KR101342485B1

KR101342485B1 - 트리펩타이드 및 이를 함유하는 노화방지, 주름개선, 미백 및 항염효능의 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101342485B1
Application number: KR1020120021032A
Authority: KR
Inventors: 이윤섭; 최혜정; 최하영; 김명옥
Original assignee: 미원상사주식회사
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2013-12-17
Also published as: KR20130099480A; WO2013129801A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 트리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선, 미백, 항염용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 트리펩타이드는 콜라겐 분해효소인 MMPs생성 억제, 콜라겐 생합성 증진효과로 인한 주름 개선효과와 더불어 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성을 억제 함으로써 피부 색소 침착현상을 방지하는 등의 미백 효과 및 염증 억제 효과를 나타냄으로써 주름, 미백 및 염증개선에 탁월한 효능을 갖는 화장료를 제공한다. 특히, 상기 주름개선 및 미백용의 트리펩타이드는 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태 등의 다양한 기초 화장료 조성물에 첨가하여 사용할 수 있으며 피부자극이 없고 피부안정성도 우수한 특징을 갖는다.
화학식 1
R¹-X-Leu-Phe
(상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1 중의 X로 표시되는 부분은 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며, C-말단은 카르복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)

Description

트리펩타이드 및 이를 함유하는 노화방지, 주름개선, 미백 및 항염효능의 화장료 조성물{Anti-aging, anti-wrinkle, whitening and anti-inflammatory tripeptide and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 트리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선, 미백, 항염용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 본 발명은 노화방지 및 주름 개선용 화장품 적용에 가장 중요한 요소인 콜라겐 분해 효소의 합성 및 발현 억제와 콜라겐 생합성에 우수한 효과를 보일 뿐 아니라 미백 화장품 적용에 중요한 요소인 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성을 효과적으로 저해하고 자외선에 의해 증가하는 싸이토카인을 감소시킴으로써 노화방지, 주름 개선, 미백 및 항염효능을 가지는 신규한 트리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화는 유전적, 환경적 노출(UV 조사, 기계적인 충격), 호르몬 변화, 대사적 과정(활성산소종, 당, 알데하이드와 같은 반응성이 큰 화합물)에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인들은 피부의 구조, 기능, 겉모습의 축적된 변화를 초래한다. 인간의 피부 노화는 크게 생물학적 과정에 따라 시간이 지나면서 나타나는 내적 노화와 지속적인 빛 노출, 스트레스, 흡연 등과 같은 환경에 의한 외적 노화(광노화)로 구분된다. 임상학적으로 내적 노화된 피부에서는 얇고 건조하고 창백하며 탄성을 잃고 많은 잔주름을 띄는 특징을 지니는 반면 빛, 흡연 등 외적 환경에 의해 노화가 진행된 피부의 경우 깊은 주름, 반점의 착색과 거친 피부가 관찰되는 등 피부에 더 큰 영향을 가하게 된다. 비록 연대학적으로 나이든 피부와 광노화된 피부는 형태학적 조직학적으로 차이가 있어 외관이 확연히 구분되지만 최근 연구 결과들에 의하면 두 노화들이 모두 콜라겐 분해효소(MMPs)의 발현 촉진, 프로콜라겐의 합성 감소, 결합조직의 손상과 같은 신호전달 경로를 포함한 중요한 분자적 특징을 공유한다고 보고 되어 있다. 환경에 의한 영향은 내적인 요인보다 피부에 미적 질이나 조직에 더욱 더 명백한 변이를 주는데, 가장 치명적인 외부적 요인은 UV 조사이다. 이러한 분자적 메커니즘의 일치는 UV 조사가 인간 피부의 연대학적 나이에 의한 노화의 중요 측면들을 가속화하는 것으로 여겨진다.

피부에 손상을 가하는 환경적 요인 중에서 가장 피부에 유해한 요소인 자외선은 전자기파 스펙트럼에서 200nm 와 400nm 사이의 파장대를 말하며, 파장의 길이에 따라 UVA(320-400 nm), UVB(280-320nm) 와 UVC(200-280nm)로 나누어 진다. UVC는 오존층에 의해 차단되기 때문에 인간 피부에 해롭게 작용하는 태양복사는 UVA와 UVB이다. UVA 복사는 UVB 복사보다 덜 강하지만 피부 침투성이 높은 특징을 가지고 있고 UVA에 의한 피부 손상은 선번(sunburn), 암, 피부노화 등이 알려져 있다. 인간의 건강과 관련하여 가장 위험한 환경적 발암 인자로 알려져 있는 UVB 복사는 홍반과 선번(sunburn) 이외에도 유전자 손상과 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 광노화에 의해 손상된 피부의 가장 큰 변화는 피부의 깊은 부분인 진피에서 일어나며 연결 조직의 분해, 콜라겐 함량의 감소와 변형된 엘라스틱 섬유의 축적을 유발한다.

조직학적 관점에서 피부노화는 피부의 진피에서 메트릭스를 형성하는 세포 외 조직(Extracellular matrix proteins) 조성의 변화로 나타난다. 진피 세포 외 조직 중 콜라겐 단백질들은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부 노화와 주름형성에 밀접한 관련이 있다. 건강한 진피의 주요 가교 구성 성분들은 타입Ⅰ 콜라겐과 타입Ⅲ 콜라겐이다. 하지만 광노화에 의해 손상된 피부에서는 이 두 콜라겐의 전구체가 확연히 감소하였고 이들의 감소가 임상학적 심각성과 연관되어 있다. 콜라겐의 분해는 노화가 진행되면서 분해되기도 하나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가하면서 콜라겐 합성이 감소하게 되어 주름이 형성된다. 콜라겐 분해효소들(MMPs)은 아연-의존적인 세포 내 단백분해 효소로 진피의 세포 외 구조의 성분들을 분해시키거나 재구조화시킬 수 있는 물질로서 그 중 MMP-1은 진피의 콜라겐에 작용하여 분절시킨다. 따라서 이 효소의 합성 양과 활성도의 조절이 주름에 중요한 요인으로 작용한다.

