CN1384733A - 分散性得到改进的干粉组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高度可分散的制剂,其含有一种活性剂和一种含有至少两个亮氨酰残基的二肽或三肽。本发明的组合物具有优越的气雾剂性能并因此优选用于向肺部雾化给用。本发明还提供了一种方法,用于(i)增加用于向肺部给用的、含有活性剂的制剂的分散性,和(ii)将组合物输送至患者的肺部。

Description

分散性得到改进的干粉组合物

本申请要求以下美国临时专利申请的优先权：序列号60/162,451，1999年10月29日提交；序列号60/164,236，1999年11月8日提交；序列号60/172,769，1999年12月20日提交；序列号60/178,383，2000年1月27日提交；及序列号60/178,415，2000年1月27日提交，上述所有的专利申请整体引入本文作参考。

发明领域

本发明涉及高度分散的干粉组合物，特别涉及通过雾化向肺部输送的高度分散的、可吸入的干粉组合物。本发明的干粉含有一种活性剂和一种含有至少2个亮氨酰残基的二肽或三肽，且在储存时具有物理和化学稳定性。本发明的粉末还具有优良的气雾剂性能。

发明背景

传统上来讲，与更传统的给药途径如口服和静脉内给药相比，吸入疗法在生物治疗剂和常规的药物的给药中所起的作用相当次要。注射是输送生物治疗剂(例如，肽、蛋白质和核酸)的传统途径，但由于与注射有关的许多缺点(例如，不方便、不舒适、患者讨厌基于注射针的输送方法)，需要可选择的给药途径。

肺部给药就是这样的一种可选择的给药途径，其比皮下给药具有几个优点。这些优点包括病人自主给药的方便性、减少药物副作用的可能性、吸入给药的简便易行、不需要注射针等等。使用吸入的蛋白、肽、DNA和小分子进行的许多临床前和临床研究表明可获得肺内和全身的疗效。尽管具有如此的效果，但是，近几年来吸入疗法在保健领域的作用并没有象预期的那样增长，这部分是由于开发可吸入的药物制剂所独有的一组问题。干粉制剂尽管比麻烦的液体剂型和推进剂驱动的制剂具有独特的优点，但其倾向于聚集和低流动性的现象显著降低了基于干粉的吸入疗法的疗效。

为提供用于有效的吸入疗法的分散粉末，必须减少由粒子-粒子相互作用如疏水、静电和毛细管相互作用引起的粒子聚集。采用了多种方法，试图制备粒子聚集最小、气雾剂性能良好的干粉。这些方法包括对干粉粒子表面结构进行改性(Ganderton等，美国专利5,376,386)、大的载体粒子(不含药物)与气雾治疗剂共同输送以实现高效雾化、粒子包衣(Hanes，5,855,913；Ruel等，5,663,198)、空气动力学轻粒子(Edwards等，5,985,309)、使用抗静电剂(Simpkin等，5,908,639)及添加特定的赋形剂，例如表面活性剂(Hanes，5,855,913；Edwards，5,985,309)。不幸的是，粒子聚集体的形成以及流动性不好和低分散性的粉末的生成仍旧困扰着制备用于吸入疗法的可雾化的干粉的开发工作。因此，存在对用于肺部输送治疗剂的改良的可吸入气雾剂的需求，特别地，存在对任何治疗剂都具有优良气雾剂性能和粒子-粒子相互作用减弱的干粉的需求。

发明概述

本发明基于对一类特殊赋形剂的发现，这类赋形剂当与干粉制剂混合以雾化和输送至肺部时，显著地改进干粉的分散性和雾化性能，不论在制剂中含有何种类型的活性剂。更具体地，本发明提供一种干粉组合物，其含有一种活性剂和一种含有至少两个亮氨酸的二肽或三肽。优选的二肽和三肽是具有表面活性的那些。

本发明的干粉通常含有约2重量％至约99重量％的二肽或三肽，并可以优选含有另外的赋形剂或载体，如碳水化合物、氨基酸、肽、蛋白质、有机酸盐和/或聚合物。

含有二肽或三肽的干粉组合物比不含二肽或三肽的干粉组合物，在显著增加干粉的释放剂量(emitted dose)方面更有效。在本发明的一个特殊的实施方案中，本发明的干粉的特征是释放剂量至少约30％。在另一个实施方案中，粒子表面的二亮氨酰二肽或三肽的浓度比粉末本体的浓度大。

在一个实施方案中，本发明的干粉粒子的另外的特征包括物质平均直径(mass median diameter)小于约10微米，在另一个实施方案中，粒子的平均空气动力学直径小于约10微米。在再一个实施方案中，干粉含有堆积密度为0.1-10克/立方厘米的粒子。

本发明的干粉的进一步的特征是储存时的物理和化学稳定性，在一个实施方案中，该物理和化学稳定性表征为当在环境条件下储存三个月时，释放剂量的下降不超过约10％。在另一个实施方案中，干粉的化学稳定性表征为当干粉化的组合物在环境条件下储存三个月时，活性剂的降解率低于约5重量％。

另一方面，本发明提供一种增强干粉的气雾剂性能的方法。在该方法中，一种二肽或三肽合入到一种含有液体制剂的活性剂中。干燥所得的液体制剂，得到一种含有该活性剂和二肽和/或三肽的干粉，由此所得的干粉具有比含有同样的组分但不含二肽或三肽的干粉更高的释放剂量。

在本方法的一个实施方案中，液体制剂是一种含水制剂。在本方法的另一个特殊的实施方案中，液体制剂被喷雾干燥，制成干粉。

在进一步的方面，本发明提供一种增强含有活性剂的、适于向肺部给药的制剂的气雾剂性能的方法。按照本方法，含有至少两个亮氨酸的二肽或三肽被合入一种含有活性剂的制剂中。所获得的含有活性剂和二肽或三肽的组合物的释放剂量比含有相同组分但不含二肽或三肽的组合物的释放剂量大。在一个实施方案中，本方法产生一种适于向肺部雾化给药的液体组合物；在一个备选的实施方案中，本方法产生一种适于向肺部雾化给药的干粉化的组合物。

本发明的再一个方面涉及一种通过吸入雾化形式的前述的本发明的组合物，向哺乳动物患者的肺部输送干粉组合物的方法。

通过结合附图和实施例阅读下面的详细描述，本发明的这些和其它目的和特征将更加显而易见。本发明的详细描述

I.定义

本文中使用的以下术语具有指定的含意。

本文所述的“活性剂”包括具有某些可在体内或体外验证的、通常是有益的药理学效果的任何试剂、药物、化合物、物质的组合物或混合物。其包括食物、食物补剂、营养素、营养药物、药物、疫苗、抗体、维生素和其它的有益试剂。如本文所使用的，这些术语还进一步包括在患者中产生局部或全身效果的任何具有生理或药理活性的物质。

“氨基酸”是指所有既含有氨基又含有羧酸基的化合物。尽管氨基的最常见的位置是邻近羧基官能团，但氨基也可以位于分子中的任意位置。氨基酸也可以含有另外的官能团，如氨基、硫基、羧基、羧酰胺、咪唑等。氨基酸可以是合成的或天然的，并可以使用其外消旋形式或旋光活性形式(D-或L-)。

无论是作为单独的氨基酸还是作为肽的一个氨基酸部分，“亮氨酸”都指氨基酸亮氨酸，其可以为外消旋混合物或其D-形式或L-形式，以及亮氨酸的改性形式(即，亮氨酸的一个或多个原子被另外的原子或官能团取代)，其中改性氨基酸或肽的分散性增强效果与未改性的物质相比实质上没有改变或没有改进。

“二肽”，在本文中也称作二聚物，是指由两个氨基酸组成的肽。

“三肽”，在本文中也称作三聚物，是指由三个氨基酸组成的肽。

“表面活性”物质是一种具有表面活性(例如通过表面张力法测定)的物质，其表面活性表征为其降低溶解了该物质的液体的表面张力的能力。与液相和其他相之间的界面相关联的表面张力，是由于表面上的分子表现出向内的吸引力而产生的一种性质。

典型地，在本发明的范围内，具有表面活性的二肽或三肽是通过制备标的肽在水中的不同浓度(从约0.01％重量/体积(0.1mg/ml)至约2％重量/体积(20mg/ml))的溶液，并测定每种溶液的表面张力来进行鉴定的。表面活性的肽是这样一种肽，当在溶液中以任何浓度存在时，尽管通常是以大于0.25mg/ml的量存在，能够有效地使水的表面张力低于其对照值。一种比另一种肽的表面活性更强的肽是这样的一种肽，当在液体中以同样的浓度存在并在一组相同的实验条件下测定时，其更大程度地降低水的表面张力。

“干粉”是指一种粉末组合物，根据特定的制剂，其通常含有约20％以下的水分，优选10％以下的水分，更优选含有约5-6％以下的水分，最优选含有约3％以下的水分。

一种“适于肺部输送”的干粉是指一种组合物，其含有固体(即，非液体)或部分固体粒子，所述的固体粒子能够(i)容易地分散在一种吸入装置中或被该装置分散及(ii)被患者吸入，从而一部分粒子到达肺部而能够渗入肺泡中。这样的一种粉末被认为是“可呼吸的”。

“雾化的”或“可雾化的”粒子是这样的一些粒子，当其由被动吸入装置或主动吸入装置分散到气流中时，其保持在气体中悬浮至足以使部分粒子被患者吸入的一定量时间，从而使一部分粒子到达肺部。

“释放剂量”或“ED”表示一台合适的吸入器装置启动或分散后输送的药物制剂量。更具体地，对于干粉制剂，ED是从单位剂量包装中释放出，并离开吸入器装置接口的粉末的百分比的度量。ED定义为吸入器装置输送的剂量与名义剂量(即，在一台合适的吸入器装置启动前置入其中的每单位剂量的粉末质量)的比值。ED是一个由实验确定的参数，通常是使用一种模仿患者用药的体外装置测定的。为测定ED值，将一种通常是单位剂量形式的名义剂量的干粉置入一种合适的干粉吸入器(如转让给Inhale Therapeutic Systems的美国专利5,785,049所描述的吸入器)中，然后启动该吸入器，使粉末分散。然后使用真空装置从该装置中抽出所得的气雾剂的雾化物，气雾剂雾化物收集在该装置中的一个与该装置接口相连的配衡过滤器中。到达过滤器的粉末量构成了释放剂量。例如，对于一种置入一台吸入装置中的含有5mg干粉的剂型，如果粉末的分散导致4mg粉末到达如上所述的配衡过滤器中，则干粉组合物的释放剂量为：4mg(送达剂量)/5mg(名义剂量)×100＝80％。对于非同质粉末，ED值表示在一台吸入器装置启动后输送的药物量而非输送的干粉量，且ED值是基于药物的量而非粉末总重量。同样对于MDI和喷雾剂型，ED相当于从剂型中抽出，并离开吸入器装置接口的药物的百分比。

