接参与配体-受体结合的区域以外区域的取代，预计不会显著地改变M-CSF突变蛋白(或M-CSFR突变蛋白)的结合特性。可以根据氨基酸的物理性质以及对蛋白质的二级和三级结构的影响，对氨基酸进行分类。本领域中的保守取代是指用具有相似特性的氨基酸取代另一氨基酸。典型的保守取代列于下表2中(来源于WO 97/09433，第10页，1997年3月13日出版(PCT/GB96/02197，于9/6/96提交)。
                         表2
                      保守取代I
侧链特征                       氨基酸
脂族的
非极性                         G A P I L V
极性-不带电荷                  C S T M N Q
极性-带电荷                    D E K R
芳香族的                       H F W Y
其它                           N Q D E
或者，保守氨基酸可以用Lehninger(生物化学，第二版；Worth Publishers，Inc.NY：NY(1975)，71-77页)中所述的方法进行归类，如下面表3中列出的。
                             表3
                          保守取代II
侧链特征                           氨基酸
非极性(疏水)
A.脂肪族：                         A L I V P
B.芳香族：                         F W
C.含硫：                           M
D.临界：                           G
不带电荷-极性
A.羟基：                           S T Y
B.氨基：                           N Q
C.巯基：                           C
D.临界：                           G
带正电(碱性)：                     K R H
带负电(酸性)：                     D E
作为另一种选择，典型的保守取代列于下面的表4中。
                       表4
                   保守取代III
原始残基               典型取代
Ala(A)                 Val，Leu，Ile
Arg(R)                 Lys，Gln，Asn
Asn(N)                 Gln，His，Lys，Arg
Asp(D)                 Glu
Cys(C)                 Ser
Gln(Q)                 Asn
Glu(E)                 Asp
His(H)                 Asn，Gln，Lys，Arg
Ile(I)                 Leu，Val，Met，Ala，Phe，
Leu(L)                 Ile，Val，Met，Ala，Phe
Lys(K)                 Arg，Gln，Asn
Met(M)                 Leu，Phe，Ile
Phe(F)                 Leu，Val，Ile，Ala
Pro(P)                 Gly
Ser(S)                 Thr
Thr(T)                 Ser
Trp(W)                 Tyr
Tyr(Y)                 Trp，Phe，Thr，Ser
Val(V)                 Ile，Leu，Met，Phe，Ala
得到了编码M-CSF的DNA序列后，就能使用各种表达***来生产所需的多肽。可以用本领域熟知的方法，用合适的DNA序列来构建表达载体以及进行重组生产。这些技术和各种其它的技术通常根据Sambrook等人，分子克隆一实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(1989)，和Kriegler，M.，基因转移和表达，实验手册，Stockton Press，New York(1990)来进行，这两篇文献均引入本文作为参考。
对M-CSF一级序列的某些修饰，可以在不破坏所需结构(如：M-CSF的受体结合能力)的前提下，用熟知的重组DNA技术，通过对DNA序列所编码的氨基酸进行缺失、添加、或改变而实现。此外，技术人员会理解，个别氨基酸可以用氧化、还原或其它的修饰方法进行取代或修饰，而对多肽进行切割则可获得仍然保留活性结合位点和结构信息的片段。这样取代和改变得到的多肽所具有的氨基酸序列，属于“与成熟的M-CSFα(SEQ ID NO：2)、M-CSFβ(SEQ ID NO：4)、和M-CSFγ(SEQ ID NO：6)多肽具有基本相同的氨基酸序列”的多肽的定义范畴内。
可以应用本领域已知的标准液相或固相肽合成技术来合成多肽。在液相合成中，可以使用一系列连接方法和保护基团(参见，Gross和Meienhofer，eds，.“肽：分析、合成、生物学，”卷1-4(Academic Press，1979)；Bodansky和Bodansky，“肽合成操作，”第二版(Springer Verlag，1994))。此外，还可以加入中间纯化和线性放大步骤。本领域的普通技术人员可以理解，液相合成时需要考虑主链和侧链的保护基团和活化方法，以及片段选择，以便减少外消旋情况。
固相肽合成，通常可根据Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963中的方法进行操作。该方法包括用受保护的氨基酸将线性肽链装配到树脂载体上。典型的固相肽合成使用Boc或Fmoc策略。Boc策略使用1％交联的聚苯乙烯树脂。标准的α-氨基官能团的保护基团是叔丁氧羰基(Boc)基团。该基团可以用诸如25％的三氟乙酸(TFA)之类的强酸稀释液除去。下一个Boc-氨基酸通常用二环己基碳二亚胺(DCC)与氨酰基藕合。装配完成后，用无水HF处理肽-树脂，从而切除苄基酯键并释放出游离肽段。侧链官能团通常在合成时用苄基衍生的封闭基团进行封闭，封闭基团同样可以用HF切除。然后，游离的肽段用合适的溶剂从树脂上萃取下来，纯化并表征。新合成的肽段可以用例如，凝胶过滤、HPLC、分配层析和/或离子交换层析等方法进行纯化，并可以用例如，质谱或氨基酸序列分析的方法进行表征。在Boc策略中，可以用苄基羟胺(benzhydrylamine)树脂或甲基苄基羟胺(methylbenzhydrylamine)树脂得到C-末端酰胺化的肽段，用HF即可直接从树脂上切下酰胺肽。另一种可选用的方法使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)，该方法应用不同的试剂使侧链的保护基团和肽-树脂连接对用于切割N-α-Fmoc基团的仲胺保持稳定。侧链保护基团和肽-树脂连接用温和的酸解进行切割。由于需要多次接触碱试剂，Merrifield树脂不适用于Fmoc化学方法，而通常使用p-烷氧基苄酯与树脂相连。通常用TFA实现去保护和切割。N-末端的乙酰化可以通过将最终产生的肽段与无水乙酸反应获得，然后再从树脂上切割下来。C-酰胺化是用合适的树脂(如甲基苄基羟胺树脂)，使用Boc技术完成的。
通常，可以很方便地用一系列熟知的技术对编码M-CSF的多肽基因进行修饰，例如，采用定点突变(参见，Gillman和Smith，Gene 8：81-97(1979)和Robers，S.等人，Nature 328：731-734(1987)和美国专利5,032,676，这些文献都引入本文作为参考)。大多数修饰产物的评估方法是用合适的分析来筛选所需的特征。例如，可以用合适的多肽作为参照，采用竞争性检验来测定多肽与M-CSF受体结合特征的改变，或者用美国专利4,847,201(该专利引入本文作为参考)中所描述的生物学分析进行检测。
本发明的***变异体是指那些在M-CSF内预先确定的位点引入一个或多个氨基酸残基的变异体。例如，***变异体可以在亚单位的氨基端或羧基端融合了异源蛋白质或多肽的融合产物。取代变异体是指那些至少去除了一个残基，并在该残基所在的位置又***了另一个不同残基的变异体。非天然氨基酸(也就是通常并不存在于天然蛋白质中的氨基酸)，以及等体积(isosteric)类似物(氨基酸或其它物质)也可适用于本发明。合适取代基的实例在本领域中是熟知的，例如Glu-＞Asp，Ser-＞Cys和Cys-＞Ser，His-＞Ala。另一类的变异体是缺失体，其特征为M-CSF中缺失了一个或多个氨基酸残基。
本发明的其它变异体可以通过对天然蛋白质进行化学修饰而产生(例如，焦碳酸二乙酯处理可以对组氨酸残基加以修饰)。优选的是对某些氨基酸侧链特异的修饰。可通过使用针对待保护侧链的特异抗体来封闭其它侧链，从而实现特异性。化学修饰包括如下反应：氧化、还原、酰胺化、脱酰胺化、或多糖或聚乙二醇之类的大基团的取代(参见，美国专利4,179,337和WO91/21029，这两篇文献都引入本文作为参考)。
典型的修饰包括用琥珀酸或其它无水羧酸的酸酐与赖氨酰基以及氨基末端残基反应而进行修饰。用这些试剂进行修饰具有逆转赖氨酸残基所带电荷的功能。修饰含氨基的残基的其它合适试剂包括：亚氨酸酯(如甲基吡啶酸甲酯(methyl picolinimidate))；磷酸吡哆醛；氢硼化氯吡哆醛(pyridoxalchloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲，2，4-戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛酸盐之间的反应，和用聚乙二醇或其它大体积基团取代的N-羟基琥珀酰胺酯。
精氨酰基可以通过与很多试剂的反应而加以修饰，包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮、和水合茚三酮。由于胍基具有很高的pKa，所以对精氨酸残基的修饰反应要在碱性条件下进行。此外，这些试剂也可以同赖氨酸的基团以及精氨酸的ε-氨基基团发生反应。
酪氨酰基也可以加以修饰，从而在酪氨酰基上特别引入光谱标记，修饰的方法是用芳香族的重氮化合物或四硝基甲烷进行反应，从而分别形成O-乙酰酪氨酰化合物和3-硝基衍生物。酪氨酸残基还可以用125I或131I碘化来制备放射性免疫分析所用的标记蛋白质。
羧基侧链基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)可以选择性地与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R1)反应加以修饰，其中的R和R1是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基可以与铵盐反应，而转变成天冬酰氨残基(asparaginyl)和谷氨酰胺残基(glutaminyl)。
相反地，天冬酰氨和谷氨酰胺残基可以在温和的酸性条件下脱酰胺而分别成为相应的天冬氨酸和谷氨酸残基。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。
其它的形式包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酸和苏氨酸的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链中α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，蛋白质：结构和分子特性，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，79-86页(1983))，N-末端氨基的乙酰化和任何C-末端羧基基团的酰胺化。
很多方法可以用于确定M-CSF突变蛋白和天然M-CSF蛋白之间的相似性。例如，同源性百分比计算的是两条比对序列中相同的氨基酸残基在较短序列中所占的百分比(在长达100个氨基酸的序列中，可以引入4个缺口来使比对最匹配)(Dayhoff，“蛋白质序列和结构图册”(Atlas of Protein sequence andStructure)，卷5，124页，国立生化研究基金，Washington，D.C.(1972)，该文献引入本文作为参考)。用于序列比较的多肽序列比对，也可以用各种多重比对服务器来完成，目前在Internet上可以找到大多数这类服务器。例如，Clustal W，MAP，PIMA，Block Maker，MSA，MEME，和Match-Box。优选地用Clustal W(Higgins等人，Gene(1988)73：237-244；Higgins等人，Meth.Enzymol.(1996)266：383-402)对多肽(和多核苷酸)进行序列比对。类似地，BLASTP程序将氨基酸查询序列与蛋白质数据库相比较，而TBLASTN将蛋白质查询序列与对6个阅读框(两条链)进行动态翻译的核苷酸序列数据库加以比较，这同样可以用于本发明。要确定2个氨基酸序列是否在很大程度上具有同源性(也就是相似或相同)，也可以根据Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444-2448(1998)采用FASTA检索。
具体地，优选的确定同一性和/或相似性的方法设计为，使测试序列间有最大程度的匹配。用于确定同一性和/或相似性的方法，已经被编程在公众可以获得的计算机程序(例如，诸如前述的程序)。优选的确定两序列间同一性和相似性的计算机程序方法包括(但并不限于)：GCG程序包(包括GAP(Devereux等人，核酸研究(1984)12(1)：387；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，WI))、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul等人，J.Molec.Biol.(1990)215：403-410)。BLAST X程序在国家生物技术信息中心(NCBI)和其它一些地方对外开放(Altschul等人，BLAST Manual，NCB NLM NIHBethesda，MD 20894；Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215：403-410)。熟知的Smith Waterman算法也可以用来确定同一性。在用GAP程序比对多聚核苷酸序列时，优选以下的缺省参数：比较矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0，缺口罚值50，缺口长度罚值3(Needleman等人，J.Mol Biol.(1970)48：443-453)。
蛋白质的相关性也可以用编码它们的核酸之间的相关性来表征。确定多聚核苷酸序列的同一性和/或相似性的方法如上所述。此外，也可以用如下所述的方法，通过检测多聚核苷酸在中等或高度严谨条件下的杂交能力来确定它们序列间的相似性。典型的中等严谨的杂交条件如下：42℃，杂交液含有50％的甲酰胺、1％的SDS、1M的NaCl、10％的葡聚糖硫酸酯，60℃的条件下洗涤两次，每次30min，洗涤液含有0.1×SSC和1％的SDS。高度严谨的条件包括用含有0.1×SSC和1％的SDS的洗涤液在68℃的条件下洗膜。本领域的专业人员应理解，正如本领域中所述的那样，改变温度和缓冲液，或盐浓度可以得到相同的严谨条件(Ausubel，等人编，分子生物学手册，John Wiley & Sons(1994)，pp.6.0.3至6.4.10)。可以根据经验，或根据引物长度以及引物中鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)碱基对的百分比含量精确计算，从而确定杂交条件的修改。杂交条件的计算方法可以参照Sambrook等人，(Eds.)，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版：冷泉港，New York(1989)，9.47-9.51页。
本发明的典型M-CSFR片段可以含有一个或多个，或两个或多个参与M-CSF/受体结合的区域(据信是区域1，2和3)。优选的M-CSFR片段包括M-CSFR中的1、2、3所有3个结合域。还可对这些片段或对M-CSFR的整个胞外区域引入额外的突变和/或修饰，并且可参照M-CSF突变蛋白部分中的描述进行。
M-CSFR抗体
本发明还提供了可根据本发明的方法用作M-CSF拈抗剂的M-CSFR抗体。M-CSFR(SEQ ID NO：8)是含有5个胞外免疫球蛋白样结构域(其中的结构域1-3被认为参与配体-受体结合)，1个跨膜域和1个胞内间断Src相关酪氨酸激酶结构域的跨膜分子。参照SEQ ID NO：8，上述的结构域的位置如下：Ig域1：氨基酸27-102；Ig域2：氨基酸112-196；Ig域3：氨基酸215-285；Ig域4：氨基酸308-399；Ig域5：氨基酸410-492；跨膜域：氨基酸515-537；以及激酶域：氨基酸582-910。“典型的”免疫球蛋白样结构域包含1个环状结构，通常由每个环末端的两个半胱氨酸形成的二硫键所锚定。在M-CSF-R中，这些形成Ig样环的半胱氨酸氨基酸定位如下：结构域1：42，84；结构域2：127，177；结构域3：224，278；结构域4：没有半胱氨酸参与；结构域5：419，485。
完整的M-CSFR胞外部分或其能够保留其免疫原性的任何片段(例如，1个或多个Ig样环)，可以用于诱生能与天然受体结合的抗体。多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、完全的人抗体和它们的抗原结合片段，可以如上述M-CSF抗体那样进行制备。可以用本文中以“筛选方法”为标题的部分中所述的分析，或采用任何本领域已知的合适的试验，来筛选具有MCSF拮抗剂活性以及适用于本发明所述的治疗方法的抗体产物。
可溶性M-CSFR
本发明还提供了可根据本发明方法用作M-CSF拮抗剂的M-CSFR突变蛋白。
M-CSFR在体外的生物学功能，是通过结合和激活M-CSF受体而实现的，M-CSF受体也称为c-fms基因产物。重组的人可溶性M-CSF受体(rhsM-CSFR)，代表SEQ ID NO：8中的氨基酸20-511位(Coussens，L等人，Nature，320：277(1986))，它用作体外试验试剂来测定M-CSF代表的受体结合能力。为了产生跨膜受体的可溶性形式，在杆状病毒、昆虫细胞重组表达***中只表达人M-CSF受体的胞外结构域。为了在纯化可溶性受体时不对三级和四级结构产生负面效应，选用的纯化方法是非变性层析的方法，如下所述。也可选择其它的纯化重组受体的方法。当可以获得受体的合适抗体或其配体之一时，可以采用亲和层析。或者，可以在重组受体的C-末端加上“标签”，也就是KT3抗体识别序列，并且用抗-标签抗体进行纯化，也就是用KT3柱进行亲和层析。在rhsM-CSFR糖基化的表达***中，凝集素层析可用于富集特异性糖蛋白。
受体胞外域中的一个或多个上述的Ig样环，可能足以抑制M-CSF和MCSFR之间的相互作用。因此，M-CSF和其突变蛋白的胞外域片段，可以方便地用本领域熟知的重组或化学合成的方法进行制备。可以用本文中以“筛选方法”为标题的部分中所述的分析，或采用任何本领域已知的合适的试验，来筛选具有MCSF拮抗剂的活性和适用于本发明所述的治疗方法的产物。
基因治疗
可以通过体外、原位或体内的基因治疗将治疗性的蛋白质递送给合适的细胞内，其中可使用本领域已知的任何合适的方法，包括物理的DNA转移方法(例如，脂质体或化学处理)，或使用病毒载体(例如，腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)。例如，对于体内治疗，可以直接将编码所需蛋白质的核酸单独地或与载体、脂质体、或沉淀剂一同注射到对象体内，而在一些实施例中，注射的位置可以是需要表达蛋白化合物的位置。对于体外治疗，可取出对象细胞，将核酸导入这些细胞中，再将经过修饰的细胞返回对象体内，可以直接返回也可用其它方式，例如，包裹在多孔膜内植入病人体内。参见，例如美国专利4,892,538和5,283,187。已有各种不同技术可用于将核酸导入活细胞内。根据核酸是要转移至体外培养的细胞中，还是要转移至宿主的体内细胞中，所采用的技术有所不同。适用于将核酸转移至体外哺乳动物细胞内的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合，DEAE-葡聚糖、和磷酸钙沉淀。通常使用的核酸体外递送载体为逆转录病毒。
其它的体内核酸转移技术包括用病毒载体转染(如腺病毒、单纯疱疹病毒I、或腺相关病毒)和脂类***。可以任选地将核酸和转染试剂与微粒相连。典型的转染试剂包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、两亲型季氨DOTMA(溴化(二油酰氧基丙基)三甲基铵，商品名为Lipofectin，由GIBCO-BRL生产))(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417；Malone等人(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86 6077-6081)；带有侧链三甲基铵盐头部的亲脂性谷氨酸二酯(Ito等人(1990)Biochem.Biophys.Acta1023，124-132)；可代谢的亲代脂类，诸如阳离子脂质二辛基癸酰胺甘氨酰精胺(DOGS，Transfectam，Promega)和二棕榈酰磷脂酰基乙醇戊基精胺(DPPES)(J.P.Belir(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB，N-(1-[2，3-二油酰氧基]丙基)-N，N，N-三甲基铵甲磺酸盐(DOTAP)(Boehringer Mannheim)，聚乙撑亚胺(PEI)，二油酰酯，ChoTB，ChoSC，DOSC)(Leventis等(1990)Biochim.Ihter.22，235-241)；3β[N-(N，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)，以1∶1混合的二油磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰]胆固醇DC-Chol(Gao等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065，8-14)，精胺，精脒，脂多胺(Behr等人，Bioconjugate Chem，1994，5：382-389)，亲脂性多聚赖氨酸(LPLL)(Zhou等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，氢氧化[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苄基铵(氢氧化DEBDA)与过量的磷脂酰胆碱/胆固醇(Ballas等.，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)/DOPB混合物(Pinnaduwage等，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)，亲脂性的谷氨酸二酯(TMAG)与DOPE，CTAB，DEBDA，溴化双十二烷基铵(DDAB)，和硬脂胺与磷脂酰乙醇胺的混合物(Rose等人，(1991)Biotechnique 10，520-525)，DDAB/DOPE(TransfectACE，GIBCO BRL)，和含有脂类的寡聚半乳糖。可以加强转移效率的转染增强剂包括，例如，DEAE-葡聚糖，多聚季胺，破溶酶体肽(Ohmori NI等，Biochem Biophys Res Commun1997年6月27日；235(3)：726-9)，基于软骨素的蛋白多糖，硫酸蛋白多糖，聚氮丙啶，多聚赖氨酸(Pollard H等.J Biol Chem，1998 273(13)：7507-11)，整合素结合肽CYGGRGDTP，非糖类线性葡聚糖，甘油，连接于寡核苷酸核苷间键的3’-末端的胆固醇基团(Letsinger，R.L.1989 Proc Natl Acad Sci USA 86：(17)：6553-6)，溶血磷脂，溶血磷脂胆碱，溶血性磷脂酰乙醇胺和1-油基溶血磷脂胆碱。
在某些情况下，将核酸和试剂一同递送是有利的，而该试剂能够使携带核酸的载体指向靶细胞。这样的靶向分子包括：靶细胞表面膜蛋白的特异抗体、或靶细胞上受体的配体。使用脂质体时，可以用能与细胞表面与胞吞作用相关的膜蛋白相结合的蛋白进行靶向和/或促进摄取。这些蛋白质的例子包括：对特定的细胞类型具有嗜性的衣壳蛋白及其片段，在循环过程中经历内化的蛋白质的抗体，和靶向胞内定位以及延长胞内半衰期的蛋白。在其它的实施例中，可以利用受体介导的胞吞作用。这些方法在例如Wu等人，1987或Wagner等人，1990中有所描述。对于当前已知的基因标记和基因治疗方案的综述，可参见Anderson 1992。也可参见WO 93/25673以及其中引用的参考资料。对于基因治疗技术方面的其他综述，参见Friedmann，Science，244：1275-1281(1989)；Anderson，Nature，392卷(增补)，No6679，25-30页(1998)；Verma，ScientificAmerican：68-84(1990)；和Miller，Nature，357：455460(1992)Antisense。
本发明还提供了反义化合物及其使用方法。可以用熟知的反义技术、基因“剔除”技术、核酶和/或三联体螺旋方法来降低基因的表达水平，从而降低M-CSF和M-CSFR的活性。这些分子的生产和使用技术是本领域技术人员所熟知的。
反义化合物可以通过与目标mRNA杂交并且抑制蛋白质的翻译而阻碍mRNA的翻译，反义化合物包括与目标基因的mRNA互补的寡核苷酸。这些化合物可以靶向编码区，或更优选地靶向转录的不翻译的区域。绝对的互补是不必要的，只要有足够的互补度就能与内源的RNA或DNA杂交并形成稳定的双链或三链。杂交能力取决于互补度和反义核酸的长度。与目的基因非编码区互补的寡核苷酸也可用于反义技术，以便用来抑制内源mRNA的翻译。优选的反义核酸的长度在6-50个核苷酸之间。在具体的情况下，寡核苷酸至少含有10个核苷酸、至少17个核苷酸、或至少20个核苷酸。
首先进行体外研究，以便定量检测候选的反义寡核苷酸对目的基因表达的抑制能力。优选地，这些研究设置对照组，从而能将反义链的基因抑制效应与寡核苷酸的非特异性生物效应区分开来。同样优选地，这些研究将目标RNA或蛋白质的表达水平与内源的对照RNA或蛋白质的水平加以对比。
寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或其修饰物，而且可以是单链的或双链的(例如，RNAi)。可以对寡核苷酸的碱基部分、糖基部分或磷酸骨架进行修饰，从而改善如分子或杂交的稳定性。例如，参见，WO 03/088921；Dean，Curr Opin Biotechnol.12(6)：622-5，2001；Geary等人，Curr OpinInvestig Drugs.2(4)：562-573，2001。寡核苷酸可以与其它的组分偶联，这些组分包括肽(例如，用于体内靶向宿主细胞)，或促进跨细胞膜转运的试剂(参见，Letsinger，等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：648-652；PCT出版号WO88/09810，1988年12月15日出版)，或促进跨血脑屏障转运的试剂(参见，例如，PCT出版号WO89/10134，1988年4月25日出版)，杂交引发的切割试剂(参见，例如Krol等人，1988，BioTechniques 6：958-976)或嵌入剂(参见，例如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。反应化合物也可以是α-反构体寡核苷酸，它能与互补的RNA形成特异的双链平行杂交物(Gautier，等人，1987，Nucl.Acids Res.15：6625-6641)。寡核苷酸可以是2’-()-甲基核糖核苷酸(Inoue，等人，1987，Nucl.Acids Res.15：6131-6148)，或杂合的RNA-DNA类似物(Inoue，等人，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
反义分子应当被输送给至体外表达目的基因的细胞中。已经发展了很多将反义DNA或RNA递送至细胞的方法。例如，反义分子可以直接注射到组织区域，或者可以全身施用经过修饰能够靶向所需细胞的反义分子(例如，反义分子上连接了特异地与靶细胞表面表达的受体或抗原相结合的肽或抗体)。在另一种方法中，要使细胞内反义链的浓度足以抑制内源性mRNA的表达，可以通过构建重组DNA的方法来实现，将反义寡核苷酸置于一个强启动子的控制之下。使用这样的构建体去转染病人体内的靶细胞，将会转录出足够数量的单链RNA与内源性的基因转录物形成互补碱基对，从而阻止目的基因mRNA的翻译。例如，可以引入载体，例如该载体可被细胞摄取并指导反义RNA的转录。这样的载体可仍旧以游离形式存在，也可以整合到染色体上，只要它可以转录产生所需的反义RNA即可。