피부 주름 개선 물질로 가장 대표적인 것이 레티놀(Retinol)과 레티노이드라고 명명되는 그 유도체들로써 건선, 노화, 암, 여드름 등 다방면에서 좋은 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 또한 이 레티노이드는 피부에 도포하였을 때 콜라겐분해효소(MMP-1)를 저해함으로서 콜라겐의 손실을 방지하고 콜라겐 형성을 자극함으로써 내인성 및 광노화를 방지하고 회복시키는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 효과에도 불구하고 피부에 도포하였을 때 홍반, 가려움, 건선, scaling 등의 국소적 피부자극 반응을 일으킨다고 알려져 있다. 따라서 생체에 안전하고 기존의 물질보다 콜라겐분해효소(MMP-1)를 억제하고 콜라겐 합성능이 좋은 새로운 주름개선 물질 개발이 요구되고 있다.

UV 조사에 의한 피부의 손상은 주름 형성뿐만 아니라 염증반응도 일으키는 것으로 알려져 있다. 피부 손상과 관련된 생물학적 메커니즘에 의해 피부는 Interleukin-1a(IL-1a), Interleukin-1b(IL-1b), Interleukin 6(IL-6)을 포함한 수많은 싸이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있다. 만성적인 염증과 여러 암 생성의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 케라티노사이트는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다. 가장 주요한 외부자극 중 하나는 UVB 조사이다. UVB 조사는 케라티노사이트가 tumour necrosis factor- α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1 β), IL-6, IL-10 와 IL-8을 세포 외로 분비하도록 자극한다. 태양광에 노출된 피부에서 이러한 싸이토카인들의 분비는 지속적인 염증반응을 촉진시킨다. 따라서 UV자극에 의해 손상되는 피부 노화와 더불어 지속적인 싸이토카인들에 의한 염증반응을 억제하는 물질의 개발이 요구되고 있다.

피부의 색소 침착은 호르몬, 유전적 영향, 화장품, 간의 손상, 약물, 임신, 자외선 조사 등에 의해 나타날 수 있으나 이 중 가장 영향력 있게 작용하는 것이 자외선 조사에 의해 형성된 멜라닌의 축적이다. 멜라닌이라고 알려진 어두운 색소는 피부 표피의 가장 안쪽에 있는 멜라노사이트 세포내에 멜라노좀이라고 하는 특정 소기관에서 생합성 되는데 이 멜라노좀에는 멜라닌 생합성 효소인 티로시나제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 가 존재한다. 멜라닌 생합성 기작은 티로시나제라고 불리는 효소에 의해 멜라노사이트 세포안에 존재하는 L-타이로신의 산화에 의해 시작된다. L-타이로신의 수산화 반응에 의해 DOPA(3,4-다이하이드록시페닐알라닌)를 생성시키고 이것이 다시 반응성이 큰 도파퀴논(Dopaquinone)으로 변하면서, 피부 색소 침착 현상의 원인이 되며 미적으로 문제가 되는 멜라닌을 형성하는 여러 단계의 복잡한 반응들이 자동적으로 이루어진다. 티로시나제는 흑갈색의 유멜라닌과 적색의 페오멜라닌의 합성에 중요한 효소로 소포체의 멜라노소멀 리보좀에서 합성되고 골지체에서 글리코실화 된 후 멜라노좀에 비활성상태로 소낭에 싸여 운반된다. 생성된 멜라닌 색소는 멜라노사이트에서 표피를 구성하고 있는 케라티노사이트(keratinucyte)로 전이되는데 이 과정에서 과잉 생산된 멜라닌은 피부에 침착되거나 기미, 주근깨 등을 형성하게 된다.

사람들이 나이가 들어가면서 광노화에 의한 피부 색소 침착이 점점 일반화 되어감에 따라 소비자들이 이를 해결하기 위한 요구가 증가하고 있다. 미백 원료로서 가장 대표적인 것은 하이드로퀴논, 코직엑시드, 알부틴, 아스코빅엑시드 등이 티로시나제 활성을 억제함으로써 미백효과를 갖고 있지만 이들 물질의 피부에 대한 안전성과 안정성, 실질적 효능이 문제가 되고 있다. 하이드로퀴논의 경우 좋은 미백효과를 나타내지만 피부자극을 일으키고 멜라노사이트에 독성을 일으킨다. 코직엑시드는 멜라노사이트의 덴드라이트와 멜라닌 함량을 감소시킬 뿐만 아니라 항산화제로도 작용하여 널리 사용되고 있으나 자극에 의한 피부염을 일으킨다고 알려져 있다.

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이러한 배경하에 본 발명자들은 화합물 트리펩타이드의 노화방지 및 주름 개선, 미백, 항염효과를 확인하기 위하여 피부 섬유아세포종(human skin fibroblst) 세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 콜라겐과 콜라겐 분해효소(MMPs)의 생합성 능력을 검색하였고, 멜라닌생성세포(melanoma) 세포주와 멜라닌자극호르몬을 이용한 in vitro assay계를 확립하여 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제효과능력을 확인하였으며 케라티노사이트(Keratinocyte)와 UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 증가한 싸이토카인들의 감소를 확인함으로써 화합물 트리펩타이드가 주름개선효과, 미백 및 항염에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 본 발명의 목적은 인체에 무해하며 피부침투성이나 안정성이 뛰어난 신규한 트리펩타이드 및 이를 함유하는 노화방지, 주름개선, 미백 및 항염효과를 나타내는 피부 외용약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 트리펩타이드는 하기 화학식 1로 표시된다.