“微细粒子剂量”或“FPD”定义为空气动力学直径小于3.3μm的粉末粒子的质量百分比，其通常在一台Anderson阶式撞击取样器中测定。该参数表示最可能到达患者的肺深部而适于全身摄取药物的粒子的百分比。

“可分散的”或“分散的”粉末是ED值至少为约30％，更优选40-50％，甚至更优选至少约50-60％的粉末。

“物质平均直径”或“MMD”是平均粒子尺寸的度量，因为本发明的粉末通常是多分散的(即，由一定范围的粒子尺寸组成)。本文所提到的MMD值是通过离心沉降测定的，尽管可以使用多种用于测定平均粒子尺寸的通用技术(例如，电子显微镜测量法、光散射法、激光衍射)。

“物质平均空气动力学直径”或“MMAD”是分散粒子的空气动力学尺寸的度量。空气动力学直径用于描述一种雾化粉末的沉降性能，是在空气中具有与粒子相同沉降速度的单位密度球体的直径。空气动力学直径包括粒子形状、密度和粒子的物理尺寸。如果没有另外指明，本文所使用的MMAD是指通过阶式撞击测定的雾化粉末的空气动力学粒子尺寸分布范围的中点或平均值。

“可药用盐”包括但不限于，由无机酸制备的盐，如氯化物、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐和硝酸盐，或由有机酸制备的盐，如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙基琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、水杨酸盐和硬脂酸盐，以及estolate、葡庚糖酸盐和乳糖酸盐。同样，含有可药用阳离子的盐包括但不限于，钠、钾、钙、铝、锂和铵(包括烷基取代的铵)盐。

“可药用赋形剂或载体”是指一种赋形剂，其可以选择性地包含在本发明组合物中，并被摄入肺中，其对患者，特别是患者的肺部没有显著的毒理学作用。

“药理学有效量”或“生物活性剂的生理学有效量”是本文所述的可雾化组合物中存在的活性剂的量，当这样的组合物在肺部给用时，需要该组合物在待接受治疗的患者的血流中或治疗部位(例如，肺)提供期望水平的活性剂以得到预期的生理反应。确切的用量将取决于多种因素，例如，活性剂、组合物的活性、采用的送药装置、组合物的物理特性、预期的患者用量(即，每天的给用的剂量数)、患者因素等等，并且基于本文提供的信息，可以由本领域的技术人员方便地确定。

“聚合物”是指由重复的小的、简单的化学单元构造的高分子量的聚合化合物或大分子。如本领域中已知的，聚合物可以是生物聚合物，即天然存在的(例如，蛋白质、碳水化合物、核酸)，或非生物、合成的聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、菲科尔(水溶性聚蔗糖)等)。

II.组合物

本发明是基于申请人对含有两个或两个以上的亮氨酸的二肽和三肽的一类化合物的发现，该类化合物当合入到给用到肺部的制剂中时，会赋予所得的制剂优异的气雾剂性能。此外，本申请人惊奇地发现，这些二肽和三肽对于显著增强所得制剂的可分散性很有效，且无论制剂中含有何种类型的活性剂。因此，这些二肽和三肽可用于一系列范围广泛的制剂中，用来增强所得组合物的气雾剂性能，并且在某些情况下，用于在先前未知或不能获得气雾剂的情况下，提供可雾化的制剂。尽管本发明涉及干粉制剂的某些方面，但也意在一并包括液体制剂。以下将说明本发明的制剂的组分。

A.活性剂

合入本文所述的组合物中的活性剂可以是无机化合物或有机化合物，包括但不限于作用于末梢神经、肾上腺素能受体、胆碱能受体、骨骼肌、心血管***、平滑肌、血液循环***、概要部位、神经效感器结合点、内分泌和激素***、免疫***、生殖***、骨骼***、自体有效物质***、消化和******、组胺***和中枢神经***的药物。合适的活性剂可以选自例如，***和镇静剂、心理***、镇静剂、呼吸药物、抗惊厥药、肌肉松弛剂、抗震颤麻痹剂(多巴胺拮抗剂(dopamine antagnonists))、止痛药、消炎药、抗焦虑剂(抗焦虑药)、食欲抑制剂、抗偏头痛药剂、肌肉收缩剂、抗感染药剂(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)、抗关节炎药剂、抗疟疾药、止吐药、抗癫痫药、支气管扩张药、细胞因子、生长因子、抗癌药、抗血栓形成药、抗高血压药物、心血管药、抗心律不齐药、抗氧化剂(antioxicants)、抗哮喘剂、包括避孕药在内的激素剂、类交感神经药物、利尿剂、脂类调节剂、抗雄激素药剂、抗寄生物药剂、抗凝血剂、肿瘤剂、抗肿瘤药、降血糖药、营养剂和补剂、生长补充剂、抗肠炎药、疫苗、抗体、诊断剂和造影剂(contrasting agents)。当通过吸入给用时，活性剂可以在局部或全身起作用。

活性剂可以属于多种结构类型中的一种，包括但不限于小分子、肽、多肽、蛋白质、多糖、类固醇、能够引起生理效应的蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、脂肪、电解质等。

适用于本发明的活性剂的例子包括但不限于，降钙素、***(EPO)、因子VIII、因子IX、ceredase、葡糖脑苷脂酶(cerezyme)、环孢菌素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、生长激素、人生长激素(HGH)、生长激素释放激素(GHRH)、肝素、低分子量肝素(LMWH)、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-1受体、白介素-2、白介素-1受体拮抗剂、白介素-3、白介素-4、白介素-6、黄体激素释放因子(LHRH)、因子IX胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(例如，美国专利5,922,675中描述的一酰化的胰岛素)、糊精、C-肽、促生长素抑制素、包含奥曲肽的促生长素抑制素类似物、血管加压素、促卵泡激素(FSH)、***(IGF)、胰岛素调理素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、组织生长因子、角质形成细胞生长因子(KGF)、胶质生长因子(GGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、内皮生长因子、甲状旁腺激素(PTH)、胰高血糖素样肽、胸腺素α-1、IIb/IIIa抑制剂、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4抑制剂、二膦酸酯、呼吸道合胞病毒抗体、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、杀菌/渗透性增大蛋白(BPI)、抗巨细胞病毒(CMV)抗体、13-顺视黄酸、诸如红霉素、竹桃霉素、酷竹桃霉素、罗红霉素、克红霉素、davercin、阿齐红霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、桂晶白霉素、美欧卡霉素、罗他霉素、andazithromycin和swinolide A等的大环内酯；诸如环丙氟哌酸、氧氟氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿曲伐沙星、莫西沙星(moxifloxicin)、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、斯帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托磺沙星、普丽沙星(prulifloxacin)、伊洛沙星、帕珠沙星(pazufloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)和西他沙星(sitafloxacin)等的氟喹诺酮；诸如庆大霉素、奈替米星、paramecin、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和链霉素、万古霉素、替考拉宁、rampolanin、麦地拉宁(mideplanin)、多粘菌素、达托霉素(daptomycin)、短杆菌肽、多粘菌素E甲磺酸盐等的氨基糖苷；诸如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯类等的多粘菌素；青霉素，包括对青霉素酶敏感的药剂如青霉素G、青霉素V，抗青霉素酶的药剂如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴性微生物活性剂如氨苄西林、阿莫西林和海他西林、西林(cillin)和革兰西林(galampicillin)；抗假单孢菌(antipseudomonal)青霉素如羟苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢菌素如头孢泊肟、头孢罗齐、ceftabuten、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑林、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢呋辛、头孢雷特、头孢噻肟、头孢曲秦、头孢乙氰、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、洛拉卡比和拉氧头孢；单菌霉素类如氨曲南；及碳青酶烯类(carbapenems)如亚胺培南、美洛培南、戊烷脒、isethiouate、硫酸沙丁醇胺、利多卡因、硫酸奥西那林、二丙酸氯地米松、曲安西龙乙酰胺(triamcinolone acetamide)、布***(budesonide acetonide)、氟替卡松、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠、酒石酸麦角胺，以及上述药剂的可以应用的类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂及可药用盐形式。关于肽和蛋白质，本发明意在包括合成的、天然的、糖基化的、未糖基化的、聚乙二醇基化的形式及其生物活性片段和类似物。

用于本发明的活性剂进一步包括核酸、裸露的核酸分子(as barenucleic acid molecules)、载体、伴随病毒粒子、质粒DNA或RNA或其它适于细胞转染或转化，即适于包括抗致敏的基因治疗的核酸结构。此外，活性剂可以含有适于用作疫苗的减毒活病毒或灭活病毒。其它可用的药物包括《医生案头参考书》(最新版)(Physician’s DeskReference)中列举的那些。

制剂中所含活性剂的量必须是能够输送每单位剂量的治疗有效量的活性剂以获得所需要的效果的需要量。在实践中，根据特定的药剂、其活性、将接受治疗的疾病的严重程度、患病人群、剂量要求以及所期望的疗效，该量将有广泛变化。组合物通常含有约1重量％至约99重量％的任意含量的活性剂，典型为约2重量％至约95重量％的活性剂，更典型的是约5重量％至85重量％的活性剂，并将取决于组合物中所含的添加剂的相对含量。本发明的组合物特别适用于以0.001毫克(mg)/天(day)至100mg/day，优选0.01mg/day至75mg/day，更优选约0.10mg/day至50mg/day剂量输送的活性剂。

应当理解本文所述的制剂中可以含有一种以上的活性剂，使用术语“药剂”决不排除使用两种或多种这样的药剂。

B.增强可分散性的肽

本发明的组合物将含有一种或多种包含两个或多个亮氨酸残基的二肽或三肽。如上所述，本发明是基于申请人对一类在增强粉末组合物的可分散性方面效果优异的含有两个亮氨酰的二肽(例如，二亮氨酸)和三肽的发现，并且如在实施例中所证实的，这类二肽或三肽在增强气雾剂性能方面具有比亮氨酸出乎意料的、更好的效果。

