CN111205996A - 一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵菌株及其应用 - Google Patents

一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄酒苹果酸‑乳酸发酵菌株及其应用，其分类命名为酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS‑1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18682，保藏日期为2019年10月14日，酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS‑1接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在发酵温度为18‑20℃条件下，24h之内即可启酵，9‑10d即完成苹果酸‑乳酸发酵，且降酸能力强、发酵性能优良，可显著提高发酵酒样中品种香气化合物总量，丰富风味组成，酿造出风格典型的干红葡萄酒，具有良好的经济效益和应用前景。

Description

一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种葡萄酒苹果酸-乳酸发酵菌株及其应用。
背景技术
葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation，MLF)是指利用乳酸细菌中的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)将L-苹果酸转化为L-乳酸的发酵过程。良好的MLF能够改良、优化葡萄酒的口感和品质，使其香气愈加复杂，口感更为柔和，酒体更加丰满、协调。近年来，为了突显产区特色和地域特征，关于本土优良O.oeni菌种的筛选、鉴定及其对酒质提升、呈现产区微生物风土的相关研究成为了行业关注的焦点。
在适宜的条件下MLF可以自然启动，一些遗传稳定性好、抗逆性和降酸能力强、风味独特的优良菌群得以生存和积累。自然起酵酒样中的乳酸细菌约有 40余种，主要归类为乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc) 和片球菌属(Pediococcus)。自然启动的MLF往往难以预测和控制，存在耗时长、风险大、酒品不确定性高等问题，因此纯种发酵是控制MLF顺利进行的主要手段之一。在种类繁多的乳酸细菌中，优良的O.oeni菌株通常能够在低pH、高酒精度、高SO2质量浓度以及低发酵温度的葡萄酒环境中生存，是主导MLF 的主要菌株。
甘肃河西走廊葡萄酒产区位于北纬36-40°之间，具有非常特殊的地理生态环境，东西狭长，光能资源丰富、昼夜温差大，土壤矿物质含量丰富，具有生产优质酿酒葡萄和葡萄酒的天然优势。在实际生产中，对MLF过程控制是酿酒师最为关注的问题之一，通常会根据葡萄自身特点有针对性的进行菌株和工艺参数选择，从而酿造出风格典型和特色突出的葡萄酒。然而，目前国内尚无本土O.oeni推广销售，葡萄酒企业在生产过程中要么不进行MLF，要么只能选择国外进口的商品发酵剂进行发酵，导致所产酒品标准化、同质化问题十分严重。因此，生产企业急需能够采用人工接种进行MLF的优良发酵菌种，酿造具有产区风土提升特征的优质葡萄酒。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种能够快速启酵、降酸性能良好的苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株及其应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株，其分类命名为酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC 18682，保藏日期为2019年10月14日。
本发明的苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株的应用，所述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1用于葡萄酒酿造；所述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni) GS-1接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在发酵温度为18-20℃条件下，24h 之内即启动苹果酸-乳酸发酵，9-10d即完成苹果酸-乳酸发酵。
与现有技术相比，本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在发酵温度为18-20℃条件下，24h之内即可启酵，9-10d即完成苹果酸-乳酸发酵，且降酸能力强、发酵性能优良，可显著提高发酵酒样中品种香气化合物总量，丰富风味组成，酿造出风格典型的干红葡萄酒，具有良好的经济效益和应用前景。
