CN108384728B - 一株酿酒酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株酿酒酵母及其应用，属于发酵技术领域。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FS‑ZJQ已于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15063。用于佛手醋酒精阶段的酿造，能够适应佛手汁发酵环境、产酒精能力强、起发速度快、风味优良。

Description

一株酿酒酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一株酿酒酵母及其应用，属于发酵技术领域。
背景技术
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在分类学上属于真核生物原界、真菌界、子囊菌门、酵母亚门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科、酵母属。酿酒酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，在麦芽汁中培养细胞呈小圆形或卵圆形。适宜生长温度为28℃～30℃，最适 pH值为4～5。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。
佛手属芸香科柑橘属，其性状与柑橘、柚子等果木类似，与香橼、柠檬等有近缘关系，目前栽培于浙江、四川、广东、福建等地。佛手含有丰富的矿物元素和多种生理活性物质，尤其是其含有的柠檬苦素类化合物具有抗癌、抗菌、抗疟药、抗病毒、杀虫和一些其他对人体的药理作用，因此佛手是一种药食两用的农作物。目前佛手主要被用作景观和药材，深加工产品种类较少。本研究首次利用佛手汁为原料，经酒精发酵和醋酸发酵得到的果醋饮料。目的使产品中不仅保留佛手本身药用及功能性的营养成分，而且赋予了发酵过程中产生的多种有益代谢产物，更利于人体吸收。酒精发酵是生产果醋的第一步，酒精的积累、良好的香气都对果醋成品的品质起着非常重要的作用，同时为避免柠檬苦素对酵母发酵能力的影响，因此筛选一株能适应佛手发酵环境、产酒精能力强、起发速度快、风味优良的酵母对佛手果醋的工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，已于2017年12 月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15063，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母CGMCC No.15063的培养方法，是将酿酒酵母CGMCC No.15063接种至YEPD液体培养基中培养。
在本发明的一种实施方式中，所述YEPD培养基为：酵母粉5～20g/L，蛋白胨10～30g/L，葡萄糖10～30g/L，pH自然。
本发明的第三个目的是提供一种应用所述酿酒酵母生产佛手酒的方法，是在佛手酒酒精发酵阶段接种酿酒酵母CGMCC No.15063。
在本发明的一种实施方式中，所述接种是以4～6％的接种量进行接种。
本发明的第四个目的是提供所述酿酒酵母CGMCC No.15063制备的佛手酒。
本发明的第五个目的是提供所述酿酒酵母CGMCC No.15063在食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备以佛手为发酵原料的果汁或酒精饮品。
本发明的第六个目的是提供包含所述酿酒酵母CGMCC No.15063的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
本发明有益效果
本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.15063用于佛手酒酒精阶段的酿造，能够适应佛手汁发酵环境、产酒精能力强、起发速度快、风味优良。
生物材料保藏
本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FS-ZJQ，已于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15063，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为18S rDNA扩增结果电泳图谱；M，marker；1，CGMCC No.15063；
图2为不同酵母菌在佛手汁琼脂平板上的生长情况；
图3 为不同初始糖浓度酿酒酵母FS-ZJQ生长情况；
图4 为不同初始pH酿酒酵母FS-ZJQ生长情况；
图5 为不同初始酒精度酿酒酵母FS-ZJQ生长情况。
具体实施方式
YEPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，蒸馏水配置， 115℃灭菌15min。
分析方法：依据《GBT 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法》对相关指标进行检测分析。
为了便于阅读本发明的技术方案，具体实施方式中涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.12647命名为酿酒酵母FS-ZJQ。
实施例1：酿酒酵母FS-ZJQ的筛选及鉴定
1.取种：将佛手汁进行自然发酵，待发酵液出现大量泡沫。
2.接种富集培养：吸取上述发酵液，以5％接种量接种于含有100μL 10％AMP溶液的YEPD 培养基，28℃，150r/min培养1天。
3.纯种分离：将富集好的菌悬液稀释5个梯度，取100μL涂布平板，28℃倒置培养2天。从上述培养好的平板中挑选形态较好的单菌落，进行两级三区划线分离并镜检。鉴定主要通过：①菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在2.0mm左右，圆形，表面光滑，乳白色等符合酵母菌菌落特征的菌株。②个体形态观察：用光学显微镜观察，挑选卵圆形，大小(1-5)μm×(5-30)μm，视野中有明显出芽细胞的菌株。选取85株，每株两个平行，接种入装有10mL佛手汁的试管中。
4.一级筛选：以安琪活性干酵母粉为对照，以菌株生长能力及以发酵液香气成分为指标衡量指标淘汰发酵液无明显香气或气味不佳和发酵能力差的酵母。保留29株。
