CN109970852B - 分泌抗狂犬病毒m蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

分泌抗狂犬病毒m蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用，属于生物技术领域。所述杂交瘤细胞株的分类命名为杂交瘤细胞株4A1，于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201947。该杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体效价高，特异性好，生物学特性优良；鉴定了其识别RABV M蛋白的精细抗原变异表位，能够用于区分疫苗Flury毒株和其它RABV毒株；将其应用于制备检测狂犬病毒RABV的试剂盒，可以检测RABV感染以及鉴别诊断疫苗Flury毒株和其它RABV毒株。

Description

分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用。
背景技术
狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(RABV)引起的一种高度致死性人畜共患传染病。RABV感染发病后，致死率几乎为100％，是迄今为止人类历史上死亡率最高的急性传染病。目前仍无任何治疗措施，只能通过疫苗免疫接种预防RABV感染。在全球范围内有150多个国家均有狂犬病病例报道，每年约有5～7万人死于狂犬病，其中95％的病例发生在非洲和亚洲。中国的人狂犬病感染病例仅次于印度，位于亚洲第二位。犬是RABV最常见的病毒储藏库，99％的人感染狂犬病是由犬传播介导的。
RABV在病毒分类学上属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)的成员，是单股副链非节段RNA病毒，其基因组主要编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)。M蛋白，由202个氨基酸组成，约23kDa，是RABV病毒粒子最小、含量最丰富的一种非糖基化蛋白，其位于病毒囊膜和核衣壳之间，起到连接G蛋白和核衣壳的作用。M蛋白具有多种功能：参与病毒粒子的组装和出芽，对病毒粒子形态呈长杆状起到决定因素，调控病毒的转录和翻译过程，参与决定病毒的致病力，诱导细胞凋亡，抑制宿主相关基因的表达等。
目前已制备出的抗RABV蛋白的单克隆抗体主要是NP蛋白和G蛋白。NP蛋白单克隆抗体可用来区分狂犬病毒属不同血清型；G蛋白单克隆抗体则表现出较高的中和活性。RABVM蛋白的单克隆抗体报道很少，而且M蛋白单克隆抗体识别的精细表位还不清楚，缺乏对这些单克隆抗体生物学特性的了解，因此也限制了抗M蛋白单克隆抗体在病毒诊断中的应用，以及对M蛋白结构和抗原特性的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能分泌特异性识别RABV M蛋白的单克隆单体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体能与RABV毒株发生特异性反应，不能与疫苗Flury毒株发生反应。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的分类命名为杂交瘤细胞株4A1，于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201947。
本发明首先从建立的杂交瘤细胞库中得到12株稳定分泌抗狂犬病毒RABV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，并最终筛选出杂交瘤细胞4A1株，其生物学特性优良。采用间接酶联免疫吸附分析法测得制备的小鼠腹水单克隆抗体4A1的效价为1×105。
本发明还提供了由杂交瘤细胞4A1株制备得到的抗狂犬病毒M蛋白的单克隆抗体。
本发明首次鉴定了该单克隆抗体所识别的变异抗原表位，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。该抗原表位在不同的RABV毒株M蛋白上相对保守，但在疫苗Flury毒株上存在抗原变异(Flury毒株氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)，导致单克隆抗体不能识别。因此，本发明提供的单克隆抗体能与狂犬病毒毒株发生特异性反应，但是不能与疫苗Flury毒株反应。
本发明提供了杂交瘤细胞4A1株在制备检测狂犬病毒RABV的试剂盒中的应用。所述杂交瘤细胞4A1株可以应用于ELISA、免疫荧光、Western Blot、免疫组化等方法，可以在制备临床诊断RABV感染试剂中得到应用，或在不以诊断为目的的RABV的病原检测中得到应用。
本发明提供了所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒RABV的试剂盒中的应用。所述单克隆抗体可以应用于ELISA、免疫荧光、Western Blot、免疫组化等方法，可以在制备临床诊断RABV感染试剂中得到应用，或在不以诊断为目的的RABV的病原检测中得到应用。
本发明还提供了一种检测狂犬病毒RABV的试剂盒，包括所述的抗狂犬病毒M蛋白的单克隆抗体。
本发明具备的有益效果：
本发明提供的杂交瘤细胞4A1株生物学特性优良，其分泌的单克隆抗体4A1能与RABV毒株发生特异性反应，但是不能与Flury毒株反应；本发明提供的单克隆抗体可应用于制备ELISA、免疫荧光、Western Blot、免疫组化等方法的试剂盒，可用于RABV的临床检测或者是Flury毒株和其他毒株的鉴别诊断。
附图说明
图1为单克隆抗体的特异性实验。