用于本发明的含有二亮氨酰的三肽是具有通式X-Y-Z的三肽，其中至少X和Y或X和Z为亮氨酰残基(即，亮氨酰残基可以彼此相邻(在1位和2位)，或可以形成该三聚物的末端(占据1位和3位))。三聚物中所含的其余的氨基酸可以是上述部分I定义的任何氨基酸。适宜的氨基酸如甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、蛋氨酸(met)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬酰胺(asp)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、正亮氨酸(nor)及这些氨基酸的改性形式。对于含有二亮氨酰的三聚物，优选该三聚物的第三氨基酸部分为下列氨基酸的一种：亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)、异亮氨酸(ile)、色氨酸(try)、丙氨酸(ala)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、组氨酸(his)和脯氨酸(pro)。用于本发明的典型的三聚物包括但不限于下列这些：leu-leu-gly、leu-leu-ala、leu-leu-val、leu-leu-leu、leu-leu-ile、leu-leu-met、leu-leu-pro、leu-leu-phe、leu-leu-trp、leu-leu-ser、leu-leu-thr、leu-leu-cys、leu-lcu-tyr、leu-leu-asp、leu-leu-glu、leu-leu-lys、leu-leu-arg、leu-leu-his、leu-leu-nor、leu-gly-leu、leu-ala-leu、leu-val-leu、leu-ile-leu、leu-met-leu、leu-pro-leu、leu-phe-leu、leu-trp-leu、leu-ser-leu、leu-thr-leu、leu-cys-leu、leu-try-leu、leu-asp-leu、leu-glu-leu、leu-lys-leu、leu-arg-leu、leu-his-leu和leu-nor-leu。特别优选的肽是二亮氨酸和三亮氨酸。

尽管由于含有两个或多个亮氨酸残基的四聚物和五聚物在水中的溶解度有限，但用于本发明的另外的增强分散性的肽仍为这样的四聚物和五聚物。亮氨酸残基可以占据肽内的任何位置，其余的(即，非亮氨酰)氨基酸的位置由上述的任意氨基酸占据，条件是所得的四聚物或五聚物在水中的溶解度至少为约1mg/ml。优选四聚物或五聚物中的非亮氨酰氨基酸为亲水性的氨基酸，如赖氨酸，以由此增大肽在水中的溶解度。

也优选玻璃化转变温度高于约40℃的二肽和三肽。

用于本发明的优选的二肽和三肽是那些具有表面活性的肽。从实施例1的表面张力数据可以看出，二亮氨酸和三亮氨酸即使以低浓度存在时，对显著降低水的表面张力仍然极为有效。此外，检查表5的表面张力结果(外推值)可以看出，含有两个或多个亮氨酸的二肽和三肽比由少于两个亮氨酰残基组成的二肽和三肽具有更高的表面活性。由于本发明的二肽和三肽具有高度的表面活性，因此当干粉组合物含有此类二肽和三肽时，其倾向于集中在粉末粒子的表面，从而使所得的粒子具有高度的分散性。粉末的这种特性，即富集二肽或三肽的表面，通过实施例9提供的ESCA数据得到证明。

令人惊奇的是，向降钙素制剂中加入三亮氨酸这种典型的三肽，其效果几乎将所得粉末的ED值增大两倍(实施例4)。这种结果很意外，因为降钙素本身就是一种表面活性蛋白质。因此，没有料到加入另外一种表面活性物质如三亮氨酸能显著地提高组合物的分散性。与预期相反的结果表明表面活性单独并不足以显著增大分散性，还证明了本发明的含有亮氨酰的肽在特别是对于增强气雾剂性能方面所具有不同寻常的有益性能。

通常本发明的组合物将含有约1重量％至约99重量％的二肽或三肽，优选含有约2重量％至约75重量％的二肽或三肽，甚至更优选含有约5重量％至约50重量％的二肽或三肽。通常由实验确定二肽或三肽的最佳量，即，通过制备含有不同量的二肽或三肽(浓度由低到高)，检查所得的如本文所述的组合物的分散性，并进一步研究获得最佳气雾剂性能的浓度范围。在几个实施例中(实施例3、实施例4、实施例5、实施例6)使用这样的方法。对于含有三亮氨酸的干粉制剂而言，三亮氨酸的最佳含量通常出现在约22-25重量％。

C.另外的载体和赋形剂

除活性剂和二肽或三肽外，本发明的组合物可以选择性地含有一种或多种适于肺部给药的药物赋形剂。如果存在，这些赋形剂在组合物中的含量范围通常为约0.01重量％至约95重量％，优选约0.5重量％至约80重量％，更优选约1重量％至约60重量％。优选这样的赋形剂将部分起到进一步改善活性剂组合物的特性的作用，例如通过更有效、更具复现性地输送活性剂，改善粉末的处理特性(例如，流动性和稠度)，和/或促进单位剂量形式的制备和装填。特别地，赋形剂物质通常能够起到进一步改善活性剂的物理和化学稳定性、降低残留的水分含量并阻止水分吸收，以及增大粒子尺寸、增强聚集程度、增强粒子表面性能(即，粗糙度)、方便吸入和将粒子靶向肺部的作用。当需要降低活性剂在制剂中的浓度时，赋形剂也可以仅充当填充剂。

可用于本发明的组合物中的药物赋形剂和添加剂包括但不限于氨基酸、蛋白质、非生物聚合物、生物聚合物、碳水化合物(例如，糖类、衍生糖类如糖醇、醛糖酸、酯化糖和糖类高分子)，这些物质可以单独加入或组合加入。合适的赋形剂是在Inhale Therapeutic System的国际公开WO 96/32096中给出的那些。也优选玻璃化转变温度(Tg)高于约35℃，优选高于约40℃，更优选高于约45℃，最优选高于约55℃的赋形剂。

典型的蛋白质赋形剂包括白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白、血红蛋白等。也可发挥缓冲能力的合适的氨基酸(本发明的二亮氨酰肽以外)包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)、酪氨酸、色氨酸等等。优选充当分散剂的氨基酸和多肽。落入该范围的氨基酸包括疏水性氨基酸如亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸和脯氨酸。增强分散性的肽类赋形剂包括含有如上所述一个或多个疏水氨基酸成分的二聚物、三聚物、四聚物和五聚物。

适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃基山梨糖醇、肌醇等。

本发明的组合物也可以包含一种缓冲剂或一种pH调节剂，其通常是由有机酸或碱制备的盐。典型的缓冲剂包括柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的有机酸盐、氨基丁三醇(Tris)、氨丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲剂

本发明的组合物也可以包含聚合物赋形剂/添加剂，例如，聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素、菲科尔(一种聚合糖)、羟乙基淀粉、葡萄糖结合剂(例如，环糊精如2-羟丙基-β-环糊精和磺基丁基醚-β-环糊精)、聚乙二醇和果胶。

本发明的组合物可以进一步包含调味剂、气味掩蔽剂、无机盐(例如，氯化钠)、抗微生物剂(例如，苯扎氯铵(benzalkonium chloride))、增甜剂、抗氧剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，如“吐温 20”和“吐温 80”)、山梨糖醇酯、脂类(例如，磷脂，如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺)、脂肪酸和脂肪酯、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA、锌和其它合适的阳离子)。适用于本发明的组合物的其它药物赋形剂和/或添加剂列在“Remington：TheScience & Practice of Pharmacy”，19th ed.，Williams & Williams，(1995)，和“Physician’s Desk Reference”，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)中。

III.剂型

本文所述的组合物可以是粉末形式或可流动的液体形式。液体制剂优选是活性药物溶于溶剂(例如，水、乙醇、乙醇-水、盐水)中的溶液，不优选胶体悬浮液。液体制剂也可以是活性剂在一种低沸点推进剂中形成的溶液或悬浮液。

含有所公开的含有二亮氨酰的肽的液体制剂可高度分散，具有高的ED值。

IV.制备干粉

优选通过喷雾干燥制备干粉制剂。例如，通常按照《喷雾干燥手册》(“Spray Drying Handbook”)，5th ed.，K.Masters，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1991)，及Platz，R.等的国际专利公布WO 97/41833(1997)中的描述对制剂进行喷雾干燥，这两项文献的内容引入本文作参考。

在水中的溶解度至少约0.10mg/ml的活性剂(例如，肽、蛋白质、核酸等)可以由其水溶液进行喷雾干燥。利用这种方法，首先将活性剂溶于选择性地含有一种生理可接受的缓冲剂的水中。含活性剂的溶液的pH值范围通常在约4至11，优选接近中性pH，因为当粉末在肺中分散后，这样的pH将有助于维持粉末的生理相容性。含水制剂可以选择性地含有另外的与水混溶的溶剂，如丙酮、醇类等。典型的醇是低级醇如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等。喷雾干燥前的溶液通常含有以从0.01％(重量/体积)至约20％(重量/体积)，通常为0.1％至3％(重量/体积)的浓度溶解的固体。

然后在一台常规的喷雾干燥机，如可从Niro A/S(丹麦)、Buchi(瑞士)等供应商获得的喷雾干燥机中喷雾干燥溶液，得到一种可分散的干粉。喷雾干燥溶液的最佳条件将随制剂的组成而变化，通常通过实验确定。用来对材料进行喷雾干燥的气体通常是空气，但惰性气体如氮气或氩气也是合适的。另外，用来喷雾干燥物质的气体的进口和出口的温度应不使被喷雾干燥的物质中的活性剂发生分解。这样的温度通常通过实验确定，但一般来讲，进口温度范围为约50℃至约200℃，而出口温度范围为约30℃至约150℃。

当活性剂为疏水性药物时，使用与上述方法不同的方法对制剂进行喷雾干燥。一种这样的方法描述在Gordon，M.S.，Lord，J.D.转让给Inhale Therapeutics Systems的美国专利5,985,248中。在该方法中，将一种疏水性药物溶解于一种有机溶剂或共溶剂体系中，且亲水性组分(例如，含有亮氨酰基的肽和可选的其它赋形剂)至少部分溶于相同的有机溶液或共溶剂体系中。然后喷雾干燥所得的溶液，形成粒子。通常活性剂和亲水性组分的溶解性决定有机溶剂体系的选择。选择对亲水性组分具有至少1mg/ml，优选至少5mg/ml的溶解度，对疏水性药物具有至少0.01mg/ml，优选至少0.05mg/ml的溶解度的有机溶剂。

作为选择，可通过对一种悬浮液进行喷雾干燥来制备组合物，如Gordon，M.S.转让给Inhale Therapeutics Systems的美国专利5,975,574中的描述。在该方法中，将疏水性药物溶于一种有机溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、庚烷、己烷、氯仿、***中，然后将亲水赋形剂悬浮在该有机溶剂中形成悬浮液。然后喷干所得的悬浮液形成粒子。对上述两种喷雾干燥方法均优选的溶剂包括醇类、醚类、酮类、烃类、极性非质子溶剂及其混合物。

还可以通过将制剂组分的水溶液或悬浮液合并，然后将其在一台喷雾干燥机中同时喷雾干燥来制备本发明的干粉，如在Gordon，M.转让给Inhale Therapeutic Systems的美国专利6,001,336中的描述。作为选择，可以通过制备亲水性赋形剂或添加剂的一种水溶液、制备疏水性药物的一种有机溶液、并同时通过一个喷嘴，例如，同轴喷嘴对该水溶液和有机溶液进行喷雾干燥，形成干粉，如Gordon，M.等的国际公布WO 98/29096中的描述。

