CN1361829A - 利用特异性lna引物检测基因突变 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测不同核酸的方法,该核酸的核苷酸序列彼此在单一或多个位置的不同。本方法使用一组含有DNA单体和新颖种类的DNA类似物－锁定核酸(LNA)的嵌合寡核苷酸。LNA寡聚物遵循沃森－克里克碱基配对原则形成双显性组合,该双显性组合比DNA所形成的类似双显性组合更加稳定。其中在3’位置发现LNA核苷酸的含有“等位基因特异的”LNA寡核苷酸可利用酶仅在延长方向末端的核苷酸处延长,该核苷酸与待检测的核酸(一等位基因)的对应核苷酸互补。因此可区别不具序列示差杂交而具有标记寡核苷酸的等位基因。本发明进一步涉及进行该方法的试剂和该方法的应用。

Description

利用特异性LNA引物检测基因突变
发明领域
本发明包括检测不同核酸的方法，适于此目的一组寡核苷酸，用来进行本发明方法的试剂盒以及该方法在鉴定特异性基因序列及诊断疾病与感染的用途和应用。
发明背景
现今，在核酸序列中某些核酸样本的检验越来越重要。部分归因于核酸的核苷酸序列是每种生物体的独特特征的事实。首先，一些疾病就正常基因的核苷酸序列以某种方式改变的意义而言为遗传疾病。这种改变是由一个碱基被另一碱基取代而引起。包括超过一个碱基以上的改变也可理解。已知单一氨基酸的三个碱基密码，一个碱基的改变(一点突变)会导致该氨基酸的变化，接着会导致细胞制造缺陷蛋白质。镰状细胞贫血为此种由单一基因中的单一碱基改变引起遗传缺陷的一类典型实例；β-球蛋白基因(在密码子6的AT颠换)。例如也可在LDL受体(Atherosclerosis(1992)，96：91-107)或载脂蛋白-B-基因(密码子3500的CGG CAG突变(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1989)86：587-591)发现重要的点突变。由单一基因缺陷引起疾病的其它实例包括因子IX和因子VIII缺陷、乳癌、胆囊纤维化(cysticfbrosis)、因子V Leiden、脆性X、亨丁顿氏舞蹈病(Huntington disease)、肌强直性营养失调(myotonic dystrophy)、血友病A(Haemophilia A)、血友病B(HaemophiliaB)、神经纤维瘤I型(Neurofibromatosis type I)、腺苷脱氨酶缺乏(adenosine deaminasedeficiency)、嘌呤核苷酸磷酸化酶缺乏(purine nucleotide phosphorylase deficiency)、鸟胺酸转胺甲酰酶缺乏(omithine transcarbamylase deficiency)、精胺酸琥珀酸合成酶缺乏(argininsuccinate synthetase deficiency)、β-地中海贫血症(beta-thalassemia)、α-1抗胰蛋白缺乏(alpha-1 antitrypain deficiency)、葡糖脑苷脂酶缺乏(glucocerebrosidasedeficiency)、苯基丙胺酸羟基酶缺乏(phenylalanine hydroxylase deficiency)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferasedeficiency)。
其次，癌症的主要原因被认为是在直接或间接控制细胞生长及分化的细胞基因的改变。有至少三十个基因家族与人类肿瘤形成有关，称的为致癌基因。其中一种家族成员-ras基因家族，经常发现在人类肿瘤中产生突变。在其正常状态中，ras基因产生的蛋白质被认为与正常细胞的成长及突变有关。Ras基因突变在蛋白质产物中的三个临界位置的一引起氨基酸改变，导致转变成与肿瘤形成有关的类型。具有此突变的基因称为”突变型”或”活化的”。未突变的ras称为“野生型”或“正常”ras。认为致癌剂或其它环境因素会诱导此种导致ras活化的点突变。已发现超过90％的胰脏癌，约50％的结肠肿瘤与癌，约50％的肺癌及甲状腺癌，以及大部分如急性骨髓白血病、淋巴瘤和myelodysplastic并发症含有活化的ras致癌基因。大体上，部分人类肿瘤的10至20％具有在三个ras基因(H-ras、Ki-ras或N-ras)中的一的突变。
与癌症发展高度相关的另一个基因实例为TP53基因。超过半数以上的所有人类癌症由于突变及/或缺失改变了TP53基因。该点突变散播在超过250密码子并且大多数出现错义突变。就这一点而言，TP53基因与其它肿瘤抑制基因如成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因(Rb1)和经常由于缺失或无意义(nonsense)突变而失去活性的p16基因不同。
多数的恶性肿瘤显示在TP53基因的两等位基因发生了改变。此通常与一等位基因的完全缺失及错义突变使其它等位基因失去活性有关。此结果为完全缺乏TP53蛋白质或发生改变的蛋白质的表达。在TP53高度保留区域的错义突变也和TP53蛋白质增加的程度有关。这似乎是由突变诱导的构型改变所造成，此改变可稳定蛋白质并且延长半衰期从4小时到8小时。多数错义突变群集在蛋白质中央核心的四个高度保留区域。此区域是序列特定DNA结合的由来且对于TP53功能的完整有绝对的重要性。在这些区域内已鉴定出七个突变的热点。这些热点位于氨基酸残基175、213、245、248、249、273和282。
第三，引起传染病的寄生虫、微生物和病毒，都具有其本身的核酸。通常利用一些传统方法(例如：培养)来确定生物材料样本中这些生物体的存在。各生物体皆有其独特的基因组，假如存在对单一物种(对数种相关物种，对一属(genus)，或对较高程度关系)为特定的核酸基因或序列，此序列将提供该生物体(或物种等)的”指纹(fingerprint)”，例如在HIV病毒逆转录酶的基因中(在密码子215的A→T突变：Science(1989)246：1155-1158)。其它病毒的实例包括HPV、EBV、HSV、B型肝炎和C型肝炎及CMV。微生物的实例包括细菌，更特别地包括支原体、军团菌属、分枝杆菌、衣原体、假丝酵母、gonocci、志贺菌属及沙门氏菌(salmonella)的各种菌株。藉由本发明鉴定微生物的功能将增加科学界从更多生物得到基因组的信息。在某些细菌菌株的核酸中，发现其核糖体基因与其rRNA有极大的相似性。
目前在检验不同核苷酸序列样本领域的尝试集中于利用在核苷酸序列中的唯一变异区别核酸。此种变异可为点突变造成的结果(例如核苷酸交换)或是在微生物的情况下，物种间变异的结果。此种接近的相关核酸的天然实例为等位基因，亦即在染色体上限定部位的已知基因序列的交替变体。
在上述各实例中，可从样本中分离核酸并通过鉴定对于疾病或生物体特异的一个或多个序列，测定该样本是否含有任何上述序列，亦即对“遗传疾病”、癌症、传染病或传染性生物体有特异性的序列。鉴定在核苷酸序列中的变异或改变时的困难是该检测不易应用于样本中存在的靶序列复制数少的情况。此种情况中，难以区别信号与噪声。绕过此问题的一种方法是增强信号。因此，一些用来扩增样本靶序列的方法已有叙述。其中一种最为熟知且广泛使用的扩增方法是聚合酶链反应(称为PCR)，此方法在美国专利US4,683,195、US4,683,202与US4,800,159中有详细说明。
以PCR技术为基础，一些用来检测序列变异的方法已有叙述。从OncogenResearch 1(1989)，235-241及Nucl.Acids Res.17(1989)，8093-8099已知在PCR中利用特殊设计的引物先扩增可能含有等位基因变体的区域，接着以限制酶处理该区域。然后用限制片段长度多型性(RFLP)分析可诊断该等位基因。依大小电泳分离***的产物，于是显露出探针中是否含有对应的等位基因。此方法的缺点是需要特定的限制性消化。除了此方法对于尚未产生RFLP的各突变为一麻烦方法的事实的外，必须能将引物设计成与点突变相邻，允许用在给定位点可精确***的限制酶加以消化。由于这些列于公开出版物中的原因，这可能是困难的处。
EP-A-0332435与US5,605,794说明了选择性检测与相邻核酸仅有一个核苷酸不同的核酸的方法。在此使用的结果为下列一个：由对待检测的核酸杂交的寡核苷酸，仅那些利用酶可理论上在延长方向末端的单一核苷酸处延长，该单一核苷酸与待检测的核酸(一等位基因)的对应核苷酸互补。因此选择仅能与欲检验的核酸互补的寡核苷酸。这样，杂交到其它等位基因的寡核苷酸在理论上无法延长。其结果是实际上杂交到其它等位基因的寡核苷酸尽管只有较少的程度但仍会延长。这会降低该方法的敏感度，特别是特异性。尤其当T为3’-末端错配的一部分时或是该错配为一C∶A错配时可能容易出现非特定延长(Kwok et al.(1990).NucleicAcids Research，18：999-1005)。为了增加特异性，EP-A-0 332 435建议选择寡核苷酸的核苷酸序列，该寡核苷酸末端区域含有与该两核酸的对应核苷酸不互补的其它核苷酸。对于两等位基因的检测两反应必须在每一反应仅检测两等位基因其中之一的方式进行。此方法需要合成两等位基因特定引物与一链互补链引物。在两个反应中扩增该样本：一次在PCR中利用链互补链引物与一等位基因特异的引物，在第二个平行反应-PCR，利用该链互补链引物和第二等位基因特异的引物扩增样本。假使在该反应其中之一检测不出被怀疑可能存在的等位基因特异的PCR产物，可假设为在该样本中不存在该个别等位基因。由于同型结合的DNA样本仅含有在两个反应仅其中之一可被检测的两等位基因中的一个，因此需要使用在所有反应中产生相同控制产物的两个额外引物。此控制产物与特异的产物不同以控制其它等位基因个别PCR的效率并建立缺少的个别等位基因。假使PCR产物中存在控制产物但未发现等位基因特异的产物，该样本可能不含反应中欲试验的等位基因。此方法中，必须在两个别反应中建立存在或缺少的两等位基因，各独立的PCR必须包括一控制PCR。
Biochem.Biophys.Res.Commun.(1989)，160：441-447建议利用减少dNTP浓度增加选择性。即使需要额外的量测，不同批次中等位基因的检测可生成非特异的产物。
在连接酶链反应(ligase chain reaction)中(WO89/09835)，利用热稳定性特异地连接酶连接两相邻寡核苷酸。只要该寡核苷酸在严格的杂交温度下杂交到互补靶上并在连锁部位有完整的碱基配对就会发生此反应。假使两等位基因与各个其它在连锁部位的突变结果不同，上述完整碱基配对会仅对于等位基因其中之一完成。接着在连接酶反应中，需要与前两个寡核苷酸互补的额外两个寡核苷酸来扩增连接反应(ligation)产物。迄今，两等位基因的检测需要具有至少六个寡核苷酸的两个反应并且利用放射标记检测扩增产物(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1991)，88：189-193)。
由Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)，82：1585-1588与New England Journal ofMedicine(1987)，317：985已知一种以具有检查下的等位基因的“等位基因特异的”寡核苷酸差别杂交(ASO)为基础的检测等位基因的方法。例如合成长度各为20bp两个寡核苷酸。该两寡核苷酸各与两个不同等位基因配对但对于在寡核苷酸序列中间的另一等位基因具有错配。利用具有标记寡核苷酸的差别杂交可区别等位基因。这可应用在人类基因组DNA及PCR产物两者的分析上。也可利用本方法直接及个别分析基因组DNA但需要额外的消化与电泳。
Nucleic Acids Research(1989)，17：2437-2448及EP-A-0 333 465说明一种利用等位基因-特异的引物竞争(竞争性寡核苷酸引发competitive oligonucleotide priming＝COP)检验在少数额外PCR循环存在不同等位基因的预扩增的人类基因组DNA的方法。然后上述ASO-技术转变为PCR技术。在原本的ASO技术中，由于在对应控制允许明确转译的期间信号强度的比较，因此由交错杂交引起的5％错误率是可接受的。然而在PCR反应中，该引物为等位基因特异的寡核苷酸，假使错误发生在两等位基因扩增的试剂混合物中，则仅含有等位基因其中之一的样本的错误率在十次循环后大概总计为12％。该引物竞争显示增加的选择性，但基因组DNA所关注的区域在PCR会先被扩增，接着以十次后续循环进行不同等位基因的分析。在这些循环中使用两个等位基因特异的引物和互补链引物，并且在两个反应中放射标示等位基因特异的引物的其中之一。对于长度为12至16个碱基的寡核苷酸显示出不同的等位基因的选择性检测，反之在该已知条件下较长的寡核苷酸也可生成非特异的产物。