附图说明
图1为本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1的革兰氏染色结果图。
图2为本发明的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1菌落形态图。
图3为本发明实施例2的酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1菌株的生长曲线。
图4为本发明实施例3的发酵酒样中L-苹果酸的含量表。
图5为本发明实施例4的发酵酒样中挥发性香气化合物种类和总含量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
本实施例的一种苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株GS-1，是从甘肃河西走廊葡萄酒产区自然启动苹果酸-乳酸发酵酒样中分离筛选获得的，具体的分离筛选方法是采集生产企业自然启动苹果酸-乳酸发酵的赤霞珠酒样，先用灭菌生理盐水稀释至10-1-10-8，摇匀后吸取0.1mL涂布于ATB分离培养基进行分离培养，28℃厌氧培养5-7d。待菌落形成后观察其形态，挑取菌落较小(直径小于1mm)、表面较光滑、湿润的白色单菌落于ATB分离培养基上反复划线分离，直至纯化。将初筛菌分别接种于含有3种复筛培养基的48孔板中，28℃厌氧培养3-5d，分离纯化菌株苹果酸转化为乳酸能力检测：从3d开始利用48孔板乳酸显色反应体系检测菌株转化苹果酸的能力，在超净工作台用灭菌牙签将每个孔中的菌液混匀，然后分别用排枪吸取10-50μL菌液至新的高压灭菌的空48孔板中得到培养液，依次加入显色试剂，充分混匀，放入37℃水浴或保温箱中，反应20-60 min，观察颜色变化并记录：以不加菌液的空白培养基为对照，用“﹢+﹢”表示显色最明显，“﹢﹢”表示显色较明显，“﹢”表示有显色，“﹣”表示颜色无变化，通过检测培养液中的L-乳酸生成量，挑取显色反应为显色最明显“﹢+﹢”的为初筛菌株；
菌株复筛：将初筛所得菌株经ATB分离培养基划斜面活化后，每株菌挑取 3个单菌落分别接种于含有三种增殖培养基的深孔板中，并留有多个孔不接菌，作为对照组，每株菌设置3个重复孔板，将接菌后的多孔板置于厌氧培养箱 25-28℃下培养3-5d，待48孔板底部有明显菌体沉淀后，利用48孔板乳酸显色反应体系进行检测，筛选产乳酸能力最优的菌株GS-1；
菌种鉴定：利用理化试验对菌株GS-1进行初步鉴定，通过分子生物学方法进行菌种最终鉴定，具体如下：
形态特性：
如图1所示，菌株GS-1革兰氏染色结果为阳性，细胞形态为圆或椭圆形，细胞不运动，呈对、链、簇状排列。
培养特性
28℃厌氧培养5-7d后，在ATB固体培养基上可观察到光滑、湿润、大小形态均一且直径在1mm左右的乳白色菌落，菌落中央凸起，边缘较整齐，如图 2所示。
过氧化氢酶试验
对菌株GS-1进行过氧化氢酶试验，载玻片上所有菌株周围均不产生气泡，结果显示为过氧化氢酶阴性菌株。
遗传学特征(菌株16S rDNA序列)
本发明测定了菌株GS-1的16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA测序结果，采用BLAST方法对GenBank数据库搜索比对分析，结果表明，该菌株为酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)。菌株GS-1的16S rDNA测序(北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司)结果：
TAGCGTGAGACCCTTAGAGTGAGATCGTGTCACGCGAGTCACCGCGG TGACCCCATAGGTGAAGTGAGGCAATGACTATAGTGGCGAACTGGTGAGT AACACGTAAGAAACCTGCCCTTTAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGAT GCTAATACCGCGTAACAACAAATCACACATGTGATCTGTTTGAAAGGTCCT TTTGGATCGCTAGAGGATGGTCTTGCGGCGTATTAGCTTGTTGGTAGGGTA GAAGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGGCCGGCC ACATTGGGACTGAGACACTGCCCAAACTCCTACGGGAGGCTGCAGTAGGG AATTTTCCGCAATGCACGAAAGTGTGACGGAGCGACGCCGCGTGTGTGAT GAAGGCTTTCGGGTCGTAAAGCACTGTTGTAAGGGAAGAATAACTGAATT CAGAGAAAGTTTTCAGCTTGACGGTACCTTACCAGAAAGGGATGGCTAAA TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGTCCCGAGCGTTATCCGGATTTA TTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGACGGTTTATTAAGTCTGATGTGAAATCCCG AGGCCCAACCTCGGAACTGCATTGGAAACTGATTTACTTGAGTGCGATAGA GGCAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAAGA ACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTGCTAGATCGTAACTGACGTTGAGGCTCG AAAGTATGGGTAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCATACCGTAAA CGATGGGTGCTAGTTGTTAAGAGGTTTCCGCCTCCTAGTGACGTAGCAAAC GCATTAAGCACCCCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTTAAAG GAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGGTTTAATTCGAA GATACGCGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACCAATGATCGCTTTTGTAT GAAAGCTTTTCTTCGAACATTGGAAAACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGAA。
将上述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18682，保藏日期为2019 年10月14日。
另外，本实施例还提供了菌株GS-1发酵耐受性分析，具体分析过程如下：
葡萄酒发酵过程中存在诸多抑制O.oeni菌株生长的因子，在各因素的共同作用下，可能会导致MLF的延滞或终止。将GS-1菌株经ATB斜面培养、ATB 液体培养基活化后，将处于对数生长期的供试菌株以107CFU/mL的接种量，接种于不同初始pH值、酒精度、SO2质量浓度的葡萄酒模拟汁中，20℃恒温发酵。结果如表1所示，菌株在不同处理组合条件下均可增殖，尤其是在pH值3.2、酒精度14％以及SO2质量浓度为40mg/L的极端培养条件下也可生长，OD600值达到0.431，具有良好的发酵耐受性。
葡萄酒模拟汁：葡萄糖1g/L、果糖1g/L、海藻糖1g/L、酒石酸1g/L、L- 苹果酸3g/L、柠檬酸1g/L、醋酸钠0.14g/L、酵母浸粉4.0g/L、水解酪蛋白2.5 g/L、KH2PO4 0.3g/L、KCl0.22g/L、L-型半胱氨酸盐酸0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.065 g/L、MnSO4·4H2O 0.015g/L、CaCl20.065g/L。
表1复合因子耐受性结果
Figure BDA0002278334990000061
Figure BDA0002278334990000071
实施例2
测定酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1在葡萄酒模拟汁中的生长曲线，本实施例采用酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1作为供试菌株，以商业菌株VP41为对照，具体应用过程如下：
菌株活化：
取冷冻保存的酒酒球菌菌株GS-1，置室温下2h后，从斜面培养基上挑取2 环接种至配制好的液体培养基中，于28℃培养箱中培养，备用。
使用无菌蒸馏水活化，按0.02g/L的添加量称取于冰箱冷藏保存的酒酒球菌VP41菌株，25℃活化20min。
生物量测定：
将活化至对数生长期的O.oeni以4％的接种量接至装有葡萄酒模拟汁的150 mL锥形瓶中，每株菌设置3个重复，置于28℃培养箱厌氧培养，每隔4h吸取菌悬液用分光光度计测其OD600值，以菌株OD600值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制O.oeni生长曲线。
结果分析：
图3为2株酒酒球菌于ATB培养基中的生长曲线。由图可知，前12h为各菌株生长适应期，随后GS-1和VP41迅速进入对数生长期(12h和24h)，在 84h后菌株GS-1进入生长稳定期；VP41生长期较长，约108h后达到生长稳定期。
实施例3
测定酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1苹果酸降解能力，本实施例采用酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1作为供试菌株，以商业菌株 VP41为对照，具体应用过程如下：