设计用于催化切割目的基因mRNA转录物的核酶分子也可以用来阻止目的基因mRNA的翻译，进而阻止目的基因产物的表达(参见，例如，PCT国际出版物WO90/11364，出版于1990年10月4日；Sarver，等人，1990，Science247，1222-1225)。核酶是能够催化RNA特异性切割的RNA酶类分子(参见Rossi，1994，Current Biology4：469-471的综述)。核酶的作用机制包括核酶分子与互补的目标RNA序列特异性杂交，随后发生核酸内裂解切割事件。核酶分子的组成必须包括一个或多个与目的基因的mRNA互补的序列，优选地，该互补序列位于5’末端附近，而且必须包含熟知的能够起到mRNA切割作用的催化序列。对于该序列，参见，如美国专利5,093,246，该文献全文引入本文作为参考。也可以使用锤头状核酶，其切割mRNA的位点由与目标mRNA形成互补碱基对的特异侧翼区域决定。锤头状核酶的构建和产生在本领域中是已知的，并在Myers，1995，分子生物学和生物技术：全面的桌面参考书，VCHPublishers，New York，(尤其参见833页的图4)，以及Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591中有更详细的描述，这些文献作为参考全文引入本文。也可以使用RNA核酸内切酶(也称为“Cech型核酶”)。此类核酶(如天然存在于Tetrahymena thermophila中的核酶(也称为IVS或L-19 IVSRNA))已在Zaug，等，1984，Science，224：574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug，等，1986，Nature，324：429-433；已出版的国际专利申请WO 88/04300；以及Been和Cech，1986，Cell，47：207-216中有所描述。Cech型核酶具有一个与目标RNA序列杂交的8碱基对活性位点。核酶也由可以经过修饰的寡核苷酸组成(例如，为了改善其稳定性和靶向性等)，而且应当在体内被呈递至表达目标基因的细胞中。不同于反义分子，核酶具有催化活性，因此要达到一定效果所需的细胞内浓度更低。
还可以通过定向同源重组使目标基因或其启动子失活或“剔除”，从而降低内源性目的基因的表达(例如，参见Smithies，等人，1985，Nature 317：230-234；Thomas和Capecchi，1987，Cell 51：503-512；Thompson，等人，1989，Cell5：313-321；每一篇都全文引入本文作为参考)。例如，可以使用目的基因的突变的、非功能靶基因(或完全不相关的DNA序列)，在其两侧加上内源性目的基因的同源DNA序列(可以是目的基因的编码区或调控区)，可以加入或不加选择性标记和/或反向选择标记，用该构建体转染在体内表达目的基因的细胞。通过定向同源重组，该DNA构建体即可***目的基因，导致其失活。
或者，可以通过设计与目的基因调控区(也就是目的基因的启动子和/或增强子)互补的脱氧核苷酸序列，使之与调控区形成三螺旋结构来阻碍体内靶细胞中目的基因的转录，从而降低内源性目的基因的表达。(一般参见，Helene，1991，Anticancer Drug Des.，6(6)：569-584；Helene，等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：27-36；和Maher，1992，Bioassays 14(12)：807-815)。
用于形成三螺旋从而抑制转录的核酸分子应当是单链的，并且由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成必须设计成能够提高根据Hoogsteen碱基配对规则形成的三螺旋，该规则通常需要双螺旋中的一条链中存在一大段嘌呤或嘧啶链。核苷酸序列以嘧啶碱基为基础，这能够使产生的三螺旋中跨三条相关链形成TAT和CGC+三联体。富含嘧啶的分子给双螺旋中一条单链的嘌呤密集区以该链的平行取向提供碱基互补。此外，也可以选用富含嘌呤的核酸分子，例如含有一段G残基的核酸。这些分子能够与富含GC碱基对的DNA双螺旋形成三螺旋，目标双螺旋中的大部分嘌呤残基均位于其中的一条链上，跨三螺旋的三条链形成GGC三联体。或者，可以通过制造称为“回转(switchback)”的核酸分子，来增加潜在的可以形成三螺旋的序列。回转分子以交替的5’-3’，3’-5’方式合成，这样它们先与双螺旋中的第一条链形成碱基对，然后再与另一条形成碱基对，这样就不需要双螺旋中的一条链上含有一大段嘌呤或嘧啶链了。
如果反义链、核酶或三螺旋治疗将目的基因的表达水平降至异常低，那么可以施用替代蛋白质。或者，可以用修饰过而不含有受反义链、核酶或三螺旋治疗影响的序列的核酸进行基因治疗，从而来提高基因的表达量。
本发明的反义RNA和DNA、核酶和三螺旋分子可以用任何本领域已知的DNA和RNA分子的合成方法进行制备。这些方法包括本领域熟知的寡聚脱氧核糖核苷酸和寡聚核糖核苷酸的化学合成技术，例如，固相亚磷酰胺化学合成技术。或者，可以用编码治疗性RNA分子的DNA序列，在体外和体内转录产生RNA分子。
化学合成方法包括使用市售的DNA自动合成仪；寡核苷酸硫代磷酸酯可以用Stein，等人(1988，Nucl.Acids Res.16：3209)的方法合成，而甲基膦酸酯可以用可控的多孔玻璃聚合物载体来制备(Sarin，等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451)。
肽和小分子
如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、寡肽、多肽、肽等。此外，术语蛋白质还可以指完整的分子和/或片段的片段、多聚体或聚集体。蛋白质可以是天然存在的蛋白质，也可以是用重组DNA方法或化学和/或酶方法合成产生的蛋白质。参见，例如，Sambrook等人，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室(第三版2001)。
术语“肽”是指相对较短的氨基酸链，优选的是长度在6至100个氨基酸之间的肽。
肽可以用噬菌体展示技术筛选所需的结合活性(例如，与M-CSF或M-CSFR结合)或生物学活性(参见，例如，Scott等Science 249：386(1990)；Devlin等，Science 249：404(1990)；1993年6月29日授权的美国专利5,223,409；1998年3月31日授权的美国专利5,733,731；1996年3月12日授权的美国专利5,498,530；1995年7月11日授权的美国专利5,432,018；1994年8月16日授权的美国专利5,338,665；1999年7月13日授权的美国专利；出版于1996年12月19日的WO 96/40987；以及出版于1998年4月16日的WO 98/15833(每一篇都作为参考引入本文))。在这样的展示库中，肽序列与丝状噬菌体的衣壳蛋白相融合而展示。典型的，展示的肽对抗体固定化的受体胞外域进行亲和洗脱。保留的噬菌体可以通过一系列的亲和纯化和再增殖进行富集。可以对结合性最好的肽进行测序，来识别一个或多个结构相关的肽家族内的关键残基。
还可以用其它方法筛选肽，如产生与lac阻遏物的羧基端相融合的文库并在大肠杆菌中表达，或者将肽与肽聚糖相关脂蛋白(PAL)相融合而将其展示于大肠杆菌的外膜上。在另一种方法中，RNA的随机翻译在核糖体释放之前就终止了，这样就产生了一个相关RNA仍旧附着在上面的多肽文库。其它方法应用肽与RNA的化学连接方法(参见，例如，Roberts和Szostak，Proc Natl Acad SciUSA，94：12297-303(1997))。已经发展了化学衍生的肽文库，其中的肽固定于稳定的非生物材料上，如聚乙烯棒或溶剂通透性树脂。其它化学衍生的肽文库应用光蚀刻技术将肽扫描固定化于玻璃片上。化学肽筛选的优点在于它可以容许使用D-氨基酸和其它非天然类似物，以及非肽元件(element)。生物和化学方法的综述参见Wells和Lowman，Curr Opin Biotechnol 3：355-62(1982)。
可以在DNA水平上进行诱变而达到对肽的进一步修饰。可以创建并筛选诱变文库而进一步优化最佳结合物的序列(Lowman，Ann Rev Biophys BiomolStruct 26：401-24(1997))。也可以从蛋白质相互作用的结构分析中得到能够模拟大分子蛋白配体结合活性的肽。在这样的分析中，结晶结构可提示了大分子蛋白配体中关键残基的种类及相对取向，据此，就可以设计肽(参见，例如，Takasaki等人，Nature Biotech 15：1266-70(1997))。
随机肽或从抗原结合CDRs衍生而来的肽可以以线性方式融合或作为三维支架的一部分，例如抗体或其部分(如恒定区)，来创建能够与所需抗原结合的新型大分子。可以包括了同一肽段的多个拷贝或不同的肽段。
如本文所用，术语“模拟肽”是指由氨基酸侧链、或药效基团、或其合适的衍生物装配而成的非肽化合物，这些物质装配于支架上，这样药效基团的空间取向基本模拟了天然肽的生物活性构型。例如，模拟肽可以缺失氨基酸或肽键但仍旧保留亲代肽中肽链基团的特殊三维构造，而此特殊构造对结合活性是必须的。支架可包含双环、三环或更多环的碳或杂原子骨架，或者可以一个或更多个环状结构(例如，吡啶、吲唑等)或酰胺键为基础。这类支架可以通过间隔区与位于核心一端的酸性基团(例如，羧酸官能团)相连接，并与位于核心另一端的碱性基团(例如，含氮基团，如脒或胍)相连。典型的模拟肽合成技术描述于2003年10月23日出版的美国专利申请20030199531中，和2003年7月24日出版的美国专利申请20030139348中。
除了抗体和其它蛋白质以外，本发明还考虑了其它的M-CSF拮抗剂，包括但并不限于，同样在治疗癌转移和/或与癌转移相关的骨质损失中有效的小分子。可以通过检测此类小分子与M-CSF结合的能力和/或其抑制M-CSF与M-CSFR相互作用的能力而加以鉴定。
测定M-CSF与小分子结合的方法在本领域中很容易获得，包括，例如，竞争性检测。在该检测中，用小分子干扰M-CSF和其受体M-CSFR或抗M-CSF抗体之间的相互作用。或者，可以采用直接结合试验来测定小分子与M-CSF之间的相互作用。举例来说，可以将M-CSF吸附到不溶性的基质上，如组织培养板或珠上，进行ELISA检测。由于包含了感兴趣的小分子，标记的M-CSFR或抗M-CSF抗体与M-CSF的结合受阻。或者，小分子与M-CSF的结合可以用荧光激活细胞分选(FACS)试验加以确定。采用这种方法，表达M-CSF的细胞与携带荧光标签的抗M-CSF抗体一同培养，或者在携带荧光标签的第二抗体重组的条件下与抗M-CSF抗体一同培养。可以根据与表达M-CSF的细胞结合的剂量依赖性荧光强度的减弱来评估小分子与M-CSF的结合情况。类似地，可以用例如放射性标记或荧光标签来标记小分子物质，将其与固定化的M-CSF或表达M-CSF的细胞一同培养并检测结合的小分子的放射性或荧光强度，以此来评估小分子的之间结合情况。
筛选方法
有效的治疗依赖于鉴定有效且无明显毒性的制剂。可以用多种检测方法筛选在预防或治疗与癌转移相关的骨质损失中具有潜在功效的化合物。例如，候选的拮抗剂可以先在细胞培养***中表征以确定其在诱导破骨细胞生成过程中中和M-CSF的能力。这样的***可以包括鼠颅腔破骨细胞与脾细胞的共培养***(Suda等人，破骨细胞分化的调控，Endocr.Rev.13：66 80，1992；Martin和Udagawa，Trends Endocrinol.Metab.9：6-12，1998)，鼠基质细胞系(例如，MC3T3-G2/PA6和ST2)与鼠脾细胞的共培养***(Udagawa等人，Endocrinol125：1805 13，1989)，以及ST2细胞和骨髓细胞、外周血单核细胞或肺泡巨噬细胞的共培养***(Udagawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：7260 4，1990；Sasaki等人，Cancer Res.58：462 7，1998；Mancino等人，J.Surg.Res.100：18-24，2001)。在没有M-CSF拮抗剂存在的情况下，这样的共培养***中形成的单核细胞满足破骨细胞的主要标准，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP，破骨细胞的标志酶)活性、降钙素受体、p60C-STS，玻联蛋白结合素受体、和在骨和牙片上形成重吸收坑的能力。有效的M-CSF拮抗剂的存在能抑制这样的多核细胞的生成。
除了上述的共培养***，候选的M-CSF拮抗剂抑制破骨细胞生成的能力也可以在无基质细胞或无破骨细胞的***中进行检测。破骨细胞生成必须的M-CSF可由共培养的转移癌细胞(例如MDA 231)提供或由这些癌细胞的条件培养基提供(Mancino等人，J.Surg.Res.0：18-24，2001)，或者可以加入纯化的M-CSF。
给定的M-CSF拮抗剂在预防或治疗与癌转移相关的骨质损失中的功效，也可以在任何的动物骨质损失模型***中测定，这些***是本领域的技术人员所熟知的。这样的模型***包括，直接将肿瘤细胞注入骨髓腔的***(Ingall，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，117：819-22，1964；Falasko，Clin.Orthop.169：20 7，1982)，直接将肿瘤细胞注入大鼠腹腔膜的***(Powles等，Br.J.Cancer 28：316 21，1973)，注入小鼠尾部侧静脉或左脑室的***(Auguello等，Cancer Res.48：6876 81，1988)。在没有有效的M-CSF拮抗剂存在的条件下，注入的肿瘤细胞形成的溶骨性转移可以用(溶骨病变区域的)放射显影图来确定或用(骨及软组织的)组织化学方法确定。Sasaki等，Cancer Res.55：35517，1995；Yoneda等，J.Clin.Invest.99：2509 17，1997.Clohisy和Ramnaraine，Orthop Res.16：660 6，1998。Yin等，Clin.Invest.103：197206，1999。在存在有效的M-CSF拮抗剂的情况下，可以预防或抑制溶骨性骨质转移，使得转移病灶数量更少，和/或体积更小。
本发明的M-CSF拮抗剂也可以用于预防或治疗癌转移。候选的M-CSF拮抗剂在预防或治疗癌转移方面的有效性，可以用人羊膜基底膜侵入模型进行筛选，如Filderman等人，Cancer Res 52：36616，1992中所述。此外，还可以应用各种类型癌症转移的任何动物模型***加以检测。这样的模型***包括，但并不限于Wenger等人，Clin.Exp.Metastasis 19：169 73，2002；Yi等人，Cancer Res.62：917 23，2002；Tsutsumi等人，Cancer Lett 169：77-85，2001；Tsingotjidou等人，Anticancer Res.21：971 8，2001；Wakabayashi等人，Oncology 59：75 80，2000；Culp和Kogerman，Front Biosci.3：D672 83，1998；Runge等人，Invest Radiol.32：212 7；Shioda等人，J.Surg.Oncol.64：1226，1997；Ma等人，Invest Oplithalmol Vis Sci.37：2293 301，1996；Kuruppu等人，J Gastroenterol Hepatol.11：26 32，1996中所述的***。在存在有效的M-CSF拮抗剂的情况下，可以预防或抑制癌转移，使得转移病灶数量更少，和/或体积更小。
也可以通过运用许多已知的用于鉴定和获得特异性地与其它蛋白质或多肽相互作用的方法中的任意一种来鉴定其它的M-CSF拮抗剂，例如，诸如美国专利5,283,173所述的酵母双杂交***或等价的方法。在本发明的一个实施例中，可以将编码M-CSF的cDNA或其片段克隆到一个双杂交诱饵载体中，并用其在互补的靶文库中筛选具有M-CSF结合活性的蛋白。
特定的M-CSF拮抗剂或M-CSF拮抗剂的组合物的抗肿瘤活性，可以用合适的动物模型进行体内评估。例如，异源淋巴癌模型，该模型中人的淋巴细胞被引入免疫受损的动物体内，如裸鼠或SCID小鼠。也可以用测定肿瘤形成、肿瘤复发或转移等的抑制率的试验来预测其功效。
本发明提供的氨基酸序列信息，同样可用于鉴定与M-CSF或M-CSF多肽或多核苷酸相互作用的结合伙伴化合物。鉴定结合伙伴化合物的方法包括溶液试验、体外试验(其中，M-CSF或M-CSF多肽被固定化)、和细胞试验。M-CSF或M-CSFR的结合伙伴化合物的鉴定，为治疗或预防性干预与M-CSF或M-CSFR的正常或异常生物学活性相关的病理学提供了候选化合物。
本发明包括几个鉴定M-CSF或M-CSF多肽结合伙伴的测试***。在溶液试验中，本发明的方法包括以下几个步骤：(a)使M-CSF或M-CSF多肽与一种或多种候选的结合伙伴化合物相接触；(b)鉴定与M-CSF或M-CSF多肽结合的化合物，可以通过分离M-CSF或M-CSF多肽/结合伙伴复合物，并将M-CSF或M-CSF多肽与结合伙伴化合物分离来达到鉴定的目的。在本发明的另一实施例中，还详细描述了表征结合伙伴化合物的物理、生物、和/或化学特性的额外步骤。一方面，M-CSF或M-CSF多肽/结合伙伴复合物，可用M-CSF或M-CSF多肽或候选结合伙伴化合物的特异性抗体进行分离。
在又一个实施例中，M-CSF或M-CSF多肽或候选的结合伙伴化合物含有便于其分离的标记或标签，而本发明的鉴定结合伙伴化合物的方法则包括：通过与标记或标签的相互作用而分离M-CSF或M-CSF多肽/结合伙伴复合物这一步骤。这一类的典型标签是多聚组氨酸序列，通常含有6个左右的组氨酸残基，这样标记的化合物可以通过镍的螯合作用来分离化合物。其它的标记和标签，如本领域熟知并常规使用的FLAG标签(Eastman Kodak，Rochester，NY)也包含在本发明中。
在体外试验的变化形式中，本发明提供一种方法，它含有以下步骤：(a)使M-CSF或M-CSF多肽与一种或多种候选的结合伙伴化合物相接触；(b)检测候选化合物与M-CSF或M-CSF多肽的结合情况。在另一实施例中，候选的结合伙伴化合物被固定化，而检测的是M-CSF或M-CSF多肽与它们的结合情况。固定化可以用本领域熟知的任何方法完成，包括与载体、珠、或层析树脂共价键合，以及利用非共价的高亲和相互作用(如抗体结合或使用链霉亲和素/生物素结合，其中固定化的化合物包含一个生物素组分)。结合的检测可以采用(i)非固定化的化合物上的放射性标记，(ii)非固定化化合物上的荧光标签，(iii)非固定化化合物的免疫特异性抗体，(iv)非固定化化合物上的标记，该标记能够激发连在固定化化合物上的荧光载体，也可以采用本领域熟知并常规使用的其它方法。
调控(也就是，增强、减弱或阻碍)M-CSF或M-CSF多肽的活性或表达的试剂，例如抗体或有机/无机化合物，可以如下鉴定：可以将假定的调控物与表达M-CSF或M-CSF多肽或多核苷酸的细胞一同培养，并确定假定调控物对M-CSF或M-CSF多肽或多核苷酸的活性或表达的作用。调控M-CSF或M-CSF多肽的化合物的选择性可以通过比较其对M-CSF或M-CSF多肽的作用和它对其它相关化合物的作用而加以评估。具有选择性的调控物可包括，例如，抗体以及特异地与M-CSF或M-CSF多肽或编码M-CSF或M-CSF多肽的核酸相结合的其它蛋白质、肽、或有机分子。M-CSF或M-CSF多肽活性的调控物，可以在治疗由正常或异常的M-CSF或M-CSF多肽活性参与的疾病和生理情况中发挥作用。
本发明中鉴定调控物的方法包括上述任何鉴定结合伙伴化合物方法的变化形式，这些变化形式包括：对于已经鉴定的结合伙伴化合物，在候选的调控物存在及不存在的情况下实施结合试验。如果在候选调控物存在及不存在的情况下，M-CSF或M-CSF多肽与结合伙伴化合物的结合有所变化，则将该候选调控物鉴定为调控物。增强M-CSF或M-CSF多肽与其结合伙伴化合物之间结合的调控物称为增强子或激活剂，而减弱M-CSF或M-CSF多肽与其结合伙伴化合物之间结合的调控物称为抑制剂。
本发明还包括，鉴定与M-CSF或M-CSFR多肽相互作用或抑制其生物活性(也就是抑制酶活性、结合酶活性等)的化合物的高通量筛选(HTS)试验。HTS试验能够高效地筛选大量化合物。考虑将基于细胞的HTS***用于探究M-CSF或M-CSFR和其结合伙伴之间的相互作用。设计的HTS试验，可用于鉴定具有所需特性的“优先化合物”或“先导化合物”(“hits”or“lead compound”，对于鉴定所得的化合物可以设计修饰来改善所需活性。对“优先化合物”或“先导化合物”的化学修饰，一般基于“先导化合物”与M-CSF或M-CSFR多肽之间的可识别的结构/活性关系。
本发明的另一方面，涉及鉴定与M-CSF或M-CSFR多肽或编码M-CSF或M-CSFR多肽的核酸分子相结合的化合物的方法，该方法包括：将化合物与M-CSF或M-CSFR多肽或者编码M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相接触，并确定该化合物是否与M-CSF或M-CSFR多肽或编码M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相结合。可以用技术人员熟知的结合试验确定结合情况，包括但并不限于，凝胶移位分析、Western杂交印记、放射性标记竞争试验、基于噬菌体的表达克隆、层析共分离、共沉淀、交联、互作捕获/双杂交分析、Southwestern杂交印记分析、ELISA等等，这些方法描述于，例如，Current Protocols in MolecularBiology(1999)John Wiley&Sons，NY，该文献全文引入本文作为参考。要进行筛选的化合物(可以包括怀疑能够与M-CSF或M-CSFR多肽或编码M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相结合的化合物)包括但并不限于，胞外、胞内、生物或化学来源的物质。本发明的方法还包括连有标记物的配体(包括底物、衔接子或受体分子)，标记物诸如放射性标记(例如125I、35S、32P、33P、3H)，荧光标签、化学发光标记、酶类标记或免疫原性标记。本发明范围内的调控物包括但并不限于，非肽类分子(如非肽模拟物)、非肽别构剂、和肽。此类测试中所用的M-CSF或M-CSFR多肽或多聚核苷酸可以以游离形式存在于溶液中，附着于固相载体上，位于细胞表面或位于细胞内或与细胞的一部分相结合。本领域的技术人员可以，例如，测定M-CSF或M-CSFR多肽与待测化合物之间复合物的形成情况。或者，本领域的技术人员可以检测由待测化合物引起的M-CSF或M-CSFR多肽与其底物形成复合物的减少情况。
本发明的另一方面，涉及能够调控(也就是降低)M-CSF或M-CSFR多肽活性的化合物的鉴定方法，该方法包括使M-CSF或M-CSFR多肽与化合物相接触，并且确定该化合物是否能够调控M-CSF或M-CSFR多肽的活性。将待测化合物存在条件下的活性与没有待测化合物存在条件下的活性相比较。如果含有待测化合物的样品所具有的活性高于不加入待测化合物样品的活性，那么该化合物就具有增强活性。类似地，如果含有待测化合物的样品所具有的活性低于不加入待测化合物样品的活性，那么该化合物就具有抑制活性。
本发明尤其适用于在任何一种药物筛选技术中使用M-CSF或M-CSFR多肽来筛选化合物。待筛选的化合物(可含有怀疑能与M-CSF或M-CSFR多肽或编码M-CSF或M-CSFR多肽的核酸相结合的化合物)包括但并不限于，胞外的、胞内的、生物和化学来源的化合物。在此试验中应用的M-CSF或M-CSFR多肽或多聚核苷酸可以以游离形式存在于溶液中，附着于固相载体上，位于细胞表面或位于细胞内或与细胞的一部分相结合。本领域的技术人员可以，例如，测定M-CSF或M-CSFR多肽与待测化合物之间复合物的形成情况。或者，本领域的技术人员可以检测由待测化合物引起的M-CSF或M-CSFR多肽与其底物形成复合物的减少情况。
本发明的M-CSF或M-CSFR多肽活性的确定，可以采用如下方法，例如，检测它们与化学合成的和天然存在的配体互相结合的能力。或者，可以通过检测M-CSF或M-CSFR多肽与衔接分子相结合的能力来测定它们的活性。M-CSF或M-CSFR多肽活性也可以通过检测效应分子的活性加以确定，这些效应分子包括但并不限于，由M-CSF或M-CSFR激活的其它下游酶类。因此，M-CSF或M-CSFR多肽活性的调控物可以改变M-CSF或M-CSFR的功能，例如，M-CSF或M-CSFR多肽的结合特性。在本发明的多个实施例中，可以采用M-CSF或M-CSFR多肽与天然结合伙伴之间的结合试验，也可以用其它的本领域已知的M-CSF或M-CSFR多肽活性的结合或功能试验。本发明的生物学活性，包括但并不限于，与天然的或非天然的配体之间的结合活性，以及本领域已知的M-CSF或M-CSFR多肽的任何功能活性。M-CSF或M-CSFR多肽活性的非限制性实例包括底物蛋白的水解，以及其与底物、配体、衔接子(adaptor)和受体分子的结合活性。
本发明的调控物表现出各种化学结构，通常可以归为以下几类：天然的M-CSF或M-CSFR配体的非肽模拟物、M-CSF或M-CSFR的肽和非肽异构效应子、以及可以起到M-CSF或M-CSFR激活剂或抑制剂作用的肽(竞争性的、无竞争性的、和非竞争性的)(例如，抗体产物)。本发明并不限制合适的调控物的来源，调控物可以来自源于天然的物质，如植物、动物或矿物萃取物，或者来自非天然物质，如小分子文库，包括组合化学方法构建的文库以及肽文库的产物。
其它方法也可用于酶活性的检测，这些方法包括但并不限于，光度测定法、放射性测定法、HPLC、电化学等方法，这些方法描述于，例如酶试验：实用方法，R.Eisenthal和M.J.Danson编(1992)牛津大学出版，该文献全文引入本文作为参考。
编码M-CSF或M-CSFR多肽的eDNA可以用于药物开发过程；每天能够以高通量筛选方式(HTSs)检测上千种未知化合物的试验已有详尽的描述。文献中有很多将放射性标记的配体用于HTS结合试验，并以其发现药物的实例(参见，Williams，Medicinal Research Reviews(1991)11，147-184；Sweetnam，等人，J.Natural Products(1993)56，441-455的综述)。结合试验HTS中优选固定化的M-CSF或M-CSFR，因为这样会有更好的特异性(更高的相对纯度)，并且会提供产生大量的M-CSF或M-CSFR材料的能力，还可以用于多种形式中(参见，Hodgson，Bio/Technology(1992)10：973-980)；这些文献均全文引入本文作为参考)。
已有多种异源***可用于功能性地表达重组多肽，这些***是本领域技术人员所熟知的，这些***包括细菌(Strosberg，等人，Trends inPharmacological Sciences(1992)13：95-98)、酵母(Pausch，Trends inBiotechnology(1997)15：487-494)、几种昆虫细胞(Vanden Broeck，Int.Rev.Cytology(1996)164：189-268)、两栖类细胞(Jayawickreme等人，CurrentOpinion in Biotechnology(1997)8：629-634)和几种哺乳动物细胞系(CHO，HBK293，COS，等；参见Gerhardt，等人，Eur.J.Pharmacology(1997)334：1-23)。这些例子并不排除使用其它可能的细胞表达***，包括来自线虫的细胞系(PCT申请WO 98/37177)。
在本发明的优选实施例中，调控M-CSF或M-CSFR多肽活性的化合物的筛选方法包括：将待测化合物与M-CSF或M-CSFR多肽相接触，并检测化合物与M-CSF或M-CSFR多肽是否形成复合物。在这样的试验中，配体通常是带有标记的。在进行了合适的培养以后，将游离的配体从结合形式中分离出来，而游离的未形成复合物的标记量，可作为特定化合物与M-CSF或M-CSFR多肽的结合能力的度量标准。
在本发明的另一实施例中，采用高通量的筛选方法筛选与M-CSF或M-CSFR多肽有合适的结合亲合度的化合物。简单来说，在固相底物上合成了大量不同的小肽待测化合物。肽类待测化合物与M-CSF或M-CSFR多肽接触并洗涤。然后，用本领域已知的方法检测结合的M-CSF或M-CSFR多肽。本发明中纯化的多肽也可以直接包被于板上，并用于前述的药物筛选技术。此外，非中和抗体也可以用来捕捉蛋白质并将其固定于固相载体上。
通常，用本领域技术人员熟知的方法，表达的M-CSF或M-CSFR多肽可以和用合适的放射性同位素标记的底物、配体、衔接子或受体分子联合应用于HTS结合试验，这些同位素包括但并不限于，125I、3H、35S或32P。或者，底物、配体、衔接子或受体分子可以用熟知的方法以合适的荧光衍生物进行标记(Baindur，等人，Drug Dev.Res.，(1994)33：373-398；Rogers，Drug DiscoveryToday(1997)2：156-160)。固定的与M-CSF或M-CSFR特异结合的放射性配体，可以用几种标准试验中的某一种，并通过HTS分析加以检测，包括：过滤M-CSF或M-CSFR-配体复合物而将结合形式和非结合形式的配体加以分离(Williams，Med.Res.Rev.(1991)11，147-184；Sweetnam，等人，J.Natural Products(1993)56，441-455)。其它方法包括闪烁亲近测定法(SPA)或FlashPlate形式，在该方法中不需要进行这样的分离(Nakayama，Cur.Opinion Drug Disc.Dev.(1998)1：85-91 Bosse，等人，J.Biomolecular Screening(1998)3：285-292)。荧光配体的结合可以用多种方法加以检测，包括荧光能量转移(FRET)，结合配体的直接质谱-光学-荧光测定(spectrophotofluorometric)分析，或荧光极化法(Rogers，Drug Discovery Today(1997)2，156-160；Hill，Cur.Opinion Drug Disc.Dev.(1998)1，92-97)。
本发明包括大量用于筛选和鉴定与M-CSF或M-CSFR结合的M-CSF或M-CSFR抑制剂的方法。在一个实施例中，将M-CSF或M-CSFR固定化，并在候选调控物(如，抑制化合物)存在与不存在的条件下，检测M-CSF或M-CSFR与结合伙伴之间相互作用。在另一实施例中，M-CSF或M-CSFR与结合伙伴的相互作用在溶液中加以检测，同样是在存在与不存在候选抑制化合物的条件下加以检测。在以上两种试验中，降低M-CSF或M-CSFR和其结合伙伴之间结合的化合物鉴定为抑制剂。另一种构思的方法包括双杂交试验的变化形式，其中蛋白/蛋白相互作用的抑制剂鉴定为能够使转化或转染的宿主细胞中检测到正信号的物质，如1995年8月3日出版的PCT申请WO95/20652中所描述的。