存在着对于直接检测在样本中至少一个单一碱基变异的简单及更特殊方法的需求，该样本含有如基因组DNA核酸，该方法将检测步骤减到最少而可利用最少的操作技巧，快速、精确及容易地进行该方法。
以示差杂交法为基础的方法仅能应用在某些情形，此外这些方法非常复杂而且易受干扰。并且，预扩增步骤为一程序步骤(例如在COP过程)，最好排除此步骤。
上述检测不同核酸的所有方法具有依赖未修饰核苷酸在不同核酸检测中作为区别因子的特性。
发明概述
本发明提供特定检测不同核酸的简单方法，该方法不需由限制酶消化，可允许在单一试剂混合物中扩增核酸，而且不会取决于后续的酶反应。本发明中的重要成分为LNA，其为DNA类似物的新种类，具有某些非凡特性使其成为改善体外DNA诊断的主要候选者。该LNA单体为双环状化合物，在结构上非常类似RNA单体，参见式I。LNA享有DNA与RNA大部分的化学性质，其为水溶性，可由凝胶电泳分离，经乙醇沉淀等(Tetrahedron，54，3607-3630(1998))。然而将LNA单体引入到DNA或RNA寡体中会造成具有互补的DNA或RNA的二显性组合前所未有的高热稳定性，而同时遵守沃森-克里克(Watson-Crick)的碱基-配对原则。以LNA寡聚物形成的二显性组合的高热稳定性，连同发现的含有3’位置LNA的引物可为酶延长(例如PCR反应)的底物，在本发明中利用此高度热稳定性显著提升在体外检测不同核酸的特异性，如本申请所说明。单独等位基因的扩增方法会出现高度辨别能力(未见到交错反应)且在相同容器中可能发生数种反应。发明详细说明
本发明涉及检测不同核酸的方法，该不同核酸具有在至少一位置A彼此不同的核苷酸序列。该方法包括至少两个步骤：
a)利用至少一个诊断的寡核苷酸作为延长反应的引物进行延长反应，该至少
一个诊断的核苷酸为含有LNA寡核苷酸，其中以LNA在位置A或在位置A
的邻近位置优选，而在寡核苷酸的3’-末端为更优选。
b)检测该延长产物，例如利用标准凝胶电泳、毛细管电泳或各种杂交测定。
本发明其它实施方案为利用该至少一个寡核苷酸、一组寡核苷酸、不同组的寡核苷酸、一种试剂盒进一步延长和扩增以及该方法的各种应用与用途。
根据本发明“靶核酸”为包含在样本中的并存在感兴趣对象的核酸，该靶核酸(Q’和Q)的核苷酸序列为实质上完全相同，但该核酸Q’在其核苷酸序列的至少一个位置与核酸Q的核苷酸序列不同。核苷酸序列中变异的位置称为“位置A”。位置A也称为多型部位，并且核酸中位置A的存在称为基因多型性。如果该不同核苷酸序列包括数种不同的核酸(Q’1，Q’2，...，Q’e)，该变异位置称为A1，A2，...，Ae。此种变异的发生，例如可能为点突变的结果或可能由单一或数个碱基的缺失或***引起。待检测的核酸可为RNA或DNA且已证明特别适合于尤其细菌rRNA的诊断。
“诊断的寡核苷酸”指一种寡核苷酸，该寡核苷酸在位置A与在待检测的靶核酸的位置A发现的核苷酸互补的核苷酸，且该寡核苷酸在给定杂交条件下能区别不同靶核酸序列(Q’1，Q’2，...，Q’e)，并且仅起始在位置A含有核苷酸的靶核酸序列的延长，该核苷酸与诊断寡核苷酸的位置A的核苷酸互补。
术语“产物靶”指那些为原始靶核酸的延长产物的核苷酸。也可以使用产物靶物作为靶核酸，其通常小于原始靶。
术语“位置”指该核酸上的限定部位。此种位置可例如为一核苷酸所占用。
术语“等位基因”指任何在同源染色体上不同碱基序列的相同基因座产生的相同基因的形式。
核苷酸指在确保正常沃森-克里克碱基配对条件(例如G-C，A-T或A-U)下存在互补性。此互补的碱基配对可导致匹配，反之不互补的碱基配对会导致错配。能产生此种碱基配对的任何核碱基(例如7-脱氮-dGTP、dITP、LNA-碱基类似物等)也和存在互补性有关。
为了解本发明方法，待检测的核酸必须以适合在体外反应的形式存在。用已知的方法消化待检测的样本，例如组织样本、组织萃取物、个别细胞或含细胞流体以打破细胞壁(例如热溶解、酶溶解或化学溶解或其组合)释出核酸。
然后使样本与本发明的诊断寡核苷酸接触。选择可使本发明的寡核苷酸与待检测核酸的对应区域杂交的条件。此杂交通常已知为退火(annealing)。通过选择适当的核苷酸序列、核苷酸长度、杂交温度、佐剂等避免与无关的核酸(亦即那些不待检测的核酸)杂交(参见Ausubel等人在Current Protocols in Molecular Biology，pub.John Wiley & Sons(1998)及实施例的细节)。
本发明不同诊断的寡核苷酸的数目相当于待检测的不同靶核酸的最少数目。因此两个不同突变的检测需要至少两个不同诊断的寡核苷酸，各含有与可存在靶核酸位置A的核苷酸的其中仅有的一互补的核苷酸。使用诊断的寡核苷酸优选具有小于50个核苷酸的长度，优选在5-40个核苷酸的范围内，更优选为5至30个核苷酸的范围，甚至更优选为5至25个核苷酸的范围，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。各诊断寡核苷酸具有与位置A的邻近区域高度互补的核苷酸序列，因此此寡核苷酸与待检测的核酸杂交。
本发明方法为胜过以竞争引发或错配引发法原则为基础的方法。然而，不管应用不同的方法，用于靶核酸检测的各诊断寡核苷酸包括至少一个LNA。此LNA优选与待检测的靶核酸的位置A发现的核苷酸相对应并互补。
本发明的一个实施方案为检测样本中靶核酸Q’样本存在的方法，该靶核酸Q’的核苷酸序列与核酸Q在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)将存在于样本中的核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂及至少一个诊断的寡核苷酸结合，该诊断的寡核苷酸在位置A含有核苷
酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但是不与核酸
Q位置A的核苷酸杂交，至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA，
b)延长任何杂交到存在于样本中的核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中该
所述核酸作为模板，
c)检测任何在步骤b)中所形成的核酸，因此检测样本中核酸Q’的存在。
此方法可应用于例如RNA逆转录成cDNA及其它第一链合成的应用。利用增加下列步骤代替步骤c)循环延长反应使该方法更有效率：
c1)形成延长产物之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d1)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，利用至少一
个诊断的寡核苷酸杂交步骤c1)的单链核酸，该寡核苷酸在位置A含有在杂交
条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但是不与核酸Q位置A的核苷酸
杂交的核苷酸，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA，
e1)重复步骤c1)至d1)足够次数以产生可检测量的延长产物，
f1)检测形成的延长产物。
此方法会导致线性扩增，可进一步延伸包括作为靶核酸相反链延长产物合成引物的”下游寡核苷酸”的重新扩增步骤，此方法可允许对于PCR型的指数扩增。检测靶核酸Q’存在的方法包括下列步骤，该靶核酸Q’的核苷酸序列与样本中核酸Q至少一个位置A不同：
a)将核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的试剂、至少一个
下游寡核苷酸及至少一个诊断的寡核苷酸结合，该诊断的寡核苷酸在位置A
含有核苷酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但是
不与核酸Q位置A的核苷酸杂交，至少一个该诊断的寡核苷酸含有至少一个
LNA，
b)延长任何杂交到该核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中所述核酸作为模
板，
c)形成延长产物的后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，利用至少一
个下游寡核苷酸及至少一个诊断的寡核苷酸杂交步骤c)的单链核酸，该寡核
苷酸在位置A含有在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不与
核酸Q位置A的核苷酸杂交的核苷酸，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少
一个LNA，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测量的延长产物，
f)检测形成的延长产物。
依照本发明方法的变化选择，该LNA-核苷酸位于诊断寡核苷酸的给定部位，优选在位置A，例如在诊断寡核苷酸内部位置或在诊断寡核苷酸的3’-末端。
本发明特别适用于多重分析。在一些情况下，分析可能含有在不同部位一些不同突变的基因，例如在许多密码子具有突变的TP53基因。利用一些小心配对的LNA-寡体/DNA-寡体成对，各个成对指向一特定突变且各个成对可导致特征大小的片段或特征标记的片段，通过按大小切分所产生的片段或检测片段的标记可区别一些不同的突变。检测其核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同的靶核酸的方法与上述方法类似，但此处的诊断寡核苷酸由一个以上的序列组成，该方法包括下列步骤：
a)在杂交条件下，将核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂及至少一组诊断的寡核苷酸结合，该至少一组诊断的寡核苷酸具有核苷
酸序列，该核苷酸序列在至少一个位置A彼此不同且含有至少一个LNA，
b)延长任何杂交到该核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中该核酸用作为模
板，
c)检测在步骤b)中形成的核酸。
此构成一种例如可用来作为不同核酸序列的序列特异的第一链合成以并且能够用作例如RNA序列特异的逆转录的方法。也如同上述，检测其核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同的靶核酸的方法可通过重复几次延长反应，如同所述增加下列步骤代替步骤c)使该方法更有效：
c1)形成延长产物的后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d1)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，使步骤c1)
的单链核酸与至少一组诊断的寡核苷酸杂交以合成进一步的延长产物，该组
诊断寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，
e1)重复步骤c1)至d1)足够次数以产生可检测量的延长产物，
f1)检测形成的延长产物。
此方法会导致线性扩增对应于所用的寡核苷酸的不同核酸，以及可进一步延伸包括作为靶核酸相反链延长产物合成引物的单一或多数下游寡核苷酸的重新扩增步骤，此方法可允许对于PCR型的指数扩增。检测其核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同的靶核酸的方法将包括下列步骤：
a)在杂交条件下结合核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂、至少一个下游寡核苷酸及至少一组诊断的寡核苷酸，该至少一组诊断
寡核苷酸具有在至少一个位置A彼此不同的核苷酸序列，并含有至少一个
LNA，
b)延长任何杂交到该核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中该核酸用作为模
板，
c)形成延长产物的后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，使步骤c)的
单链核酸与至少一个下游寡核苷酸及至少一组诊断的寡核苷酸杂交以合成进
一步的延长产物，该组诊断寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不
同，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测量的延长产物，
f)检测形成的延长产物。
同样在该方法的变化中，由于在这些条件下该杂交具有较高的选择性与特异性，因此优选为对应于突变位置(该靶核酸的位置A)的诊断寡核苷酸的3’-末端LNA-核苷酸。
在所有上述方法中的用于聚合的试剂优选为酶，例如RNA聚合酶、逆转录酶或DNA聚合酶。该DNA聚合酶优选为热稳定DNA聚合酶，如Taq、Pfu、Pwo或Tth。