화학식 1

R¹-X-Leu-Phe

(상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1 중의 X로 표시되는 부분은 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며, C-말단은 카르복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)

본 발명은 또한 상기한 트리펩타이드를 유효성분으로 하는 항노화, 주름개선, 미백 및 항염용 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 상기한 트리펩타이드가 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~1% 중량으로 포함되는 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 트리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태 중 어느 하나인 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 피부자극이 없고 피부안정성이 우수한 신규한 트리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1생성 억제, 콜라겐 생합성 증진효과로 인한 주름 개선효과와 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성을 억제함으로써 피부 색소 침착현상을 방지하는 등의 미백 효과 및 염증 억제 효과를 나타냄을 확인하였고, 이에 이것을 주름, 미백 및 염증개선에 탁월한 효능을 갖는 피부 약학 조성물 및 화장료 조성물로 사용하는 것이다.

도 1은 트리펩타이드(A350_4)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도2는 본 발명의 실시예로서 도1에서 확인한 안전한 농도에서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 3은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 생성량의 억제능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 4는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVB 조사에 의헤 증가한 MMP-1 생성량의 억제능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 5는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 감소한 Procollagen1의 합성 증진능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 6은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 MMP-1 mRNA 발현 억제능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 7은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 mRNA 발현 감소능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 8은 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 생성량의 저해능력을 레티닐팔미테이트와 트리펩타이드(A350_4)를 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 9는 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 생성량의 저해능력을 레티놀과 트리펩타이드(A350_4)를 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 10은 본 발명의 실시예로서 지방산 트리펩타이드가 a-MSH 처리 후 증가한 티로시나제 활성을 감소시킨 결과를 나타낸 도표이다.
도 11은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 a-MSH 처리 후 증가한 멜라닌 함량을 감소시킨 결과를 나타낸 도표이다.
도 12는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 a-MSH 처리 후 증가한 cAMP 함량을 감소시킨 결과를 나타낸 도표이다.
도 13은 본 발명의 실시예로서 휴먼 멜라노사이트에서 트리펩타이드(A350_4)의 멜라닌관련 유전자의mRNA 발현 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 14는 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVB 조사에 의해 증가한 IL-1a, IL-1b와 IL- 6 싸이토카인 mRNA 발현 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 15는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 주름 수, 주름 길이, 주름 면적의 감소를 임상실험에서 확인한 결과를 나타낸 도표이다.
도 16은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 주름개선효과를 임상실험에서 영상 이미지를 통해 확인한 결과를 확인한 사진이다.
도 17은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 미백효과를 임상실험에서 L^*값으로 수치화 한 결과를 나타낸 도표이다.
도 18은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 미백효과를 임상실험에서 ITA^*값으로 수치화 한 결과를 나타낸 도표이다.
도 19는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 미백효과를 임상실험에서 영상 이미지를 통해 확인한 결과를 확인한 사진이다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 트리펩타이드를 제공한다.

화학식 1

R¹-X-Leu-Phe

화학식 1에서 표시되는 R¹의 구체적인 예로는 수소 또는 아세틸, 프로파노일, 부타노일, 펜타노일, 헥사노일, 옥타노일, 노나노일, 데카노일, 도데카노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일, 옥타데카노일 등과 같은 아실기가 포함될 수 있다. 특히 R¹은 수소, 아세틸, 옥타노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일 또는 옥타데카노일 중에서 선택되는 것이 바람직하고, R¹이 테트라데카노일, 헥사데카노일 또는 옥타데카노일중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

화학식 1 중의 X로 표시되는 아미노산은 20종의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(phenylglycine) 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 세린(serine), 아스파틱산(aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 발린(valine), 트리오닌(thrionine), 알지닌(arginine), 라이신(lysine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 이소루신(isoleucine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 메타이오닌(methionine), 시스틴(cystein), 트립토판(tryptopane) 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine) , 페닐글리신(phenylglycine) 등이 있으며, 이 중 바람직하게는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 아스파틱산(aspartic acid), 라이신(lysine), 메타이오닌(methionine), 아스파라긴(asparagine), 알지닌(arginine), 티로신(tyrosine) 중에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 글리신(glycine), 루신(leucine), 메타이오닌(methionine)인 경우이다.

화학식 1에 표시되는 트리펩타이드의 아미노산 중 Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 L-Leu와 L-Phe으로 구성된다. 트리펩타이드의C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 선택될 수 있으며, 바람직하게는 카복실산 형태를 가진다.

본 발명에 따른 트리펩타이드는 통상적인 펩타이드 합성기를 사용한 고체상 방법에 의하여 합성될 수 있다. 통상적으로, 사용되는 아미노산은 N-말단이 보호된 형태 그리고 반응성 측쇄가 보호된 형태로 사용된다. N-말단을 보호하는 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)가 일반적으로 사용된다. 반응성 측쇄를 보호하기 위한 보호기로는 트리페닐메틸, 부틸옥시카르보닐, t-부틸에스테르, 펜타메틸크로만-6-술포닐 등이 사용된다. 본 발명에서 사용되는 아미노산은 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)로 N-말단이 보호될 수 있다.

고체상 반응을 위하여 사용되는 수지는 폴리펩타이드의 C-말단의 형태가 카복실산인지 아마이드 형태인지에 따라 다르게 적용한다. C-말단의 형태가 카복실산인 경우는 2-클로로트리틸 클로라이드(2-Chlorotrityl chloride, CTC), 4-벤질옥시벤질알콜(Wang), 하이드록시메틸페녹시아세틸(HMPA) 수지가 사용될 수 있으며, C-말단의 형태가 아마이드인 경우는 수지의 말단이 아민기로 만들어진 것으로서, 예를 들어 트리알콕시벤즈하이드릴아민 (Trialkoxybenzhydrylamine, Rink amide), 메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지가 사용될 수 있다.