5.二级筛选：以安琪活性干酵母粉为对照，以酒精度和香气感官品评为衡量指标淘汰发酵液酒精度过低和品评结果过差的酵母。保留7株。
6.三级筛选：以安琪活性干酵母粉为对照，以起发速度为衡量指标淘汰起发速度慢的酵母。保留3株。
7.四级筛选：将上述3株菌分别发酵成佛手酒，测定成品酒有机酸含量，保留非挥发性酸含量最多的1株。
8.菌种鉴定：提取菌株基因组DNA，用酵母ITS通用引物对正向引物ITS1、反向引物ITS4 扩增基因组DNA，反应条件为：94℃预变性5min后进入以下循环：94℃变性45s，55℃退火 40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将PCR扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定为酿酒酵母，并命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FS-ZJQ。该菌已于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15063，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2酿酒酵母FS-ZJQ发酵液中主要风味成分分析
将酵母菌株FS-ZJQ与安琪葡萄酒酵母于三角瓶中进行发酵，采用气相色谱-质谱(GC-MS) 分析佛手酒精发酵液的香气成分。由表1可知，不同的菌株经过酒精发酵后，发酵产物中挥发性成分都有不同程度变化。佛手汁挥发性成分相对含量较高的为萜烯类化合物。经FS-ZJQ 发酵后，与安琪葡萄酒酵母相比，发酵液中萜烯类化合物相对含量高7.6％，萜烯类化合物种类有：α-萜品烯(柑橘和柠檬香气)、α-水芹烯(薄荷香气)、β-水芹烯(青草香气)等9 种：酯类化合物相对含量高6.6％，分别为：乙酸己酯(水果清甜气味)、辛酸乙酯(水果香气)、乙酸香叶酯(玫瑰薰衣草香气)、乙酸苯乙酯(玫瑰花香)等12种，不同酯的种类和数量决定了果酒的香气和风味。由此可见，FS-ZJQ挥发性香气成分种类丰富，能适应佛手环境，产香能力优于安琪葡萄酒酵母。
表1酿酒酵母FS-ZJQ发酵液中主要风味成分分析
实施例3酿酒酵母FS-ZJQ与其他酵母菌在佛手汁琼脂平板生长对比情况
将酵母菌株FS-ZJQ与其他酵母菌活化后涂布于佛手汁琼脂平板上，浓度均为1.5×108个 /mL，稀释至10-5进行涂布，2d后观察其生长情况。由图2可知，不同酵母菌在佛手汁平板上生长情况不同。(a)(b)(c)的菌落个数分别为±155个，±121个，±95个，并且(a)中的菌落大小明显大于(b)(c)，而(d)(e)上没有长出酵母菌落。由此可知，FS-ZJQ可以适应佛手汁，生长情况优于安琪葡萄酒酵母等其他酵母。
实施例4酿酒酵母FS-ZJQ耐受性的验证
1.糖度耐受性：以5％接种量分别接种于12、15、18、21、24°Bx佛手汁中，28℃培养3d，每12h取样，用紫外分光光度计在600nm测定吸光值。由图3可知，0～24h期间，当初始糖浓度低于21°Bx时，酵母生长速率随着糖浓度的增加而加快，当糖浓度高于21°Bx时，其生长速率随着糖浓度的增加而减缓，随后趋于稳定。由此可知，FS-ZJQ的耐糖性能力较强。
2.pH耐受性：佛手汁的pH为4.2左右，故考虑FS-ZJQ在pH<4的耐受性。分别设置pH为2、2.5、3、3.5、4五个梯度。接种量5％，佛手汁糖度为18°Bx，28℃培养3d，每12h取样，用紫外分光光度计在600nm测定吸光值。由图4可知，当初始pH<3时，酵母细胞的生长受到抑制，当pH＝2时，抑制作用明显。这是因为强酸条件会对细胞造成一定的损伤，导致生理活性的丧失。当初始pH在3～4之间时，酵母生长趋势整体相似，生长速度均由快速趋于缓慢。由此可知，FS-ZJQ在pH为3～4之间具有耐酸能力，符合酸类果汁酒精发酵对pH 的要求。
3.酒精耐受性：分别设置初始酒精度(％v·v-1)为5、8、11、14、17，将6-7以5％接种量接种于18°Bx佛手汁中，28℃培养3d，每12h取样，用紫外分光光度计在600nm测定吸光值。由图5可知，酒精度高于14％v·v-1时，酵母生长受到抑制。当酒精度为5％v·v-1、8％v·v-1、 11％v·v-1时，酵母生长趋势较为相似。0～24h之间酵母生长缓慢，24～48h，生长明显加快，随后趋于稳定。这是因为初始培养基中的酒精对酵母的生长产生了胁迫作用，酵母生长进入迟滞期。24h后，酵母进入对数生长期，细胞浓度增加，酒精积累抑制了酵母的生长，所以 36h后酵母生长缓慢，最后趋于平稳。由此可知，FS-ZJQ在酒精度低于11％v·v-1具有较强的耐受性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已于2017年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15063，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.15063的培养方法，其特征在于，所述方法是将酿酒酵母CGMCC No.15063接种至YEPD液体培养基中培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述YEPD培养基为：酵母粉5～20g/L，蛋白胨10～30g/L，葡萄糖10～30g/L，pH自然。
4.应用权利要求1所述的酿酒酵母生产佛手酒的方法，其特征在于，所述方法是在佛手酒酒精发酵阶段接种酿酒酵母CGMCC No.15063。
5.权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.15063制备的佛手酒。
6.权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.15063在食品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备以佛手为发酵原料的果汁或酒精饮品。
8.包含权利要求1所述的酿酒酵母CGMCC No.15063的微生物菌剂。
9.根据权利要求8所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
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