利用下列实例可说明不同核酸的检测原则。单一反应容器含有用于同步检测一基因的两等位基因的PCR试剂混合物。这些等位基因在一个碱基位置上不同(等位基因Q’(突变体)的位置A与等位基因Q(正常)的位置A)。在该反应中使用三个引物、一个与两等位基因互补的基因引物及各自对于两等位基因之一有选择性的两个引物。碱基使引物的选择性产生作用，该碱基位在单一选择性引物的3’-末端系与Q’的位置A互补，另一引物的碱基与Q的位置A互补。两个引物含有对应于位置A在3’-位置的LNA。此外，为了容易区别最终的PCR产物，例如可选择等位基因特异的引物以便产生不同长度或具有不同标记的PCR产物，并通过例如凝胶电泳、毛细管电泳或本领域中已知的各种杂交技术方便检测不同长度或具有不同标记的PCR产物。
对于检测在单一碱基的核苷酸序列变异的杂交的选择性可利用连接酶反应增强。一般而言(Nature 327，293-297(1987)and Nature 327，298-303(1987))，观察到已知寡核苷酸长度越短对单一碱基变异的辨别效果越好。然而，短DNA-寡体具有极低的Tm，因此对DNA寡体长度设定了较低的限制。另一方面，该LNA修饰导致在Tm极为显著的增加(每次修饰3至8℃)，因此能使甚至4至25个寡核苷酸的短引物在与标准PCR及LCR(连接酶链反应)条件相容的条件下杂交到靶核酸，并且在对于单一碱基变异具有改善识别的情形下进行此杂交。和PCR一样，LCR使用交替温度(alternating temperature)的多重循环来扩增许多DNA的靶标序列。但LCR不使用单独核苷酸作模板延长反而藉助过量的寡核苷酸，该寡核苷酸与靶区域的双链互补。在双链模板DNA变性的后，利用与靶链其中之一相邻区域互补的两个(或更多)寡核苷酸引物起始该LCR程序。与任一链互补的寡核苷酸可被结合。在连接与第二次变性步骤的后，该原始模板与两个(或更多)新结合的产物作为提供靶序列指数扩增的额外连接的模板。此方法详述于Genomics，4：560-569(1989)，引入本文作为参考。本发明中提出含有至少一个LNA，优选含有4至25个核苷酸，更优选为5至20个核苷酸，甚至更优选为6至15个核苷酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个核苷酸的短寡核苷酸。在该“LCR程序”中此寡核苷酸会抗基因-多型性。在交替温度的多重循环之后，已扩增许多靶标序列并且可利用凝胶电泳、”三文治”-杂交或任一种本领域中叙述的许多方法加以检测。以下列步骤说明：
a)在杂交条件下结合靶核酸与适量的核苷三磷酸盐、至少两个寡核苷酸以及
用于寡核苷酸连接的试剂，其中至少一个该寡核苷酸为诊断寡核苷酸，该至
少一个诊断寡核苷酸为在位置A含有与待检测的靶核酸位置A发现的核苷酸
互补的核苷酸的寡核苷酸，该诊断寡核苷酸含有至少一个LNA，
b)连接任何在相邻位置杂交到该核酸的寡核苷酸以形成连接产物，其中使用
该核酸作为模板，
c)在连接之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离连接产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于寡核苷酸连接的试剂存在下，使步骤c)的单链
核酸与至少一个与步骤b)连接产物互补的寡核苷酸及至少一个诊断的寡核苷
酸杂交，该至少一个诊断寡核苷酸为在位置A含有与待检测的靶核酸位置A
发现的核苷酸互补的核苷酸的寡核苷酸，该诊断寡核苷酸含有至少一个LNA，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测量的连接产物，
f)检测形成的连接产物。
该方法当然可以在步骤b)的后停止并立刻观察。
优选的用于连接的试剂为酶，例如连接酶、优选为DNA连接酶、例如T4-DNA连接酶、更优选为热稳定酶，例如Taq DNA连接酶。
本方法的另一改善是LCR及PCR的联合使用。因此本方法提出将两个(或更多)短(例如8bp)上游LNA-引物代替单一上游引物杂交至模板。将两个(或更多)短LNA-引物彼此靠近地杂交，可利用连接反应使该短LNA-引物与其中一个结合。因此连接将确保充分的特异性。在连接之后，可延长经连接的引物。之前所述的两个热稳定连接酶和聚合酶建议利用交替温度多重循环以扩增许多DNA靶标序列。在双链模板DNA变性之后，利用连接与靶链其中之一相邻区域互补的两个(或更多)寡核苷酸引物起始该程序。该结合/连接的寡核苷酸形成一个由该聚合酶延长的上游”引物”。在第二次变性步骤之后，该原始模板链与新形成产物作为提供靶序列指数扩增的额外连接的模板。在交替温度多重循环之后，扩增许多DNA靶序列。
所有上述方法的诊断寡核苷酸具有下列通式a)           5’-Nua(NubLNAc)mNudAeNuf-3’
其中A为在位置A的LNA，在此该靶核酸的不同核酸序列彼此不同；LNA为LNA；Nu为选自除可与不同核酸形成特异的碱基配对的LNA以外的任何核苷酸的单体；a、b、c、d与f为0至30的整数，m为1至8的整数，e为1至6的整数，条件是a、b、c、d、e与f的总和至少为5。
此意指优选为该诊断寡核苷酸序列的至少一个位置A与待检测的靶核酸序列位置A互补，但与另一靶核苷序列的位置A不互补。此外，优选为该诊断寡核苷酸至少一个位置A为LNA。
延长产物的特异性检测为量测在样本中待检测核酸的量，例如也可利用以一个额外特征区别寡核苷酸的事实进行此特定检测。此种特点可例如为一组寡核苷酸的长度变化。延长不同的诊断寡核苷酸，然后产生不同长度的延长产物。也可藉由不同标示区别该诊断寡核苷酸。此种标记例如为在后续反应中藉由可检测基团的辅助而可被检测的彩色或萤光分子或化学基。此类化学基包含例如地高辛(digoxin)与地高辛配基(digoxigenin)的半抗原(hapten)。利用经标记的抗体与半抗原反应可以检测半抗原，然后检测该标记。另一种半抗原可例如为生物素(biotin)，其可利用不同经标记的抗体或straptavidin检测。
本文中，术语“标记”指通过其本身或作为检测系列中的一部份而可被检测的基团报道的基团的官能部分的实例有生物素，地高辛配基，荧光基团(可吸收电磁射线，例如特定波长的光或X-射线，以及接着将所吸收的能量转变成波长较长的辐射的基团；说明性实例为丹酰(5-二甲氨基)-1-萘磺酰基)，DOXYL(N-氧基-4，4-二甲基噁唑烷)，PROXYL(N-氧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷)，TEMPO(N-氧基-2，2，6，6，-四甲基哌啶)，二硝基苯基，吖啶，香豆素，Cy3和Cy5(生物检测***公司的商标)，原藻红，香豆酸，繖形酮，德克萨斯红，若丹明，四甲基若丹明，Rox，7-硝基苯并-2-氧杂-1-二唑(NBD)，芘，萤光黄，铕，钌，钐，和其它稀土金属)，放射性同位素标记，化学发光标记(在化学反应过程中通过发出光可检测到的标记)，自旋标记(自由基(例如取代的有机硝基氧)或其它利用电子自旋共振光谱学可检测的结合至生物分子的顺磁性的探针(例如Cu2+，Mg2+))，酶(例如过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，和葡糖氧化酶)，抗原，抗体，半抗原(可与抗体结合的，但本身不能激活免疫反应基团，如肽和类固醇激素，)，细胞膜穿透载体***如：脂肪酸残基，类固醇部分(胆固醇基)，维生素A，维生素D，维生素E，作为特异性受体的叶酸肽，介导细胞内吞作用的基团，表皮生长因子(EGF)，缓激肽，血小板衍生生长因子(PDGF)。特别关注的实例为生物素，萤光黄，德克萨斯红，若丹明，二硝基苯基，地高辛配基，钌，钐，Cy5，Cy3等。
用以度量待检测的核酸的量及核酸存在的不同延长产物可以各种方法检测。可以在分离该试剂混合物的后或相继在得到试剂混合物时，根据已知方法使用适当的标记同时单独检测该延长产物。以可检测基团标记在各寡核苷酸组的单独寡核苷酸为优选，对各单独寡核苷酸而言，该可检测基团不同。
已证明EP-A-0324474叙述的方法为利用类固醇荷尔蒙作为记号的优选方法。另一种方法为使用不同的萤光染料。可直接标示该寡核苷酸或可例如以对应的萤光标记赋予在抗体对化学基上。利用同时量测相当于不同寡核苷酸引物的数个频道的萤光可检测各种等位基因产物。并且利用萤光标记可以标示该产物的一部分，反的酶可用于出自该相同试剂混合物的其它产物。原则上，可采用标示与检测的任何的已知方法。
在连续或同步检测中，可以使用两个不同的化学基，优选为利用不同抗体可检测的半抗原，来标记该两个寡核苷酸。此种半抗原包含地高辛配基、生物素与萤光素。优选地，对萤光素的抗体及对地高辛配基的抗体具有不同酶作为标记。然后通过连续或同时接触酶-特异的可检测底物检测该核酸。
也可利用捕捉探针使一般延长反应的混合物随后进行变性反应，以使该单链延长产物键合到固定或可经由基团(例如生物素)固定的固体相上。或者可预先藉由例如蒽醌(anthraquinone)光化学作用(WO 96/31557)将捕捉探针永久地连接到固体相上。在这些方法中，反应的延长产物与所有待检测的核酸固定在一起。由于捕捉探针的特异性，因此可连续检测该核酸(藉由清洗步骤分离)。如果在单一容器中可同时产生及检测到待检测的信号，则可省略此清洗步骤。
在延长反应发生的后，从该试剂混合物取出不同两足够等分试样的液体(或如果检测超过两个等位基因且使用超过两组特异的引物则取相对更多等份)，检验各等分试样的延长产物。该等分试样由多重反应取得，取决于用于寡核苷酸的不同标记的数目、在各等分试样中可检测的扩增产物的相对数目。
本发明方法可应用在各种应用。例如可由一个单一检验对象(个别诊断法)的待检测核酸找出有关的某些疾病，例如代谢失调(metabolic disorders)、致死性疾病(lifestyle diseases)、癌症或遗传疾病。致死性疾病的实例为肥胖(obesity)、家族性血胆固醇过多(familial hypercholesterolaemia)、动脉硬化(atherosclerosis)与糖尿病(diabetes)。
含有待检测的核酸的样本典型为始生生物、原核生物或真核生物的细胞、组织样本或组织萃取物。在来自动物如哺乳动物或人类的样本的情形中，该样本可以是血液、血清(serum)、血浆(plasma)、网状细胞(reticulocytes)、淋巴细胞(lymphocytes)、尿、骨髓组织(bone marrow tissue)、脑脊髓液(cerebrospinal fluid)或由血液或淋巴制成的任何产物或任何类型的活组织活组织检查(biopsy)，如肌肉活组织检查、肝脏活组织检查、肾脏活组织检查、膀胱活组织检查、骨骼活组织检查、软骨活组织检查、皮肤活组织检查、胰腺活组织检查、肠道活组织检查、胸腺活组织检查、***活组织检查、子宫活组织检查、睪丸活组织检查、眼睛活组织检查或脑活组织检查。
此外，由于该方法良好的特异性，该方法也适合进行集合体筛选(pool-screening)的探针检验。根据此原则混合不同检验对象的大量个别探针。当诊断出在apo B3500-基因例如与糖尿病、家族性血胆固醇过多、动脉硬化或肥胖有关缺陷时，已证实在单一集合体(pool)中适合结合64个探针。利用本发明方法可确定包含于该集合体中的探针的此缺陷的存在与否。当根据本发明方法连续数次检验来自具有阳性结果(positive results)集合体的数个部分集合体时，少数几次测定(与现有技术相比)即足以检测出具有该缺陷的基因。
在本发明方法中，已证实对于不具缺陷的基因存在时能同时检测该基因特别有利。当筛选一集合体时，可交替检测突变体产物，或如果突变的等位基因不存在时检测正常基因。本发明方法除作为如两等位基因的检测反应的控制之外，也是量化待检测核酸的一种工具。
由于用于集合体-筛选法的样本并非患者特定而是不具名的，因此可将这些方法用于检验特别是流行病方面的疾病，例如AIDS病毒的污染率或例如高的胆固醇水平(elevated cholesterol levels)、高血压或糖尿病(大量筛选)。这些方法可供测定等位基因的频率。
该相同方法可应用在生物体、微生物的特种(species)、亚种(sub-species)或菌株(strain)的检测或诊断，或特别是细菌传染病物的特种(species)、亚种(sub-species)或菌株(strain)的检测或诊断及某些情况下可应用在病毒上。特别感兴趣的方面集中在密切相关的致病(pathogenic)/非致病(non-pathogenic)的种或菌株的同步检测。此外，本发明方法也适用于可靠检测，例如经由已知AT-序列可靠检测大肠杆菌K12(根据基因技术法评估)，因此可区别各种标准的大肠杆菌。该方法因此也可以应用在环境状态的分析上。