作为选择，可以通过冻干法、真空干燥法、喷雾冷冻干燥法、超临界流化处理法、风干法或其它形式的蒸发式干燥法制备粉末。在某些情况下，通过制备由细粒子聚集体，即上述干粉粒子的聚集体或凝集体组成的组合物，提供具有改进的处理/加工性能，例如静电减少、流动性更好、结块少等的干粉制剂形式可能是理想的，其中这些聚集体很容易被打碎而变回适于肺部给药的细粉末组分，如在Johnson，K.等人1997的美国专利5,654,007中的描述，将该专利文献的内容引入本文作参考。

另一种制备干粉的方法是，通过使粉末组分聚集，将物质过筛得到聚集体，将其团成球状而得到更圆的聚集体，并过筛得到均一尺寸的产物，如Ahlneck，C.等人的1995年的国际PCT公布WO 95/09616中的描述，将该文献的内容引入本文作参考。

还可以通过混合、研磨、过筛或喷射研磨制剂组分成干粉形式制备干粉。

干粉组合物一旦形成，优选在其制备、加工和储存期间保持干燥的状态(即，相对低的湿度)。无论所使用的干燥方法是哪一种，优选该干燥方法将获得含有活性剂和含二亮氨酰的二聚物或三聚物的可呼吸并高度分散的粒子。

V.干粉制剂的特征

本发明的粉末进一步通过几个特征进行表征，其中最为显著的特征是，(i)一贯的高分散性，即使在储存时也能保持该特征(实施例8)，(ii)较小的空气动力学粒子尺寸(MMAD)，(iii)细粒子份值提高，即粉末中尺寸在3.3微米MMAD以下的粒子百分率更高，所有以上的特征共同使粉末透入下呼吸道(即，肺泡)的组织进行局部或***治疗的能力得到改进。下文将详细描述的含有二亮氨酰肽的干粉的这些物理特性对于使将这样的粉末雾化输送至肺深部的效率最大化十分重要。

本发明的干粉由有效透入肺部的可雾化的粒子组成。本发明的粒子的物质平均直径(MMD)小于约20μm，优选小于约10μm，更优选小于约7.5μm，最优选小于约4μm，且其直径通常在0.1μm至5μm的范围内。优选的粉末由MMD为约0.2至4.0μm的粒子组成。在某些情况下，该粉末还将含有不可呼吸的载体粒子，如乳糖，其中该不可呼吸的粒子的尺寸通常大于约40微米。

本发明的粉末进一步的特征是气雾剂粒子尺寸分布小于约10μm物质平均空气动力学直径(MMAD)，优选小于4.0μm。粉末的物质平均空气动力学直径的特征范围是约0.1-10μm，优选约0.2-5.0μmMMAD，更优选约1.0-4.0μm MMAD，甚至更优选约1.5-3.5μmMMAD。典型的含有二亮氨酰肽的粉末组合物的示例性的MMAD值在实施例2、3、4、5和6中给出。这些实施例中的几个说明通过向制剂中加入二亮氨酰二肽或三肽，改进了气雾剂的粒子尺寸分布。

本发明的粉末进一步的特征是其密度。该粉末的堆积密度通常为约0.1-10克/立方厘米，优选约0.1-2克/立方厘米，更优选约0.15-1.5克/立方厘米。

本发明的粉末的水含量一般为低于约20重量％，通常为低于约10重量％，优选低于约6重量％。具有如此低的水分含量的固体在包装和储存时倾向于具有更好的稳定性。

本发明的组合物的一个最显著的特征是其分散性，如同ED值所表明的。在制剂中加入二亮氨酰肽使所得的制剂的分散性显著改进。这些粉末的释放剂量(ED)一般高于30％，通常高于40％。更优选本发明的粉末的ED高于50％，且常常高于55％。事实上，由实施例可以看出，含有二亮氨酰肽的粉末通常具有高达80％或以上的最佳ED值。此外，这些实施例进一步说明在多种活性剂制剂中合入二亮氨酰二肽或三肽在所有情况下都能有效地增大所得组合物的ED值，且在某些情况下，甚至使该值加倍。另外，对蛋白质和小分子活性剂粉末都能观察到这种效果。

干粉的总的气雾剂性能的另外一个度量是细粒子剂量(FPD)，该数值描述空气动力学直径小于3.3微米的粉末的百分比。本发明的粉末特别适合肺部给药，其FPD值的范围为约35％-85％。这样的粉末含有至少约35％的尺寸为3.3μm以下至约0.5μm的气雾剂粒子，因此当以雾化形式输送时，能够特别有效地到达肺的区域，包括肺泡。

本文所述的组合物具有随时间推移的良好的稳定性，包括化学稳定性和物理稳定性，物理稳定性即气雾剂性能(实施例8)。一般来说，对化学稳定性而言，当组合物在环境条件下储存时，制剂中的活性剂在3个月期间内发生的降解不会超过约10％，优选不超过约7％，更优选不超过约5％。如实施例8中示例性的PTH制剂所表明的，在加速稳定性条件(40℃，环境湿度)下储存3个月(12周)期间，仅有2.3％的蛋白质发生降解(从起始纯度值97.1％至94.8％的纯度值)。由于温度升高导致反应速率增大，因此可以断定将相同的组合物在环境条件下储存时产生的降解率将小于2.3％，这进一步证明了本发明组合物的化学稳定性。

对气雾剂性能而言，当在环境条件下储存3个月时，本发明的组合物一般表征为释放剂量的下降不超过约20％，优选不超过约15％，更优选不超过约10％。通过实施例8的结果可以看出，当在加速稳定性条件下(40℃，环境湿度)储存时，示例性PTH-三亮氨酸制剂的气雾剂性能(MMAD、FPD、ED)基本上没有变化，特别是没有减弱。

本发明组合物的另一个优选的粒子特征是二亮氨酰二肽或三肽在粒子表面富集，这可从实施例9的结果得到说明。

所发现的含有二亮氨酰二肽和三肽的组合物的气雾剂性能的改进(即，分散性大大增强、细粒子剂量值下降、更小的空气动力学直径)产生了几个相关的优点，如：(i)由于更多的粉末被雾化并因此可由患者吸入，使昂贵药物在吸入装置中的损失减少；(ii)由于粉末的高效雾化，每单位剂量所需的干粉的量下降；(iii)通过增加雾化的药物到达患者肺部的量而减少了每天的吸入次数。

VI.组合物的给用

本文所述制剂可以通过任何适宜的干粉吸入器(DPI)输送，干粉吸入器即一种吸入装置，其利用患者的吸入呼吸作为将干粉输送到肺部的手段。优选的干粉吸入器为在Patton，J.S.等人的美国专利5,458,135(1995)；Smith，A.E.等人的美国专利5,740,794(1998)；和Smith，A.E.等人的美国专利5,785,049(1998)所述的Inhale Therapeutic Systems生产的干粉吸入装置，在此引入上述专利作为参考。

当使用此种类型的装置给药时，粉末装在具有一个可刺穿的盖子或其它易接近面的容器中，容器优选为泡罩包装或药筒，其中的容器可以装有一个剂量单位或多个剂量单位。在例如Parks，D.J.等人的WO97/41031(1997)中描述了用计量剂量的干粉药物填充大量空腔(即，单位剂量包装)的方便方法，该文献引入本文作参考。

用在例如Cocozza，S.等人的美国专利3,906,950(1974)和Cocozza，S.等人的美国专利4,013,075(1997)中描述的干粉吸入器类型输送本文所述的粉末也是合适的，这两篇文献引入本文作参考，其中将给用给患者的预定剂量的干粉装在一个硬质的明胶胶囊中。

其它用于肺部给用干粉的干粉分散装置包括在例如 Newell，R.E.等人的欧洲专利EP 129985(1988)；Hodson，P.D.等人的欧洲专利EP472598(1996)；Cocozza，S.等人的欧洲专利EP 467172(1994)和Lloyd，L.J.等人的美国专利5,522,385(1996)中描述的那些装置，这些文献引入本文作参考。另外适用于输送本发明的干粉的吸入装置是诸如Astra-Draco“TURBUHALER”。此种类型的装置在Virtanen，R.的美国专利4,668,281(1987)；Wetterlin，K.等人的美国专利4,667,668(1987)；和Wetterlin，K.等人的美国专利4,805,811(1989)中有详细描述，所有的上述文献引入本文作参考。其它合适的装置包括诸如Rotahaler(Glaxo)、Discus(Glaxo)、Spiros^TM吸入器(DuraPharmaceuticals)和Spinhaler(Fisons)的干粉吸入器。下文描述的装置也是适合的，即使用活塞供应空气用于夹带粉末状药物、通过使空气通过载体筛从载体筛中提升药物或使空气与粉末药物在一个混合室内混合，随后通过该装置的接口使粉末进入患者体内，如在Mulhauser，P.等人的美国专利5,388,572(1997)中描述的装置，将该文献引入本文作参考。

也可以使用一种增压的、计量剂量吸入器(MDI)输送干粉，这样的吸入器例如Ventolin计量剂量吸入器，其含有药物在一种药物惰性的液体推进剂如氯氟烃或氟烃中所形成的溶液或悬浮液，如Laube等人的美国专利5,320,094(1994)和Rubsamen，R.M.等人的美国专利5,672,581(1994)中的描述，这两篇文献引入本文作参考。作为选择，也可将本文所述的粉末溶解或悬浮于一种溶剂如水、乙醇或盐水中，并通过喷雾给用。用于输送雾化的溶液的喷雾器包括AERx^TM(Aradigm)、Ultravent(Mallinkrodt)和Acorn II(MarquestMedical Products)。

使用前，通常将干粉在环境条件下储存，并优选在或低于约25℃的温度、相对湿度(RH)范围约30％至60％的条件下储存。通过将干燥剂装入剂型的第二包装中可以获得更优选的相对湿度条件，例如小于约30％。

VII.应用

当将本发明组合物经肺部以对哺乳动物患者具有疗效的剂量给用，用于治疗或预防任何对给用上述部分II所述的活性剂敏感的疾病时，本发明组合物是有效的。

以下的实施例用于说明本发明，不应理解为限制本发明的范围。对本领域的普通技术人员来说，通过本发明的公开、附图和权利要求，该实施例变化方案和等同方案是显而易见的。

在此通过引用并入本文引用的所有的论文、书籍、专利和其它出版物的全部内容。

实施例

材料和方法

材料

盐酸环丙氟哌酸(Neuland Laboratories，India)

硫酸庆大霉素(H&A(canada)Industrial)

硫酸奈替米星(Scientific Instruments And Technology)

L-亮氨酸(Aldrich，St.Louis，MO)

盐酸(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)

0.1N氢氧化钠滴定液(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)

乙醇，200强度标准(Proof)(USP/NF，Spectrum Chemical Mfg.Corp.，New Brunswick，N.J.)

甲醇(HPLC级，EM Industries，Gibbstown，N.J.)