위의 모든 수지를 사용함에 있어서 펩타이드는 C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성된다. 커플링시 아미노산의 카르복실기를 활성제로 활성화시키고, 커플링 후 N-말단의 보호기는 피페리딘으로 제거되고, 다음 커플링이 수행된다. 카르복실기 활성제로는 HATU(N-[(dimethylamino-)-1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)가 함께 이용 될 수 있고, N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)와 첨가 보조제로 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 함께 사용될 수 있다. 본 발명에서는 3개의 아미노산이 커플링 된 후에는 N-말단의 아민기는 원하는 아실기를 가지는 아실 활성체, 예를 들어, 아실안하이드라이드(acyl anhydride)와 DMAP(4-(N,N-dimethylamino)pyridine))를 함께 반응하여 N-말단에서 아마이드 결합을 형성하거나 카르복실산(Fatty acid)과 N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 함께 사용되어 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 그런 후 트리플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 절단용액에 의하여 폴리펩타이드 유사체는 고체 수지로부터 분리되고 또한 그것의 측쇄에 결합된 보호기가 제거된다.

본 발명은 또한 이러한 트리펩타이드를 포함하는 항노화제 조성물을 제공한다.

화학식 1의 화합물은 항노화용 화장료에 0.0001~1중량%로 함유하는 것이 바람직하며, 0.001~0.5중량%로 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 활성이 미미하고, 1 중량% 이상인 경우에는 사용량에 따른 경제성이 결여될 경향이 높아진다.

상기 화학식 1의 트리펩타이드를 포함하는 화장료는 이미 알려진 화장료 제조방법에 의해 화장료를 제조할 수 있고, 일반적인 피부 화장료에 한정되지 않고 의약부외품, 외용 의약품에도 적용할 수 있다. 이들의 제형은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그리고 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기한 트리펩타이드 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형, 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 다음은 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.

<실시예 1> 시료준비 (합성 및 분리정제)

R¹-X-Leu-Phe

시료로 합성한 화합물

Compound No .	Sequence	Compound No .	Sequence
A350_1	myr-ALF	A350_11	myr-VLF
A350_2	myr-DLF	A350_12	myr-YLF
A350_3	myr-FLF	A350_13	myr-CLF
A350_4	myr-GLF	A350_14	myr-ELF
A350_5	myr-KLF	A350_15	myr-HLF
A350_6	myr-LLF	A350_16	myr-ILF
A350_7	myr-MLF	A350_17	myr-QLF
A350_8	myr-NLF	A350_18	myr-SLF
A350_9	myr-PLF	A350_19	myr-TLF
A350_10	myr-RLF	A350_20	myr-WLF

상기 표 1에서 myr은 테트라데카노일 그룹, 즉 미리스토일(myristoyl) 그룹을 의미한다.

위의 표 1에 제시된 본 발명의 트리펩타이드를 합성하기 위해 메리필드(Merrifield)의 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 방법(J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149-2154)을 이용하였다. 발명의 펩타이드 합성을 위해 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC) 수지를 이용하여 합성을 시작하였으며, 첫 단계의 Fmoc(9-fluorenylmethoxy carbonyl) 아미노산은 N,N-디이소프로필데틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIEA)를 사용하여 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 용매 하에서 커플링한다. 그 다음 단계의 Fmoc아미노산부터는HATU(N-[(dimethylamino-)-1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)를 함께 사용하여 커플링을 해나가는 방법으로 펩타이드의 사슬을 연장시켰다. 이때, C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성해 나가며, 아미노 말단에 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% piperidine 용액으로 Fmoc기를 제거(Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). CRC Press. 848)하고 DMF(Dimethylforamide)으로 여러번 씻어준 다음 커플링 해나가는 방법으로 진행된다. 마지막으로 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% piperidine 용액으로 Fmoc기를 제거하고 카르복실산과 N, N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 함께 사용하여 아실기를 커플링한 다음 DMF로 여러번 세척하여 건조시켰다. 여기에 TFA(Trifuloroacetic acid)-H₂O-Triisopropylsilane(95:2.5:2.5, v/v/v) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기(Protecting group)의 제거 및 resin으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침천시켰다. 상기의 방법으로 얻은 crude 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 구배용매조성으로 RP-HPLC(2996 Detector, 515 Pump, Waters)을 이용하여 순도를 확인하였으며, 순도확인 결과 95%이하의 펩타이드는 Prep-LC로 분리 정제하여 95% 이상의 펩타이드를 얻었다. 이 펩타이드의 정확한 성분확인을 위하여 Elemental Analyzer(EA1112, CE Instrument, Italy)로 원소분석을 한 결과, 펩타이드의 원소별 함유량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 원소별 함유량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 이때 C-말단이 아마이드 형태의 화합물인 경우 트리알콕시벤즈하이드릴아민 (Rink amide) 수지를 이용하였으며, 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC)를 이용한 펩타이드 합성시의 첫번째 커플링 방법을 제외한 다음 단계방법부터 동일하게 커플링을 진행하였다.

<실시예 2> 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과

인간의 진피 세포를 이용하여 실시예 1 에서 합성한 트리펩타이드의 피부 노화 방지 효과와 피부주름 개선 효과를 실험하였다.

피부에 주름이 생성되는 것은 피부가 노화가 진행되거나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면서 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가함에 따라 콜라겐 합성이 감소하기 때문이다. 따라서 MMP-1과 같은 콜라겐 분해효소의 생합성양을 감소 시키고 자외선에 의해 급감하는 Type Ⅰ procollagen1 양을 증진 시키는 것으로 피부 주름을 예방, 개선할 수 있다.

본 실험은 피부 섬유아세포종(human skin fibroblast, Hs68) 세포주와 트리펩타이드를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 MMP-1의 생합성 양과 mRNA 발현양을 평가함으로서 트리펩타이드의 피부 노화 방지 효과를 확인하였고, 피부 섬유아세포종(human skin fibroblst, Hs68) 세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의한 노화에 미치는 트리펩타이드의 활성을 측정함으로써 피부주름 개선 효과를 측정하였다.