本发明的一重要主题为含有至少一个LNA的诊断寡核苷酸的用途，该LNA如藉由蒽醌(anthraquinone)光化学作用(WO96/31557)以数组形式(array format)共价附着到固体表面(Nature Genetics，suppl.vol.21，Jan 1999，1-60)。含有至少一个直接抗不同靶核酸序列的LNA的不同诊断寡核苷酸可以点在数组的中永久地附在该固体表面。此数组后续可进行延长反应或PCR。如果该诊断寡核苷酸附着在适当的显微镜载玻片，如经表面处理的玻璃或聚碳酸酯载玻片，便可在一市售的PCR加热循环器中进行延长反应或PCR反应。在PCR反应后，可利用适当标记检测阳性点(显示特定突变体者)。此方法的结果将为大量不同核酸半定量评估(semi-quantitative assessment)。
本发明优于现有技术的主要优点为实际上没有二级反应而可以同步检测在单一容器所含的混合物中的等位基因化合物。而且不需利用限制酶消化或后续杂交。藉由LNA寡聚物遵守沃森-克里克碱基配对原则并形成比DNA∶DNA所形成的相似二显性组合更加稳定的二显性组合，及含有3’位置LNA的引物为PCR反应的底物的事实的优点而达成此目的。单独等位基因的扩增过程产生高度辨别能力(交错反应)并在相同反应容器中发生数个反应。
本发明的另一主题为核酸检测的试剂盒。该试剂盒包括一组本发明的寡核苷酸及如有需要，额外的寡核苷酸与延长该寡核苷酸所需的佐剂。此外，该试剂盒可包括额外的寡核苷酸，例如互补链引物。优选地，试剂盒提供了酶、寡核苷酸与其它分离容器中的试剂。
本文中使用的术语“LNA”或“含LNA的寡核苷酸”是指包含至少一个通式I的核苷类似物的寡聚物及其碱性盐和酸性加成盐：
Figure A0080754300221
其中X选自-O-，-S-，-N(RN*)-，-CR6(R6*)；
B选自核碱基；
P指核苷间键合至下一单体或5’-端基的游离基位置。，此核苷间键合或5’端基任选地包括取代基R5；
R3或R3*为P*，其指与前一个单体或3’端基相连的核苷间键合；
R4*和R2*共同指由1-4个基团/原子组成的双游离基，所述1-4个基团/原子选自-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Ra)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-，和＞C＝Z，
其中Z选自-O-，-S-，和-N(Ra)-，并且Ra与Rb各自独立的选自氢，任选取代的C1-12-烷基，任选取代的C2-12-链烯基，任选取代的C2-12-炔基，羟基，C1-12-烷氧基，C2-12-烯氧基，羧基，C1-12-烷氧基羰基，C1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，一-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基(sulphono)，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，亚磺酰基(sulphanyl)，C1-6-烷基-硫，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基因(reporter group)和配体，其中芳基和杂芳基可任选地被取代，并且其中两个双取代基Ra及Rb共同指任选取代的亚甲基(＝CH2，被如对芳基的任选取代基所定义的取代基任选地取代一或二次)；和
存在的但不包含于P或P*中的取代基R1*，R2，R3，R3*，R5，R5*，R6和R6*，各自独立地选自氢，任选取代的C1-12-烷基，任选取代的C2-12-链烯基，任选取代的C2-12-链炔基，羟基，C1-12-烷氧基，C2-12-烯氧基，羧基，C1-12-烷氧基羰基，C1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，一-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰基氧基，磺酰基，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，亚磺酰基，C1-6-烷硫基，卤素，DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基因，和配体(其中后面的基团可以包括如对取代基B所定义的间隔物)，其中芳基和杂芳基可任选地被取代，其中两个双取代基可共同指定为指氧代，硫代，亚氨基，或任选取代的亚甲基，或者可共同形成由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺旋双游离基，该亚烷基链可选择性地被一个或多个选自-O-，-S-，和-(NRN)-的杂原子/基团中断和/或结束，其中RN选自氢和C1-4-烷基，并且其中两相邻(非-双)取代基可指定生成双键的另外的键；和RN*，当其存在且与双游离基无关时，选自氢及C1-4-烷基。
本文中使用的术语”LNA”(锁定的核苷类似物Locked Nucleoside Analogues)指并入寡聚物的双-环核苷类似物(通式I)。
本文中，术语“核碱基”包含自然产生的核碱基和非-自然产生的核碱基。如本领域的技术人员所知，一些以前认为的“非-自然产生”的核碱基后来在自然界中已发现。因此，“核碱基”不只包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，也包括杂环类似物和其互变异构物。核碱基的说明性实例是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶，嘌呤，黄嘌呤，二氨基嘌呤，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤，7-去氮杂黄嘌呤，7-去氮杂鸟嘌呤，N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶，N8，N6-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-(C3-C5)-炔基胞嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，假异胞嘧啶，2-羟基-5-甲基-4-三偶氮吡啶(triazolopyridine)，异胞嘧啶，异鸟嘌呤，肌苷和详述于Benner等人的美国专利第5,432,272号中的”非-自然产生”的核碱基。术语“核碱基”函盖每一个一种和所有的这些实例及其类似物和互变异构体。尤其关注的核碱基是腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，和尿嘧啶，这些都认为是与人类的治疗和诊断应用有关的自然产生的核碱基。
本文中所使用的术语“DNA嵌入剂”指可***至DNA或RNA螺旋，二显性组合或三显性组合的基团。DNA嵌入剂的官能部分的实例为吖啶，蒽，醌如蒽醌，吲哚，喹啉，异喹啉，二羟基醌，蒽环素，四环素，亚甲基蓝，蒽环酮，补骨脂素，香豆素，卤化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，dynemicin，金属复合物如1，10-菲咯啉-铜，三(4，7-联苯基-1，10菲咯啉)钌-钴-烯二炔如卡开素(calcheamicin)，卟啉，远端霉素，纺锤菌素，紫罗郡(viologen)，柔红霉素。尤其值得关注的实例为吖啶，醌如蒽醌，亚甲基蓝，补骨脂素，香豆素，和卤化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。
本文中，术语“光化学活性基”函盖可经受由光辐照引发的化学反应的化合物。关于此官能团的说明性实例为醌，尤其是6-甲基-1，4-萘醌，蒽醌，萘醌，和1，4-二甲基-蒽醌，二氮杂苯(diazirines)，芳香族氮化物，二苯甲酮，补骨脂素，重氮化合物，和二氮杂苯(diazirino)化合物。
本文中，“热化学活性基”定义为一官能团，该官能基团可与其它基团由热化学诱发而形成共价键。热化学活性基团的官能部分的说明性实例为羧酸、羧酸酯如活性酯、羧酸卤化物如酰基氟，酰基氯，酰基溴，和酰基碘、羧酸氮化物、羧酸酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酸卤化物、氨基脲、硫氨基脲、乙醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、苯酚、烷基卤、硫醇、二硫化物、伯胺、促胺、叔胺、肼、环氧化物、马来酰亚胺和硼酸衍生物。
本文中，术语“螯合基”指含有一个以上的结合位置且经常同时以一个以上的结合位置与其它分子，原子或离子结合的分子。螯合基的官能部分的实例为亚氨二乙酸，氨三乙酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，氨基膦酸等。
本文中，“配体”意指可与某些物质成键的化合物。配体可包括官能团如：芳基(如苯，吡啶，萘，蒽，和菲)、杂芳基(如噻吩，呋喃，四氢化呋喃，吡啶，二噁烷和嘧啶)、羧酸、羧酸酯、羧酸卤化物、羧酸氮化物，羧酸酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酸卤化物、氨基脲、硫氨基脲、乙醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、苯酚、烷基卤、硫醇、二硫化物、伯胺、促胺、叔胺、肼、环氧化物、马来酰亚胺、C1-C20烷基，其可选择地以一个或多个杂原子如氧原子，氮原子和/或硫原子中断和/或终止，选择性可含有芳香族或单/多不饱和烃，聚环氧乙烷如聚乙二醇，寡/聚酰胺如聚-β-丙氨酸，聚甘氨酸，聚赖氨酸，肽，寡/多糖类，寡/聚磷酸酯，毒素，抗生素，细胞毒物，和类固醇及“亲和力配体”，即对特定蛋白质，抗体，多糖和寡糖，和其它生物分子的位置具有特异性亲和力的官能团或生物分子。
本领域的技术人员很清楚，以上所提及的特定的有关DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基因，和配体的实例与讨论中的基团的“活性/官能”部分相对应。对于本领域的技术人员更加清楚的是DNA嵌入剂，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基因，和配体典型地以M-K-形式表示，其中M为讨论中的基团的“活性/官能”部分，而K为间隔物，通过该间隔物“活性/官能”部分连接到5-或6-元环上。因此，应当理解当B选自DNA嵌入物，光化学活性基，热化学活性基，螯合基，报道基因和配体时，基团B具有M-K-形式，其中M为DNA嵌入物，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因和配体的各基团的“活性/官能”部分，K为可选择的包含1-50个原子，优选1-30个原子，特别为1-15个原子，在5-或6-元环与”活性/官能”部分之间的间隔物。
本文中，术语“间隔物”指热化学作用和光化学作用的非-活性距离生成基团，该基团用来连接两个或多个上述定义的类型的不同部分。基于不同分子的特性包括疏水性，亲水性，分子柔顺性和长度(例如参见Hermanson等人”固定的亲和力配体技术(Immobilized Affinity Ligand Techiniques)，Academic Press，圣地亚哥，加州(1992)，p.137-ff)来选择间隔物。一般来说，间隔物的长度小于或等于约400，在一些应用上优选小于100。因此，该间隔物包括任选用一个或多个杂原子，如氧原子，氮原子和/或硫原子中断或结束的碳原子链。因此，该间隔物K可以包括一个或多个酰氨，酯，氨基，醚和/或硫醚官能团，和任选的芳香族或单/聚不饱和烃，聚氧乙烯如聚乙二醇，寡/聚酰胺如聚-β-丙氨酸，聚甘氨酸，聚赖氨酸和肽，通常还有寡糖，寡/聚磷酸酯。此外，该间隔物可由其结合成的单位所组成。考虑到理想的或必须的基团的“活性/官能”部分的定位和空间取向与5-或6-元环的关系，该间隔物的长度可以变化。特别值得关注的实施方案，该间隔物包括一化学上可劈开的基团。此化学上可劈开的基团的实例包括在还原条件下可劈开的二硫化物基团，由肽酶可劈开的肽的片段等。
变量K指一个单键以使所讨论的基团的”活性/官能”部分直接连接到5-或6-元环上。
在一个优选实施方案中，通式I和II中的取代基B优选选自核碱基，特别选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶。
在寡聚物中(通式I)，P指用于核苷间键合的连接至下一单体或5’-端基的游离基位置。第一个可能性适用于当所讨论的LNA不是5’-末端“单体”时，而后一可能性适用于当所讨论的LNA是5’-末端“单体”。应理解(也可由进一步说明如下的核苷间键合和5’-端基的定义了解)此核苷间键合或5’-端基可包括取代基R5(或同样适用的取代基R5*)从而与P基团形成一双键。(5’末端指核苷内对应于核糖部分的5’碳原子的位置)。