图2为单克隆抗体识别表位在不同RABV毒株的比对。
图3为单克隆抗体与不同毒株的反应性。
图4为单克隆抗体与不同突变表位的反应性。
图5为单克隆抗体的免疫组化实验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(一)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.CVS-11 M蛋白的原核表达及纯化
根据GenBank中注册的CVS-11株(Liu Juan,et al.BECN1-dependent CASP2incomplete autophagy induction by binding to rabies virusphosphoprotein.Autophagy,2017,13(4):739-753)M蛋白基因(序列号：ADJ29910.1)的核苷酸序列设计特异引物，以提取的病毒RNA反转录产物为模板，进行M蛋白基因的扩增，然后将M蛋白的基因克隆至pET-28a(+)载体，测序验证正确后转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，在37℃条件下用IPTG(1mM)诱导约5h后，用Ni-NTA柱(购自QiAGEN)纯化重组M蛋白。重组M蛋白的表达和纯化用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)分析。
2.动物免疫
用以上纯化的M蛋白作为免疫原，背部皮下注射免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，100μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂(购自Sigma)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂(购自Sigma)乳化抗原，加强免疫2次。第3次免疫一周后断尾采血，测定小鼠血清抗体效价。选取血清抗体效价>106的小鼠，细胞融合前3d用不加佐剂的抗原以腹腔注射的方式再次加强免疫(200μg/只)。
3.细胞融合
采用PEG细胞融合方法。取骨髓瘤细胞SP2/0与完成免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:10的比例充分混匀，在1min内加完预热至37℃的50％PEG-4000(购自Sigma)1mL，边加边轻轻振荡，1min内加完，再静置1min。沿管壁加入已预热至37℃的无血清RPMI-1640(购自Hyclone)培养基，终止融合反应。要求在第1min内加完4mL，前30s内加入1mL，后30s内加入3mL；在第2min内加完11mL，最后3min内加至总体积40mL。然后1000rpm低速离心5min，弃去上清，再沿管壁加入30mLRPMI-1640不完全培养基，再次离心、弃上清，以尽可能地去除残留的融合剂PEG。沿50mL离心管壁加入40mL预热至37℃的含HAT(购自Sigma)和10％FBS(购自Gibco)完全培养基，轻柔地吹打以重悬细胞。将重悬的细胞转移至10cm细胞培养皿内，将混匀的细胞以100μL/孔接种至已铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，然后将细胞培养板放置于37℃、5％CO2的细胞培养箱(购自Thermo)中静置培养。5d后改用含HT(购自Sigma)和10％FBS(购自Gibco)的RPMI-1640(购自Hyclone)培养基，10d后换成含10％FBS(购自Gibco)的RPMI-1640(购自Hyclone)培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底1/10-1/5时，取培养上清检测抗体。
4.杂交瘤细胞的筛选
用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)对纯化的M蛋白进行稀释，并以0.02mg/mL蛋白浓度包被ELISA板(100μL/孔)，置4℃包被过夜(不少于12h)，PBST洗涤3次，每次5min，第3次后拍干；以含10％脱脂奶粉的PBS进行封闭(200μL/孔)，37℃放置1h，PBST洗涤3次，每次5min，第3次后拍干；将融合后14d的细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1000稀释的小鼠阴性血清分别加入相应孔内(100μL/孔)，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，第3次后拍干；加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自KPL)的脱脂奶粉(100μL/孔)，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，第3次后拍干；加入底物TMB-H2O2(100μL/孔)，37℃避光作用10min；每孔加入50μL硫酸(2mol/L)终止反应。以空白对照调零，酶标仪测定各孔的OD450nm值，P为各待测孔中样品的OD450nm值，N为阴性参考血清的OD450nm值，将N≤0.1，阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，将P/N≥2.1的检测孔判为阳性，2.1＞P/N≥1.5的检测孔杂交瘤细胞株判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。隔3d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株进行克隆化。
5.杂交瘤细胞的克隆化