(1) 세포주 및 세포배양

실험에 사용된 세포주는 human skin fibroblast Hs68세포(ATCC, USA)를 사용하였다. Hs68 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). Hs68 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.

(2 ) 세포 생존률 측정

Hs68 (Human skin fibroblast)를 1*10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하고 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양하였다. 배양상등액을 제거하고 무혈청배지 100㎕와 MTT용액 (3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5디페닐테트라졸리움브로마이드)(5mg/㎖)을 각각 10㎕씩 넣고 3시간 동안 배양 후 배지를 제거한다. 각 well 에 100㎕ 의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)용액을 첨가하고 포마젠(Formazan)을 용해시킨 후 마이크로 플레이트 판독기(Microplate reader, Tecan)을 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 1과 같이 세포 생존률(%)을 환산하였다.

[수학식1]

세포 생존률(%) = (S_p)/S_c×100

S_s: 시료를 처리한 군의 흡광도

S_c: 시료를 처리하지 않은 군의 흡광도

아래의 표2는 트리펩타이드를 2ppm 처리한 후 세포독성 실험한 결과를 나타낸 것이다. 대부분의 트리펩타이드는 2ppm 농도에서 독성을 보이지 않는 것을 확인하였다.

각 화합물에 의한 세포독성

Compound No.	Sequence	Cell viability(%)	Compound No.	Sequence	Cell viability(%)
A350_1	myr-ALF	100	A350_11	myr-VLF	97
A350_2	myr-DLF	101	A350_12	myr-YLF	102
A350_3	myr-FLF	99	A350_13	myr-CLF	96
A350_4	myr-GLF	102	A350_14	myr-ELF	99
A350_5	myr-KLF	101	A350_15	myr-HLF	90
A350_6	myr-LLF	98	A350_16	myr-ILF	98
A350_7	myr-MLF	99	A350_17	myr-QLF	97
A350_8	myr-NLF	98	A350_18	myr-SLF	78
A350_9	myr-PLF	100	A350_19	myr-TLF	100
A350_10	myr-RLF	101	A350_20	myr-WLF	102

도1은 위의 표1과 표2에서 보여주는 것과 같이 세포독성이 없고 MMP-1 저해 효과가 가장 좋았던 화합물A350_3, 화합물A350_4, 화합물A350_6, 화합물A350_7 중 하나인 A350_4의 세포독성을 다양한 농도에서 실험한 결과를 나타낸 도표이다. 도1에 나타난 바와 같이, MTT 분석결과 1내지 10ppm까지 95% 이상의 세포 생존률을 보여 화합물A350_4가 안전한 원료임을 확인하였다.

(3 ) 트리펩타이드의 MMP -1 생성 억제 효과

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline(PBS)으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체용액를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕의 1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정하였다. MMP-1 생성 억제율(%)은 아래의 수학식 2와 같이 환산하였다.

[수학식2]

MMP-1 생성 억제율(%) = [1 - (M_s)/M_c]×100

M_s: 시료를 처리한 군의 흡광도

M_c: 컨트롤 군의 흡광도

아래의 표3은 본 발명의 일 실시예로서 20개의 트리펩타이드 중 MMP-1 저해 효과를 보이는 12가지의 트리펩타이드에 의한 MMP-1 생성율 억제율을 나타낸 표이다. 2ppm으로 처리한 후 MMP-1 생성량을 ELISA assay로 측정한 결과 12개의 트리펩타이드에서 MMP-1을 확연히 억제시키는 것을 확인하였다.

각 화합물의 MMP-1 생성 억제율

Compound No.	Sequence	MMP-1 억제율(%)	Compound No.	Sequence	MMP-1 억제율(%)
A350_1	myr-ALF	30	A350_7	myr-MLF	49
A350_2	myr-DLF	10	A350_8	myr-NLF	23
A350_3	myr-FLF	38	A350_9	myr-PLF	14
A350_4	myr-GLF	41	A350_10	myr-RLF	6
A350_5	myr-KLF	7	A350_11	myr-VLF	23
A350_6	myr-LLF	49	A350_12	myr-YLF	22

도 2는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 세포독성이 없고 MMP-1 저해 효과가 가장 좋았던 화합물A350_3, 화합물A350_4, 화합물A350_6, 화합물A350_7 중 하나인 A350_4를 양성대조군인 레티노익산과 비교 한 후 MMP-1 합성 억제능 시험 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 A350_4의 농도가 0.8, 1.5, 2ppm으로 증가할수록 MMP-1 억제효과가 커짐을 보였고 가장 큰 MMP-1 합성 억제효과를 보인 2ppm(48%)에서는 Retinoic acid(41%)보다 더 큰 MMP-1 억제효과를 보였다.

(4) 트리펩타이드의 UVA / UVB 조사에 의한 MMP -1 생성 억제 효과

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 50 mJ/cm²자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 3과 같이 MMP-1 생성 억제율(%)을 환산하였다.

[수학식3]

MMP-1 생성 억제율(%) = [(M_u-M_s)/( M_u -M_c)]×100

M_c: 컨트롤군의 흡광도

M_u: UVA 또는 UVB를 조사한 군의 흡광도

M_S: UVA또는 UVB 조사 후 시료를 처리한 군의 흡광도

아래의 표4는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 UVA 조사 자극에 의해 증가한 MMP-1 생성에 대해 트리펩타이드들의 MMP-1 생성 억제능을 시험한 결과를 나타낸 표이다. 각 트리펩타이드의 처리 농도는 2ppm 이다.