另一方面，与前一个单体或3’-端基(P’)相连的核苷间键合可源自以取代基R3或R3*之一所定义的位置，优选为来自以取代基R3*所定义的位置。(3’-末端指核苷内对应于核糖部分的3’碳原子的位置)
应理解到作为R3*(“正常”的结构)或R3(木(xylo)结构)的P*基团的取向代表着两种同样有趣的可能。已发现所有“正常”(R3*＝P*)寡聚物和具有“正常”LNA单体和核苷酸(2-脱氧核苷酸和/或核苷酸)结合的寡聚物强烈地与DNA，RNA和其它LNA寡聚物杂交(亲和力会增加)。目前认为结合所有-木LNA寡聚物和具有木LNA(R3＝P*)单体的寡聚物和，例如，木核苷酸(核苷酸和/或2-脱氧核苷酸)将引起类似的杂交特性。已显示出当具有“正常”结构(R3*＝P*)的寡聚物杂交(亲和力会增加)至DNA，RNA和其它LNA寡聚物时可引起一反向平行取向的LNA寡聚物。因此要设想当一具有木结构(R3＝P*)的寡聚物杂交至DNA，RNA或另一LNA时将会引起的平行方向定位取向。
鉴于以上所述，应考虑到在寡聚物中“正常”LNAs和木-LNAs(xylo-LNAs)的结合能够产生有趣的特性，只要这些不同类型的单***于区域中，即使包含至少5个，如至少10个单体(例如木-LNA，木核苷酸等单体)的未中断区域被包含至少5个，如至少10个其他的类型(例如“正常”LNA，“正常”核苷酸等)的单体的未中断区域接随等。此嵌合类型的寡聚物可以，例如用来捕捉核酸。
本文中，术语“单体”涉及自然产生的核苷酸，非-自然产生的核苷酸，PNAs，LNAs等。因此，“下一个单体”指5’-末端方向的相邻单体，“前一个单体”指3’-末端方向的相邻单体。此下一个单体和前一个单体，是以LNA单体的位置为参考的，可为自然产生的核苷酸或非-自然产生的核苷酸，而且甚至为LNA单体。
因此，本文中(可由上述定义衍生而来)，术语“寡聚物”意指经由合并一个或多个LNA(s)修饰的寡核苷酸。
本文中，双游离基(R2*-R4*)的方向为左-手侧表示具有数目最小的取代基而右手侧表示具有数目最大的取代基，因此，当R2*和R4*共同指定为指双游离基“-O-CH2-”，应理解氧原子代表R2*，从而该氧原子，例如连接至R2*的位置，且亚甲基代表R4*。
就合并入寡聚物中LNA(s)的双游离基(R2*-R4*)的结构的多种有趣的可能而论，相信该双游离基优选选自-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-，-Y-(CR*R*)r+s-Y-，-Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r+s-，-Y-，-Y-Y-，其中各Y独立地选自-O-，-S-，-Si(R*)2-，-N(R*)-，＞C＝O，-C(＝O)-N(R*)-，和-N(R*)-C(＝O)-，其中各R*独立地选自氢，卤素，叠氮基，氰基，硝基，羟基，巯基，氨基，单-或双(C1-6-烷基)氨基，任选取代的C1-6-烷氧基，任选取代的C1-6-烷基，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因，和配体，并且/或者两相邻(非双)R*可共同指定一双键；且r和s各为0-4，条件是r+s的总和为1-4。特别值得关注的情况是其中双游离基是选自-Y-，-(CR*R*)r+s-，-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-，和-y-(CR*R*)r+s-Y-的那些基团，其中r和s各为0-3，条件是r+s的和为1-4。
特别值得关注的寡聚物是其中寡聚物的至少一个一种LNA的R2*和R4*共同指定选自-O-，-S-，-N(R*)-，-(CR*R*)r+s+1-，-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-，-O-(CR*R*)r+s-O-，-S-(CR*R*)r+s-O-，-O-(CR*R*)r+s-S-，-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-，-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-，-S-(CR*R*)r+s-S-，-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-，-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-，和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-的双游离基。
更优选的R*选自氢，羟基，任选取代的C1-6-烷氧基，任选取代的C1-6-烷基，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因，和配体，并且任何剩余取代基R*为氢。
对一优选的变量，至少一个LNA的双游离基的R*基团选自DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因，和配体(其中后面的基团可包括如对取代基B所定义的间隔物)。
优选地，存在的且不含于P或P*中的LNA(s)的取代基R1*，R2，R3，R3*，R5，R6，R6*，各自独立地选自氢，任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，羟基，C1-6-烷氧基，C2-6-烯氧基，羧基，C1-5-烷氧羰基，C1-6-烷基羰基，甲酰基，氨基，单-和双(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和双(C1-6-烷基)-氨基-羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，叠氮基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基，亚磺酰基，C1-6-烷硫基，DNA嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因，和配体，和卤素，其两个双取代基可共同指定氧代，且当RN*存在且不为双游离基时，选自卤素和C1-4烷基。
在LNAs的优选的变量中，X选自-O-，-S-，和-NRN*-，尤其为-O-，并且存在且不含于P或P*中的LNA(s)的各取代基R1*，R2，R3，R3*，R5，R5*，R6和R6*指卤素。
在更优选的变量中，X为O，R2选自氢，羟基，和任选取代的C1-6-烷氧基，R3与R3*之一为P*而另一个为氢，和R1*，R5与R5*指定为指氢，更确切地，该双游离基(R2*-R4*)选自-O-，-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-，-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-，-(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-，和-(CH2)2-4-，尤其选自-O-CH2-，-S-CH2-，和-NRH-CH2-。一般，由于具有目前获得的结果，优选地，构成R2*和R4*的双游离基形成两碳原子桥，亦即双游离基形成具有呋喃糖环(X＝O)的五元环。特别关注的也为那些寡聚物，其中式I中合并的LNA中的R2*和R4*共同指定为指选自-O-CH2-，-S-CH2-，和-NRH-CH2-的双游离基；X为O，B指定为指选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶的核碱基；R2为氢，R3或R3*之一指定为指P*，另一个为氢，，R1*，R3，R5，和R5*指定为指氢。
在这些实施方案中，更优选的为并入寡聚物中的至少一个LNA包括选自腺嘌呤和鸟嘌呤的核碱基(取代基B)。尤其是，具有LNA并入其中的寡聚物包括至少一个选自胸腺嘧啶，尿嘧啶和胞嘧啶的核碱基和至少一个选自腺嘌呤和鸟嘌呤的核碱基。至于LNA单体，尤其优选的为核碱基选自腺嘌呤和鸟嘌呤。
在这些关注的具体实施方案中，寡核苷酸的所有单体为LNA单体。
由通式I(寡聚物中的LNA(s))和与之相关的定义，依据取代基的特性和可能的双游离基如下所示，寡聚物中可能存在一到数个不对称碳原子。
在一个变量中，R3*指定为指P*。在另一个变量中R3指定为指P*，在第三个变量中，在一些LNAs中R3*指定为指P*，在寡聚物中其它的LNAs的R3指定为指P*。
一般的寡聚物包括1-10000个通式I的LNA(s)和0-10000个选自自然产生的核苷和核苷类似物的核苷。核苷酸数目和LNA(s)数目的总和至少为2，优选至少为3，特别至少为5，尤其至少为7，例如在2-15000的范围，优选在2-100的范围，如3-100，特别为2-50的范围，如3-50或5-50或7-50。
在本文中，术语“核苷”指杂环碱基的糖苷。术语“核苷”广泛的使用于包括非-自然产生的核苷，自然产生的核苷与其它核苷类似物。有关核苷的说明性的例子为包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。关于该种核苷的碱基，应了解其可能为任何自然发生的碱基例如腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，和尿嘧啶和任何修饰的变体或任何可能的非自然碱基。
当考虑核苷的定义与已知的核苷(自然产生和非-自然产生)和核苷类似物(包括已知的双-与三环类似物)时，显然地，寡聚物可以包括一个或多个LNA(s)(由于所选择的取代基和所选择的双游离基，其可能相同或不同)和一个或多个核苷和/或核苷类似物。本文中“寡核苷酸”指由通过核苷间键合所连接的连续链的核苷；然而，应理解寡聚物(寡核酸)中一个或多个核苷酸单位(单体)的核碱基可以被上述所定义的取代基B修饰。
如上文所提及，寡聚物的LNA(s)通过核苷间键合与其它单体连结。本文中“核苷间键合”指由2到4，优选为3个选自-CH2-，-O-，-S-，-N(RH)-，＞C＝O，＞C＝NRH，＞C＝S，-Si(R”)2-，-SO-，-S(O)2-，-P(O)2-，-PO(BH3)-，-P(O，S)-，-P(S)2-，-PO(R”)-，-PO(OCH3)-，和-PO(NHRH)-的基团/原子所组成的键合，其中RH选自氢和C1-4-烷基，和R”选自C1-6-烷基和苯基。该种核苷间键合的说明性的例子为：-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(当作为与下一个单体的键合时包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO--NRH、-O-CH2-CH2-NRH、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(当作为与下一个单体的连接时包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH--O-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(当作为对与下一个单体的连接时包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(OCH)3-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-o-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-、和-Si(R”)2-O-、其中优选的是-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(CH3)-O-，和-O-PO(NHRN)-O-，其中RH选自氢和C1-4烷基，R’选自C1-6烷基和苯基。Mesmaeker等人的Current Opinion inStructural Biology 1995，5，343-355中进一步提出了说明性的例子。核苷间左手侧的健合与5-元环以取代基P*结合，而右手侧与前一个单体的5’-位结合。
由上述说明很清楚当讨论中的LNA为5’-末端的单体时，P基团也可指5’-端基。这种5’-端基的实例有氢、羟基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C1-6烷基羰氧基、任选取代的芳氧基、单磷酸根、双磷酸根、三磷酸根、和-W-A’-，其中W选自-O-，-S-，和-N(RH)-，而RH选自氢和C1-6烷基，A’选自DNA嵌入物，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因，和配体(其中后面的基团可包含如对取代基B所定义的间隔物)。