本发明涉及的候选调控物，包括从潜在激活剂和潜在抑制剂文库中选到的化合物。有很多用于鉴定小分子调控物的不同文库，包括：(1)化学文库，(2)天然产物文库，和(3)由随机肽、寡核苷酸、或有机分子组成的组合文库。化学文库包含随机化学结构物，其中的一些是已知化合物的类似物或是在其它药物筛选中鉴定为“优先化合物”或“先导化合物”的类似物，其中一些由天然物衍生而来，另一些则来自非定向的有机合成化学法。天然物文库是微生物、动物、植物或海洋生物的集合体，通过以下方法创造用于筛选的混合物：(1)发酵并提取来自土壤、植物或海洋微生物的培养液。天然物文库包括聚酮化合物、非核糖体肽，及其变异体(非天然存在形式)。参看Science 282：63-68的综述。组合文库是由大量的肽、寡核苷酸、或有机化合物组成的混合物。这些文库相对容易用传统的自动化合成方法、PCR、克隆或合适的合成方法进行制备。尤为感兴趣的是非肽组合文库。其它感兴趣的文库包括肽文库、蛋白质文库、模拟肽文库、多平行合成集合文库、重组文库、和多肽文库。可以参见Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8：701-707(1997)中关于组合化学及其由此产生的文库的综述。使用本文所述的各种文库鉴定调控物，可以对候选“优先化合物”(或“先导化合物”)进行修饰，从而使“先导化合物”的调控活性达到最佳能力。
还可以设计本发明范围内的其他候选抑制剂，包括可溶性形式的结合伙伴，以及这些结合伙伴的嵌合或融合蛋白。本文使用的“结合伙伴”广泛地包括非肽调控物，以及肽调控物，包括抗体、抗体片段、和包含对M-CSF或M-CSFR具有免疫特异性抗体域的修饰化合物。
可用其他分析鉴定M-CSF或M-CSFR特异性配体，这些试验包括：通过检测受试配体与靶蛋白的直接结合作用来鉴定靶蛋白的配体，以及用离子喷雾质谱/HPLC方法或其它的物理和分析法进行亲和超滤来鉴定靶蛋白的配体。或者，这种结合相互作用可以用酵母双杂交***间接鉴定，该方法描述于Fields等人，Nature，340：245-246(1989)和Fields等人，Trends in Genetics，10：286-292(1994)，这两篇文献作为参考引入本文。双杂交***是检测两种蛋白质或多肽之间相互作用的遗传学方法。可以用来鉴定与已知蛋白相结合的蛋白质，或者用来描绘对于相互作用起关键作用的结构域或残基。已经发展出该方法的变化形式用于克隆编码DNA结合蛋白的基因，用来鉴定与蛋白质结合的肽，以及用于药物筛选。双杂交***利用了一对相互作用的蛋白将转录激活域带到DNA结合域附近的能力，其中该激活域可与报告基因的上游激活序列(UAS)相结合，并且该方法通常在酵母中进行。该试验要求构建2个杂交基因：(1)编码与第一个蛋白质相融合的DNA结合域的基因，和(2)编码与第二个蛋白质相融合的激活域的基因。DNA结合域将第一个杂交蛋白质定向地引向报告基因的UAS；然而，由于大多数的蛋白缺乏激活域，这一DNA结合杂交蛋白并不能激活报告基因的转录。第二个杂交蛋白质尽管含有结合域，但由于其不与UAS结合，所以本身也不能激活报告基因的表达。然而，在两个杂交蛋白均存在的情况下，第一个和第二个蛋白质之间的非共价相互作用将激活域拉到UAS处，激活了报告基因的转录。例如，当第一个蛋白质是M-CSF或M-CSFR(或其亚单位或片段)时，已知它能与另一种蛋白质或核酸相互作用，那么这一试验可以用于检测试剂对结合相互作用的干扰。在***中加入不同的受试试剂，并且检测报告基因的表达。存在抑制剂则使报告信号不能出现。
酵母双杂交试验也可以用于鉴定与M-CSF或M-CSFR相结合的蛋白质。在鉴定与M-CSF或M-CSFR(或其亚单位或片段)相结合的蛋白的试验中，可以运用同时编码M-CSF或M-CSFR(或其亚单位或片段)和UAS结合域(也就是第一个蛋白质)的融合多聚核苷酸。此外，构建大量编码激活域与另一个蛋白融合蛋白的杂交基因，并在试验中进行筛选。通常，第二个蛋白质是由总cDNA和基因组DNA融合文库中的一个和多个成员所编码的，每个第二个蛋白的编码区都与激活域相融合。这一***可以用于一系列蛋白质，而且甚至无需知道第二个结合蛋白的种类或功能。该***高度敏感并且能够检测到其它方法无法显现出的相互作用；仅仅是暂时的相互作用就能引发转录从而产生稳定的mRNA，此mRNA可以反复翻译而产生报告蛋白。
其它试验也可以用于寻找与靶蛋白相结合的试剂。一种这样的鉴定受试配体与靶蛋白之间结合作用的筛选方法描述于美国专利5,585,277中(该文献作为参考引入本文)。该方法依据的原理是蛋白质通常是以折叠和非折叠状态的混合物的形式存在的，而且在两种状态间不断变换。当受试配体与折叠形式的靶蛋白相结合时(也就是当受试配体是靶蛋白的配体时)，与配体相结合的靶蛋白仍旧保持其折叠状态。因此，当存在与靶蛋白结合的受试配体时，折叠状态的靶蛋白量会比不存在配体时的量多。配体与靶蛋白的结合可以用任何能够区分靶蛋白的折叠和非折叠状态的方法加以测定。在进行该试验时，并不需要知道靶蛋白的功能。几乎任何试剂都可以作为受试配体而用这种方法进行检测，包括但并不限于，金属、多肽、蛋白质、脂类、多糖、多核酸和有机小分子。
鉴定靶蛋白的配体的另一种方法描述于Wieboldt等人，Anal.Chem.，69：1683-1691(1997)(作为参考引入本文)。这一技术能同时筛选组合文库中以溶液形式存在的20-30种试剂与靶蛋白的结合情况。结合于靶蛋白的试剂可用简单的洗膜步骤而与文库中的其它组分分离开来。随后，将保留于膜上的特异性选择到的分子从靶蛋白中释放出来，并用HPLC和气动辅助电喷雾(离子喷雾)离子化质谱进行分析。这一程序可选择到与靶蛋白亲和度最大的文库组分，并且尤其适用于小分子文库。
本发明的其它实施例包括使用竞争性筛选试验，其中能与本发明的多肽相结合的中和抗体，会与受试化合物竞争性地与多肽结合。这样，该抗体可用于检测是否存在任何含有一个或多个M-CSF或M-CSFR分子抗原决定簇的肽段。放射性标记竞争结合研究描述于A.H.Lin等人Antimicrobial Agents andChemotherapy(1997)41卷，no.10，第2127-2131页，其揭示的内容全部引入本文作为参考。
在本发明的其它实施例中，本发明的多肽用作研究工具而鉴别、表征和纯化相互作用的调节蛋白。用本领域已知的方法在本发明的多肽上引入合适的标记，并用其捕捉相互作用的分子。例如，将分子与带标记的多肽一同培养，洗去未结合的多肽，然后定量检测多肽复合物。用不同的多肽浓度得到的数据可用来计算多肽与蛋白质复合物的结合情况、数目、和亲和度。
标记的多肽同样可以作为试剂来纯化与多肽相互作用的分子，包括但并不限于，抑制剂。在亲和纯化的一个实施例中，多肽与层析柱共价偶连。提取细胞和它们的膜，并使各种细胞的亚组分穿过层析柱，分子通过它们与多肽的亲和力而结合于层析柱上。从柱上回收多肽复合物，解离并将回收的分子用于测序。然后，该氨基酸序列再用于鉴定捕获的分子或用于设计简并的寡核苷酸，从合适的cDNA文库中克隆对应的基因。
或者，可以鉴定与M-CSF或M-CSFR配体表现出相似特性的化合物，但是这些化合物却比人或动物体内的内源性配体更小并表现出更长的半衰期。在设计有机化合物时，根据本发明制得的分子用作“先导”化合物。为已知的药物活性化合物设计模拟物的方法，是基于这些“先导”化合物而开发药物的熟知的方法。模拟设计、合成和检测，通常可以用来避免对大量分子的目标特性进行随机筛选。此外，对本发明的多肽所编码的推定氨基酸序列分析所得到的数据，可以用来设计特异性更好因而药效更高的新药。
可以根据已有的信息，用计算机模拟来推断本发明蛋白质的三维结构。因此，可以根据预测的M-CSF或M-CSFR的结构来设计新颖的配体。
本发明的另一个方面是用本文揭示的M-CSF或M-CSFR核苷酸在其它的动物中鉴定同源物。本文揭示的任何核苷酸序列、或其任何部分都可以用作例如探针，从而用于筛选数据库或核酸文库，例如，基因组文库或cDNA文库，并使用本领域的技术人员所熟知的筛选程序来鉴定同源物。因此，可以鉴定出与M-CSF或M-CSFR的序列至少具有50％的同源性，较佳地至少具有60％的同源性，更佳地至少具有70％的同源性，更佳地至少具有80％的同源性，更佳地至少具有90％的同源性，更佳地至少具有95％的同源性，最佳地至少具有100％的同源性的同源物。
联合治疗
鉴定了一种以上在动物模型中有效的M-CSF拮抗剂以后，可以将两种或更多种的此类M-CSF拮抗剂混合使用而进一步改善其对癌转移和/或与癌转移相关的骨质损失的疗效。含有一种或多种M-CSF拮抗剂的组分可以施用于患者、或容易罹患癌转移和/或与癌转移相关的骨质损失的人或哺乳动物。
尽管M-CSF拮抗剂治疗可以用于癌症的各个阶段，然而抗体治疗尤其适用于晚期或转移性癌症。对没有接受过化疗的病人更推荐将抗体治疗与化疗或放疗联合使用，而接受过一种或更多种化疗的病人则更适合应用抗体治疗。此外，抗体治疗还能降低同时使用的化疗的剂量，尤其适用于对化疗剂的毒性没有很好的耐受能力的病人。
本发明的方法包括施用单一的或联合使用的抗M-CSF和抗M-CSFR抗体，或者是不同抗体的“鸡尾酒混合物(cocktail)”。这样的抗体鸡尾酒可具有某些优点，因为它们含有的抗体利用不同的效应子机制，或者是将具有直接细胞毒性的抗体与依赖免疫效应功能的抗体联合使用。这样的组合抗体可以显现出协同的治疗效果。此外，可以将M-CSF或M-CSFR抗体与其它治疗剂和/或治疗程序联合使用，包括但并不限于，各种化学制剂、雄激素阻断剂、和免疫调节剂(例如，IL-2，GM-CSF)、二磷酸盐(bisphosphonat)制剂(例如，Aredia、Zometa、氯膦酸盐(clodronate))、手术、放疗、化疗、激素治疗(例如，它莫西芬、抗雄激素治疗)、抗体治疗(例如，RANKL/RANK中和抗体、PTHrP中和抗体、抗Her2抗体、VEGF中和抗体)、治疗性蛋白治疗(例如，可溶性的RANKL受体、OPG和PDGF和MMP抑制剂)、小分子药物治疗(例如，Src激酶抑制剂)、生长因子受体激酶抑制剂、寡核苷酸治疗(例如，反义的RANKL或RANK或PTHrP)、基因治疗(例如，RANKL或RANK抑制剂)、肽治疗(例如，RANKL突变蛋白)以及本文所述的那些蛋白质、肽、化合物、和小分子。
癌症的化疗剂包括，不限于：烷化剂，如卡铂和顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，如亚硝(基)脲氮芥(BCNU)；抗代谢剂，如氨甲蝶呤；嘌呤类似物抗代谢剂，巯(基)嘌呤；嘧啶类似物抗代谢剂，如5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨(gemcitabine)；激素类抗肿瘤制剂，如瑞林、亮丙瑞林和它莫西芬；天然抗肿瘤制剂，如阿地白介素(aldesleukin)、白介素-2、紫杉萜、依托泊甙(VP-16)、干扰素α、紫杉醇、和维甲酸(ATRA)；抗生素类天然抗肿瘤制剂，如博来霉素、放线菌素、阿霉素、和丝裂霉素；和长春碱天然抗肿瘤制剂，如长春花碱、长春新碱、长春地辛；羟基脲；醋葡醛内酯、阿霉素、异环磷酰胺、依诺他滨、环硫雄醇、阿柔比星、环胞苷、尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、卡波醌、卡铂、卡莫氟、色霉素A3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺、裂褶菌、阿糖胞苷、甲氮咪胺、巯嘌呤苷、三胺硫磷、替加氟、新制癌菌素、OK-432、博来霉素、福他隆(furtulon)、溴尿甘、二甲磺酸丁酯、磷酸己烯雌酚四钠、培洛霉素、贝他定(乌苯美司)、干扰素β、美雄氨、二溴甘露醇、消旋苯丙氨酸氮芥、核纤层肽、香菇[多]糖、采绒革盖菌提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(***/氮芥(mechlorethamine))。
此外，其它的用作癌症病人治疗剂的试剂包括EPO、G-CSF、更昔洛韦；抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；叠氮胸苷(AZT)；白介素1至18，包括其突变物和类似物；干扰素或细胞因子，如干扰素α、β、和γ激素，如促黄体(生成)激素释放激素(LHRH)及其类似物以及***释放激素(GnRH)；生长因子，如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)、和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α和β(TNF-α&β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形态发生蛋白1至7(BMP1-7)；生长抑素(somatostatin)；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物岐化酶(SOD)；补体因子；抗血管生成因子；抗原物质；和前体药物。
施用与制剂
本发明提供了化合物、含有化合物的药物制剂、制备药物制剂的方法、和用药物制剂和化合物治疗病人的方法。
这些组合物可以下列形式存在，例如，颗粒、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳化剂、酏剂、悬浮剂或溶液。该组合物可以以各种施用途径进行给药，例如，口服给药、鼻部给药、直肠给药、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹腔膜内注射。以下的剂型作为实例给出，而不应当认为是对本发明的限制。
对于口服、面颊和舌下给药，粉末、悬浮剂、颗粒、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊、和小胶囊和可以接受的固态剂型。其制备方法为，例如，混合本发明的一种或多种化合物，或药学上可接受的盐或其互变异构体，至少添加一种添加剂，如淀粉或其它添加剂。合适的添加剂为蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、***树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。或者，口服剂型可以含有其它组分来辅助施药，如惰性稀释剂、或润滑剂如硬脂酸镁、或防腐剂如对羟基苯甲酸酯(paraben)或山梨酸、或抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E或半胱氨酸，分解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲液、甜味剂、调味剂或芳香剂。片剂和丸剂还可以进一步用本领域已知的合适的包衣材料处理。
可以口服的液态剂型可以是药学上可接受的乳化剂、糖浆、酏剂、悬浮剂和溶液，可以含有惰性的稀释剂，如水。药物剂型和药剂可以用灭菌液体制备成液态悬浮剂或溶液的形式，可用的液体如，但并不限于，油、水、醇，及其组合物。药学上可接受的合适的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂也可以加入以口服或肠道外的方式给药的药剂中。
如上所述，悬浮剂可以含有油类。这些油包括但并不限于：花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。悬浮剂的制备也可以含有脂肪酸的酯类，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯、乙酰脂肪酸甘油酯。悬浮剂可以含有醇类，如，但并不限于：乙醇、异丙醇、十六烷基醇、甘油和丙二醇。醚类，如，但并不限于，聚(乙烯醇)、石油类碳氢化合物(如矿物油和石蜡油)；而且，水也可以用于悬浮剂。
对于鼻部给药，药物制剂和药剂可以是含有合适的溶剂以及选择性含有其它化合物(如，但并不限于，稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些物质的混合物)的喷雾或气溶胶。气溶胶制剂的推进剂可以含有压缩空气、氮气、二氧化碳、或低沸点的碳氢化合物溶剂。
可注射的剂型通常包括水相悬浮制剂或油相悬浮制剂，可以用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂进行制备。可注射剂型可以是溶液相的或为悬浮形式的，用溶剂或稀释剂进行制备。可接受的溶剂或载体包括无菌水、Ringer′s溶液、或等渗的水相盐溶液。或者，可以用无菌油类作为溶剂或悬浮剂。优选地，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然的或合成的油类、脂肪酸、单、双或三脂肪酸甘油酯。
用于注射的药物制剂和/或药剂可以是能用上述的合适溶液复原的粉末。这样的例子包括但并不限于，冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或粒子。用于注射的制剂可以选择性地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些制剂的混合物。
对于直肠给药，药物制剂或药剂可以是栓剂、软膏剂、灌肠剂、片剂或乳膏剂的形式，使化合物在小肠、乙状结肠和/或直肠中释放。用本发明的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐或异构体以及可接受的载体(例如，可可脂或聚乙二醇，其在通常的储存温度下以固相形式存在，而在体内适合药物释放的温度下(如直肠中)则以液相存在)来制备直肠栓剂。可以将油类用于软胶形式和栓剂的制备。水、盐水、水相葡萄糖和相关的糖溶液、以及甘油可以用来制备悬浮制剂，悬浮制剂还可以含有悬浮剂，如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙纤维素或羧甲基纤维素，以及缓冲剂和防腐剂。
除了上述的典型剂型，药学上可接受的赋形剂和载体基本上是本领域的技术人员所熟知的，因此也包括在本发明中。这些赋形剂和载体描述于，例如，“Remingtons Pharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)，作为参考引入本文。
本发明的药剂可以如下所述设计为短时作用、快速释放、长时作用和持续释放的。因此，药物制剂也可以制成可控释放或缓慢释放的形式。
本组合物还可以含有，例如，微胶粒或脂质体，或其它胶囊形式，也可以施用长时间释放的形式而施用达到长时间贮存和/或递送的效果。因此，药物制剂和药剂可以压缩至丸或筒中并作为缓释注射或作为植入物(如支架)进行肌肉或皮下植入。这种植入物可以采用已知的惰性材料，如聚硅酮和生物可降解的聚合物。
可以根据病情、年龄、体重、总体健康情况、性别、和对象的饮食情况、剂量间隔、施用途径、***率和药物组合等调整特定的剂量。任何含有有效剂量的上述剂型都属于常规实验的范围内，因此也属于本发明的范围内。
根据本发明，含有M-CSF拮抗剂的组合物可以用不经过胃肠道的、局部的(topically)、口服的或病灶局部(locally)的给药方式用以治疗。优选地，组合物用口服或不经过胃肠道的方式给药，也就是静脉、腹腔膜、皮内或肌肉注射。因此，本发明提供的方法采用组合物的方式予以给药，该组合物含有一种或多种M-CSF拮抗剂，并使用药学上可接受的载体，优选的是含水载体。可以使用一系列的含水载体，例如，水、水缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸溶液等等，还可以含有其它的蛋白质以提高稳定性，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，这些蛋白可以进行温和的化学修饰等。
通常，制备的用于治疗癌症转移或与癌症转移相关的骨质损失的M-CSF拮抗剂基本上不含有其它天然存在的免疫球蛋白或其它生物分子。优选的M-CSF拮抗剂还在施用于罹患或容易罹患癌症转移和/或与癌症转移相关的骨质损失的哺乳动物时表现出最低的毒性。
本发明的组合物可以用传统的、熟知的消毒技术进行消毒。得到的溶液可以包装以供使用或在无菌的条件下过滤并冷冻干燥，施用前再将冷冻干燥的药品与无菌溶液混合。组合物可以含有药学上可接受的适用于生理条件所需的辅助物质，如pH调节剂和缓冲试剂、渗透性调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和稳定剂(例如1.20％的麦芽糖等)。
本发明的M-CSF拮抗剂还可以通过脂质体施用。脂质体包括乳化剂、泡沫、微胶粒、不可溶的单层磷脂分散体、薄片层等等，这些都可以作为载体而将M-CSF拮抗剂靶向特定的组织以及延长组合物的半衰期。可获得各种制备脂质体的方法，如美国专利4,837,028和5,019,369等所述，这些专利作为参考引入本文。
这些组合物中M-CSF拮抗剂的浓度变化范围很宽，也就是其质量浓度从低于约10％，通常至少约为25％，至高达约75％或90％，而且根据选用的特殊施用模式，主要通过液体的体积、粘度等来进行选择。制备可口服、局部和肠胃外给药的化合物的实际方法，对于本领域的技术人员是熟知的或显而易见的，例如Remington′s Pharmaceutical Science，第19版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)，作为参考引入本文。
对本发明化合物治疗癌症转移或/与癌症转移相关的骨质损失的有效剂量的确定可以用标准的经验方法来完成，这是本领域所熟知的。例如，可以采用确定血清阻碍M-CSF引发的鼠单核细胞(CD11b+细胞，CD11细胞的亚群，表达高水平的M-CSF受体)的增殖和存活的试验而对施用了一定剂量的M-CSF拮抗剂的对象进行体内血清中和活性的评估。
施用于已经患有或易患癌症转移或/与癌症转移相关的骨质损失的哺乳动物的本发明组合物，其剂量要足以预防或至少部分抑制癌症转移或/与癌症转移相关的骨质损失的发展。足够达到这一效果的剂量定义为“治疗有效剂量”。M-CSF拮抗剂的有效剂量可根据疾病的严重性和受治病人的体重和总体状况而有所变化，但是通常在约1.0μg/kg至约100mg/kg体重之间，更普遍使用的剂量为每次施用约10μg/kg体重至约10mg/kg体重之间。根据药物对疾病的反应和病人对治疗的耐受情况，可以根据需要每日、每周或以更低的频率进行施药。可在一段较长的时间内施用维持剂量，而剂量也可根据需要调整。
组合物可以单独或复合施用，而主治医师可以选择其剂量水平及施用方式。在任何情况下，制剂所提供的M-CSF拮抗剂应当足以有效的预防癌症转移或/与癌症转移相关的骨质损失或将其严重性降至最低。本发明的组合物可以单独施用或作为辅助治疗与本领域已知的其它疗法联合使用来治疗癌症转移或/与癌症转移相关的骨质损失。
II免疫疗法
对治疗癌症有效的抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体包括能够对肿瘤发动有效免疫应答的抗体以及具有直接细胞毒性的抗体。在这方面，抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体或者通过补体介导的机制或者通过依赖抗体的细胞毒性(ADCC)机制而引起肿瘤细胞的裂解，这两个机制都要求免疫球蛋白分子完整Fc片段与效应细胞的Fc受体区域或与补体蛋白相互作用。此外，对肿瘤细胞的生长发挥直接生物学效应的抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体也可以用于本发明的操作中。这种直接细胞毒性的抗体发挥作用的潜在机制包括：抑制细胞生长，调控细胞分化，调控肿瘤血管生成因子的分布型，以及诱导细胞凋亡。特定的抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体发挥其抗肿瘤效果的机制可以用任何设计用来确定ADCC、ADMMC、补体介导的细胞裂解等的方法加以评估，这在本领域中是普遍知晓的。
在一个实施例中，所实施的免疫疗法使用对膜结合形式的M-CSF(M-CSFα)比分泌性的M-CSF具有更高亲和度的抗体。例如，所制备的抗体可以特异地与M-CSFα的切割位点或其邻近区域结合，或与M-CSFα的膜邻近部分结合。这样的抗体同样有利于抑制可溶性的M-CSFα活性部分的切割与释放。
抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体可以以它们的“裸露”形式或非偶联形式施用，或者可以将治疗制剂偶联其上。在一个实施例中，抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体作为辐射敏化剂使用。该实施例中，抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体偶联于辐射敏化剂上。如本文所用，术语“辐射敏化剂”定义为：以治疗有效剂量施用于动物的分子(优选低分子量的分子)，用于提高细胞对电磁辐射的敏感度和/或改善电磁辐射治疗疾病的疗效。能用电磁辐射治疗的疾病包括肿瘤疾病，良性和恶性的肿瘤，以及癌细胞。
如本文所用，术语“电磁辐射”和“辐射”包括但并不限于，波长在10-20至100米之间的辐射。本发明的优选实施例采用的电磁辐射：伽玛辐射(10-20至10-13米)，X-射线辐射(10-12至10-9米)，紫外光(10nm至400nm)，可见光(400nm至700nm)，红外辐射(700nm至1.0mm)，和微波辐射(1mm至30cm)。
已知辐射敏化剂能够提高癌细胞对电磁辐射毒性效果的敏感性。目前，很多癌症治疗方案都利用能被X-射线电磁辐射所激发的辐射敏化剂。例如，X-射线所激发的辐射敏化剂包括，但并不限于以下几种：甲硝哒唑，米索硝唑，脱甲基米索硝唑，哌莫硝唑，依他硝唑，尼莫唑，丝裂霉素C，RSU 1069，SR 4233，EO9，RB 6145，烟酰胺，5-溴脱氧尿嘧啶(BUdR)，5-碘脱氧尿嘧啶(IUdR)，溴脱氧胞嘧啶，氟脱氧尿嘧啶(FUdR)，羟基脲，顺铂，以及它们的治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力治疗(PDT)将可见光用作敏化剂的辐射激活因子。光动力辐射敏化剂的例子包括(但并不限于)下列物质：血卟啉衍生物、光敏素(r)[Photofrin(r)]、苯卟啉衍生物、Npe6、本卟啉锡(SnET2)、脱镁叶绿甲酯酸-a(Pheoborbide-a)、菌叶绿素a(bacteriochlorophyll-a)、萘青色素(naphthalocyanines)、酞青(phthalocyanines)、酞箐锌、以及它们的治疗上有效的类似物和衍生物。
本发明的一种方法的操作中所使用的抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体可以制成含有适合所需给药方法载体的药物组合物。合适的载体包括任何在与抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体组合使用时仍能保持抗体的抗肿瘤功能并且不与对象的免疫***发生反应的材料。实例包括但并不限于，任何标准的药物载体，如无菌磷酸缓冲液、抑菌水等。
本发明进一步提供了上面所述的带有可检测标记形式的抗体。可以使用放射性同位素标记，亲和标记(如：生物素、亲和素等)，酶标记(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)，荧光标记(如FITC或罗丹明等)，顺磁原子等来为抗体加上可检测的标记。这样标记的方式是本领域所熟知的；例如，参见(Sternberger，L.A.等人，J.Histochem.Cytochem.18：315(1970)；Bayer，E.A.等人，Meth.Enzym.62：308(1979)；Engval，E.等人，Immunol.109：129(1972)；Goding，J.W.J.Immunol.Meth.13：215(1976))。
本发明考虑使用“裸露”的抗M-CSF抗体或抗M-CSFR抗体，以及使用免疫偶联物。免疫偶联物的生产描述于美国专利6,306,393中。免疫偶联物可通过将治疗剂直接偶联于抗体组分而制备。通用技术描述于Shih等人，Int.J.Cancer41：832-839(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101-1106(1990)；和Shih等人，美国专利5,057,313。常用的方法包括将含有氧化的碳水化合物组分的抗体组分与载体聚合物(至少含有一个游离的胺官能团，并且加载了很多药物、毒素、螯合剂、硼附加物或其它的治疗制剂)反应。该反应会引入一个最初的Schiff碱(亚胺)连接，Schiff碱可以还原成仲胺而形成最终偶联加以稳定。
优选的载体聚合物是至少含有50个氨基酸残基的氨基葡聚糖或多肽，尽管也可以使用其它本质上等价的聚合物载体。优选地，最终的免疫偶联物可以溶解于水溶液中，如哺乳动物的血清，这样便于施用以及便于在治疗中有效的靶向。因此，载体聚合物的溶解功能将会增强最终的免疫偶联物的血清溶解度。尤其优选氨基葡聚糖。
用氨基葡聚糖载体制备免疫偶联物的程序通常是从葡聚糖聚合物开始，最好是平均分子质量在约10,000-100,000之间的葡聚糖。葡聚糖与氧化剂反应从而影响其碳水化合物环中的一部分，进行可调控的氧化而产生醛基，根据常规程序，氧化可以方便地用糖酵解化学试剂来完成，如NaIO4。
然后，氧化的葡聚糖再于多胺反应(优选二胺，更优地为单羟基或多羟基二胺)。合适的胺包括乙烯二胺，丙二胺，或其它的诸如聚亚甲基二胺，二亚乙基三胺或像多胺，1，3-二胺-2-羟基丙烷，或其它的像羟基二胺或多胺，等等。相对于葡聚糖的醛基，所使用的胺要过量，这样就能保证醛基官能团完全转变成Schiff碱官能团。
使用NaBH4，NaBH3，CN等还原剂来使产生的Schiff碱中间物还原并稳定。可以将所得的加合物通过传统的大小层析柱来除去交联的葡聚糖而得到纯化。
也可以使用其它传统的对葡聚糖引入胺官能团制备衍生物的方法，例如，与溴化氰反应后再与二胺反应。
氨基葡聚糖再与要加载的特殊药物的衍生物、毒素、鳌合剂、硼附加物(addend)或其他治疗剂反应，它们为激活形式，优选地是传统方法制备的羧基激活衍生物，例如，使用二环己基碳二亚胺(DCC)或其水溶性的变体来形成中间加成物。
或者，可以将如商路抗病毒抗体或蓖麻毒素的A链等多肽毒素藕合到氨基葡聚糖上，采用的方法为戊二醛缩合或用蛋白质上的激活羧基官能团与氨基葡聚糖上的胺反应。
用于放射性金属或核磁共振增强剂的螯合剂在本领域是熟知的。典型的有乙二胺四乙酸(EDTA)和五乙酸三钠钙(DTPA)的衍生物。这些螯合剂通常在其侧链上含有能将螯合剂连接到载体上的基团。这样的基团包括，例如，苯甲基异硫氰酸盐，DTPA或EDTA可以通过它藕合到载体的胺基团上。或者，螯合剂上的羧基或氨基可以用活化的方式藕合到载体上，或者先制备其衍生物再进行藕合，这些技术都是熟知的方法。