각 화합물의 MMP-1 생성 억제율

Compound No.	Sequence	MMP-1 억제율(%)	Compound No.	Sequence	MMP-1 억제율(%)
A350_1	myr-ALF	75	A350_7	myr-MLF	133
A350_2	myr-DLF	37	A350_8	myr-NLF	-11
A350_3	myr-FLF	91	A350_9	myr-PLF	64
A350_4	myr-GLF	133	A350_10	myr-RLF	-11
A350_5	myr-KLF	16	A350_11	myr-VLF	17
A350_6	myr-LLF	148	A350_12	myr-YLF	102

도 3은 본 발명의 일 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA조사에 대한 MMP-1 합성 억제효과를 시험한 결과이고, 도 4는 트리펩타이드(A350_4)의 UVB 조사에 대한 MMP-1 합성 억제 효과를 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 도3, 4에서 보여주는 것과 같이 UVA 에 의해 증가한 MMP-1을 트리펩타이드(A350_4) 2ppm에서 46.5%, retinoic acid에서 43% 감소시키는 것을 확인하였고 UVB 에 의해 급증한 MMP-1 에 대해서도 트리펩타이드(A350_4) 2ppm에서 82%, retinoic acid에서 83% 감소시키는 것을 확인하였다.

(5) 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 감소한 프로콜라겐 합성 증진 효과

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVA 조사장치(Sankyo, Japan)에 의해 30 J/cm² 자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 세포 용해 완충액(lysis buffer)(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10％ glycerol, 5 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 12 mM bglycerophosphate, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mg/ml aprotinin, and 1％ NP40)으로 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 26,000 g에서 15분간 원심분리하여 세포 추출물을 분리한 후BCA법으로 단백질 양을 측정하여 동량을 맞추고 95℃에서 5분간 가열하여 단백질을 변성시킨 후 20㎍을 10% SDS-PAGE전기영동을 걸어준다. 전기영동을 걸어준 젤을 나이트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 단백질을 이동(transfer)시킨 후 TBST 버퍼에 용해시킨 5% 스킴밀크에서 1시간 동안 배양시킨 후 프로콜라겐 1(Santa Cruze Biotechnology, CA) 항체를 TBST 버퍼에 1:100으로 희석한 용액에 3시간 동안 쉐이킹 하면서 배양시킨다. 항체용액을 제거하고 0.05% Tween 20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 5분씩 3회 세척한 후 HRP-conjugate 된 2차 항체를 TBST 버퍼에 1:2000으로 희석한 용액에1시간 동안 배양한다. 멤브레인을 세척한 후, ECL 용액을 뿌려 imaging densitometer [Labworks ver.4.6. (image acquisition and analysis software), UVP, CA]를 이용하여 측정하였다.

이 때 대조군에는 항-튜불린 항체(Sigma)를 이용하였다.

도5는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 UVA조사에 대해 감소한 type Ⅰ procollagen1 생합성 증진 효과를 실험한 도표이다. 음성대조군(negative control)은 UVA를 조사한 군으로 프로콜라겐 생성량을 1로 기준하고 UVA 조사 후 시험물질인 트리펩타이드(A350_4)와 양성대조군인 레티노익산을 처리한 군에 대해 상대적인 효과를 나타냈다. 도5에 나타난 바와 같이, 트리펩타이드(A350_4) 처리 군은 UVA 단독 조사군에 비해 프로콜라겐 생합성양이 3.87 배 증가 했으며 레티노익산에서도 동일한 결과를 보였다. 따라서 트리펩타이드(A350_4)가 UVA 조사에 의해 감소한 프로콜라겐 생합성양을 촉진한다는 것을 확인하였다.

(6) 트리펩타이드(A350_4)의 MMP - 1발현 억제 효과

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 phosphate buffer saline(PBS) 1㎖씩을 넣어 배지를 세척한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. MMP-1, Type Ⅰ procollagen1의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MMP-1의 primer sequence는 표 5와 같다. 각 primer를 각각 1 ㎕ (0.5 ㎍/㎕)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 60℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다.

도 6은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 양성대조군인 레티노익산과 비교하여 트리펩타이드(A350_4)의 MMP-1 mRNA 발현 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 트리펩타이드(A350_4)의 농도가 0.8, 1.5, 2ppm으로 증가할수록 MMP-1 mRNA 발현 저해효과가 커짐을 보였고 가장 큰 MMP-1 mRNA 발현 저해효과를 보인 2ppm에서는 레티노익산과 같은 효과를 보였다.

유전자이름	Forward primer (5’ 3’)	Reverse primer (3’ 5’)
MMP-1	ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA	ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG
GAPDH	CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG	CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG

(7) 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 증가한 MMP - 1발현 억제 효과

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 80mJ/cm²자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. MMP-1, Procollaen 1의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MMP-1의 primer sequence는 표5과 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 60℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다.

도7은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 UVA조사에 대해 증가한 MMP-1 mRNA 발현 억제 효과를 실험한 도표이다.

상기와 같이 실험한 결과 트리펩타이드(A350_4)의 농도가 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2ppm으로 증가할수록 MMP-1 mRNA 발현 저해효과가 커짐을 보였고 가장 큰 MMP-1 mRNA 발현 저해효과를 보인 2ppm에서는 양성대조군인 레티노익산 보다 더 큰 저해효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

도 8과 9는 본 발명의 일 실시예로서 기존에 항노화 화장료에 사용되는 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate)와 레티놀(retinal)과의 비교효과 및 시너지 효과를 실험한 도표이다. 도 8, 9에서 보듯이 레티닐팔미테이트나 레티놀의 경우 트리펩타이드(A350_4)와 같은 강력한 억제효과를 보여주지 않으나 함께 사용시 약간의 시너지 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 피부 미백효과

멜라닌 생성 세포를 이용하여 트리펩타이드의 미백효능을 실험하였다.

피부가 흑화를 일으키는 것은 피부의 멜라닌 생성세포에서 멜라닌을 만들어 표피로 내보내기 때문으로 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생성과 그 기전을 차단시킨다면, 멜라닌이 만들어 지지 않아 피부 흑화는 나타나지 않는다. 따라서 멜라닌 생성과 멜라닌 합성의 주요단계에 관여하는 티로시나제 효소의 활성도는 미백을 측정하는 중요한 척도로 사용된다.