于本文的说明和权利要求中，“单磷酸根”，“双磷酸根”，和“三磷酸根”分别指下式的基团：-O-P(O)2-O-，-O-P(O)2-O-P(O)2-O-，和-O-P(O)2-O-P(O)2-O-P(O)2-O-。
在特别关注的实施方案中，基团P指定为指选自单磷酸根、双磷酸根和三磷酸根的5’-端基。尤其关注的是三磷酸根的变异物作为核酸聚合酶的底物。
相似地，当讨论中的LNA为3’-末端的单体时，该P*基团可指定为指3’-端基。这种3’-端基的实例有氢、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基羰氧基、任选取代的芳氧基、和-W-A’-，其中W选自-O-、-S-和-N(RH)-而，RH选自氢和C1-6-烷基，A’选自DNA嵌入物，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基，报道基因和配体(其中后面基团可包含如取代基B所定义的间隔物)。
优选的LNA(s)的变异物，其寡聚物具有下列通式V：
           G-[Nu-L]n(o)-{[LNA-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*    V其中q为1到50；n(0)，.....，n(q)各自独立地为0到10000；m(1)，.....，m(q)各自独立地为1到10000；条件是n(0)，.....，n(q)和m(1)，.....，m(q)的总和为2到15000；G指5’-端基；Nu各自独立地指选自自然产生的核苷和核苷类似物的核苷；LNA各自独立地指核苷类似物；L各自独立地指选自Nu和LNA两基团之间的核苷间键合，或L与G*一起指3’-端基；和LNA-L各自独立地指上述所定义的通式I的核苷类似物。
在该变异物中，一般地，LNAs优选包括不同的核碱基，特别是选自胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶的核碱基和选自腺嘌呤和鸟嘌呤的核碱基。
该寡聚物也打算包括嵌合寡聚物。术语“嵌合寡聚物”意指两个或多个寡聚物带有不同来源直接或由间隔物连接的单体。可结合的该寡聚物说明性的例子有肽，PNA-寡聚物，含有LNAs的寡聚物，和寡核苷酸寡聚物。该具有木-LNA(R3＝P*)区域和“正常”LNA(R3*＝P*)区域的寡聚物的结合可构成作为嵌合寡聚物的例子，因为各个区域可具有不同的亲和性和特异的结构。
一般地，以亲和力和特异性而言该寡聚物具有惊人地良好的杂交特性。因此，该寡聚物含有至少一种核苷类似物，该核苷类似物赋予该具有一个互补DNA的寡核苷酸的寡聚物较高的Tm，该Tm比不含有任何核苷类似物的相应的未经修饰的对照寡核苷酸至少高2.5℃，优选为至少高3.5℃，特别则至少高4℃，尤其至少高5℃。尤其是该寡聚物的Tm至少提高2.5×N℃，优选为至少提高3.5×N℃，特别则至少提高4×N℃，尤其至少提高5×N℃，其中N为核苷类似物的数目。
在与互补RNA寡核苷酸的杂交中，至少一种核苷类似物赋予该具有互补DNA寡核酸的寡聚物较高的Tm，该Tm比相应的未经修饰的不含有任何核苷类似物的对照的寡核苷酸至少高4℃，较佳为至少高5℃，较特别则至少高6℃，尤其至少高7℃。尤其是该寡聚物的Tm至少是提高4×N℃，较佳者为至少提高5×N℃，较特别则至少提高6×N℃，尤其至少提高7×N℃，其中N为核苷类似物的数目。
术语“相应的未经修饰的对照寡核苷酸”指寡核苷酸只包括自然产生的核苷酸，其在相同的绝对顺序(和相同的方向)表示相同的核碱基。
该Tm在下列条件之一下测得：a)10mM Na2HPO4，pH7.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA；b)10mM Na2HPO4，pH7.0，0.1mM EDTA；或c)3M四甲基氯化铵(TMAC)，10mM Na2HPO4，pH7.0，0.1mM EDTA；
优选a)条件，等摩尔量(一般为1.0μM)的寡聚物和互补DNA寡核苷酸。
该寡聚物优选如上所定义，至少一种核苷类似物具有通式I，其中B为核碱基。特别有趣的是至少一种核苷类似物包括选自腺嘌呤和鸟嘌呤的核碱基的情况。
再者，有关特异性和亲和力，当该寡聚物与部份互补的DNA寡核苷酸杂交或与部份互补RNA寡核苷酸杂交时，含有一个或多个与该寡聚物错误的配对，将因该错误的配对而呈现出Tm减少，该结果系相等或大于相应的未含有任何核苷类似物的未经修饰的对照核苷酸其所观察到Tm的减少。同样地，该寡聚物对杂交缓冲液中离子强度与相应的未经修饰的对照核苷酸一样具有相同的Tm敏感性。
这里所定义的寡聚物为通常至少有1％经过修饰，如至少2％经过修饰，例如3％经过修饰，4％经过修饰，5％经过修饰，6％经过修饰，7％经过修饰，8％经过修饰，或9％经过修饰，至少10％经过修饰，例如至少11％经过修饰，例如12％经过修饰，13％经过修饰，14％经过修饰，或15％经过修饰，至少20％经过修饰，例如至少30％经过修饰，至少50％经过修饰，例如70％经过修饰，和在一些有趣的应用中100％经过修饰。
优选寡聚物比相应的未经修饰的对照寡核苷酸具有更高的3’-核外分解稳定性。应了解该寡聚物(其中LNAs被并入的)和LNAs包括其盐类，其中药理学上可接受盐类尤其重要。盐类包括酸加成盐和碱性盐。例如，酸加成盐的实例有盐酸盐，钠盐，钙盐，钾盐等。碱性盐的例子是这样的盐，其中(残余)相反离子选自碱金属，如钠和钾，碱土金属，如钙，和铵离子(+N(Rg)3Rh，其中各个Rg和Rh独立地指任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的芳基，或任选取代的的杂芳基)。药理学上可接受盐为，例如详述于Remington’s Pharmaceutically Science，17.Ed.Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mack Publishing Company，Easton，PA，U.SA.，1985和较近版本和于Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中的那些。因此，这里所用的短语“其酸加成盐或碱性盐”包含该种盐类。再者，该寡聚物、LNAs和任何中间产物或起始物都可以水合物形式存在。
附图说明图1说明具有配对的3’-末端的LNA引物作为PCR引物。图2藉由在PCR反应中并入3个DNA寡体获得寡核苷酸指导的单一碱基突变。A)利用3个寡核苷酸起始双链PCR引物及一个突变寡体，用X指示的错配碱基遗子。B)在2次PCR循环后生成4个单链PCR产物。C)在少许额外的PCR循环后产物1和4生成含有预期突变的双链PCR产物。图3具有LNA引物的等位基因特异的PCR。左侧面板显示利用引物组EQ3053/EQ3213“野生型”反应的结果。“G”表示使用ApoB基因的”G-等位基因”作为模板，“A”表示使用ApoB基因的”A-等位基因”。右侧面板显示利用引物组EQ3157/EQ3176“突变型”反应的结果。注意该引物指向非编码链。“C”表示使用ApoB基因野生型的”G-等位基因”作为模板，“T”表示使用ApoB基因突变的“A-等位基因”。记号为LowDNA MassTM(美国马里兰州Rockville郡Life Techologies公司GibcoBRL序号10068-013)。图4比较LNA与DNA引物。左侧面板显示具有LNA/DNA引物组EQ3053/EQ3213的结果。右侧面板显示具有引物组EQ3647/EQ3213”的结果。”G”表示使用ApoB基因的“G-等位基因”作为模板，“A”表示使用ApoB基因的“A-等位基因”以及“H2O”表示在该PCR反应不含模板。记号为Low DNA MassTM(美国马里兰州Rockville郡Life Techologies公司GibcoBRL序号10068-013)。图5一个接一个循环地监测该扩增过程。利用EQ3053/EQ3213引物组以及”A-等位基因”质粒或“G-等位基因”质粒作为模板，于”G-等位基因”(G，上曲线)与”A-等位基因”(A，下曲线)扩增期间增加萤光。图6利用EQ3053/EQ3213引物组以及”A-等位基因”(A，下曲线)模板或”G-等位基因”(G，上曲线)模板产生PCR片段的熔融曲线分析。上面板显示键合到双链扩增子的SyBR Green I染料的萤光。下面板显示上面板中该熔融曲线的一次负导数(-dF/dT)。在-dF/dT图上的波峰视为Tm。
实施例
实施例1具有LNA引物的序列特异的扩增引物的合成与分析
除了将LNA amidites偶合时间从标准两分钟增加至五分钟之外，根据DNA合成机(Pharmacia Gene Assembler Special，Pharmacia AB，Uppsala，Sweden)的流程，采用标准的偶合条件。逐步偶合的产率约为99％。一般采用标准的2’-脱氧核苷CPG或聚苯乙烯固体支持体。完成所要的序列之后，利用32％氨水(55℃ 5或10小时)完成从固体支持体裂解并移除保护基。在5’-0-DMT-ON模式合成的LNA利用逆相HPLC(Delta Pak C-18，300A，管柱大小0.4×30cm)在0.05M乙酸三乙基铵缓冲液pH7.0(流率1.5cm/分钟)的乙腈浓度梯度中纯化。蒸发含有5’-0-DMT-ON LNA的部分(30至35分钟的停留时间)，在80％乙酸(1cm，室温，1小时)进行去三苯甲基化。蒸发之后，利用如上述的逆相HPLC(洗脱为单峰)再纯化LNA。样本制备
利用哺乳动物血液的DNA分离试剂盒(丹麦，Hvidovre，Roche MolecularBiochemicals，Roche分子***序号1 667 327)，并紧接着依照制造商的建议步骤，从5毫升全血分离人类基因组DNA。
利用PCR扩增部分含有ApoB3500基因座的野生型人类ApoB基因(Ludwig etal.(1987)DNA 6：363-372；accession no.M19828，SEQ ID ON 4)产生ApoB基因的“G-等位基因”。利用TOPOTM TA Cloning试剂盒(美国，加州，Carisbad，Invitrogen公司，Invitrogen，序号K4500-01)将该PCR片段克隆到质粒pCR2.1-TOPO上。利用QUIAGEN质粒试剂盒(德国，Hilden，QIAGEN德国)从细菌培养中纯化质粒DNA。利用ALFexpress II DNA分析***(Amersham Pharmacia Biotech)并紧接着依照制造商的建议步骤，藉由DNA排序证实***的DNA序列。PCR扩增
利用Hybaid PCR Express加热循环器(英国，Middlesex，Hybaid)在0.5毫升的薄壁试管中进行PCR反应。该dNTP来自瑞典，Uppsala，Amersham PharmaciaBiotech AB。最终试剂混合物的组成如下：dATP、dGTP、dTTP、dCTP：各200μM1.5mM MgCl25μL 10×GeneAmp PCR缓冲液(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1μM引物EQ3053，SEQ ID NO 11μM引物EQ3054，SEQ ID NO 21单位AmpliTaq Gold聚合酶(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序号N808-0240)2μL在连续稀释中的DNA模板，参见图150μL总体积热循环变性：                  95℃15分钟循环：                  35次(在94℃30秒；在63℃30秒；在72℃30秒)最终延长：              10分钟72℃冷却至4℃延长产物的检测
10μL PCR产物随后与2μL应用缓冲液(40％蔗糖，0.25％溴苯酚蓝，0.25％二甲苯苯胺(xylene cyanol)，0.1M EDTA pH8.0)混合，并且在琼酯糖凝胶(agarosegel)中电泳。该凝胶由1％SeaKem、1×TAE中琼酯糖(美国，宾州，费城，FMCBioProducts公司)、0.5μg/mL溴苯酚蓝(丹麦，Vallensbaek Strand，Sigma-Aldrich丹麦A/S，Sigma-Aldrich序号E7637)(50×TAE＝242克Tris碱基，57.1毫升冰醋酸，100毫升0.5M EDTA pH8.0)组成。该凝胶在大约5V/cm电压下0.5至1小时。利用Image-Master VDS设备(瑞典，Uppsala，Amersham Pharmacia Biotech AB)拍摄萤光。典型实验示于图1。