硼附加物，如碳硼烷，可以用传统的方法连接到抗体组分上。例如，如本领域中熟知的，碳硼烷可以用悬挂的侧链上的羧基官能团进行制备。将这样的碳硼烷连接到载体上，例如，氨基葡聚糖，可以通过碳硼烷的羧基基团的活化并与载体上的胺缩合而完成，以此产生中间偶联物。而后，这样的中间偶联物再连接到抗体组分上从而产生有疗效的免疫偶联物，如下所述。
多肽载体可以替代氨基葡聚糖使用，但是多肽载体的链中至少应当含有50个氨基酸残基，优选地含有100-5000个氨基酸残基。这些氨基酸中至少应当有一些为赖氨酸残基或谷氨酸或天冬氨酸残基。赖氨酸残基上悬挂的胺和谷氨酸以及天冬氨酸残基上悬挂的羧酸盐便于连接到药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其它的治疗制剂上。合适的多肽载体的实例包括多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、它们的共聚物，以及这些氨基酸和其它氨基酸(例如，丝氨酸)的混合聚合物，而使得到的加载载体和免疫偶联物具有所需的溶解特性。
中间偶联物与抗体组分的偶联是通过氧化抗体组分的碳水化合物部分并将所得的醛(或酮)羰基与加载了药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼附加物或其它的治疗制剂后仍残留在载体上的胺基团反应而获得的。或者，可以在加载了治疗制剂后，再往中间偶联物上引入胺基团，然后通过氧化的抗体组分与引入的胺基团的反应而得到中间偶联物。氧化可以很方便的用化学方法，例如NaIO4或其它糖酵解试剂实现，或者用酶的方法，例如神经酰胺酶和半乳糖氧化酶。在使用氨基葡聚糖作为载体的情况中，并不是所用的氨基葡聚糖的胺都典型地用于加载治疗制剂。氨基葡聚糖中剩余的胺与氧化的抗体组分缩合而形成Schiff碱加成物，然后再通过还原而稳定，通常使用硼氢化物还原剂进行还原。
类似的步骤也用于产生其它的根据本发明的免疫偶联物。加载的多肽载体优选地含有剩余的游离赖氨酸残基，与抗体组分的氧化碳水化合物部分进行缩合。
多肽载体上的羧基可以，如果需要，用例如DCC激活并与过量的二胺反应而转化成胺。
最终的免疫偶联物用传统的方法进行纯化，如在Sephacryl S-300上进行尺寸层析或用一个或多个CD84Hy抗原表位进行亲和层析。
或者，可以直接将抗体组分与治疗制剂进行偶联而制备免疫偶联物。常用的步骤与间接偶联方法类似，除了此处的治疗制剂是直接连接到氧化的抗体组分上的。
可以理解的是其它治疗制剂可以取代本文所述的螯合剂。本领域的技术人员可以在不使用不当的实验技术的前提下设计出偶联方法。
用于进一步说明，治疗制剂可以通过形成二硫键而连接到还原的抗体组分铰链区上。例如，可以在破伤风类毒素多肽上构建单一的半胱氨酸残基，用来将肽连接到抗体组分上。或者，可以用异双功能交联剂(如N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP))将这样的肽连接到抗体组分上。Yu等人，Int.J.Cancer56：244(1994)。这样的偶联所用的通用技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong，蛋白偶联和交联化学(CRC出版1991)；Upeslacis等人，“化学方法修饰抗体，”在单克隆抗体中：原理和应用，Birch等人(eds.)，187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“合成肽衍生抗体的生产及表征，”在单克隆抗体中：生产、工程和临床应用，Ritter等人(eds.)，60-84页(Cambridge University出版1995)。
如上所述，抗体Fc区域的碳水化合物组分可以用来偶联治疗制剂。然而，如果把抗体片段用作免疫偶联物的抗体组分，那么Fc片段会缺失。然而，可以将碳水化合物组分引入抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等人，美国专利5,443,953。工程处理过的碳水化合物组分再用于连接治疗制剂。
此外，本领域的技术人员可以知道很多偶联方法的变化形式。例如，碳水化合物组分可以用来连接聚乙二醇，从而延长完整抗体、或其结合片段在血液、淋巴液或其它细胞外液中的半衰期。而且，可以通过将治疗制剂连接到碳水化合物组分并连接到游离的巯基基团上而构建“二价的免疫偶联物”。这样的游离巯基基团可以定位于抗体组分的铰链区。
抗M-CSF和抗M-CSFR抗体融合蛋白
本发明包括：含一个或多个抗M-CSF和抗M-CSFR抗体组分以及免疫调节剂或毒素组分的融合蛋白的用途。制备抗体融合蛋白的方法是本领域所熟知的。参见，例如美国专利6,306,393。含有白介素-2的抗体融合蛋白描述于Boleti等人，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等人，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93：7826(1996)，Hank et at，Clin.CancerRes.2：1951(1996)，以及Hu等人，Cancer Res.56：4998(1996)。此外，Yang等人，人抗体杂交瘤6：129(1995)描述了含有F(ab’)2片段和肿瘤坏死因子α组分的融合蛋白。
制备抗体-毒素融合蛋白(其中，重组分子含有一个或多个抗体组分和一个毒素或化疗剂)的方法同样也是本领域的技术人员所熟知的。例如，抗体-假单胞菌外毒素A融合蛋白描述于Chaudhary等人，Nature 339：394(1989)，Brinkmann等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88：8616(1991)，Batra等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 89：5867(1992)，Friedman等人，J.Immunol..150：3054(1993)，Wels等人，Int.J.Can.60：137(1995)，Fominaya等人，J.Biol.Chem.271：10560(1996)，Kuan等人，Biochemistry 35：2872(1996)，以及Schmidt等人，Int.J.Can.65：538(1996).含有白喉毒素组分的抗体-毒素融合蛋白描述于Kreitman等人，Leukemia 7：553(1993)，Nicholls等人，J.Biol.Chem.268：5302(1993)，Thompson等人，J.Biol.Chem.270：28037(1995)，以及Vallera等人，Blood 88：2342(1996)。Deonarain等人，TumorTargeting 1：177(1995)描述了含有RNA酶组分的抗体-毒素融合蛋白，而Linardou等人，Cell Biophys.24-25：243(1994)生产了含有DNA酶I组分的抗体-毒素融合蛋白。Gelonin作为Wang等人，209届ACS国家会议的摘要，Anaheim，Calif，Apr.2-6，1995，Part 1，BIOT005制备的抗体-毒素融合蛋白中的毒素。作为另一个实例，Dohlsten等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA91：8945(1994)，报道了含有葡萄球菌内毒素A的抗体-毒素融合蛋白。
适用于制备这样的偶联物的代表性的毒素是：篦麻毒素、相思豆毒蛋白，核糖核酸酶，DNase I，葡萄球菌内毒素A，商陆抗病毒蛋白、白树因(gelonin)，白喉毒素，假单胞菌外毒素，和假单胞菌内毒素。参见例如，Pastan等人，Cell47：641(1986)，和Goldenberg，CA-A Cancer Journal for Clinicians44：43(1994)。其它合适的毒素是本领域的技术人员所已知的。
本发明由以下实例加以说明，而这些实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
这一实施例表明，高转移性的乳腺癌细胞系高水平地表达M-CSF。使用微阵列，将高转移性的细胞系MDA231的M-CSF基因表达量，与细胞系MCF7和细胞系ZR751的M-CSF基因表达量相比较。结果是MDA231中M-CSF的蛋白水平相对MCF7中的蛋白表达水平增加6.9倍，而与ZR751相比MDA231的基因表达水平增加5.2倍。
实施例2
这一实施例表明，在体外的破骨细胞形成试验中，纯化的M-CSF可以用来自转移性细胞系MDA231的条件培养基来替换，但不能用来自细胞系MCF7的培养基替换(图3)。
条件培养基(CM)的生产：将MDA231或MCF7细胞接种到8毫升含有1×ITS(BD Bioscicences，Lexington，KY)的50％DMEM/50％HAMs F12培养基中，细胞密度为1×106/10cm培养皿，这是补充有胰岛素、人运铁蛋白和***的补充培养基。在37℃，5％CO2的条件下培养48小时后，收集培养基并以1500RPM的转速离心10分钟，从而除去任何悬浮的细胞。收集上清液，用0.2nm孔径的滤膜过滤，用作CM。
破骨细胞试验：将骨髓CD34+细胞接种于100μl含有10％FCS、1×Pen/Strep和1×两性霉素B去氧胆酸钠的αMEM中，细胞密度为15000细胞/96孔。第二天，从每孔中移去50μl培养基并补入25μlαMEM培养基和75μl条件培养基或含有ITS的50％DMEM/50％HAMs F12。每孔中加入RANKL使其终浓度达到100ng/ml，在合适的孔中加入30ng/ml的M-CSF。在37℃，5％CO2的条件下培养11天。在这段时间内，6天后再加入新鲜的RANKL。11天后，固定细胞并用Sigma产的白细胞酸性磷酸酶试剂盒对抗酒石酸酸性磷酸酶进行染色。
结果：如图3所示，在体外的破骨细胞形成试验中，纯化的M-CSF可以用来自转移性细胞系MDA231的条件培养基来替换，但不能用来自细胞系MCF7的培养基替换。
实施例3
该实施例表明，由MDA231条件培养基诱导产生的破骨细胞可以用抗M-CSF的抗体中和(图4)。
如实施例2中所述的方法接种骨髓CD34+细胞。第二天，每孔中移去50μl培养基。每孔加入25μl的6×抗体5H4或αMEM培养基，再加入75μl的CM或含有1×ITS的50％DMEM/50％HAMs F12或αMEM培养基。在所有的孔中加入100ng/ml的RANKL，而在一半的孔中加入30ng/ml的M-CSF。在37℃，5％CO2的条件下培养11天。在这段时间内，6天后再加入新鲜的RANKL。11天后，固定细胞并用Sigma产的白细胞酸性磷酸酶试剂盒对抗酒石酸酸性磷酸酶进行染色。
如图4所示，由MDA231条件培养基诱导产生的破骨细胞可以用抗M-CSF的抗体中和。
实施例4
该实施例显示，单克隆抗体5H4(美国典型培养物保藏中心保藏号：HB10027)和其它抗人M-CSF的抗体具有中和活性。
为了在小鼠M NFS 60细胞(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL-1838，可购自ATCC(Rockville，MD，USA)，该细胞来源于用Cas-Br-MuLV野生小鼠亲嗜性逆转录病毒诱导的粒细胞白血病，对白介素3和M-CSF都有反应，并且还含有因逆转录病毒整合而造成的截短的c-myb原癌基因)上测定对抗人M-CSF活性抗体的中和能力，先将重组的人CSF-1(以终浓度10ng/ml)与不同浓度的抗体一起在37℃，5％CO2条件的培育箱中培养1小时。此后，将化合物加到培养在96孔微量滴定板中的M NFS 60细胞培养物中。每孔的总试验体积为100μl，含有10ng/ml的rhM-CSF和图5中所示的抗体浓度，其细胞密度为5000细胞/孔。在37℃的CO2的培育箱中培养72小时后，用CellTiter Glo Kit(Promega)测定细胞增殖。所有产生的抗体都是抗人M-CSF的抗体。Anogen是指Anogen产品目录#MO C40048 A克隆116；Antigenix是指Antigenix America公司产品目录#MC600520克隆M16；以及R&D是指R&D Systems产品目录#Mab216。
如图5所示，相对于Anogen和Antigenix，细胞增殖受抗体5H4处理的影响最大。
实施例5
这一实施例表明，抗M-CSF抗体在预防与癌转移相关的严重溶骨性疾病方面十分有效。
实验设计。为了评估M-CSF抗体作为治疗骨质溶解的治疗制剂的有效性，将高度转移性的人乳腺癌细胞系MDA-231(3×105)注入雌性裸鼠的胫骨骨髓腔内。小鼠的年龄是4-7周龄，平均体重约为20g。对小鼠进行标注(chipped)以便鉴别，并且在为时8周的研究开始前至少经历7天的适应期。
小鼠总共接受1.5mpk剂量的丁丙诺啡(每只小鼠0.03mg)，在胫骨内注射前的30分钟注射入两侧皮下。用吸入异氟醚的方式对小鼠实施麻醉，并用70％的乙醇清洗右后腿。将悬浮于10μl盐水中的肿瘤细胞(MDA-MB-231-luc，3×105)用50或100μl的微量注射器注入右侧胫骨的骨髓腔中。
作为抗体治疗，如下选择各组：
1.小鼠IgG1同种型对照
2.5H4小鼠IgG1抗人M-CSF
3.大鼠单克隆对照(TBD)
4.5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF
5.5H4+5A1(双重治疗)
6.小鼠+大鼠同种型对照(双重对照)
(没有PBS对照组)
剂量。抗体治疗开始于肿瘤细胞注射后的第二天。对于小鼠IgG1同种型对照、5H4小鼠IgG1抗人M-CSF、大鼠单克隆对照、和5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF(Lokeshwar，B.L.，Lin，H.S.，J Immunol.，15；141(2)：483-8(1988))，每周施用1次10mg/kg的抗体。对于联合治疗组(5H4+5A1，小鼠+大鼠同种型对照)，每周一次分开注射10mg/kg个体(也就是未混合)的抗体，这样这些治疗组的小鼠每周接受2次注射。
所提供的药剂溶剂是稀释前的浓度(＝2mg/ml)，这样IP注入100μl将可以满足施用于20g小鼠的目标剂量(＝200μg)。根据体重调整，注射的体积依体重的不同每克体重增加或减少5μl。例如，一只23g的小鼠接受115μl，而18g的小鼠则接受90μl。
测定。要评估各治疗组之间骨质溶解的严重程度，每只小鼠在注入肿瘤细胞后的一天接受基线Faxitron成像。研究最后(8周后)，再接受Faxitron成像。由于肿瘤细胞稳定地表达荧光素酶，用Xenogen***同步测定肿瘤生长。
结果。如图6所示，在接受5A1+5H4抗体联合治疗的组中，平均溶骨值≥2.5个动物个体数最少。溶骨性骨损坏是以0-4的评分等级进行评估的，0相当于没有骨损坏，1-2相当于有一些骨损坏，而2.25及更大的数值则表示有严重的骨损坏。数据表明，小鼠(也就是宿主)表达的M-CSF比肿瘤细胞产生的M-CSF对骨质溶解有更大的影响(将5H4同5A1单独及联合施用相比较)。
实施例6
基本上重复以上实施例5中所述的研究，除了在实验设计中有一个区别。在本研究中，抗体治疗并不是从肿瘤接种后的2周才开始的。肿瘤接种后的1天，取后腿的放射显影图以获得基线图像以及检测由注射引起的骨折。进一步，在肿瘤接种后的14天，用Xenogen IVIS***对小鼠成像，来计量肿瘤细胞发出的荧光光子。
选择60只胫骨光子信号强度类似的小鼠。本研究排除具有胸部信号(人工肺癌转移病灶)的小鼠。将选择的小鼠随机分成6个治疗组，并且如实施例5中所述的方法施用抗体治疗。在整个研究过程中，每周一次连续地监测光子发射情况。从治疗接种后的第5周起，每周还获取放射显影图来评估骨中的肿瘤生长。
如图7所示，在接受5A1+5H4抗体联合治疗的组中，平均溶骨值≥2.5个动物个体数最少。溶骨性骨损坏是以0-4的评分等级进行评估的，0相当于没有骨损坏，1-2相当于有一些骨损坏，而2.25及更大的数值则表示有严重的骨损坏。数据表明，小鼠(也就是宿主)表达的M-CSF比肿瘤细胞产生的M-CSF对骨质溶解有更大的影响(将单独施用5H4同单独施用5A1及联合施用相比较)。
实施例7
该实施例展示，在皮下注射SW620的模型中评估抗M-CSF单克隆抗体的抗癌活性的步骤。以上的实施例5和6表明，抗M-CSF单克隆抗体治疗显著地抑制骨髓中的肿瘤生长。本研究的目的是评估抗体是否同样能够抑制软组织中的肿瘤生长。
本研究采用10周龄、平均体重约20g的雌性nu/nu小鼠。小鼠在研究开始前至少经历7天的适应期。在第0天，在裸鼠的右侧皮下注入SW620人结肠癌细胞，每只小鼠注射5×106细胞每100μl。在肿瘤体积达到100-200mm3时(通常在肿瘤接种后的1周)，将小鼠随机地分为5组，每组10只小鼠，如下：
1)PBS
2)5H4
3)5A1
4)mIgG1+rIgG1同种型Ab对照
5)5A1+5H4
用指定的抗体以10mpk每周一次的剂量，持续4周给小鼠实施腹膜内注射。当肿瘤体积达到2000mm3时，研究即停止。或者，在下面这些情况出现时，动物也会被实施安乐死：肿瘤表面溃疡面积大于总表面积的30％，显著的体重降低(＞20％)，脱水，和垂死。从所有的小鼠身上收集全血并且分析单核细胞群，作为潜在的替代标记。用2-D分析来测定肿瘤生长/体积。肿瘤宽度及长度的测定则用于肿瘤体积的计算。预计因上述实验，结果会导致抑制软组织中的肿瘤的生长。
实施例8
以下实施例展示了，对联合治疗在治疗和预防与癌转移相关的严重溶骨性疾病中作用的评估程序。
实验设计。基本上重复以上实施例5中所述的研究，除了在实验设计中有以下区别。除了以下列出的抗体或抗体联合治疗组以外，动物还将接受以下额外治疗中的一种：
1.二磷酸盐(例如，Aredia；Zometa；氯膦酸盐)
2.手术
3.放射性治疗
4.化疗
5.激素治疗(例如，它莫西芬；抗雄激素治疗)
6.抗体治疗(例如，RNAKL/RANK中和抗体；PTHrP中和抗体)
7.治疗性蛋白质治疗(例如，可溶性RANKL受体；OPG，和PDGF，以及MMP抑制剂)
8.小分子药物治疗(例如，Src-激酶抑制剂)
9.寡核苷酸治疗(例如，RANKL或RANK或PTHrP反义链)
10.基因治疗(例如，RANKL或RANK抑制剂)
11.肽治疗(例如，RANKL突变蛋白)
治疗组如下。以上的额外治疗在下面表示为“加上治疗X”：
1.只有PBS
2.只有治疗X
3.大鼠IgG1同种型对照
4.小鼠IgG1同种型对照
5.只有5H4抗人M-CSF
6.只有5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF
7.大鼠IgG1和小鼠IgG1同种型对照联合治疗
8.5H4和5A1联合治疗
9.大鼠IgG1同种型对照加上治疗X
10.小鼠IgG1同种型对照加上治疗X
11.5H4抗人M-CSF加上治疗X
12.5A1大鼠IgG1抗小鼠M-CSF加上治疗X
13.大鼠IgG1和小鼠IgG1同种型对照联合治疗加上治疗X
14.5H4和5A1联合治疗加上治疗X
剂量：每种抗体以0.1-30mg/kg的剂量施用给每个动物。优选的剂量为10mg/kg。施用途径可以是IV、IP、SC。优选的途径为腹膜内(IP)。治疗开始于注射肿瘤细胞后的第二天，如实施例5中所述，见上。
检测。为了评估各治疗组之间骨质溶解的严重程度，每只小鼠在注入肿瘤细胞后的一天接受基线Faxitron成像。研究最后(8周后)，再接受Faxitron成像。由于肿瘤细胞稳定地表达荧光素酶，用Xenogen***可同步测定肿瘤生长。与单独实施抗体治疗相比，预计将联合治疗用于治疗和预防与癌转移相关的严重溶骨性疾病会改善疗效。
实施例9
以下的实施例提供了，用荧光激发细胞分选法来评估M-CSF特异性抗体与例如乳腺癌细胞(细胞系MDA 231)或多发性骨髓瘤癌细胞(细胞系ARH 77)之间结合能力的方案。
首先，用PBS(无Ca2+、Mg2+)洗涤细胞2次。在每个10cm的培养皿中加入2ml的3mM EDTA，然后把培养皿在37℃的条件下培养2-3分钟，直到细胞变圆并开始脱离培养皿。然后，加入10ml缓冲液A(PBS+5％FBS)，并混合。此时，沉淀细胞并将细胞重新悬浮于PBS+5％FBS中，约5×106细胞/ml，再将细胞接种于小管中，100微升/样品。
此时，加入0.1-1.0μg/ml的原始抗体(按所示浓度使用M-CSF抗体或对照抗体)。如果需要，以5％的FBS/PBS进行稀释。然后，将混合物在4℃条件下培养30分钟。培养以后，用400g离心5分钟，洗涤细胞3次，并且重新悬浮于PBS中。
用1％的BSA/PBS稀释FITC或PE标记的抗IgG抗体(0.25μg/样品)至最佳稀释度，然后将细胞重新悬浮于此溶液中，4℃培养30分钟。接着，如上所述将细胞洗涤3次。洗涤后，用0.5ml/样品PI-PBS将细胞重新悬浮(如果需要区分死细胞和活细胞)。也可以固定细胞留作以后分选之用(如果用0.1％的甲醛固定，细胞可以持续约3天)。然后，采用标准步骤使用荧光激发FACS分析细胞。
如图8A和8B所示，M-CSF特异性抗体在一系列所示的抗体浓度下，与乳腺癌细胞系MDA 231或多发性骨髓瘤细胞系ARH77发生结合。
实施例10
以下的实施例表明，M-CSF普遍存在于很多的癌细胞表面。用M-CSF特异性抗体对M-CSF进行免疫组化染色，操作如下。
首先，将载玻片在55-60℃的烤箱中加热1小时，并且冷却2-3分钟。采用以下的脱蜡和再水化(re-hydration)参数：
a二甲苯                       3×5分钟
b100％醇试剂                  2×5分钟
c95％醇试剂                   2×4分钟
d75％醇试剂                   2×3分钟
e50％醇试剂                   1×3分钟
g去离子水                     2-3次快速漂洗
在过氧化封闭步骤之前，用1×Biogenex Citra Plus制备抗原检索玻片(retrieval)。该溶液首先用微波炉最高火力煮沸。一旦溶液沸腾，立即将微波炉火力调至2档，加热13分钟，放凉后再使用。过氧化封闭步骤如下进行。将载玻片浸入3％的H2O2中(将25ml的30％溶液稀释于250ml去离子水中)，并在室温下放置10分钟。然后用去离子水漂洗载玻片2次，并用1×PBS洗涤2×2分钟。
亲和素/生物素封闭步骤如下进行。将载玻片放平于金属支架上。在组织周围使用蓝色的PAP笔(疏水玻片标记)。然后，加入2滴Zymed亲和素(试剂A)-足够覆盖组织，再将载玻片于室温下孵育10分钟。孵育后，用以下方法洗涤载玻片：
1×PBS中洗涤2×3分钟
2滴Zymed生物素(试剂B)，室温下10分钟
1×PBS中洗涤2×3分钟
蛋白质封闭步骤操作如下。首先，加入第二抗体物质的10％血清(至2％的终浓度)。然后用去离子水将BioGenex Power Block稀释至1×。载玻片的支架浸Power Block中，室温下8分钟，然后用1×PBS将载玻片漂洗2次。
为了加入原始抗体，将载玻片平放于金属支架上。加入抗体覆盖每个区域(～350μl)，用移液管尖铺开抗体(如果需要)，但不要刮到组织。然后在室温下孵育载玻片1小时。孵育后，用1×PBS洗涤载玻片3次，每次3-5分钟。此时，将BioGenex Multi-Link加到区域上，并在室温下孵育10-11分钟。然后，洗涤载玻片，每次3分钟。
对区域施用BioGenex HRP标记物，然后在室温下孵育10-11分钟，并用1×PBS洗涤载玻片3×3分钟。随后，在切片上加入BioGenex H2O2底物(每2.5mlH2O2加入1滴AEC)，并在室温下孵育10分钟。然后，切片用去离子水漂洗几次。复染色步骤如下进行。在室温下用苏木精对切片染色1分钟。然后，用H2O漂洗切片2次，再在1×PBS中孵育1分钟。然后用H2O充分漂洗切片以除去PBS。在切片上加1滴BioGenex Super Mount，并在室温下空气干燥过夜，以此对其进行封固。
如图9所示，M-CSF广泛存在于很多肿瘤细胞的表面。所示肿瘤细胞类型的切片如下记分：
0无染色
1染色与背景类似
2阳性，但是染色弱
3阳性，并且显著染色
4阳性，并且强染色
在本说明书和/或申请数据表中提及的所有上述美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物，都全文引入本文作为参考。
从上述描述中，应理解到，尽管出于阐述目的描述了本发明的具体实施例，但是可以在不背离本发明精神和范围的情况下进行各种改动。因此，本发明除了受到所附权利要求的限制之外，并不受实施例的限制。
                              序列表
<110>齐默尔曼，等人(Zimmerman et al.)
<120>防止和治疗癌转移以及与癌转移相关的骨质损失的方法
<130>27527/39636A
<150>US 60/426,781
<151>2002-11-15
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1855
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(190)..(960)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(190)..(285)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(286)..(957)
<400>1
gagggctggc cagtgaggct cggcccgggg aaagtgaaag tttgcctggg tcctctcggc    60
gccagagccg ctctccgcat cccaggacag cggtgcggcc ctcggccggg gcgcccactc    120
cgcagcagcc agcgagcgag cgagcgagcg agggcggccg acgcgcccgg ccgggaccca    180
gctgcccgt atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc tgc cct ccc acg aca    231
          Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr
          1               5                   10
tgg ctg ggc tcc ctg ctg ttg ttg gtc tgt ctc ctg gcg agc agg agt      279
Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser
15              20                      25                  30
atc acc gag gag gtg tcg gag tac tgt agc cac atg att ggg agt gga      327
Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly
                35                  40                  45
cac ctg cag tct ctg cag cgg ctg att gac agt cag atg gag acc tcg      375
His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser
            50                  55                  60
tgc caa att aca ttt gag ttt gta gac cag gaa cag ttg aaa gat cca      423
Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro
        65                  70                  75
gtg tgc tac ctt aag aag gca ttt ctc ctg gta caa gac ata atg gag      471
Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu
    80                  85              90
gac acc atg cgc ttc aga gat aac acc ccc aat gcc atc gcc att gtg    519
Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val
95                  100                 105                 110
cag ctg cag gaa ctc tct ttg agg ctg aag agc tgc ttc acc aag gat    567
Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp
                115                 120                 125
tat gaa gag cat gac aag gcc tgc gtc cga act ttc tat gag aca cct    615
Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro
            130                 135                 140
ctc cag ttg ctg gag aag gtc aag aat gtc ttt aat gaa aca aag aat    663
Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Kys Asn
        145                 150                  155