본 실험은 멜라닌생성세포(melanoma) 세포주와 멜라닌자극호르몬을 이용한 in vitro assay계를 확립하여 트리펩타이드에 의한 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제효과를 측정함으로써 피부 미백 효과를 확인하였다.

(1) 세포주 및 세포배양

실험에 사용된 세포주는 melanoma B16F10 세포와 human primary melanocyte HEMn-LP 세포(Cascade Biologics, USA)를 사용하였다 B16F10 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). HEMn-LP 세포는 1% HMGS (Cascade Biologics, USA)이 혼합된 99% Medium 254 (Cascade Biologics, USA) 배지를 이용하여 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다 (Incubator; Thermo-scientific, USA). B16F10, HEMn-LP 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.

(2) 티로시나제 활성억제를 통한 미백효과 실험

6 well plate의 각 well에 B16F10 멜라닌 생성세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 1x10⁵cell/well (Final volume 3ml)로 넣고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도별로 만들어 30분간 전처리 하였다.

이어서 α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세포스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각의 1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4°C, 1,300rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포펠렛을 회수하여 200ml의 라이시스 버퍼 (1% Triton X-100, 1mM PMSF이 함유된 100mM sodium phosphate buffer (pH6.8))를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 1,300rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. BCA protein assay kit (PIERCE, USA)를 이용하여 총단백질 정량을 하였고, 같은 양으로 정량된 시료를 96 well plate의 각 웰에 40ml씩 넣고, 이어서 2mg/ml로 실험 전 phosphate buffer (pH 6.8)에 바로 녹인 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 120ml씩 넣었다. 37°C에서 30분~60분간 반응시킨 뒤, ELISA 리더를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군을 기준으로 타이로시나제 활성억제율(%)을 다음 [수학식 4]에 의하여 구하였다. 음성대조군은 시료대신 DMSO를 처리하여 샘플로 사용하였다.

도 10은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 a-MSH 에 의해 증가한 티로시나제의 활성 억제 효과를 나타낸 도표이다.

[수학식 4]

티로시나제활성 억제율(%) = [(T_m -T_s)/( T_m -T_c)]×100

T_c: 컨트롤군의 흡광도

T_m: α-MSH 처리군의 흡광도

T_S: 시료와 α-MSH를 처리한 군의 흡광도

(3) 멜라닌 생성억제 효과 측정

6 well plate 의 각 웰에 B16F10 멜라닌 생성세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 1x10⁵cell/well (Final volume 3ml)로 넣고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도별로 만들어 30분간 전처리 하였다.

이후 α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세포스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각의1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4°C, 1,300rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포펠렛을 회수하여 200ml의 라이시스 버퍼 (1% Triton X-100, 1mM PMSF, 50mM Tris-HCl (pH7.0), 2mM EDTA(pH8.0), 150mM NaCl)를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 1,300rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포펠렛을 회수하여 60°C에서 약 3시간 건조시킨 뒤, 10% DMSO가 첨가된 2N NaOH를 150ml씩 넣어 60°C에서 1시간 동안 세포 내 멜라닌을 용해시켰다. 96 well plate 의 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100ml씩 넣어 ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료대신 DMSO로 처리하였다. 멜라닌 생성억제율(%)은 다음 [수학식 5]에 의하여 구하였다.

도 11은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 α-MSH 에 의해 증가한 멜라닌의 생성 억제 효과를 나타낸 도표이다.

[수학식 5]

멜라닌 생성 억제율(%) = [(M_m -M_s)/( M_m -M_c)]×100

M_c: 컨트롤군의 멜라닌양

M_m: α-MSH 처리군의 멜라닌양

M_S: 시료와 α-MSH를 처리한 군의 멜라닌양

(4) cAMP 생성 억제효과

cAMP ELISA kit (Assay Design, USA)을 이용하여 세포 내에 방출된 cAMP양을 측정하였다. 피부흑화의 세포전달시 발생되는 cAMP의 양을 얼마나 억제하는지 그 양을 ELISA법을 통해 측정하여 그 결과를 도12에 나타내었다.

상기 실험결과, 트리펩타이드(A350_4)에서 cAMP의 억제효과를 보임을 확인하였다.

(5) 피부 흑화 관련 유전자의 mRNA 억제효능

60mm 접시에 B16F10 멜라닌 생성 세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 5x10⁵ cell/웰 (Final volume 5ml)로 넣고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 시료를 농도별로 만들어 30분간 전처리하였다.

이후 α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 PBS 1ml로 워싱한 뒤, easy-spin^TM (DNA free) Total RNA extraction kit (Intron, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였다. PCR Primer는 mouse 의 beta-actin, tyrosinase, TRP1, TRP2, MITF, POMC를 제작하였고, 94°C 1분, 55°C 1분, 72°C 2분의 조건으로 30회 증폭하였다. PCR product는 1% agarose gel에 로딩하여 30분간 전기영동하고 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. 멜라닌 합성에 있어서 중요한 역할을 하는 유전자를 선정하였고, 그 Primer 서열은 표 6와 같다.

PCR primer

유전자 이름	Forward primer (5’3’)	Reverse primer (5’3’)
Tyrosinase	GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT	TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC
MITF	GGA GCA GAG CAG GGC AGA	CAT GCA CGA CGC TCG AGA
POMC	AGC AAC CCG CCC AAG G	GCG TCT GGC TCT TCT CGG
TRP1	GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC	AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT
TRP2	GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC	CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC
Beta-actin	TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C	TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G

[표 6]에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 도13에 기재하였다.

상기와 같이 실험한 결과 화합물 트리펩타이드(A350_4)는 Tyrosinase 및 TRP1, TRP2, POMC, MITF의 mRNA를 효과적으로 억제시켰고, 이는 트리펩타이드(A350_4)가 우수한 미백 성분임을 확인할 수 있다.