菌株活化：
取冷冻保存的酒酒球菌菌株GS-1，置室温下2h后，从斜面培养基上挑取2 环接种至配制好的液体培养基中，于28℃培养箱中培养，备用。
使用无菌蒸馏水活化，按0.02g/L的添加量称取于冰箱冷藏保存的酒酒球菌OMEGA菌株，25℃活化20min。
L-苹果酸测定：
将2018年采自甘肃莫高葡萄种植基地的赤霞珠葡萄，参照干红葡萄酒生产工艺完成酒精发酵后，倒罐分装入2.5L发酵瓶中。再将活化后的供试O.oeni 菌株，以4％的接种量取活化后菌液，3000r/min离心10min后弃去上清液，沉淀用酒样洗入发酵瓶中，以未加O.oeni的酒样作为对照。置于20℃启动MLF，当酒样中L-苹果酸消耗完毕或含量不再变化时，结束发酵。
在MLF发酵过程中，每隔24h取样，参照爱尔兰Megazyme公司L-苹果酸检测试剂盒推荐的方法测定L-苹果酸含量，分析酒样中L-苹果酸含量的变化。 L-苹果酸含量按如下公式计算：
苹果酸含量(g/L)＝0.4980×[(A4-A3)-(A2-A1)]×稀释倍数。
结果分析：
由图4可知，除对照组未MLF发酵酒样(CK)外，其余葡萄酒样中L-苹果酸含量均呈下降趋势。其中GS-1是进入对数生长期(12h)最快的菌株(图3)，其诱导发酵的葡萄酒中L-苹果酸含量也下降最快，24h时L-苹果酸含量约从3.378g/L迅速降至2.649g/L，相比其他菌株降酸速率最高。当L-苹果酸浓度降至约0.200g/L时，所有菌株降酸速率均变得缓慢。在MLF 9d后，GS-1酒样中苹果酸含量仅剩0.008g/L，最先完成发酵；而VP-41用时14d，未接菌的对照组酒样苹果酸含量几乎无变化，结果表明GS-1菌株(CGMCC 18682)具有良好的降解L-苹果酸的能力。
实施例4
将酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1菌株应用于赤霞珠干红葡萄酒酿造，本实施例采用酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1作为供试菌株，以商业菌株VP41为对照，具体应用过程如下：
1)葡萄除梗、破碎：采用人工方式分选葡萄，去除青果、烂果及果梗，混匀破碎；
2)装罐：将手工破碎的葡萄汁(带皮)混匀，按80％装液量装入5L的棕色广口瓶中；
3)SO2及果胶酶的添加：向发酵罐中添加40mg/L SO2(以偏重亚硫酸钠计) 添加时用适量葡萄汁溶解，之后加至大瓶中并摇匀。将果胶酶溶于适量蒸馏水中，活化20min后按30mg/L均匀加入葡萄汁中，25℃浸渍48h；
4)酿酒酵母活化：根据说明书推荐方法和用量，将酿酒酵母菌株VR干粉加入50mLdd H2O，37℃水浴活化15min，再加入50mL葡萄汁中，30℃水浴活化15min，活化的酵母菌株按200mg/L的添加量接入葡萄汁中；
5)酒精发酵：温度控制为25℃，发酵期间定时摇罐，及时压入“酒帽”，并对总糖的含量进行监测，当总糖≤4.0g/L时(一般需4-6d)，结束酒精发酵，分离出罐；
6)苹果酸-乳酸发酵：酒精结束后降低发酵温度至20℃，接种本发明的酒酒球菌GS-1菌株，进行苹果酸-乳酸发酵。将ATB培养基扩培至对数生长期 (OD600≈1.0)的GS-1菌株6000r/min离心15min，ddH2O洗涤2次，按照5％接种量接入待发酵酒样中。MLF过程中对L-苹果酸的含量进行监测，当L-苹果酸≤0.3g/L时，结束苹果酸-乳酸发酵；
7)发酵后处理：MLF结束后按50mg/L的用量补充SO2，密封满罐储存，定期倒罐去除酒泥，直到酒样澄清；
8)发酵酒样理化指标测定：对赤霞珠干红葡萄酒取样进行基本理化检测，结果均符合国标GB/T 15037-2006的要求，见表2。
表2苹果酸-乳酸发酵前后葡萄酒样理化指标
理化指标 MLF前酒样 VP41 GS-1
pH 3.41 3.59 3.64
残糖(g/L) 2.10 1.90 1.80
酒精度(％) 12.30 12.20 12.10
总酸(g/L) 9.42 6.89 6.86
挥发酸(g/L) 0.20 0.35 0.39
总SO<sub>2</sub>(mg/L) 28.25 35.40 34.25
另外，对发酵酒样挥发性香气化合物进行测定：采用GC-MS对MLF发酵结束的赤霞珠干红葡萄酒和未MLF发酵酒样(CK)进行挥发性香气化合物定性、定量分析。由图5可知：实验共检出81种香气物质，其中醇类18种、酯类36种、酸类10种、萜烯类12种和其他类5种。其中，VP41菌株发酵酒样中共检出70种香气成分，总含量为14.36mg/L，GS-1菌株和未MLF酒样中分别检出香气物质69种(总含量14.02mg/L)和58种香气成分(总含量12.87 mg/L)。其中菌株GS-1发酵的酒样检出萜烯类化合物的种类和含量最高，共12 种(总含量0.27mg/L)，与其他酒样中萜烯化合物含量存在显著性差异(P<0.05)，主要检出的萜烯类化合物为β-紫罗兰酮、金合欢醇和萜品醇等具有花香、果香、植物香的物质，而CK酒样中未检出。