ctc ctt gac aag gac tgg aat att ttc agc aag aac tgc aac aac agc    711
Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser
    160                 165                 170
ttt gct gaa tgc tcc agc caa ggc cat gag agg cag tcc gag gga tcc    759
Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser
175             180                     185                 190
tcc agc ccg cag ctc cag gag tct gtc ttc cac ctg ctg gtg ccc agt    807
Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser
                195                 200                 205
gtc atc ctg gtc ttg ctg gcc gtc gga ggc ctc ttg ttc tac agg tgg    855
Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp
            210                 215                 220
agg cgg cgg agc cat caa gag cct cag aga gcg gat tct ccc ttg gag    903
Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu
        225                 230                 235
caa cca gag ggc agc ccc ctg act cag gat gac aga cag gtg gaa ctg    951
Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu
    240                 245                 250
cca gtg tag agggaattct aagctggacg cacagaacag tctctccgtg            1000
Pro Val
255
ggaggagaca ttatggggcg tccaccacca cccctccctg gccatcctcc tggaatgtgg  1060
tctgccctcc accagagctc ctgcctgcca ggactggacc agagcagcca ggctggggcc  1120
cctctgtctc aacccgcaga cccttgactg aatgagagag gccagaggat gctccccatg  1180
ctgccactat ttattgtgag ccctggaggc tcccatgtgc ttgaggaagg ctggtgagcc  1240
cggctcagga ccctcttccc tcaggggctg caccctcctc tcactccctt ccatgccgga  1300
acccaggcca gggacccacc ggcctgtggt ttgtgggaaa gcagggtgga cgctgaggag  1360
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atggacctgt ctccagagag aggagcctga agttcgtggg gcgggacagc gtcggcctga  1480
tttcccgtaa aggtgtgcag cctgagagac gggaagagga ggcctctgga cctgctggtc  1540
tgcactgaca gcctgaaggg tctacaccct cggctcacct aagtgccctg tgctggttgc  1600
caggcgcaga ggggaggcca gccctgccct caggacctgc ctgacctgcc agtgatgcca    1660
agagggggat caagcactgg cctctgcccc tcctccttcc agcacctgcc agagcttctc    1720
caggaggcca agcagaggct cccctcatga aggaagccat tgcactgtga acactgtacc    1780
tgcctgctga acagcctgcc cccgtccatc catgagccag catccgtccg tcctccactc    1840
tccagcctct cccca                                                     1855
<210>2
<211>256
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr
            20                   25                 30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu
        35                  40                  45
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
    50                  55                  60
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
                85                  90                  95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
            100                 105                  110
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
        115                 120                 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln
    130                 135                 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
                165                 170                 175
Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser
            180                 185                 190
Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile
        195                 200                 205
Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg
    210                 215                 220
Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro
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Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val
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<210>3
<211>2749
<212>DNA
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<222>(286)..(1851)
<400>3
gagggctggc cagtgaggct cggcccgggg aaagtgaaag tttgcctggg tcctctcggc    60
gccagagccg ctctccgcat cccaggacag cggtgcggcc ctcggccggg gcgcccactc    120
cgcagcagcc agcgagcgag cgagcgagcg agggcggccg acgcgcccgg ccgggaccca    180
gctgcccgt atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc tgc cct ccc acg aca    231
          Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr
          1               5                   10
tgg ctg ggc tcc ctg ctg ttg ttg gtc tgt ctc ctg gcg agc agg agt      279
Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser
15                  20                  25                  30
atc acc gag gag gtg tcg gag tac tgt agc cac atg att ggg agt gga      327
Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly
                35                  40                  45
cac ctg cag tct ctg cag cgg ctg att gac agt cag atg gag acc tcg      375
His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser
            50                  55                  60
tgc caa att aca ttt gag ttt gta gac cag gaa cag ttg aaa gat cca      423
Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro
        65                  70                  75
gtg tgc tac ctt aag aag gca ttt ctc ctg gta caa gac ata atg gag    471
Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu
    80                  85                  90
gac acc atg cgc ttc aga gat aac acc ccc aat gcc atc gcc att gtg    529
Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val
95                  100                 105                 110
cag ctg cag gaa ctc tct ttg agg ctg aag agc tgc ttc acc aag gat    567
Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp
                115                 120                 125
tat gaa gag cat gac aag gcc tgc gtc cga act ttc tat gag aca cct    615
Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro
            130                 135                 140
ctc cag ttg ctg gag aag gtc aag aat gtc ttt aat gaa aca aag aat    663
Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn
        145                 150                 155
ctc ctt gac aag gac tgg aat att ttc agc aag aac tgc aac aac agc    711
Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser
    160                 165                 170
ttt gct gaa tgc tcc agc caa gat gtg gtg acc aag cct gat tgc aac    759
Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn
175                 180                 185                 190
tgc ctg tac ccc aaa gcc atc cct agc agt gac ccg gcc tct gtc tcc    807
Cys Leu Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser
                195                 200                 205
cct cat cag ccc ctc gcc ccc tcc atg gcc cct gtg gct ggc ttg acc    855
Pro His Gln Pro Leu Ala Prp Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr
            210                 215                 220
tgg gag gac tct gag gga act gag ggc agc tcc ctc ttg cct ggt gag    903
Trp Glu Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu
        225                 230                 235
cag ccc ctg cac aca gtg gat cca ggc agt gcc aag cag cgg cca ccc    951
Gln Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro
    240                 245                 250
agg agc acc tgc cag agc ttt gag ccg cca gag acc cca gtt gtc aag    999
Arg Ser Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Prp Glu Thr Pro Val Val Lys
255                 260                 265                 270
gac agc acc atc ggt ggc tca cca cag cct cgc ccc tct gtc ggg gcc    1047
Asp Ser Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala
                275                 280                 285
ttc aac ccc ggg atg gag gat att ctt gac tct gca atg ggc act aat    1095
Phe Asn Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn
            290                 295                 300
tgg gtc cca gaa gaa gcc tct gga gag gcc agt gag att ccc gta ccc    1143
Trp Val Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro
        305                 310                 315
caa ggg aca gag ctt tcc ccc tcc agg cca gga ggg ggc agc atg cag    1191
Gln Gly Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln
    320                 325                 330
aca gag ccc gcc aga ccc agc aac ttc ctc tca gca tct tct cca ctc    1239
Thr Glu Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser pro Leu
335                 340                 345                 350
cct gca tca gca aag ggc caa cag ccg gca gat gta act ggt aca gcc    1287
Pro Ala Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala
                355                 360                 365
ttg ccc agg gtg ggc ccc gtg agg ccc act ggc cag gac tgg aat cac    1335
Leu Pro Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His
            370                 375                 380
acc ccc cag aag aca gac cat cca tct gcc ctg ctc aga gac ccc ccg    1383
Thr Pro Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro
        385                 390                 395
gag cca ggc tct ccc agg atc tca tca ctg cgc ccc cag ggc ctc agc    1431
Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser
    400                 405                 410
aac ccc tcc acc ctc tct gct cag cca cag ctt tcc aga agc cac tcc    1479
Asn Pro Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser
415                 420                 425                 430
tcg ggc agc gtg ctg ccc ctt ggg gag ctg gag ggc agg agg agc acc    1527
Ser Gly Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr
                435                 440                 445
agg gat cgg agg agc ccc gca gag cca gaa gga gga cca gca agt gaa    1575
Arg Asp Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu
            450                 455                 460
ggg gca gcc agg ccc ctg ccc cgt ttt aac tcc gtt cct ttg act gac    1623
Gly Ala Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp
        465                 470                 475
aca ggc cat gag agg cag tcc gag gga tcc tcc agc ccg cag ctc cag    1671
Thr Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln
    480                 485                 490
gag tct gtc ttc cac ctg ctg gtg ccc agt gtc atc ctg gtc ttg ctg    1719
Glu Ser Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu
495                 500                 505                 510
gcc gtc gga ggc ctc ttg ttc tac agg tgg agg cgg cgg agc cat caa    1767
Ala Val Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln
                515                 520                 525
gag cct cag aga gcg gat tct ccc ttg gag caa cca gag ggc agc ccc    1815
Glu Pro Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro
            530                 535                 540
ctg act cag gat gac aga cag gtg gaa ctg cca gtg tag agggaattct     1864
Leu Thr Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val
        545                 550
aagctggacg cacagaacag tctctccgtg ggaggagaca ttatggggcg tccaccacca  1924
cccctccctg gccatcctcc tggaatgtgg tctgccctcc accagagctc ctgcctgcca  1984
ggactggacc agagcagcca ggctggggcc cctctgtctc aacccgcaga cccttgactg  2044
aatgagagag gccagaggat gctccccatg ctgccactat ttattgtgag ccctggaggc  2104
tcccatgtgc ttgaggaagg ctggtgagcc cggctcagga ccctcttccc tcaggggctg    2164
caccctcctc tcactccctt ccatgccgga acccaggcca gggacccacc ggcctgtggt    2224
ttgtgggaaa gcagggtgga cgctgaggag tgaaagaacc ctgcacccag agggcctgcc    2284
tggtgccaag gtatcccagc ctggacaggc atggacctgt ctccagagag aggagcctga    2344
agttcgtggg gcgggacagc gtcggcctga tttcccgtaa aggtgtgcag cctgagagac    2404
gggaagagga ggcctctgga cctgctggtc tgcactgaca gcctgaaggg tctacaccct    2464
cggctcacct aagtgccctg tgctggttgc caggcgcaga ggggaggcca gccctgccct    2524
caggacctgc ctgacctgcc agtgatgcca agagggggat caagcactgg cctctgcccc    2584
tcctccttcc agcacctgcc agagcttctc caggaggcca agcagaggct cccctcatga    2644
aggaagccat tgcactgtga acactgtacc tgcctgctga acagcctgcc cccgtccatc    2704
catgagccag catccgtccg tcctccactc tccagcctct cccca                    2749
<210>4
<211>554
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr
            20                  25                  30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu
        35                  40                  45
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
    50                  55                  60
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
                85                  90                  95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
            100                 105                 110
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
        115                 120                 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln
    130                 135                 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
                165                 170                 175
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
            180                 185                 190
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
        195                 200                 205
Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu
    210                 215                 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro
225                 230                 235                 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser
                245                 250                 255
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
        275                 280                 285
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
