CN1428416A - 苹果酸－乳酸细菌SD－2a及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于葡萄酒制造技术领域。苹果酸－乳酸发酵(MLF)是干红葡萄酒生产必不可少的工序之一，但由于葡萄酒生产要求特殊的环境，大多数能够进行苹果酸－乳酸发酵的细菌很难在其中繁殖代谢，本发明筛选出对葡萄酒环境适应性良好的酒类酒球菌(Oenococcus oeni)SD－2a。本发明可用于葡萄酒行业以及相关的食品行业。
Description
技术领域：
本发明涉及一种微生物，具体地说涉及一种苹果酸-乳酸细菌。
背景技术：
苹果酸-乳酸发酵(MLF)是干红葡萄酒生产必不可少的工序之一，目前，干红葡萄酒生产中进行苹果酸-乳酸发酵通常有两种方法，一是自然触发，二是人工接种乳酸菌，但是迄今国内还不能生产活性乳酸菌干粉，此类发酵剂全部依赖进口。究其原因在于葡萄酒生产要求特殊的环境，大多数能够进行苹果酸-乳酸发酵的细菌很难在其中繁殖代谢。筛选出适合中国葡萄酒生产的苹果酸-乳酸细菌尤为迫切。
发明内容：
本发明的目的就是筛选出对不良环境抗性强、苹果酸-乳酸酶活力高、酿酒特性好的优良苹果酸-乳酸细菌；
本发明的另一目的在于将本发明所述的菌种用于葡萄酒的生产。
本发明的技术方案是：
本发明利用改良ATB或改良MRS培养基，其配方分别为：
改良ATB培养基：ATB培养基+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素；
改良MRS培养基：MRS培养基+10％番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素；
本发明所述MRS培养基配方为：酵母浸出物5g，牛肉膏10g，胰蛋白胨15g，乙酸5g，柠檬酸铵2g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，葡萄糖20g，Tween80 1ml，1MHCl或NaOH调pH至4.8。
本发明所述ATB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，盐酸半胱氨酸0.5g，1MHCL或NaOH调pH至4.8。
从中国主要葡萄酒产区，山东烟台、河北昌黎、四川攀枝花、陕西扬凌等地分离苹果酸-乳酸细菌，具体分离方法为：在上述分离培养基即ATB培养基+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素或MRS培养基+10％番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素上，采用涂布分离法对苹果酸-乳酸细菌进行分离，取样量为0.1ml，培养温度为28℃，在厌氧箱中充N2培养5-7天，充N2的量应大于厌氧箱内剩余体积的95％。
将上述苹果酸-乳酸细菌进行pH、SO2、酒精的抗性实验：具体做法是，首先进行pH、SO2、酒精单因子实验，然后进行复合实验，筛选出对逆境抗性强的苹果酸-乳酸细菌。本发明所述的各种抗性实验方法是本领域内技术人员公知的方法。
苹果酸降解实验：将筛选出的菌株按107cfu/ml的接种量接入添加有3g/L的L-苹果酸ATB培养基中(pH4.8)，每隔24h进行纸层析监测，观察苹果酸斑点的变化，以苹果酸斑点消失时为苹果酸分解完毕。
苹果酸-乳酸酶活力测定：苹果酸-乳酸酶活力的定义为：20℃条件下，在10ml的培养基中，苹果酸-乳酸细菌24h降解苹果酸的毫克数与每毫升中活细胞数的对数值(logcfu/ml)的比值。试验证明，SD-2a的苹果酸-乳酸酶活力是对照菌株31DH的1.32倍。
酿酒适应性实验：通过对苹果酸-乳酸发酵速率、苹果酸降解率、挥发酸生成量、葡萄酒中有机酸、丹宁、总酚以及颜色发生的变化、酒体柔和指数发生的改变以及氨基酸代谢对葡萄酒质量的影响等方面的综合测定，结合品尝分析，确定酒类酒球菌(Oenococcus oeni)SD-2a为酿酒特性优良的菌株，该菌株已于2002年2月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCCNO.0715。