首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含10％FBS(购自Gibco)的RPMI-1640培养基(购自Hyclone)稀释成100个细胞/10mL培养基的细胞悬液，将稀释的细胞悬液加入已铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板(100μL/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每天于光学显微镜下观察克隆细胞的形成情况，记录只有单个克隆的生长孔，当细胞生长至96孔板孔底1/10-1/5时取细胞上清用于ELISA检测。选择检测为阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性，取OD450nm值最大的孔进行扩大培养，最终从杂交瘤细胞库中筛选到了12株稳定分泌RABV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
6.单克隆抗体腹水的制备
将灭菌的液体石蜡腹腔注射6～8周龄的雌性BALB/c小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，0.5mL/只，7d后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株(0.5mL/只，含2×106～5×106个杂交瘤细胞)，7～10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000rpm离心10min，收集上清，即为RABV单克隆抗体，分装后于-20℃保存备用。
(二)单克隆抗体4A1的生物学特性
生物保藏
杂交瘤细胞4A1株，于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201947，分类命名：杂交瘤细胞株4A1。
1.单克隆抗体的类型测定
亚类测定按照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(购自Thermo)操作说明书进行，结果显示，单克隆抗体4A1亚型为IgG2bκ。
2.单克隆抗体效价和稳定性测定
将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞4A1株进行连续培养传代20次、液氮冻存与复苏试验，以纯化的原核表达的RABV M蛋白为检测抗原，通过间接ELISA方法连续检测单克隆抗体4A1的效价，结果各代次杂交瘤细胞分泌的抗体ELISA效价基本一致，达到103-104。
3.单克隆抗体的特异性鉴定
采用间接免疫荧光试验验证单克隆抗体4A1与RABV的反应性。用CVS-11毒株感染BHK-21细胞(购自ATCC)，培养48h后吸弃细胞培养液，加入-20℃预冷的甲醇-丙酮(1:1)固定液，200uL/孔，-20℃固定15min后，弃去固定液，用PBS洗涤3次后拍干；加入5％脱脂奶粉(200uL/孔)，37℃封闭1h后，PBST洗涤3次，加入单克隆抗体4A1(1:500)，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，拍干后加入1:500稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(购自KPL)，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，拍干后每孔加入50uL PBS，置于荧光显微镜下观察。单克隆抗体4A1与CVS-11感染的BHK-21细胞反应，产生绿色荧光，而正常未感染CVS-11毒株的BHK-21细胞无绿色荧光(见图1)。
4.单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
将M蛋白基因609bp序列(aa1-aa203)分为相互重叠的片段，设计引物(表1)，上、下游分别引入HindⅢ/KpnⅠ酶切位点，将扩增纯化的目的片段克隆于表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，诱导表达的重组His标签多肽与单克隆抗体进行Western blot验证，对阳性区段逐步进行截短表达，完成抗原表位初步定位。为精确鉴定抗原表位，从初步定位的肽段的N端和C端分别以1个氨基酸残基为单位逐步递减设计引物，上、下游分别引入BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点(表2)，通过上、下游引物退火得到目的片段，将目的片段克隆于表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，用Western blot检测诱导表达的重组GST多肽与单克隆抗体的反应性，确定单克隆抗体识别的抗原表位为25PPYDDD30。
表1鉴定单克隆抗体抗原表位所在区段引物
Figure GDA0002526607270000071
表2鉴定单克隆抗体精细表位引物
Figure GDA0002526607270000072
5.单克隆抗体表位序列分析