S.降钙素(Bachem California Inc.USA Torrance，CA)

三亮氨酸(Bachem California Inc.USA Torrance，CA)

表面张力实验使用的其它氨基酸自Sigma St.Louis，MO获得。

方法

粒子尺寸测量(Horiba)

使用一台Horiba CAPA-700粒子尺寸分析仪(Horiba InstrumentsInc.Irine，CA)测量粉末的物质平均直径(MMD)。测量是基于分散的粒子在悬浮介质中的离心沉降。通过粒子密度和悬浮介质的密度和粘度计算基于粒子的斯托克粒径(Stokes’diameter)的物质平均直径。

对所有的粉末，将其密度设定为1.5克/立方厘米。(该标称值用于被分析的所有粉末，并在喷干的粉末的典型值范围内)。通过在5mlSedisperse A-11(Micromeritics，Norcross，GA)中悬浮约5-10mg粉末，并通过超声处理使其分散10分钟，进行粒子尺寸测量。设定采集粒子尺寸数据的范围为0.4-10.0μm。

空气动力学粒子尺寸测量

Andersen阶式撞击取样器。使用一台Andersen阶式撞击取样器(一种筛样的装置，带有多个层级，通过惯性撞击按照粒子尺寸将其收集在盘上)测定在空气气流中雾化的粉末制剂的MMAD和粒子尺寸分布。在试验前和后都称取盘的重量，并测定沉积在每层级盘上的粉末质量。如无另外指明，当以28.3L/min的流速操作时，使用常规Andersen阶式撞击取样器进行研究，其具有8个层级(从顶层至底层0-7)分界尺寸范围为9.0-0.4μm，和一个终过滤层级，终过滤层级收集粒子尺寸＜0.4μm的粒子。该装置试验设置与ED试验类似，不同之处在于阶式取样器和一个USP(United States Pharmacopia)狭口(throat)(USP23，<601>章节)连接到装置的接口处而非过滤器上。对每次阶式撞击通常进行多次分散，以获得重量分析准确的数据。

Andersen短排气道(SS)法。在SS法中，层级放置的顺序与上述常规的Andersen阶式撞击器的设置不同。从顶部起，层级0被用作入口锥形附件，以与狭口相连。接下来在层级0下面设置层级3、再下面是过滤层级(层级F)。含有粉末的气流仅通过层级0和3；空气(而不是粉末)流过其它层级，其它的层级安置在层级F下面，用来将该设备的其它部分固定就位。在层级F上安置一个预先称重的过滤器，用于收集粒子尺寸＜3.3μm的粒子。在层级3下面的反向盘上安置第二过滤器，用于收集粒子尺寸＞3.3μm的粒子。对于本文所述的研究，将一个含有2 mg粉末组合物的BP(泡罩包装)分散在一台气雾剂输送装置中，并按USP方法，以28.3L/min的速率抽真空。然后重复该方法两次，达到每次操作6mg目标质量。然后去掉过滤器、称其重量，测定沉存的粉末量。

实施例1

二肽和三肽的表面活性

在25℃和45℃下测定几种典型的二肽、三肽和蛋白质的表面张力，以表征其相对表面活性。使用一台Kruss Processor Tensionmeter-K12，通过Wilhelmy法(Plate法)测定表面张力。

溶解0.05％、0.2％或0.6％的肽/蛋白质(重量)和适当量(重量)的棉子糖制备溶液，得到的最终溶液的固含量为1.0重量％。然后，在3个不同的时间点(49秒、100秒和194秒)测定试验溶液在25℃和45℃下的表面张力。结果列在下表1-5中。

高表面活性的肽和蛋白质是有效地降低水的表面张力至低于其对照值的肽和蛋白质。从表1-4可以看出，棉子糖(将其加到每种溶液中，使总的固含量达1.0％)不具有表面活性，因此对每种肽/蛋白质的表面张力结果不产生影响。

通过以下的结果可以看出，高表面活性的肽包括二亮氨酸和三亮氨酸肽。在显著降低水的表面张力方面，这些肽与高表面活性的蛋白质鲑鱼降钙素(S.降钙素)同样有效。三亮氨酸在更高的浓度(例如，参见0.05重量％、0.2重量％和0.6重量％三亮氨酸的数据)时，能够有效地将水的表面张力降至更大的程度。与三亮氨酸和二亮氨酸相比，异亮氨酸的二聚物及缬氨酸的二聚物和三聚物在降低水的表面张力方面不是特别有效。

该方法可用来识别适用于本发明的干粉的其它表面活性的二肽和三肽。

表1.表面张力测量

样品	表面张力(ST)mN/m(毫牛/米)	时间/秒	STmN/m	时间/秒	STmN/m	时间/秒
							水空白-1	72.6	49	72.6	100	72.6	194
水空白-2	72.5	49	72.5	100	72.4	194
							水空白-3	72.5	49	72.4	100	72.4	194
							1％棉子糖-1	72	49	72	100	72	194
1％棉子糖-2	72	49	72	100	72	194
							1％棉子糖-3	72	49	72	100	72	194
							0.2％三丙氨酸-1	72.4	49	72.4	100	72.3	194
0.2％三丙氨酸-2	72.2	49	72.2	100	72.2	194
							0.2％三丙氨酸-3	72.3	49	72.2	100	72.2	194
							0.2％三谷氨酸盐-1	72.1	49	72.1	100	72.1	194
0.2％三谷氨酸盐-2	72.4	49	72.4	100	72.4	194
							0.2％三谷氨酸盐-3	72.4	49	72.4	100	72.3	194
							0.2％二丙氨酸-1	72	49	72	100	71.9	194
0.2％二丙氨酸-2	72	49	71.9	100	71.9	194
							0.2％二丙氨酸-3	72.1	49	72.1	100	72.1	194
							0.2％二亮氨酸-1	58.4	49	58.1	100	57.9	194
0.2％二亮氨酸-2	58.7	49	58.3	100	58.2	194
							0.2％二亮氨酸-3	60.1	49	59.8	100	59.7	194
							0.2％三亮氨酸-1	51	49	50.9	100	50.9	194
0.2％三亮氨酸-2	51	49	50.8	100	50.7	194
							0.2％三亮氨酸-3	51	49	50.8	100	50.7	194
							0.2％S.降钙素-1	48.7	49	48.6	100	48.5	194
0.2％S.降钙素-2	48.4	49	48.4	100	48.4	194
							0.2％S.降钙素-3	48.4	49	48.4	100	48.4	194

测量在25℃进行。0.2％(重量/体积)溶液还含有棉子糖，形成总固含量为1％(重量/体积)的溶液。

表2.表面张力测量

样品	STmN/m	时间/秒	STmN/m	时间/秒	ST mN/m	时间/秒
							水空白-1	72	49	71.8	100	71.7	194
水空白-2	72.2	49	72.2	100	72.2	194
							水空白-3	71.5	49	71.6	100	71.6	194
							0.2％二异亮氨酸-1	67.6	49	67.2	100	67	194
0.2％二异亮氨酸-2	68	49	67.8	100	67.6	194
							0.2％二异亮氨酸-3	67.7	49	71.6	100	71.6	194
							0.2％二缬氨酸-1	71.7	49	71.6	100	71.6	194
0.2％二缬氨酸-2	71.6	49	71.6	100	71.6	194
							0.2％二缬氨酸-3	71.7	49	71.6	100	71.6	194
							0.2％三缬氨酸-1	68.8	49	68.8	100	68.8	194
0.2％三缬氨酸-2	68.8	49	68.7	100	68.7	194
							0.2％三缬氨酸-3	68.7	49	68.7	100	68.7	194

在25℃测量表面张力。

溶液含有0.20％(重量/体积)的下列物质之一：二异亮氨酸、二缬氨酸或三缬氨，及0.80％(重量/体积)棉子糖。

表3.表面张力测量

样品	STmN/m	时间/秒	STmN/m	时间/秒	STmN/m	时间/秒
							1％棉子糖(pH4)-1	71.4	49	71.4	100	71.4	194
1％棉子糖(pH4)-2	71.1	49	71.1	100	71.1	194
							1％棉子糖(pH4)-3	71.1	49	71.1	100	71.1	194
							1％棉子糖(pH7)-1	71.1	49	71.1	100	71.1	194
1％棉子糖(pH7)-2	71.1	49	71.1	100	71.1	194
							1％棉子糖(pH7)-3	71.1	49	71.1	100	71.1	1 94
							水空白-1	72.1	49	72	100	72	194
水空白-2	72.2	49	72.1	100	72	194
							水空白-3	72.2	49	72.1	100	72	194
							0.05％leu3(pH4)-1	59.9	49	59.8	100	59.7	194
0.05％leu3(pH4)-2	60.4	49	60.3	100	60.2	194
							0.05％leu3(pH4)-3	60.4	49	60.3	100	60.2	194
							0.2％leu3(pH4)-1	51.4	49	51.2	100	51.1	194
0.2％leu3(pH4)-2	51.4	49	51.3	100	51.2	194
							0.2％leu3(pH4)-3	51.4	49	51.2	100	51.1	194
							0.6％leu3(pH4)-1	44.2	49	44.1	100	44	194
0.6％leu3(pH4)-2	44.3	49	44.2	100	44.2	194
							0.6％leu3(pH4)-3	44.2	49	44.2	100	44.1	194
							0.05％leu3(pH7)-1	60.1	49	59.8	100	59.7	194
0.05％leu3(pH7)-2	60	49	59.8	100	59.7	194
							0.05％leu3(pH7)-3	60.2	49	60	100	59.8	194
							0.2％leu3(pH7)-1	51	49	50.8	100	50.7	194
0.2％leu3(pH7)-2	50.9	49	50.7	100	50.6	194
							0.2％leu3(pH7)-3	50.7	49	50.5	100	50.4	194
							0.6％leu3(pH7)-1	43.7	49	43.7	100	43.6	194
0.6％leu3(pH7)-2	43.8	49	43.7	100	43.7	194
							0.6％leu3(pH7)-3	43.8	49	43.7	100	43.7	194
							水空白-5	71.7	49	71.7	100	71.6	194
水空白-6	72.2	49	72.1	100	72.1	194