实施方式：
一、菌种的培养
1、斜面培养：固体培养温度28-30℃，厌氧(充N2)，采用上述固体ATB培养基，培养时间为5-8天。(液体培养基中另外添加1.8％琼脂)
2、菌种扩大培养基为液体ATB培养基，液体ATB培养基含有水及上述ATB培养基的组分，液体培养25-28℃，静置。液体培养待到对数期末离心收集菌体，离心转速为10000rpm，加入保护剂，予冻，真空干燥，真空包装，将其制成活性乳酸菌干粉。本发明的保护剂为本领域内技术人员共知的物质，它可由下述物质复配而成：甘油 3％，蔗糖5％，脱脂乳15％，余量为水。
二、本发明微生物的在干红葡萄酒生产中的应用
1、葡萄除梗、破碎，其中除梗率＞70％，破碎率＜30％。
2、装罐：装入发酵灌容积的80％，并精确计算。装罐结束后，进行一次开放式倒罐(100％)，并利用倒罐的机会加入果胶酶及活性酵母，同时取样分析原料的总糖、总酸。
3、二氧化硫：使用二氧化硫含量大于6％的亚硫酸。在装罐的同时加入，其流量应与原料的流量相匹配，同时应将二氧化硫直接加入到破碎后的原料中去(在原料输送管的出口处)。二氧化硫的用量：50mg/l(按将要酿出的葡萄酒的量计算)。
4、果胶酶：用量：30-50mg/l；使用方法见商品果胶酶的使用说明书；加入时间：在装罐结束后的开放式倒罐时进行。
5、活性酵母：用量(200mg/l)；其使用方法见商品活性酵母的说明书；加入时间：在装罐结束后的开放式倒罐时进行。
6、浸渍发酵：浸渍发酵温度为20-28℃，每天开放式倒罐2次，每次倒罐量1/2倒罐时应淋洗整个皮渣的表面。倒罐时测温度、比重，绘制发酵曲线，并根据发酵曲线及时对发酵进程进行控制(见酒精发酵记录表)。当葡萄汁的比重降至1025左右时(一般需要4-6天)，进行出罐。
7、加糖：在酒精发酵帽形成时一次性加入所需的糖量。转化率计算：原料含糖量17g/l＝1度酒精；加入的蔗糖浸渍发酵18g/l＝1度酒精；加入的蔗糖纯汁发酵17.5g/l＝1度酒精。加糖时应用葡萄汁完全溶解。加完糖时进行一次开放式倒罐(100％)。
8、分离出罐：当葡萄汁的比重降至1025时，分离自流酒于一干净的发酵罐中，皮渣经压榨后压榨酒入另一发酵罐中，继续进行酒精发酵。
9、混合：自流酒与压榨酒根据原料的卫生状况在进行了6-24小时的轻微澄清后，可相互混合。如果压渣酒的感官质量较差，则应单独进行酒精发酵。
10、酒精发酵：出罐后的葡萄汁，应在18-20℃的温度条件下，静置发酵。但如果发酵速度太慢，有终止发酵的危险时，则可进行一次开放式倒罐(1/2)。当比重降至1010时，应取样分析酒度和糖以便于最终酒度进行调整。当葡萄酒中的糖＜2g/l(化学分析)时，酒精发酵结束。
11、苹果酸-乳酸发酵：酒精发酵结束后，用碳酸氢钾将葡萄酒的PH值调至3.2(葡萄酒的PH值高于3.2则不用调整)。加入本发明的微生物，进行苹果酸乳酸发酵。在整个苹果酸乳酸发酵过程中将温度控制在18-20℃同时将葡萄酒添满、密闭。在此期间，应用纸上层析法对苹果酸乳酸发进行监控，同时测定挥发酸的含量。如果发酵正常，则应将所有的苹果酸转化为乳酸。但如果发酵不正常，挥发酸的含量接近0.6g/l时，就应终止发酵。
12、终止发酵：在苹果酸-乳酸发酵结束后，或当挥发酸接近0.6g/l时，则应立即分离换罐。并在分离时加入50mg/l二氧化硫，添满、密闭。天后应进行一次分离换罐，也可在此时进行一次粗滤。添满、密闭陈酿。
Claims (3)
1一种优良苹果酸-乳酸细菌，它是酒类酒球菌(Oenococcus oeni)SD-2aCGMCC：NO 0715。
2、根据权利要求1所述菌种的培养方法，其特征在于固体培养28-30℃厌氧充氮气培养；液体培养25-28℃，静置。
3、根据权利要求1所述菌种的培养方法，其特征在于液体培养，待到对数期末离心收集菌体，加入保护剂，予冻，真空干燥，真空包装，将其制成活性乳酸菌干粉。
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2002
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