<실시예 4> 피부 항염효과

인간의 표피 케라티노사이트 세포를 이용하여 화합물 트리펩타이드의 항염 효과를 실험하였다. 피부의 만성적인 염증과 여러 암 생성과의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 케라티노사이트는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다.

본 실험은 피부 표피 케라티노사이트(human keratinocyte, HaCaT) 세포주와 UVB 램프를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의해 발현하는 대표적인 싸이토카인인 Interleukin-1a(IL-1a), Interleukin-1b(IL-1b)와 Interleukin 6(IL-6) mRNA 발현양을 평가함으로써 트리펩타이드의 염증 억제 효과를 확인하였다.

(1) 세포주 및 세포배양

실험에 사용된 세포주는 Human Keratinocyte의 일종인 HaCaT 세포를 사용하였다 HaCaT 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). HaCaT 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.

(2) UVB 자극에 의한 피부 염증 관련 유전자의 mRNA 억제효능

Human Keratinocyte (HaCaT)세포를 6*10⁵cells/well 농도로 60mm 접시에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 항염효능 시료를 농도 별로 만들어 4시간 전처리 하였다.. 각 well plate에 PBS 3㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 100mJ/cm² UVB를 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6) mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6)의 primer sequence는 표7과 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 56℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에 로딩하여 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. Densitometer로 수치화한 mRNA량은 gapdh수치로 나누어 정량 하였다.

피부 염증 관련 유전자의 PCR primer 서열

유전자 이름	Forward primer (5’→3’)	Reverse primer (5’→3’)
IL-1α	CTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC	CTA GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C
IL-1β	TGG AGA ACA CCA CTT GTT GCT CCA	AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC CAG G
IL-6	GCC TTC GGT CCA GTT GCC TT	GCA GAA TGA GAT GAG TTG TC
GAPDH	CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG	CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG

[표 7]에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 다음 도14에 기재하였다.

상기와 같이 실험한 결과 화합물 트리펩타이드(A350_4)는 UVB 조사에 의해 증가된 싸이토카인인 IL-1α ,IL-1β 와 IL-6의mRNA를 효과적으로 억제시켰고, 이는 트리펩타이드(A350_4)가 우수한 항염 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 임상에서의 주름 개선 효과 및 미백효과

아래 표8에 나타낸 조성으로 로션을 제조하여 인체에 대한 주름 개선 효과와 미백 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

주름 개선 및 미백효과 평가를 위한 로션 Formulation

유상		수상
성분	함량(중량%)	성분	함량(중량%)
Mineral Oil	6.0	Glycerin	4.0
Stearic acid	2.7	Methyl paraben	0.5
Cetyl alcohol	2.0	TEA	0.5
Propyl paraben	0.05	Distilled water	82.6496
Tween 60	1.2
Aracel 83	0.4
화합물 A350_4	0.0004

(1) 트리펩타이드(A350_4)의 주름개선 효과 평가

33명의 45-60세의 건강한 동양 여성들에게 트리펩타이드(A350_4) 4ppm을 함유하는 로션을 매일 아침 저녁 2회씩 적당량을 눈가 주름을 포함한 한쪽 얼굴에 3개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 주름 개선효과를 Replica analysis(주름 평가법)방법을 통해 전체 주름 수, 주름 길이, 주름 면적을 측정하여 수치화 하였고, 영상분석을 통해 평가하였다. 이 시험은 태국의 임상전문 업체인 Spincontrol Asia를 통해 진행 되었으며, 그 결과를 도15, 도16에 나타내었다.

도15 및 도16으로부터 트리펩타이드(A350_4)를 함유한 화장료의 피부주름 개선 효과가 매우 우수함을 확인하였다.

(2) 트리펩타이드(A350_4)의 미백 효과 평가

30명의 45-60세의 건강한 동양 여성들에게 트리펩타이드(A350_4) 4ppm을 함유하는 로션을 매일 아침 저녁 2회씩 적당량을 눈가 주름을 포함한 한쪽 얼굴에 3개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 색소침착 변화는 크로마메터(Chromameter CR-300, Minolta, Japan)로 측정하여, L^*(Luminosity)와 ITA^* (Arc tan) 값으로 수치화 하였고, 영상분석을 통해 평가하였다. L^*와 ITA^*값의 감소는 피부 흑화가 증가되었다는 것을 알려준다. 이 시험은 태국의 임상전문 업체인 Spincontrol Asia를 통해 진행되었으며, 그 결과를 도17, 도18, 및 도19에 나타내었다.

도17, 도18 및 도19로 부터, 트리펩타이드(A350_4)를 함유한 화장료의 피부 미백 효과가 매우 우수함을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 우수한 주름개선 효과등과 안전성은 앞서 기술한 실시예와 구체예에 대해서 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 당연한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

하기 화학식 1 로 표시되는 트리펩타이드.
화학식 1
R¹-X-Leu-Phe
(상기 화학식 1에서, R¹은 테트라데카노일이고, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1 중의 X로 표시되는 부분은 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 아스파틱산(aspartic acid), 라이신(lysine), 메타이오닌(methionine), 아스파라긴(asparagine), 알지닌(arginine), 티로신(tyrosine) 으로 이루어진 아미노산으로부터 선택되는 것이고, C-말단은 카르복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 X는 글리신(glycine), 루신(leucine), 메타이오닌(methionine) 으로 이루어진 아미노산으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 트리펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 표시되는 트리펩타이드의 아미노산 중 Leu 는 L-Leu으로 Phe는 L-Phe이며 C-말단은 카복실산형태인 것임을 특징으로 하는 트리펩타이드.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 트리펩타이드를 유효성분으로 하는 항노화, 주름개선, 미백 또는 항염 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태를 가지는 화장료 조성물.
삭제
제7항에 있어서,
상기 트리펩타이드가 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~1% 중량으로 포함되는 화장료 조성물.