在25℃测量表面张力。三亮氨酸制剂还含有棉子糖，得到总固含量为1％(重量/体积)的溶液。

表4.测量表面张力

样品	STmN/m	时间/秒	STmN/m	时间/秒	STmN/m	时间/秒
							水空白-5	69.2	49	69.2	100	69.2	194
							1％棉子糖(pH4)-1	67.9	49	68	100	68	194
1％棉子糖(pH4)-2	68.2	49	68.2	100	68.2	194
							1％棉子糖(pH4)-3	68	49	68	100	68.1	194
							1％棉子糖(pH7)-1	68.3	49	68.3	100	68.3	194
1％棉子糖(pH7)-2	68.4	49	68.4	100	68.4	194
							1％棉子糖(pH7)-3	68.4	49	68.4	100	68.4	194
							含有棉子糖的Leu3制剂，使总固含量为1％
							0.05％leu3(pH4)-1	57.1	49	57	100	57	194
0.05％leu3(pH4)-2	58.1	49	57.9	100	57.8	194
							0.05％leu3(pH4)-3	58	49	57.8	100	57.8	194
							0.2％leu3(pH4)-1	47.9	49	47.5	100	47.4	194
0.2％leu3(pH4)-2	47.2	49	47.2	100	47.3	194
							0.2％leu3(pH4)-3	47.9	49	47.3	100	47.1	194
							0.6％leu3(pH4)-1	40.9	49	40.9	100	40.8	194
0.6％leu3(pH4)-2	41.1	49	41	100	40.9	194
							0.6％leu3(pH4)-3	41.1	49	41	100	40.8	194
							0.05％leu3(pH7)-1	58.5	49	58.4	100	58.4	194
0.05％leu3(pH7)-2	58.2	49	58.2	100	58.1	194
							0.05％leu3(pH7)-3	58.2	49	58.1	100	58.1	194
							0.2％leu3(pH7)-1	58.5	49	58.4	100	58.4	194
0.2％leu3(pH7)-2	58.2	49	58.2	100	58.1	194
							0.2％leu3(pH7)-3	58.2	49	58.1	100	58.1	194

在45℃测量表面张力。含有三亮氨酸的制剂还含有棉子糖，得到总固含量为1％的溶液。

另外还测定了用于本发明的二聚物和三聚物(即，具有表面活性的二聚物和三聚物)的表面张力。

表5.典型的二聚物和三聚物的表面张力

		25℃		45℃		25℃	45℃
										真实值		真实值		外推值	外推值
样品	浓度mg/ml	平均值	SD	平均值	SD	浓度为2mg/ml	浓度为2mg/ml
								二聚物
Leu-2	13.60	46.6	0.6	42.7	0.3	60.4	52.4
									4.53	54.9	0.5	48.2	0.1
	1.51	61.5	0.6	53.2	0.1
								Leu-Val	8.80	59.1	0.2	55.7	0.3	67.2	62.3
	2.93	65	0.2	60.4	0.0
									0.98	69.2	0.4	64.2	0.2
Leu-Tyr	6.40	62.2	0.1	59.5	0.3	68.3	67.3
									2.13	68.0	0.1	65.6	0.3
	0.71	71.5	0	68.0	0.1
								Val-Leu	7.80	68	0	63.5	0.2	69.8	65.3
	2.60	69.5	0.1	65.0	0.2
									0.87	70	0.5	65.5	0.0
Val-Ile	10.00	66.1	0	61.9	0.2	70.3	65.8
									3.33	70.1	0.3	65.3	0.1
	1.11	71.6	0.2	66.3	0.2
								Leu	TBD	56.7	0.3	54.7	0.2
		66.3	0.2	61.4	0.2
								三聚物		70.8	0.2	64.2	0.0
Leu-Tyr-Leu	2.90	44.7	0.1	40.8	0.0	47.9	44.7
									0.97	51.6	0.1	49.1	0.1
	0.32	58.4	0.1	55.4	0.3
								Leu-Phe-Leu	6.10	41.5	0.2	39.3	0.0	48.3	46.2
	2.03	48.3	0	46.2	0.1
									0.68	54.7	0.1	53.6	0.1
Leu-3	6.10	42.4	0	38.9	0.2	49.7	46.3
									2.03	49.7	0	46.3	0.3
	0.68	56.9	0	52.8	0.6
								Leu-Leu-Ala	6.80	39.9	0.5	48.4	0.2	46.6	49.8
	2.27	43.5	0.8	48.2	4.3
									0.76	60.7	0.4	58.3	0.5
Ala-Val-Leu	8.70	55.7	0.2	53.8	0.0	65	58.9
									2.90	62.8	0.5	57.7	0.2
	0.97	67.5	0.5	60.3	0.1

从以上结果可以看出，当表面活性的二聚物和三聚物以较高的浓度存在时，其对于降低水的表面张力更有效。例如，三亮氨酸以浓度1.20mg/ml存在时，有效地将水的表面张力从约72mN/m降至42mN/m，而在浓度为0.68mg/ml时，三亮氨酸能够有效地将水的表面张力降至约57mN/m。

为将浓度效应标准化，将表面张力值外推至浓度为2mg/ml的溶液(表5，第7和第8栏)。首先看二聚物，二亮氨酸在降低水的表面张力方面比受测的任何其它的二聚物都有效。看一下三聚物的数据，Leu-Tyr-Leu是表面活性最强的三聚物。除含有两个亮氨酰残基以外，还含有一个疏水性氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或丙氨酸的三聚物比含有两个以下的亮氨酰残基的三聚物的表面活性更强。

总之，含有两个或两个以上亮氨酸的二聚物和三聚物(例如，leu-try-ala、leu-phe-leu、leu-leu-leu、leu-leu-ala等等)在显著降低水的表面张力方面是有效的，并优选将其用于本发明组合物。

实施例2

甲状旁腺激素(PTH)-三亮氨酸干粉的气雾剂性能

制备含有示例性的甲状旁腺激素活性蛋白质并加入亮氨酸或三亮氨酸的干粉。还制备了不含亮氨酸或三亮氨酸的干粉，用来验证加入三亮氨酸时气雾剂性能产生的显著的改进。

按照下述方法制备典型的PTH粉末。

A.制备溶液制剂

制备总固含量为1％(重量/体积)的含水制剂溶液。测定了每种溶液的pH值，然后喷雾干燥溶液。表6列出了喷雾干燥前的PTH溶液的组成。

B.粉末处理：喷雾干燥

使用一台带有一个专用喷嘴(Platz，R.等人发明的，InhaleTherapeutic Systems的国际专利公布WO 97/41833，1997年11月13日)和旋风分离器的Buchi 190微型喷雾干燥机(Buchi Labortechnik AG，Meierseggstrasse，Switzerland)通过喷雾干燥上述A中所述的PTH水溶液制备粉末。获得了较高的收集效率(收率)，通常为约50-80％。

表6.PTH干粉的组成

批号	组成	释放剂量，％平均值，n＝10	RSD，％	MMAD(μm)	FPD
						R97190	30％PTH70％甘露醇	62	4	-	-
	30％PTH70％棉子糖	66	9	-	-
						R97191	75％PTH25％甘露醇	51	3	-	-
	30％PTH70％leu	78	-	2.43	0.58
							30％PTH70％三亮氨酸	83	-	2.63	0.45

从表6(以及其它表格)的结果可以看出，加入三亮氨酸能够有效地、显著地改进所得粉末的气雾剂性能。通过向制剂中加入三亮氨酸，由ED值表征的PTH干粉的气雾剂性能意外地从51-62％上升至83％。这些数据说明仅通过向制剂中加入典型的具有表面活性的三亮氨酸三肽就能够实现释放剂量的大幅提高。奇怪地是，甚至在根据三亮氨酸中所含氨基酸数量(每摩尔三亮氨酸含有3摩尔leu)进行摩尔-摩尔校正后，在增大干粉组合物的分散性以输送至肺部方面，每单位重量的三亮氨酸也比亮氨酸更有效。

实施例3

沙丁醇胺-三亮氨酸干粉的气雾剂性能

制备含有小分子沙丁醇胺的干粉以检验三亮氨酸对含有非蛋白质活性剂的干粉的分散性/气雾剂性能的影响。

制备溶液制剂

制备总固含量为1％(重量/体积)的制剂溶液。对于固含量低的溶液，向其中加入棉子糖，使其总固含量达到上述值。表7列出了所有喷雾干燥前的溶液的组成。

粉末处理：喷雾干燥

使用一台如上面的实施例2所述的Buchi 190微型喷雾干燥机(Buchi Labortechnik AG，Meierseggstrasse，Switzerland)，通过喷雾干燥沙丁醇胺、表面活性的二肽或三肽和/或其它赋形剂的水溶液制备干粉。所得的粉末的特性列在下表7和表8中

表7.沙丁醇胺干粉

制剂	释放剂量，％	Tg，℃
			2％沙丁醇胺98％棉子糖	31	102.2
2％沙丁醇胺5％亮氨酸棉子糖	31	88.57
			2％沙丁醇胺20％亮氨酸棉子糖	34	93.1
2％沙丁醇胺60％亮氨酸棉子糖	74	96.6
			2％沙丁醇胺5％三亮氨酸棉子糖	62	85.3
2％沙丁醇胺20％三亮氨酸棉子糖	78	95.9
			2％沙丁醇胺60％三亮氨酸棉子糖	82	88.6

表8.沙丁醇胺干粉的其它气雾剂性能

制剂	FPD	MMAD，微米
			2％沙丁醇胺60％亮氨酸棉子糖	0.56	2.43
2％沙丁醇胺20％三亮氨酸棉子糖	0.59	2.43

从上面的结果可以看出，添加三亮氨酸将沙丁醇胺干粉的释放剂量从约30％增至约80％，分散性几乎增大了三倍。因此，向活性剂干粉中添加具有表面活性的二肽或三肽能够大幅增进粉末的分散性，能够(i)减少昂贵的药物在吸入装置中的损失，(ii)通过增加雾化的药物到达患者肺泡的量而减少每天所需的吸入次数，(iii)由于干粉的雾化效率高，减少每单位剂量的干粉的量，和(iv)由于粉末的流动性增大，使粉末状药物的单位剂型的制备更容易。

另外，为取得与仅添加20重量％的三亮氨酸所获得的相同水平的分散性，需要添加60重量％的亮氨酸。因此，在增进干粉的气雾剂性能方面，三亮氨酸比亮氨酸有效得多。而且，通过仅添加约5-25重量％的三亮氨酸通常就能够获得最佳气雾剂性能；该添加量大于通常仅能够增大分散性的量。

由本文给出的实施例可以看出，三亮氨酸和其它表面活性的二肽和三肽增强可分散性的效果看来具有普遍性，且这种效果对蛋白质粉末和多种活性剂(例如，小分子、激素、抗生素等等)的粉末制剂都存在。

实施例4

鲑鱼降钙素-三亮氨酸干粉的气雾剂性能

考查了三亮氨酸对含有分子量约为4500道尔顿的激素一鲑鱼降钙素的干粉的气雾剂性能的影响。

尽管鲑鱼降钙素是表面活性很高的蛋白质，但喷雾干燥的含有5重量％鲑鱼降钙素和95重量％棉子糖的粉末却表面出相对低的释放剂量值(约50％)。在为进一步探究向粉末制剂中添加表面活性二肽和三肽以增大其分散性的广泛适用性而进行的工作中，向含有鲑鱼降钙素的制剂中加入三亮氨酸以考查其对所得粉末的影响。将三亮氨酸增进含有鲑鱼降钙素的干粉的可分散性的能力与亮氨酸氨基酸进行比较。