将鉴定的抗原表位序列25PPYDDD30与NCBI注册的RABV毒株M蛋白氨基酸序列进行比对分析(图2)，结果表明该抗原表位在RABV毒株中主要是25PPDDDD30序列。对氨基酸P26L和Y27D分别突变后进行Western blot检测，结果发现P26L和Y27D突变后，该单克隆抗体仍然能够与之反应，说明单克隆抗体4A1识别CVS-11毒株的抗原表位发生Y27D置换，但是并不影响表位的抗原性(图4)。同时，Western blot实验结果发现本发明的M蛋白单克隆抗体可与CVS-11、WT型毒株反应，不能与HEP-Flury毒株(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CVCC AV2013)反应(图3)，同时RABV毒株的N蛋白单克隆抗体可分别与3个毒株发生特异性反应，说明病毒感染细胞是成功的。RABV序列比对发现HEP-Flury毒株的抗原表位序列是25PPDGDD30，进一步将25PPYDDD30表位进行氨基酸D28G突变，Western blot实验发现单克隆抗体4A1无法与之识别(图4)。然而本发明鉴定的抗原表位与Flury及变体毒株(图2：HEP-Flury、rHEP5.0-CVSG、LEP-Flury、Flury-LEP-C)发生氨基酸D28G突变，影响了表位的抗原性，因此本发明的单克隆抗体也可用于将Flury及变体毒株与其它流行RABV毒株进行区分。
6.单克隆抗体的免疫组化实验
颅内注射感染6-8周龄C57BL/6小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)30uL CVS-11毒株(105TCID50/mL)和HEP-Flury毒株，待小鼠发病症状明显时，用2.5％avertin(购自sigma)麻醉小鼠，取脑。以颅内注射等体积的DMEM为空白对照。
(1)固定与包埋：4％多聚甲醛固定24h，经酒精脱水与透明，浸石蜡包埋，切片。
(2)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
(3)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH6.0)(购自福州迈新生物技术开发公司)的修复盒中于微波炉内中火5min，停火5min，转低火10min进行抗原修复，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5min。
(4)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5min。
(5)血清封闭：在组化圈内滴加3％BSA(购自Servicebio)均匀覆盖组织，室温封闭30min。
(6)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在CVS-11毒株、HEP-Flury毒株和DMEM感染脑组织切片上滴加1:500稀释的一抗(本发明单克隆抗体)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。其中HEP-Flury毒株感染脑组织切片再做一个阳性对照，该切片以HEP-Flury感染小鼠的血清为一抗。
(7)加二抗：玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加HRP标记的羊抗鼠IgG(购自KPL)覆盖组织，室温孵育50min。
(8)DAB显色：玻片置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液(购自福州迈新生物技术开发公司)，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
(9)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
(10)脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min--无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
(11)显微镜镜检，图像采集分析显示苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色，即该单克隆抗体能对感染的脑组织中的RABV病毒进行标记(图5)。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
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<400> 3
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1 5

Claims (6)

1.一种分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的分类命名为杂交瘤细胞株4A1，其保藏编号为CCTCC NO：C201947。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测狂犬病毒RABV的试剂盒中的应用。
3.一种抗狂犬病毒M蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备得到。
4.如权利要求3所述的抗狂犬病毒M蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别的狂犬病毒RABV抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒RABV的试剂盒中的应用。
6.一种检测狂犬病毒RABV的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求3所述的抗狂犬病毒M蛋白的单克隆抗体。
CN201910258004.2A 2019-04-01 2019-04-01 分泌抗狂犬病毒m蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 Active CN109970852B (zh)

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