为了证实具有LNA单体的PCR引物中的3’-末端取代基是否可提供等位基因特异的扩增，用两组引物EQ3053/ApoBR2与EQ3054/ApoBR2扩增DNA模板。只要使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”作为模板，则该引物组EQ3053/ApoBR2(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 3)会产生667bp PCR，而当使用30.4毫微克(ng)或更少的ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作为模板时，该EQ3053/ApoBR2引物组不会生成任何特异的PCR产物。结果示于图1。EQ3053(SEQ ID NO 1)：5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC GLNA-3’EQ3054(SEQ ID NO 2)：5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC ALNA-3’ApoBR2(SEQ ID NO 3)：5’-TTT AGA TCA TTT AGT TTC AGC CC-3’ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACAC GGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACAC AGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’
实施例2利用具有LNA引物的等位基因特异的PCR检测ApoB R3500Q突变
载脂蛋白B(Apolipoprotien B，ApoB)为可由LDL-受体识别的低密度脂蛋白(LDL)复合体的不交换蛋白。家族性缺陷ApoB 100为在氨基酸3500(arg gln)的碱基转变(GA突变)引起的正染色体显性脱序(autosomal dominant disorder)-ApoBR3500Q突变。该突变会减低LDL复合体对LDL受体的亲合性并导致血浆中LDL胆固醇水平升高。在正常人群中，该突变流行率对杂合子(heterozygote)为1∶500，对纯合子(homozygote)为1∶1,000,000(Harrison’s Principle of Internal Medicine，14thedition.by Fauci，A.S.et al.(Eds.)McGraw Hill)。
为了证实具有LNA引物的PCR的多用途，已建立能正向鉴定ApoB R3500Q多型性的“G-等位基因”和“A-等位基因”的两等位基因特异的PCR。引物的合成与分析
主要如实施例1所述进行LNA引物的合成与分析。由商业来源(丹麦，Aarthus，DNA Technology)获得如经HPLC纯化寡体的下游DNA引物。样本制备
如实施例1所述利用PCR扩增部分含有ApoB3500基因座的野生型人类ApoB基因产生该ApoB基因的“G-等位基因”。利用在氨基酸3500于PCR扩增部分含有ApoB3500基因座(SEQ ID NO 4)的野生型人类ApoB基因的过程中引起寡核苷酸导入的单一碱基突变(G A突变)。通过在PCR反应中并入3DNA寡体、两扩增寡体与涵盖欲突变部位的一个寡体获得寡核苷酸指导的单一碱基突变，此寡体在产生突变处含有一个错配。在图2中说明此原则。利用TOPOTM TA Cloning试剂盒(美国，加州，Carisbad，Invitrogen公司，Invitrogen，序号K4500-01)将该PCR片段克隆到质粒pCR2.1-TOPO。利用QUIAGEN质粒试剂盒(德国，Hilden，QIAGEN德国)从克隆的细菌培养中纯化质粒DNA。然后利用ALFexpress II DNA分析***(Amersham Pharmacia Biotech)并紧接着依照制造商的建议步骤，藉由DNA排序对存在的所希望的突变筛选质粒制剂。PCR扩增
利用Eppendorf Mastercycler Gradient加热循环器(德国，汉堡，Eppendorf-Netheler-Hinz德国)在0.5毫升的薄壁试管进行PCR反应。该dNTP来自瑞典，Uppsala，Amersham Pharmacia Biotech AB。最终试剂混合物组成如下：人类ApoB3500基因座的野生型(G-等位基因)检测方法dATP、dGTP、dTTP、dCTP：各200μM1.5mMMgCl25μL 10×GeneAmp PCR缓冲液(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1μM引物EQ3053，SEQ ID NO 11μM引物EQ3213，SEQ ID NO 61单位AmpliTaq Gold聚合酶(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序号N808-0240)2μLDNA模板(约50ng质粒/μL)。50μL总体积利用PCR扩增产生人类ApoB基因“G-等位基因”与“A-等位基因”并且使用克隆的质粒pCR2.1-TOPO。热循环变性：                      95℃15分钟循环：                      35次(在94℃30秒；在55℃30秒；在72℃30秒)最终延长：                  10分钟72℃冷却至4℃检测
随后利用标准的琼酯糖凝胶电泳(参见实施例1)分析PCR产物。不同的仅是2％琼酯糖并利用GelStar(美国，缅因州，Rockland，FMC BioProducts)以1∶30.000稀释在凝胶中着色。该块存有永久纪录的凝胶利用一合适的UV-透照器(ModelTM-20E UV Product，Upland，CA，USA)以及滤光镜(Kodak Wratten#9 EastmanKodak Co.，Rochester，NY，USA)拍照。人类ApoB3500基因座的突变型(A-等位基因)检测程序dATP、dGTP、dTTP、dCTP：各200μM1.5mM MgCl25μL10×GeneAmp PCR缓冲液(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1μM引物EQ3157，SEQ ID NO 71μM引物EQ3176，SEQ ID NO 81单位AmpliTaq Gold聚合酶(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序号N808-0240)2μLDNA模板(约50ng质粒/μL)。50μL总体积利用PCR扩增产生人类ApoB基因“G-等位基因”与“A-等位基因”并使用克隆的质粒pCR2.1-TOPO。热循环变性：                     95℃15分钟循环：                     35次(在94℃30秒；在67℃30秒；在72℃30秒)最终延长：                 10分钟72℃冷却至4℃检测
随后利用标准的琼酯糖凝胶电泳(参见实施例1)分析PCR产物。不同的仅是2％琼酯糖并利用GelStar(美国，缅因州，Rockland，FMC BioProducts)以1∶30.000稀释在凝胶中着色。该块存有永久纪录的凝胶利用一合适的UV-透照器(ModelTM-20E UV Product，Upland，CA，USA)以及滤光镜(Kodak Wratten#9 EastmanKodak Co.，Rochester，NY，USA)拍照。结果
显示具有LNA单体的PCR引物中的3’-末端取代基能提供等位基因特异的扩增DNA模板，该模板含有借助两组引物EQ3053/EQ3213与EQ3157/EQ3176扩增的人类ApoB的“G-等位基因”和“A-等位基因”。EQ3053(SEQ ID NO 1)：5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC GLNA-3’EQ3123(SEQ ID NO 6)：5’-GTT TTT CGT ACT GTG CTC CCA GAG-3’EQ3157(SEQ ID NO 7)：5’-CCC TGC AGC TTC ACT GAA GAC TLNA-3’EQ3176(SEQ ID NO 8)：5’-CAC CTC TTA CTT TTC CAT TGA GT-3’ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACAC GGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACAC AGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’
只要使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”作为模板，则该引物组EQ3053/EQ3213(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 6)会产生153bp PCR，而当使用ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作为模板时，该引物组不会生成任何特异的PCR产物。参见图3。
如使用ApoB基因的“突变体”或“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作为模板，则该引物组EQ3157/EQ3176(SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8)会产生145bp PCR，而当使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“野生型”或“G-等位基因”作为模板时，该引物组不会生成任何特异的PCR产物。参见图3。注意两引物组EQ3053/EQ3213与EQ3157/EQ3176是指向模板分子的不同链。
实施例3DNA引物无法辨别野生型与突变型
为了评估LNA与DNA引物之间的差异，建立两个PCR反应。
一个反应如实施例2所述为利用LNA引物EQ3053检测人类ApoB3500基因座的野生型(G-等位基因)的反应。
另一个反应类似，但以使用用具有类似EQ3053的DNA引物代替使用LNA引物EQ3053。引物的合成与分析
主要如实施例l所述进行LNA引物的合成与分析。由商业来源(丹麦，Aarthus，DNA Technology)获得如经HPLC纯化寡体的下游DNA引物。PCR扩增
利用Eppendorf Mastercycler Gradient加热循环器(德国，汉堡，Eppendorf-Netheler-Hinz德国)在0.5毫升的薄壁试管进行PCR反应。该dNTP来自瑞典，Uppsala，Amersham Pharmacia Biotech AB。最终试剂混合物组成如下：
利用LNA引物的反应含有1μM引物EQ3053(SEQ ID NO 1)及1μM引物EQ3213(SEQ ID NO 6)。
利用DNA引物的反应含有1μM引物EQ3647(SEQ ID NO 9)及1μM引物EQ3213(SEQ ID NO 6)。
利用LNA与DNA反应在其它方面完全相同，为：dATP、dGTP、dTTP、dCTP：各200μM1.5mM MgCl25μL 10×GeneAmp PCR缓冲液(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1单位AmpliTaq Gold聚合酶(美国，康内得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序号N808-0240)2μLDNA模板(约50ng质粒/μL)。50μL总体积人类ApoB基因的“G-等位基因”与“A-等位基因”两个模板为实施例2所述的质粒。热循环变性：            95C15分钟循环：            35次(在94℃30秒；在55℃30秒；在72℃30秒)最终延长：        10分钟72℃冷却至4℃检测
随后利用标准的琼酯糖凝胶电泳(参见实施例1)在％琼酯糖中并如实施例2所述利用GelStar(美国，缅因州，Rockland，FMC BioProducts)着色分析PCR产物。2。最后该凝胶如实施例2所述方式拍照。结果