按照上面的实施例2和3中描述的方法制备具有以下组成的粉末。

表9.S.降钙素干粉

制剂	释放剂量	FPD	Tg，℃
				5％S.降钙素95％棉子糖	48	0.30	89.9
5％S.降钙素5％亮氨酸棉子糖	47	0.31	89.3
				5％S降钙素20％亮氨酸棉子糖	50	0.28	82.9
5％S.降钙素40％亮氨酸棉子糖	48	0.29	82.3
				5％S.降钙素60％亮氨酸棉子糖	53	0.22	80.5
5％S.降钙素80％亮氨酸棉子糖	64	0.29	74.5
				5％S.降钙素5％三亮氨酸棉子糖	58	0.46	89
5％S.降钙素20％三亮氨酸棉子糖	72	0.50	91.1
				5％S.降钙素40％三亮氨酸棉子糖	76	0.46	83.4
5％S.降钙素60％三亮氨酸棉子糖	84	0.49	94.3
				5％S.降钙素80％三亮氨酸棉子糖	86	0.49	115.2

测定了两个制剂的典型的物质平均空气动力学直径。

表10.降钙素粉末的物质平均空气动力学直径

制剂	MMAD
		5％S.降钙素20％亮氨酸棉子糖	3.39
5％S.降钙素20％三亮氨酸棉子糖	2.87

从以上的数据可看出，三亮氨酸可用来改进雾化输送至肺部的多种活性剂/药物的干粉制剂的气雾剂性能。

三亮氨酸几乎使含有鲑鱼降钙素和棉子糖的对照粉末的释放剂量值提高了100％，从48％升至86％，几乎使其ED值加倍。此外，三亮氨酸在增强粉末的分散性方面比亮氨酸更有效。一种含有80重量％亮氨酸的典型制剂的ED值为64％，而含有60-80重量％三亮氨酸的制剂的ED值为84-86％，这进一步说明在显著增强干粉的气雾剂性能方面三亮氨酸比亮氨酸更有优越性。

实施例5

抗生素-三亮氨酸干粉的气雾剂性能

研究了三亮氨酸增进含有抗生素的干粉的分散性的能力。

不含有三亮氨酸的抗生素对照粉末

环丙氟哌酸粉末。制备总固含量为1％(重量/体积)的含有表9所示组分的水溶液。测定了每种溶液的pH值，然后按照实施例2所述将溶液喷雾干燥制备干粉。

表11.

批    号	喷雾干燥前的定量组成	水分含量	MMAD(μm)	释放剂量
					(1)1326-16	盐酸环丙氟哌酸  1136mg去离子水       113ml固体产物：    100％环丙氟哌酸	1.4％	2.8	42％(RSD＝8)
(2)1326-29	盐酸环丙氟哌酸 2047mg去离子水      200ml氢氧化钠 适量至pH＝12固体产物：   100％环丙氟哌酸	3.2％	4.5	51％(RSD＝7)
					(3)1300-MG-7	盐酸环丙氟哌酸 1995mg甲醇         100ml去离子水     100ml固体产物：   100％环丙氟哌酸	1.2％	2.9	33％(RSD＝13)

庆大霉素、奈替米星粉末

通过将硫酸庆大霉素或硫酸奈替米星和赋形剂(如果使用)与一种液体介质混合形成溶液，制备含有庆大霉素或奈替米星的干粉组合物。按照需要调节溶液的pH以促进溶液中的组分的溶解和/或稳定。下表12中列出了定量的制剂。然后按照上面的实施例2所述将溶液喷雾干燥制备干粉。对于使用有机溶液的制剂，使用一台改进型Buchi190微型喷雾干粉器，其使用氮气作为气体源，并装备了一个氧气传感器和其它安全设备以将***的可能性降至最低。

表12.庆大霉素/奈替米星干粉

批  号	定量组成	水分含量	MMAD(μm)	释放剂量
					1326-31	硫酸庆大霉素  2076mg去离子水      200ml盐酶      适量至pH＝5	4.1％1	3.0	37％(RSD3＝6)
1326-32	硫酸庆大霉素  2053mg去离子水      200ml氢氧化钠   适量至pH＝10	1.1％1	2.4	40％(RSD＝14)
					1300-MG-11	硫酸庆大霉素  2012mg乙醇          40ml去离子水      160ml	4.8％2	3.0	45％(RSD＝10)
1300-MG-9	硫酸奈替米星  1626mg去离子水      163ml	4.2％	3.2	47％(RSD＝8)
					1300-MG-14	硫酸奈替米星    1512mg乙醇          30ml去离子水      120ml	5.1％	2.9	39％(RSD＝7)

¹用卡尔-费休试剂滴定法测定

²通过热重分析测定

³相对标准偏差

含有三亮氨酸的抗生素粉末

制备含有抗生素和三亮氨酸、总固含量为1％的水溶液(总体积100ml)，并将溶液的pH调至4。然后喷雾干燥所得的溶液，制备具有如下表13所示的抗生素和三亮氨酸相对量的粉末。

表13.

制  剂	收率，％	MMAD，μm	FPD(＜3.3μm)	ED，％
					95％Cipro(环丙氟哌酸)5％Leu-3	64.2	2.43	0.57	77.7
75％Cipro25％Leu-3	N.A.	2.65	N.A.	83.0
					45％Cipro55％Leu-3	55.0	2.62	0.48	70.7
95％Gent.(庆大霉素)5％Leu-3	61.4	2.15	0.66	75.7
					75％Gent.25％Leu-3	52.0	2.25	0.66	93.9
55％Gent.45％Leu-3	54.2	2.51	0.51	87.3
					95％Netil.(奈替米星)5％Leu-3	62.0	2.08	0.58	82.4
75％Netil25％Leu-3	50.0	2.14	0.66	91.3
					55％Netil.45％Leu-3	40.0	2.73	0.49	90.4

从表13的结果可以看出，添加三亮氨酸对于显著增强粉末的分散性是有效的，所述的粉末是由分属两种抗生素类型的三种不同的抗生素化合物制备的，即环丙氟哌酸(喹诺酮类)，庆大霉素和奈替米星(氨基糖苷类)。环丙氟哌酸粉末的ED值从33-51％的范围升至71-83％的范围。对庆大霉素粉末可以观察到类似的有利效果，通过添加三亮氨酸，其ED值从37-45％升至76-94％，而对于奈替米星，其ED值从39-47％升至82-91％。测定对三种抗生素粉末的最佳三亮氨酸相对量为约25％，即，在相对抗生素含有25重量％的三亮氨酸的抗生素粉末中观察到了最佳ED值。

实施例6

含有β-干扰素和三亮氨酸的粉末的气雾剂性能

进一步研究了在β-干扰素粉末中使用具有表面活性的二肽和三肽以增强粉末分散性的广泛适用性。β-干扰素(I型干扰素)为具有抗菌、抗增殖和免疫调节活性的细胞因子。

按照上面的描述制备含有β-干扰素和选择性的三亮氨酸和/或其它赋形剂(羟乙基淀粉、HES和棉子糖)的粉末。干燥前的溶液的固含量为1％，例外情况是批号RB27，其固含量为0.5％。最终粉末的组成见下表14。

表14.含有三亮氨酸的β-干扰素粉末

批号	组成	ED，％平均值(n＝10)	RSD，％	MMAD，μm	FPD，％	收率，％	＜5μm的比例，％
								RB19	10％IFN-β(β-干扰素)45％Leu-345％HES	81	7	3.2	48	56	79
RB21	10％IFN-β45％Leu-345％Raff.(棉子糖)	80	6	2.9	46	61	85
								RB24	10％IFN-β90％Leu-3	-	-	-	-	9*	-
RB27	10％IFN-β67.5％Leu-322.5％Raff.	74	4	2.9	49	40	81
								RB29	10％IFN-β45％Leu-345％HES	79	5	3.2	41	50	83
RB36	10％IFN-β22.5％Leu-367.5％Raff.	87	3	-	-	61	-
								99320	10％IFN-β90％Raff.	64	-	-	-	-	-

^*由于收率低，没有进行试验

与含有其它活性剂的粉末一样，向由β-干扰素组成的粉末中添加三亮氨酸用来增加所得粉末的分散性和总的气雾剂性能。尽管改进并没有某些前面的实施例那么显著，但添加三亮氨酸将β-干扰素的ED值从64％升至74-87％。与前面的实施例一样，看来对于β-干扰素粉末，三亮氨酸的最佳量约为22-25重量％。

实施例7

因子IX干粉

为进一步研究三亮氨酸和其它具有表面活性的二肽和三肽对不同药物的增强分散效果，制备了含有因子IX、三亮氨酸和/或其它赋形剂的粉末，因子IX用于治疗血友病B，其为一种55,000道尔顿的糖蛋白，具有模块域结构和多个转译后的变体。

按照前述的方法制备含有因子IX的粉末，粉末中可含有或不含有亮氨酸或含有亮氨酸的二聚物或三聚物。喷雾干燥前的溶液的固含量为1重量％(重量/体积)。喷雾干燥的粉末的收率范围为40-60％。干粉制剂见下表15。

表15.因子IX粉末

制    剂	释放剂量(RSD)	MMAD
			93％因子IX/7％柠檬酸钠	57(5％)	-
37％因子IX/3％柠檬酸钠/60％亮氨酸	78(3％)	2.9
			56％因子IX/4％柠檬酸钠/40％三亮氨酸	89(5％)	2.7

表15的结果进一步证明了三亮氨酸对于显著增大干粉组合物的分散性的有效性，而不论组合物中含有何种活性剂。此外，与前面的实施例一样，在显著增大组合物的分散性(ED从57％增至89％)方面，三亮氨酸比亮氨酸更有效，且当三亮氨酸的用量比亮氨酸低时，也能取得这样的增进。

实施例8

稳定性研究

以在初始和3个月的时间点之间测得的蛋白质浓度和气雾剂性能的变化为基础，评价已包装的PTH粉末在加速稳定性条件下的化学和物理稳定性。按照上面的实施例2制备PTH-三亮氨酸和PTH-亮氨酸粉末。

通过手工将粉末装在泡罩包装(BPs)中。将泡罩包装置于皮氏培养皿中(20-60BPs/皿)。

表16.40℃/环境相对湿度条件下的加速稳定性研究

制剂编号组  成	包装的储存条件无第二包装无干燥剂40℃/环境RH	％纯度(面积)	％释放剂量(rsd)	细粒子剂量(FPD)＜3.3μm	MMAD(μm)	％重量变化(TGA)
							R9948430％PTH/70％亮氨酸	初始	97.0	79.6(3)	0.58	2.5	1.4
4周	n/a	74.9(5)	n/a	n/a	1.7
						6周		n/a	75.2(6)	n/a	n/a	n/a
8周	95.2*	78.8(6)	0.55	2.4	2.2
						12周		n/a	78.6(3)	n/a	n/a	TBD
R9948530％PTH/70％三亮氨酸	初始	97.1	79.4	0.45	2.9								2.6
						4周	n/a	75.8	n/a	n/a	2.4
	6周	n/a	81.6	n/a	n/a							n/a
						8周	94.8	81.6	0.44	2.9	2.4
	12周	n/a	在BP之外	n/a	在BP之外							在BP之外