    290                 295                 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly
305                 310                 315                 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu
                325                 330                 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro
        355                 360                 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro
    370                 375                 380
Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro
385                 390                 395                 400
Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro
                405                 410                 415
Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly
            420                 425                 430
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
        435                 440                 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala
    450                 455                 460
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly
465                 470                 475                 480
His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser
                485                 490                 495
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val
            500                 505                 510
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro
        515                 520                 525
Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr
    530                 535                 540
Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val
545                 550
<210>5
<211>1519
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(190)..(1506)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(190)..(285)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(286)..(1503)
<400>5
gagggctggc cagtgaggct cggcccgggg aaagtgaaag tttgcctggg tcctctcggc    60
gccagagccg ctctccgcat cccaggacag cggtgcggcc ctcggccggg gcgcccactc    120
cgcagcagcc agcgagcgag cgagcgagcg agggcggccg acgcgcccgg ccgggaccca    180
gctgcccgt atg acc gcg ccg ggc gcc gcc ggg cgc tgc cct ccc acg aca    231
          Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr
          1               5                   10
tgg ctg ggc tcc ctg ctg ttg ttg gtc tgt ctc ctg gcg agc agg agt      279
Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser
15                  20                  25                  30
atc acc gag gag gtg tcg gag tac tgt agc cac atg att ggg agt gga      327
Ile Thr Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly
                35                  40                  45
cac ctg cag tct ctg cag cgg ctg att gac agt cag atg gag acc tcg      375
His Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser
            50                  55                  60
tgc caa att aca ttt gag ttt gta gac cag gaa cag ttg aaa gat cca      423
Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro
        65                  70                  75
gtg tgc tac ctt aag aag gca ttt ctc ctg gta caa gac ata atg gag      471
Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu
    80                  85                  90
gac acc atg cgc ttc aga gat aac acc ccc aat gcc atc gcc att gtg      519
Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val
95                  100                 105                 110
cag ctg cag gaa ctc tct ttg agg ctg aag agc tgc ttc acc aag gat      567
Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp
                115                 120                 125
tat gaa gag cat gac aag gcc tgc gtc cga act ttc tat gag aca cct      615
Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro
            130                 135                 140
ctc cag ttg ctg gag aag gtc aag aat gtc ttt aat gaa aca aag aat      663
Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn
        145                 150                 155
ctc ctt gac aag gac tgg aat att ttc agc aag aac tgc aac aac agc      711
Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser
    160                 165                 170
ttt gct gaa tgc tcc agc caa gat gtg gtg acc aag cct gat tgc aac      759
Phe Ala Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn
175                 180                 185                 190
tgc ctg tac ccc aaa gcc atc cct agc agt gac ccg gcc tct gtc tcc      807
Cys Leu Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser
                195                 200                 205
cct cat cag ccc ctc gcc ccc tcc atg gcc cct gtg gct ggc ttg acc      855
Pro His Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr
            210                 215                 220
tgg gag gac tct gag gga act gag ggc agc tcc ctc ttg cct ggt gag      903
Trp Glu Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu
        225                 230                 235
cag ccc ctg cac aca gtg gat cca ggc agt gcc aag cag cgg cca ccc    951
Gln Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro
    240                 245                 250
agg agc acc tgc cag agc ttt gag ccg cca gag acc cca gtt gtc aag    999
Arg Ser Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys
255                 260                 265                 270
gac agc acc atc ggt ggc tca cca cag cct cgc ccc tct gtc ggg gcc    1047
Asp Ser Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala
                275                 280                 285
ttc aac ccc ggg atg gag gat att ctt gac tct gca atg ggc act aat    1095
Phe Asn Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn
            290                 295                 300
tgg gtc cca gaa gaa gcc tct gga gag gcc agt gag att ccc gta ccc    1143
Trp Val Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro
        305                 310                 315
caa ggg aca gag ctt tcc ccc tcc agg cca gga ggg ggc agc atg cag    1191
Gln Gly Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln
    320                 325                 330
aca gag ccc gcc aga ccc agc aac ttc ctc tca gca tct tct cca ctc    1239
Thr Glu Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu
335                 340                 345                 350
cct gca tca gca aag ggc caa cag ccg gca gat gta act ggc cat gag    1287
Pro Ala Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly His Glu
                355                 360                 365
agg cag tcc gag gga tcc tcc agc ccg cag ctc cag gag tct gtc ttc    1335
Arg Gln Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser Val Phe
            370                 375                 380
cac ctg ctg gtg ccc agt gtc atc ctg gtc ttg ctg gcc gtc gga ggc    1383
His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly
        385                 390                 395
ctc ttg ttc tac agg tgg agg cgg cgg agc cat caa gag cct cag aga    1431
Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg
    400                 405                 410
gcg gat tct ccc ttg gag caa cca gag ggc agc ccc ctg act cag gat    1479
Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp
415                 420                 425                 430
gac aga cag gtg gaa ctg cca gtg tag agggaattct aag                 1519
Asp Asg Gln Val Glu Leu Pro Val
                435
<210>6
<211>438
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
1               5                   10                  15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser ILe Thr
            20                  25                  30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu
        35                  40                  45
Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln
    50                  55                   60
Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr
                85                  90                  95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu
            100                 105                 110
Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
        115                 120                 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln
    130                 135                 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
                165                 170                 175
Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
            180                 185                 190
Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
        195                 200                 205
Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu
    210                 215                 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Prp Gly Glu Gln Pro
225                 230                 235                 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Asg Pro Pro Arg Ser
                245                 250                 255
Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
            260                 265                 270
Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
        275                 280                 285
Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
    290                 295                 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly
305                 310                 315                 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu
                325                 330                 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly His Glu Arg Gln
        355                 360                 365
Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gln LeuG ln Glu Ser Val Phe His Leu
    370                 375                 380
Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Leu Leu
385                 390                 395                 400
Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro Gln Arg Ala Asp
                405                 410                 415
Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr Gln Asp Asp Arg
            420                 425                 430
Gln Val Glu Leu Pro Val
        435
<210>7
<211>3985
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(293)..(3211)
<220>
<221>sig _peptide
<222>(293)..(349)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(350)..(3208)
<220>
<221>misc_feature
<222>(374)..(598)
<223>免疫球蛋白
<220>
<221>misc_feature
<222>(917)..(1177)
<223>免疫球蛋白
<220>
<221>misc_feature
<222>(2516)..(3022)
<223>酪氨酸激酶，催化域
<400>7
gaagggcaga cagagtgtcc aaaagcgtga gagcacgaag tgaggagaag gtggagaaga    60
gagaagagga agaggaagag gaagagagga agcggaggga actgcggcca ggctaaaagg    120
ggaagaagag gatcagccca aggaggagga agaggaaaac aagacaaaca gccagtgcag    180
aggagaggaa cgtgtgtcca gtgtcccgat ccctgcggag ctagtagctg agagctctgt    240
gccctgggca ccttgcagcc ctgcacctgc ctgccacttc cccaccgagg cc atg ggc    298
                                                          Met Gly
                                                          1
cca gga gtt ctg ctg ctc ctg ctg gtg gcc aca gct tgg cat ggt cag      346
Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His Gly Gln
        5                   10                  15
gga atc cca gtg ata gag ccc agt gtc cct gag ctg gtc gtg aag cca      394
Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro
    20                  25                  30
gga gca acg gtg acc ttg cga tgt gtg ggc aat ggc agc gtg gaa tgg      442
Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp
35                  40                  45                  50
gat ggc ccc cca tca cct cac tgg acc ctg tac tct gat ggc tcc agc      490
Aap Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser
                55                  60                  65
agc atc ctc agc acc aac aac gct acc ttc caa aac acg ggg acc tat      538
Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr
            70                  75                  80
cgc tgc act gag cct gga gac ccc ctg gga ggc agc gcc gcc atc cac      586
Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His
        85                  90                  95
ctc tat gtc aaa gac cct gcc cgg ccc tgg aac gtg cta gca cag gag      634
Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu
    100                 105                 110
gtg gtc gtg ttc gag gac cag gac gca cta ctg ccc tgt ctg ctc aca      682
Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr
115                 120                 125                 130
gac ccg gtg ctg gaa gca ggc gtc tcg ctg gtg cgt gtg cgt ggc cgg      730
Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg
                135                 140                 145
ccc ctc atg cgc cac acc aac tac tcc ttc tcg ccc tgg cat ggc ttc    778
Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe
            150                 155                 160
acc atc cac agg gcc aag ttc att cag agc cag gac tat caa tgc agt    826
Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser
        165                 170                 175
gcc ctg atg ggt ggc agg aag gtg atg tcc atc agc atc cgg ctg aaa    874
Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Asg Leu Lys
    180                 185                 190
gtg cag aaa gtc atc cca ggg ccc cca gcc ttg aca ctg gtg cct gca    922
Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala
195                 200                 205                 210
gag ctg gtg cgg att cga ggg gag gct gcc cag atc gtg tgc tca gcc    970
Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala
                215                 220                 225
agc agc gtt gat gtt aac ttt gat gtc ttc ctc caa cac aac aac acc    1018
Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr
            230                 235                 240
aag ctc gca atc cct caa caa tct gac ttt cat aat aac cgt tac caa    1066
Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln
        245                 250                 255
aaa gtc ctg acc ctc aac ctc gat caa gta gat ttc caa cat gcc ggc    1114
Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly
    260                 265                 270
aac tac tcc tgc gtg gcc agc aac gtg cag ggc aag cac tcc acc tcc    1162
Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser
275                 280                 285                 290
atg ttc ttc cgg gtg gta gag agt gcc tac ttg aac ttg agc tct gag    1210
Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu
                295                 300                 305
cag aac ctc atc cag gag gtg acc gtg ggg gag ggg ctc aac ctc aaa    1258
Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys
            310                 315                 320
gtc atg gtg gag gcc tac cca ggc ctg caa ggt ttt aac tgg acc tac    1306
Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp Thr Tyr
        325                 330                 335
ctg gga ccc ttt tct gac cac cag cct gag ccc aag ctt gct aat gct    1354
Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala
    340                 345                 350
acc acc aag gac aca tac agg cac acc ttc acc ctc tct ctg ccc cgc    1402
Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg
355                 360                 365                 370
ctg aag ccc tct gag gct ggc cgc tac tcc ttc ctg gcc aga aac cca    1450
Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro
                375                 380                 385
gga ggc tgg aga gct ctg acg ttt gag ctc acc ctt cga tac ccc cca    1498
Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro
            390                 395                 400
gag gta agc gtc ata tgg aca ttc atc aac ggc tct ggc acc ctt ttg    1546
Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu
        405                 410                 415
tgt gct gcc tct ggg tac ccc cag ccc aac gtg aca tgg ctg cag tgc    1594
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu Gln Cys
    420                 425                 430
agt ggc cac act gat agg tgt gat gag gcc caa gtg ctg cag gtc tgg    1642
Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln Va1 Trp
435                 440                 445                 450
gat gac cca tac cct gag gtc ctg agc cag gag ccc ttc cac aag gtg    1690
Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His Lys Val
                455                 460                 465
acg gtg cag agc ctg ctg act gtt gag acc tta gag cac aac caa acc    1738
Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gln Thr
            470                 475                 480
tac gag tgc agg gcc cac aac agc gtg ggg agt ggc tcc tgg gcc ttc    1786
Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe
        485                 490                 495
ata ccc atc tct gca gga gcc cac acg cat ccc ccg gat gag ttc ctc    1834
Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu Phe Leu
    500                 505                 510
ttc aca cca gtg gtg gtc gcc tgc atg tcc atc atg gcc ttg ctg ctg    1882
Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu Leu Leu
515                 520                 525                 530
ctg ctg ctc ctg ctg cta ttg tac aag tat aag cag aag ccc aag tac    1930
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro Lys Tyr
                535                 540                 545
cag gtc cgc tgg aag atc atc gag agc tat gag ggc aac agt tat act    1978
Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser Tyr Thr
            550                 555                 560
ttc atc gac ccc acg cag ctg cct tac aac gag aag tgg gag ttc ccc    2026
Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu Phe Pro
        565                 570                 575
cgg aac aac ctg cag ttt ggt aag acc ctc gga gct gga gcc ttt ggg    2074
Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly
    580                 585                 590
aag gtg gtg gag gcc acg gcc ttt ggt ctg ggc aag gag gat gct gtc    2122
Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp Ala Val
595                 600                 605                 610
ctg aag gtg gct gtg aag atg ctg aag tcc acg gcc cat gct gat gag    2170
Leu Lys Va1 Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala Asp Glu
                615                 620                 625
aag gag gcc ctc atg tcc gag ctg aag atc atg agc cac ctg ggc cag    2218
Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu Gly Gln
            630                 635                 640
cac gag aac atc gtc aac ctt ctg gga gcc tgt acc cat gga ggc cct    2266
His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly Gly Pro
        645                 650                 655
gta ctg gtc atc acg gag tac tgt tgc tat ggc gac ctg ctc aac ttt    2314
Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Phe
    660                 665                 670
ctg cga agg aag gct gag gcc atg ctg gga ccc agc ctg agc ccc ggc    2362
Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser Pro Gly
675                 680                 685                 690
cag gac ccc gag gga ggc gtc gac tat aag aac atc cac ctc gag aag    2410
Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu Glu Lys
                695                 700                 705
aaa tat gtc cgc agg gac agt ggc ttc tcc agc cag ggt gtg gac acc    2458
Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val Asp Thr
            710                 715                 720
tat gtg gag atg agg cct gtc tcc act tct tca aat gac tcc ttc tct    2506
Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser Phe Ser
        725                 730                 735
gag caa gac ctg gac aag gag gat gga cgg ccc ctg gag ctc cgg gac    2554
Glu Gln Asp Lsp Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu Arg Asp
    740                 745                 750
ctg ctt cac ttc tcc agc caa gta gcc cag ggc atg gcc ttc ctc gct    2602
Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe Leu Ala
755                 760                 765                 770
tcc aag aat tgc atc cac cgg gac gtg gca gcg cgt aac gtg ctg ttg    2650
Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu
                775                 780                 785
acc aat ggt cat gtg gcc aag att ggg gac ttc ggg ctg gct agg gac    2698
Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp
            790                 795                 800
atc atg aat gac tcc aac tac att gtc aag ggc aat gcc cgc ctg cct    2746
Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg Leu Pro
        805                 810                 815
gtg aag tgg atg gcc cca gag agc atc ttt gac tgt gtc tac acg gtt    2794
Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr Thr Val
    820                 825                 830
cag agc gac gtc tgg tcc tat ggc atc ctc ctc tgg gag atc ttc tca    2842
Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser
835                 840                 845                 850
ctt ggg ctg aat ccc tac cct ggc atc ctg gtg aac agc aag ttc tat    2890
Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys Phe Tyr
                855                 860                 865
aaa ctg gtg aag gat gga tac caa atg gcc cag cct gca ttt gcc cca    2938
Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe Ala Pro
            870                 875                 880
aag aat ata tac agc atc atg cag gcc tgc tgg gcc ttg gag ccc acc    2986
Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu Pro Thr
        885                 890                 895
cac aga ccc acc ttc cag cag atc tgc tcc ttc ctt cag gag cag gcc    3034
His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu Gln Ala
    900                 905                 910
caa gag gac agg aga gag cgg gac tat acc aat ctg ccg agc agc agc    3082
Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser Ser Ser
915                 920                 925                 930
aga agc ggt ggc agc ggc agc agc agc agt gag ctg gag gag gag agc    3130
Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu Glu Ser
                935                 940                 945
tct agt gag cac ctg acc tgc tgc gag caa ggg gat atc gcc cag ccc    3178
Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala Gln Pro
            950                 955                 960
ttg ctg cag ccc aac aac tat cag ttc tgc tga ggagttgacg acagggagta  3231
Leu Leu Gln Pro Asn Ash Tyr Gln Phe Cys
        965                 970
ccactctccc ctcctccaaa cttcaactcc tccatggatg gggcgacacg gggagaacat  3291
acaaactctg ccttcggtca tttcactcaa cagctcggcc cagctctgaa acttgggaag  3351
gtgagggatt caggggaggt cagaggatcc cacttcctga gcatgggcca tcactgccag  3411
tcaggggctg ggggctgagc cctcaccccc ccctccccta ctgttctcat ggtgttggcc  3471
tcgtgtttgc tatgccaact agtagaacct tctttcctaa tccccttatc ttcatggaaa  3531
tggactgact ttatgcctat gaagtcccca ggagctacac tgatactgag aaaaccaggc  3591
tctttggggc tagacagact ggcagagagt gagatctccc tctctgagag gagcagcaga  3651
tgctcacaga ccacactcag ctcaggcccc ttggagcagg atggctcctc taagaatctc  3711
acaggacctc ttagtctctg ccctatacgc cgccttcact ccacagcctc acccctccca  3771
cccccatact ggtactgctg taatgagcca agtggcagct aaaagttggg ggtgttctgc  3831
ccagtcccgt cattctgggc tagaaggcag gggaccttgg catgtggctg gccacaccaa  3891
gcaggaagca caaactcccc caagctgact catcctaact aacagtcacg ccgtgggatg  3951
tctctgtcca cattaaacta acagcattaa tgca                              3985
<210>8
<211>972
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His
1               5                   10                  15
Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val
            20                  25                  30
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val
        35                  40                  45
Glu Trp Asp Gly Pro Prp Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly
    50                  55                  60
Ser Ser Ser Ile Ler Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala
                85                  90                  95
Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala
            100                 105                  110
Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu
        115                 120                 125
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg
    130                 135                 140
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His
145                 150                 155                 160
Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln
                165                 170                 175
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg
            180                 185                 190
Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val
        195                 200                 205
Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys
    210                 215                 220
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn
225                 230                 235                 240
Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg
                245                 250                 255
Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His
            260                 265                 270
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser
        275                 280                 285
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser
    290                 295                 300
Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn
305                 310                 315                 320
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp
                325                 330                 335
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala
            340                 345                 350
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu
        355                 360                 365
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg
    370                 375                 380
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Pro Glu Cal Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr
                405                 410                 415
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu
            420                 425                 430
Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln
        435                 440                 445
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His
    450                 455                 460
Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn
465                 470                 475                 480
Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp
                485                 490                 495
Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu
            500                 505                 510
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu
        515                 520                 525
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro
    530                 535                 540
Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser
545                 550                 555                 560
Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu
                565                 570                 575
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala
            580                 585                 590
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp
        595                 600                 605
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala
    610                 615                 620
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu
625                 630                 635                 640
Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly
                645                 650                 655
Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu
            660                 665                 670
Ash Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser
        675                 680                 685
Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu
    690                 695                 700
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val
705                 710                 715                 720
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser
                725                 730                 735
Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu
            740                 745                 750
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe
        755                 760                 765
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val
    770                 775                 780
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala
785                 790                 795                 800
Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg
                805                 810                 815
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr
            820                 825                 830
Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile
        835                 840                 845
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys
    850                 855                 860
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe
865                 870                 875                 880
Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu
                885                 890                 895
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu
            900             905                     910
Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser
        915                 920                 925
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu
    930                 935                 940
G1u Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala
945                 950                 955                 960
Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys
                965                 970

Claims (114)

1.一种防止骨质转移的方法，其特征在于，该方法包括：给患有转移性癌症的对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂，从而防止与转移性癌症相关的骨质损失。
2.一种治疗患有骨转移性的转移性癌症的对象方法，其特征在于，该方法包括：给该对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂，从而降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重程度。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的对象为哺乳动物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物为人。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：
a)包含抗-M-CSF抗体的多肽；
b)包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；
c)包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或
d)包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂为抗-M-CSF抗体。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂为包含抗-M-CSFR抗体的多肽。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂为包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂为包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
12.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该抗体所结合的抗原表位和单克隆抗体5H4(ATCC保藏号HB10027)所结合的抗原表位相同。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，转移性癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、***癌、腺癌、血细胞癌包括白血病和淋巴瘤；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，M-CSF拮抗剂是一种抗体，其施药量在约0.01mg/kg和约100mg/kg之间。
16.一种用于治疗患有转移性癌症的对象的、与M-CSF相结合的非鼠源性抗体，其特征在于，所述的抗体有效地降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重性。
17.一种非鼠源性单克隆抗体，其特征在于，它特异结合的M-CSF的抗原表位与单克隆抗体5H4所结合的抗原表位相同。
18.一种非鼠源性单克隆抗体，其特征在于，它与单克隆抗体5H4竞争性地与M-CSF相结合，结合率高于75％。
19.一种用于治疗患有转移性癌症的对象的、与M-CSFR相结合的非鼠源性抗体，其特征在于，所述的抗体有效地降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重性。
20.如权利要求16所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
21.如权利要求20所述的抗体，其特征在于，该抗体对M-CSF具有特异性。
22.如权利要求20所述的抗体，其特征在于，该抗体对M-CSFR具有特异性。
23.如权利要求20所述的抗体，其特征在于，所述的抗体是完全的人抗体。
24.如权利要求20所述的抗体，其特征在于，所述的抗体是人源化抗体。
25.一种分泌出权利要求23所述抗体的杂交瘤细胞。
26.如权利要求20所述的抗体，其特征在于，癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、***癌、腺癌、血细胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。
27.一种药物组合物，其特征在于，它包含权利要求17到26中任一种抗体，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
28.一种筛选M-CSF拮抗剂的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
a)使转移性肿瘤细胞培养基、破骨细胞和候选拮抗剂相接触；
b)检测破骨细胞的生成、增殖和/或分化；和
c)如果检测到破骨细胞的生成、增殖和/或分化有所减少，那么所述的候选拮抗剂就被确定为M-CSF拮抗剂。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的转移性肿瘤细胞培养基包括肿瘤细胞。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的接触步骤(a)在体内进行，所述的检测步骤(b)包括检测骨质转移的大小和/或数目，并且如果检测到骨质转移的大小和/或数目有所降低，那么所述的候选拮抗剂则被确定为M-CSF拮抗剂。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：确定所述的候选拮抗剂是否与M-CSF相结合。
32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：确定所述的候选拮抗剂是否抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。
33.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述的候选拮抗剂选自下列各项所构成的组：
a)包含抗-M-CSF抗体的多肽；
b)包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；
c)包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；
d)包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；
e)肽；或
f)小分子。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候选拮抗剂是M-CSF的突变蛋白。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候选拮抗剂是M-CSFR的突变蛋白。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候选拮抗剂是抗-M-CSF抗体。
37.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述的候选拮抗剂是抗-M-CSFR抗体。
38.一种确定可以防止或治疗向骨转移的转移性癌症的M-CSF拮抗剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)检测候选拮抗剂与M-CSF的结合；和
(b)测定所述候选拮抗剂在体外或体内防止或治疗向骨转移的转移性癌症的能力。
39.一种确定可以防止或治疗向骨转移的转移性癌症的M-CSF拮抗剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)检测候选拮抗剂与M-CSFR的结合；和
(b)测定所述候选拮抗剂在体外或体内防止或治疗向骨转移的转移性癌症的能力。
40.一种确定可以防止或治疗向骨转移的转移性癌症的M-CSF拮抗剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)确定能够抑制M-CSF和M-CSFR之间相互作用的候选拮抗剂；和
(b)测定所述候选拮抗剂在体外或体内防止或治疗向骨转移的转移性癌症的能力。
41.一种防止骨质转移和肿瘤生长的方法，该方法包括，给患有转移性癌症的对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂和治疗剂，从而防止与转移性癌症相关的骨质损失并防止肿瘤生长。
42.一种治疗患有转移性癌症的对象的方法，该方法包括，给所述对象施用治疗有效量的M-CSF拮抗剂和治疗剂，从而降低与转移性癌症相关的骨质损失的严重程度并抑制肿瘤生长。
43.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，所述的对象为哺乳动物。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物为人。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述的拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。
46.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述的拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。
47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：
a)包含抗-M-CSF抗体的多肽；
b)包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；
c)包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；和
d)包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
49.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，治疗剂是二磷酸盐。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述的二磷酸盐是卓乐膦酸盐、帕米膦酸盐、氯膦酸盐、依替膦酸盐、替鲁膦酸盐、阿伦膦酸盐或伊班膦酸盐。
51.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，治疗剂是化疗剂。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，对象不接受二磷酸盐治疗。
53.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，M-CSF拮抗剂能有效地降低要达到一定治疗效果所需的治疗剂的剂量。
54.如权利要求41或42的方法，其特征在于，还包括以下步骤：施用非M-CSF型集落刺激因子，例如G-CSF。
55.一种包含M-CSF拮抗剂和癌症治疗剂的药物组合物。
56.一种包装、药瓶或容器，其特征在于，它包括：含有M-CSF拮抗剂的药物以及使用说明，该使用说明是所述药物应当与手术或放疗联合使用。
57.一种防止或治疗向骨转移的转移性癌症的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：给对象施用M-CSF拮抗剂并用手术或放疗治疗所述对象。
58.一种靶向在细胞表面上表达膜结合M-CSF的肿瘤细胞的方法，其特征在于，该方法包括步骤：施用一种特异结合于所述的膜结合M-CSF的胞外部分的抗体。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述的抗体偶联于放射性核素或其它毒素上。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
61.一种治疗患有癌症的对象的方法，其中组成所述癌症的细胞不分泌M-CSF，其特征在于，该方法包括以下步骤：施用M-CSF拮抗剂。
62.一种防止骨转移的方法，其特征在于，该方法包括给患有转移性癌症的对象施用一定剂量的M-CSF拮抗剂，使之有效地中和所述对象的细胞所产生的M-CSF，所述的剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF的剂量。
63.一种治疗患有骨转移性的转移性癌症的对象的方法，其特征在于，该方法包括给患有转移性癌症的对象施用一定剂量的M-CSF拮抗剂，使之有效地中和所述对象的细胞所产生的M-CSF，该剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF的剂量。
64.如权利要求16-25中任一项所述的抗体，其特征在于，用于药物。
65.一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用以防止患有转移性癌症的对象发生骨转移。
66.一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用以防止患有转移性癌症的对象发生与癌症相关的骨质损失。
67.一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用以治疗患有骨转移性的转移性癌症的对象。
68.一种M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用以降低患有骨转移性的转移性癌症的对象中所发生的与癌症相关的骨质损失的严重程度。
69.如权利要求65-68任一项所述的用途，其特征在于，所述的对象是哺乳动物。
70.如权利要求69所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物是人。
71.如权利要求70所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。
72.如权利要求71所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。
73.如权利要求71所述的用途，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：
a)包含抗-M-CSF抗体的多肽；
b)包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；
c)包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或
d)包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
74.如权利要求73所述的用途，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
75.如权利要求74所述的用途，其特征在于，所述的抗体对M-CSF具有特异性。
76.如权利要求75所述的用途，其特征在于，所述的抗体是抗体5H4。
77.如权利要求74所述的用途，其特征在于，所述的抗体对M-CSFR具有特异性。
78.如权利要求73所述的抗体，其特征在于，癌症是***癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、***癌、腺癌、血细胞癌(包括白血病和淋巴瘤)；头部和颈部癌症；胃肠道癌症，包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌；女性生殖道癌，包括卵巢癌、子宫内膜癌和***；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状上皮细胞癌。
79.如权利要求65-68中任一所述的用途，其特征在于，M-CSF拮抗剂是一种抗体，该抗体的施用剂量在约0.01mg/kg和100mg/kg之间。
80.一种权利要求16-25中任一所述的抗体在制备药物中的用途，所述药物用以治疗患有转移性癌症的对象。
81.一种权利要求16-25中任一所述的抗体在制备药物中的用途，所述药物用以降低患有骨转移性的转移性癌症的对象中所发生的与癌症相关的骨质损失的严重程度。
82.M-CSF拮抗剂和一种治疗剂在制备药物中的用途，所述药物用以防止发生在患有转移性癌症的对象身上的骨转移和肿瘤生长。
83.M-CSF拮抗剂和一种治疗剂在制备药物中的用途，所述药物用以防止发生在患有转移性癌症的对象身上的与癌症相关的骨质损失。
84.M-CSF拮抗剂和一种治疗剂在制备药物中的用途，所述药物用以治疗转移性癌症。
85.M-CSF拮抗剂和一种治疗剂在制备药物中的用途，所述药物用以降低在患有骨转移性的转移性癌症的对象身上所发生的与癌症相关的骨质损失的严重程度以及抑制肿瘤生长。
86.一种产品，其特征在于，它包含M-CSF拮抗剂和一种治疗剂，作为组合制剂而同时、分别或依次应用于癌症的治疗。
87.M-CSF拮抗剂在制备药物中的用途，其中所述药物用以防止和治疗骨转移性的转移性癌症，所述药物与一种癌症治疗剂同时、分别或依次地施用。
88.一种癌症治疗剂在制备药物中的用途，其中所述药物用以防止和治疗骨转移性的转移性癌症，所述药物与M-CSF拮抗剂同时、分别或依次地施用。
89.一种包装、药瓶或容器，其特征在于，它包括：含有M-CSF拮抗剂的药物以及使用说明，所述使用说明是药物应当与手术或放疗联合使用。
90.如权利要求82-85中任一所述的用途，其特征在于，所述的对象是哺乳动物。
91.如权利要求86所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物是人。
92.如权利要求90所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂抑制M-CSF和其受体M-CSFR之间的相互作用。
93.如权利要求82-85任一所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂抑制由肿瘤细胞引发的破骨细胞的增殖和/或分化。
94.如权利要求92所述的用途，其特征在于，所述的M-CSF拮抗剂选自下列各项所构成的组：
a)包含抗-M-CSF抗体的多肽；
b)包含其抗-M-CSFR抗体的多肽；
c)包含M-CSF突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽；或
d)包含M-CSFR突变蛋白或其衍生物的可溶性多肽。
95.如权利要求94所述的用途，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
96.如权利要求82-85任一项所述的用途，其特征在于，治疗剂是二磷酸盐。
97.如权利要求96所述的用途，其特征在于，所述的二磷酸盐是卓乐膦酸盐、帕米膦酸盐、氯膦酸盐、依替膦酸盐、替鲁膦酸盐、阿伦膦酸盐或伊班膦酸盐。
98.如权利要求82-85任一项所述的用途，其特征在于，治疗剂是化疗剂。
99.如权利要求51所述的用途，其特征在于，对象不接受二磷酸盐治疗。
100.M-CSF拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于降低施用于对象的、用以治疗或防止骨转移和肿瘤生长的治疗剂的剂量。
101.M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制备药物，该药物用以防止在患有转移性癌症对象身上发生的骨转移和肿瘤生长。
102.M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制备药物，该药物用以防止在患有转移性癌症对象身上发生的与癌症相关的骨质损失。
103.M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制备药物，该药物用以治疗转移性癌症。
104.M-CSF拮抗剂、治疗剂、和非M-CSF型集落刺激因子的用途，其特征在于，用于制备药物，该药物用以在患有转移性癌症对象身上降低与癌症相关的骨质损失的严重程度以及用以抑制肿瘤生长。
105.如权利要求101-103中任一项所述的用途，其特征在于，非M-CSF型集落刺激因子是G-CSF。
106.一种抗体的用途，其中该抗体特异结合于膜结合M-CSF的胞外部分，其特征在于，所述抗体用于制备药物，所述药物用以靶向在细胞表面上表达膜结合M-CSF的肿瘤细胞。
107.一种抗体的用途，其中该抗体(a)特异结合于膜结合M-CSF的胞外部分，并且(b)偶联于放射性核素或其它毒素上，其特征在于，所述抗体用于制备治疗癌症的药物。
108.如权利要求107所述的用途，其特征在于，所述的抗体选自下列各项构成的组：
a)多克隆抗体；
b)单克隆抗体；
c)人源化抗体；
c)人抗体；
e)嵌合抗体；
f)Fab、F(ab’)2或Fv抗体片段；和
g)a)至f)中任一个的突变蛋白。
109.非鼠源性抗-M-CSF抗体在制备癌症治疗药物中的用途。
110.如权利要求109所述的用途，其特征在于，组成所述癌症的细胞不分泌M-CSF。
111.一定剂量的M-CSF拮抗剂的用途，其中所述的剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量，其特征在于，用于制备防止骨转移的药物。
112.一定剂量的M-CSF拮抗剂的用途，其中所述的剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量，其特征在于，用于制备药物，该药物用于中和对象的细胞所产生的M-CSF。
113.一定剂量的M-CSF拮抗剂的用途，其中所述的剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量，其特征在于，用于制备药物，该药物用于治疗患有骨转移性的转移性癌症的对象。
114.一定剂量的M-CSF拮抗剂的用途，其中所述的剂量大于有效中和癌细胞所产生的M-CSF剂量，其特征在于，用于制备药物，该药物用于治疗癌症。
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