再对发酵酒样氨基甲酸乙酯、生物胺进行测定：对MLF发酵结束的赤霞珠干红葡萄酒和未MLF发酵酒样进行氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)、危害较大的生物胺腐胺、组胺、酪胺含量检测。结果表明，GS-1株与商品菌株VP41 发酵酒样中的EC、生物胺检测结果差异均不显著(表3，P＞0.05)。
表3苹果酸-乳酸发酵前后葡萄酒样氨基甲酸乙酯、主要生物胺指标
测定指标 未MLF酒样 VP41 GS-1
EC(μg/L) 10.05±0.10<sup>a</sup> 15.35±0.10<sup>b</sup> 15.73±0.06<sup>b</sup>
腐胺(mg/L) 0.71±0.01<sup>a</sup> 0.44±0.00<sup>b</sup> 0.42±0.01<sup>b</sup>
组胺(mg/L) 0.03±0.01<sup>a</sup> 0.03±0.01<sup>a</sup> 0.03±0.01<sup>a</sup>
酪胺(mg/L) 0.01±0.00<sup>a</sup> 0.01±0.00<sup>a</sup> 0.01±0.00<sup>a</sup>
注：同一行数据后不同小写字母表示在P﹤0.05水平的差异显著性。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 甘肃农业大学
<120> 一株葡萄酒苹果酸-乳酸发酵菌株及其应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1073
<212> DNA
<213> 酒酒球菌（Oenococcus oeni，O. oeni）GS-1
<400> 1
tagcgtgaga cccttagagt gagatcgtgt cacgcgagtc accgcggtga ccccataggt 60
gaagtgaggc aatgactata gtggcgaact ggtgagtaac acgtaagaaa cctgcccttt 120
agtgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcgt aacaacaaat cacacatgtg 180
atctgtttga aaggtccttt tggatcgcta gaggatggtc ttgcggcgta ttagcttgtt 240
ggtagggtag aagcctacca aggcaatgat gcgtagccga gttgagagac tggccggcca 300
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ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatgtgga agaacaccag tggcgaaagc 720
ggcttgctag atcgtaactg acgttgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa cgggattaga 780
taccccggta gtccataccg taaacgatgg gtgctagttg ttaagaggtt tccgcctcct 840
agtgacgtag caaacgcatt aagcaccccg cctgaggagt acggccgcaa ggctaaaact 900
taaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg tgggtttaat tcgaagatac 960
gcgaaaaacc ttaccaggtc ttgacatacc aatgatcgct tttgtatgaa agcttttctt 1020
cgaacattgg aaaacaggtg gtgcatggtc gtcgtcagct cgtgtcgtga gaa 1073

Claims (3)

1.一种苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株，其特征在于：其分类命名为酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18682，保藏日期为2019年10月14日。
2.一种如权利要求1所述的苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株的应用，其特征在于：所述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1用于葡萄酒酿造。
3.根据权利要求2所述的苹果酸-乳酸发酵乳酸菌菌株的应用，其特征在于：所述酒酒球菌(Oenococcus oeni，O.oeni)GS-1接种于酒精发酵结束后葡萄酒样中，在温度为18-20℃条件下进行苹果酸-乳酸发酵。
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