^*30％PTH/70％甘露醇制剂的40℃/环境RH样品在8周时的化学稳定性与40℃/干燥样品(加入干燥剂的箔包装)在6个月时的化学稳定性类似。

从表16的结果可以看出，即使在环境温度以上的温度下储存时，含有亮氨酸的制剂也具有化学和物理稳定性。特别地，在3个月的期间，30％PTH/70％三亮氨酸粉末的蛋白质降解最少，而该粉末的气雾剂性能基本保持不变。

实施例9

粉末制剂的化学分析电子光谱(ESCA)

对某些粉末制剂进行ESCA分析以研究粒子中的二亮氨酰二肽或三肽的表面富集。在“制剂”栏中列出了散装粉末中的粉末组分的相对浓度；在“ESCA结果”栏中列出了由ESCA测定的粒子表面上每种组分的浓度。

表17.pH为7的Scal(鲑鱼降钙素)/棉子糖/Leu制剂

批号		制剂(％重量/重量)	ESCA结果(％重量/重量)
				R99282	sCal	5	53
pH7	亮氨酸	0
					棉子糖	95	47
				R99283	sCal	5	11
pH7	亮氨酸	5	52
					棉子糖	90	38
			R99284		sCal	5	39
pH7	亮氨酸	20		28
					棉子糖	75	33
			R99286pH7		sCal	5	26
亮氨酸	80	64
				棉子糖	15	9

表18.亮氨酰肽/棉子糖制剂

批号		制剂(％重量/重量)	ESCA结果(％重量/重量)
				R99337	亮氨酸-2	5	28.7
pH7	棉子糖	95	71.3
R99338	亮氨酸-2	20	44.4
				pH7	棉子糖	80	55.9
				R99339	亮氨酸-2	60	94.9
pH7	棉子糖	40	5.1
R99340	亮氨酸-3	20	97.1
				pH7	棉子糖	80	2.9
				R99342	丙氨酸-3	20	41.3
pH7	棉子糖	80	58.7

表19.pH为4的Scal/棉子糖/Leu-3制剂

批号		制剂(％重量/重量)	ESCA结果(％重量/重量)
				R99435pH4	SCal	5	36.6
亮氨酸-3	0	0
			棉子糖		95	63.4
			R99436		Scal	5	17.9
pH4	亮氨酸-3	5		7.0
					棉子糖	90	75.1
				R99437	Scal	5	46.4
pH4	亮氨酸-3	20	24.2
					棉子糖	75	29.4
			R99438pH4		Scal	5	22.7
亮氨酸-3	40	74.8
				棉子糖	55	2.5
				R99439pH4	SCal	5	16.4
亮氨酸-3	60	81.6
			棉子糖		35	2.0

以上结果表明表面活性物质的浓度在含有表面活性物质的粉末的表面上富化。对表18中不含活性剂的粉末和表19中的S.降钙素粉末，都能够观察到二亮氨酸或三亮氨酸的表面富集。

尽管降钙素粉末的ESCA结果具有某种程度的可变性(这是由难于区分在结构中含有相同原子的组分，即降钙素和三亮氨酸对表面浓度的贡献所致)，但所观察到的总的趋势支持对粉末的发现，即在粉末中二亮氨酰二肽或三肽的表面浓度比其在粉末主体中的浓度高。

Claims (40)

1.一种干粉组合物，其含有活性剂和含有至少两个亮氨酸的二肽或三肽。

2.权利要求1所要求的干粉组合物，其中所述的组合物适于通过吸入输送至肺部或深肺部。

3.权利要求1所要求的组合物，其含有干粉粒子，其中所述的二肽或三肽在粒子表面上的浓度大于在粉末主体中的浓度。

4.权利要求1所要求的组合物，其中所述的二肽或三肽以有效地将组合物的释放剂量增至超过不含有所述二肽或三肽的组合物的释放剂量的量存在。

5.权利要求1所要求的组合物，其含有约1重量％至约99重量％的二肽或三肽。

6.权利要求5所要求的组合物，其含有约5重量％至约75重量％的二肽或三肽。

7.权利要求6所要求的组合物，其含有约5重量％至约50重量％的二肽或三肽。

8.权利要求1所要求的组合物，其进一步含有可药用的赋形剂或载体。

9.权利要求8所要求的组合物，其中所述的赋形剂选自由碳水化合物、氨基酸、肽、蛋白质、有机酸盐和聚合物组成的组。

10.权利要求1所要求的组合物，其特征在于释放剂量至少为约30％。

11.权利要求1所要求的组合物，其特征在于释放剂量至少为约45％。

12.权利要求1所要求的组合物，其含有二肽，其中所述的二肽为二亮氨酸。

13.权利要求1所要求的组合物，其含有包含两个亮氨酸和一个选自由亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)、异亮氨酸(isoleu)、色氨酸(try)、丙氨酸(ala)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、组氨酸(his)和脯氨酸(pro)组成的组的三肽的氨基酸。

14.权利要求13所要求的组合物，其中所述的三肽为三亮氨酸。

15.权利要求1所要求的组合物，其含有MMD小于约10微米的粒子。

16.权利要求1所要求的组合物，其含有MMD小于约4.0微米的粒子。

17.权利要求1所要求的组合物，其含有MMAD小于约10微米的粒子。

18.权利要求1所要求的组合物，其含有MMAD小于约4微米的粒子。

19.权利要求1所要求的组合物，其中所述的二肽或三肽的玻璃化转变温度高于约40℃。

20.权利要求1所要求的干粉组合物，其在一定的期间内具有稳定的分散性，其特征在于当在环境条件下将所述的组合物储存3个月时间时，其释放剂量下降不超过约10％。

21.权利要求1所要求的干粉组合物，其在一定的期间内具有化学稳定性，其特征在于当在环境条件下将所述的组合物储存3个月时间时，其活性剂的降解低于约5％。

22.权利要求1所要求的干粉组合物，其中所述的活性剂选自由胰岛素、环孢菌素、甲状旁腺激素、卵泡促激素、VLA-4抑制剂、白介素-4R、血小板生成素、c-肽、糊精、胰岛素原、白介素-1、白介素-2、α-1抗胰蛋白酶、布***、人生长激素、生长激素释放因子、α-干扰素、β-干扰素、生长集落刺激因子、角质形成细胞生长因子、胶质细胞生长因子、肿瘤坏死因子、促黄体激素释放激素、降钙素、低分子量肝素、促生长素抑制素、呼吸道合胞病毒抗体、***、因子VIII、因子IX、ceredase、葡糖脑苷脂酶及其类似物、激动剂和拮抗剂组成的组。

23.权利要求1所要求的干粉组合物，其含有堆积密度为0.1-10克/立方厘米的粒子。

24.权利要求23所要求的干粉组合物，其含有堆积密度为0.5-2.0克/立方厘米的粒子。

25.一种用于增强干粉的气雾剂性能的方法，所述的方法包括：

向含有活性剂的液体制剂中加入含有至少两个亮氨酸的二肽或三肽，和

干燥所述的液体制剂，以制备一种含有所述的活性剂和所述的二肽或三肽的干粉，

如此获得的干粉具有比含有相同组分但不含所述二肽或三肽的干粉的释放剂量增大的释放剂量。

26.权利要求25所要求的方法，其中所述的加入步骤包括加入二肽，其中所述的二肽为二亮氨酸。

27.权利要求25所要求的方法，其中所述的加入步骤包括加入含有两个亮氨酸和一个选自由亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)、异亮氨酸(isoleu)、色氨酸(try)、丙氨酸(ala)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、组氨酸(his)和脯氨酸(pro)组成的组的三肽的氨基酸。

28.权利要求25所要求的方法，其中所述的液体制剂为含水制剂。

29.权利要求25所要求的方法，其中还在所述的液体制剂中合入了可药用的赋形剂或载体。

30.权利要求25所要求的方法，其中所述的干燥步骤选自由喷雾干燥、冷冻干燥和喷雾冷冻干燥所组成的组。

31.权利要求25所要求的方法，其中干粉的释放剂量比含有相同组分但不含所述的二肽或三肽的干粉高出至少约5％。

32.权利要求31所要求的方法，其中干粉的释放剂量比含有相同组分但不含所述的二肽或三肽的干粉高出至少约10％。

33.权利要求25所要求的方法，其中所述的干粉的特征是释放剂量为至少约30％。

34.权利要求25所要求的方法，其中所述的活性剂选自由胰岛素、环孢菌素、甲状旁腺激素、卵泡促激素、VLA-4抑制剂、白介素-4R、血小板生成素、c-肽、糊精、胰岛素原、白介素-1、白介素-2、α-1抗胰蛋白酶、布***、人生长激素、生长激素释放因子、α-干扰素、β-干扰素、生长集落刺激因子、角质形成细胞生长因子、胶质细胞生长因子、肿瘤坏死因子、促黄体激素释放激素、降钙素、低分子量肝素、促生长素抑制素、呼吸道合胞病毒抗体、***、因子VIII、因子IX、ceredase、葡糖脑苷脂酶及其类似物、激动剂和拮抗剂组成的组。

35.一种用于增强含有活性剂的、适于向肺部给用的制剂的气雾剂性能的方法，所述的方法包括：

将一种含有至少两个亮氨酸的二肽或三肽合入到一种含有活性剂的制剂中，从而形成一种含有所述的活性剂和所述的二肽或三肽的组合物，

由于所述的合入步骤，所述组合物的释放剂量比含有相同组分但不含所述的二肽或三肽的组合物的释放剂量高。

36.权利要求35所要求的方法，其中所述的组合物为适于向肺部雾化给用的液体组合物。

37.权利要求35所要求的组合物，其中所述的组合物为适于向肺部雾化给用的干燥的组合物。

38.权利要求35所要求的方法，其中所述的三肽含有两个亮氨酸和一个选自由亮氨酸(leu)、缬氨酸(val)、异亮氨酸(isoleu)、色氨酸(try)、丙氨酸(ala)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、组氨酸(his)和脯氨酸(pro)组成的组的氨基酸。

39.一种用于将一种干粉组合物输送至哺乳动物患者的肺部的方法，所述的方法包括通过吸入给用雾化形式的权利要求1所要求的干粉组合物。

40.一种用于将一种含有活性剂的制剂输送至哺乳动物患者肺部的方法，所述的方法包括通过吸入给用通过权利要求36所要求的方法制备的液体组合物。