如图4所见，当使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”作为模板，该引物组EQ3053/EQ3213(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 6)会产生153bp PCR产物，而当使用ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作为模板时，该引物组不会生成任何特定PCR产物-参见图4。EQ3053(SEQ ID NO 1)：5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC GLNA-3’EQ3123(SEQ ID NO 6)：5’-GTT TTT CGT ACT GTG CTC CCA GAG-3’ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACAC GGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCACT-3’ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACAC AGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCACT-3’当使用“G-等位基因”或“A-等位基因”两者作为模板，该所有DNA引物组EQ3647/EQ3213(SEQ ID NO 9，SEQ ID NO 6)会产生153bp PCR-参见图4。EQ3647(SEQ ID NO 9)：5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC G-3’EQ3123(SEQ ID NO 6)：5’-GTT TTT CGT ACT GTG CTC CCA GAG-3’
我们推断LNA引物而非相似的DNA引物能检测ApoB R3500Q突变的单一碱基变异。
实施例4应用在Roche光循环器中的具有LNA引物的序列特异的扩增
为了说明具有LNA引物的PCR的灵活性，在光循环器(LightCycler)(德国，幕尼黑，Roche Diagnostics德国)上建立一个等位基因特异的PCR。光循环器为一种装置，该装置在单一操作中利用Tm量测可以扩增及鉴定所产生的PCR产物。
能正向辨别人类ApoB R3500Q多型性的“G-等位基因”的反应如下：引物的合成与分析
主要如实施例1所述进行LNA引物的合成与分析。由商业来源(丹麦，Aarthus，DNA Technology)获得如经HPLC纯化寡体的下游DNA引物。PCR扩增
利用该光循环器并紧接着依照制造商的建议步骤在硼硅酸玻璃毛细管内进行PCR反应。各反应含有：2μL的光循环器-DNA主SyBR Green I混合物(德国，幕尼黑，RocheDiagnostics德国)。该主混合物含有核苷酸、PCR缓冲液、SyBR Green与Taq聚合酶。1μLDNA模板(约50ng质粒/μL)。1μM引物EQ3053(SEQ ID NO 1)及1μM引物EQ3213(SEQ ID NO 6)3mM MgCl220μL总体积加入“G-等位基因”或“A-等位基因”质粒作为模板。人类ApoB基因的“G-等位基因”与“A-等位基因”两个模板为实施例2所述的质粒。热循环变性：             95℃2分钟，20℃/秒循环：             44次(设定在95℃0秒；在55℃5秒；在72℃7秒)Tm量测第1段：95℃，0秒，设定。第2段：65℃，10秒。第3段：95℃，0秒，设定0.1℃/秒连续量测。冷却：40℃，30秒。结果
该引物组EQ3053/EQ3213(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 6)明确地扩增“G-等位基因”，而当使用“A-等位基因”作为模板时，仅观察到极少的PCR产物-参见图5。
如图6所见该引物组EQ3053/EQ3213生成具有确定Tm为82℃的PCR产物。
我们推断EQ3053/EQ3213引物组能在光循环器中作为等位基因特异的扩增之用。
              序列表
<110>埃克西库思公司
<120>利用特异性LNA-引物检测基因突变
<130>22601PC1
<160>9
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物 EQ 3053
<221>modified base
<222>(25)...(25)
<223>G LNA
<400>1cctacttgaa  ttccaagagc  acacg                          25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物EQ3054
<221>modified base
<222>(25)...(25)
<223>A LNA
<400>2cctacttgaa  ttccaagagc acaca                           25
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物  ApoBR2
<400>3tttagatcat  ttagtttcag ccc                               23
<210>4
<211>50
<212>DNA
<213>人
<400>4cttacttgaa ttccaagagc acacggtctt cagtgaagct gcagggcact    50
<210>5
<211>50
<212>DNA
<213>人
<400>5cttacttgaa ttccaagagc acacagtctt cagtgaagct gcagggcact    50
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物  EQ3213
<400>6gtttttcgta ctgtgctccc agag                                24
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物  EQ3157
<221>modified base
<222>(22)...(22)
<223>T LNA
<400>7ccctgcagct tcactgaaga ct                                    22
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物  EQ3176
<400>8cacctcttac ttttccattg agt                                   23
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物  EQ3647
<400>9cctacttgaa ttccaagagc acacg                                 25

Claims (53)

1.一种检测样本中核酸Q’存在的方法，该核酸Q’的核苷酸序列与核酸Q在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)将存在于样本中的核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂及至少一个诊断的寡核苷酸结合，该诊断的寡核苷酸在位置A含有核苷
酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不与核酸Q
位置A的核苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA，
b)延长任何与样本中核酸杂交的寡核苷酸，以形成延长产物，其中该核酸用
作模板，
c)检测任何在步骤b)所形成的核酸并因此检测样本中核酸Q’的存在。
2.一种检测样本中核酸Q’存在的方法，该核酸Q’的核苷酸序列与核酸Q在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)将存在于样本中的核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂及至少一个诊断的寡核苷酸结合，该诊断的寡核苷酸在位置A含有核苷
酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不与核酸Q
位置A的核苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA，
b)延长任何与样本中核酸杂交的寡核苷酸，以形成延长产物，其中该核酸用
作模板，
c)形成延长产物之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，使步骤c)的
单链核酸与至少一个诊断的寡核苷酸杂交，该诊断的寡核苷酸在位置A含有
核苷酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不与核
酸Q位置A的核苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测的延长产物，
f)检测形成的延长产物。
3.一种检测样本中核酸Q’存在的方法，该核酸Q’的核苷酸序列与核酸Q在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)将核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的试剂、至少一个
下游寡核苷酸及至少一个诊断的寡核苷酸结合，该诊断的寡核苷酸在位置A
含有核苷酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不
与核酸Q位置A的核苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个
LNA，
b)延长任何杂交到该核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中该核酸用作模板，
c)形成延长产物之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，使步骤c)的
单链核酸与至少一个下游寡核苷酸及至少一个诊断的寡核苷酸杂交，该寡核
苷酸在位置A含有核苷酸，该核苷酸在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核
苷酸杂交，但不与核酸Q位置A的核苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸
含有至少一个LNA，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测的延长产物，
f)检测形成的延长产物。
4.一种检测靶核酸的方法，该靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)在杂交条件下，将核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂及至少一组诊断的寡核苷酸结合，该至少一组寡核苷酸具有在至少一个
位置A彼此不同的核苷酸序列并含有至少一个LNA，
b)延长任何与该核酸杂交的寡核苷酸，以形成延长产物，其中该核酸用作模
板，
c)检测步骤b)形成的核酸。
5.一种检测靶核酸的方法，该靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)在杂交条件下，结合该核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚
合的试剂及至少一组诊断的寡核苷酸，该至少一组寡核苷酸具有在至少一个
位置A彼此不同的核苷酸序列并含有至少一个LNA，
b)延长任何杂交到该核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中该核酸用作模板，
c)形成延长产物之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，杂交步骤c)
的单链核酸与至少一组诊断的寡核苷酸以合成进一步的延长产物，该组诊断
的寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测量的延长产物，
f)检测形成的延长产物。
6.一种检测靶核酸的方法，该靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)在杂交条件下，使核酸与适量的核苷三磷酸盐、用于核苷三磷酸盐聚合的
试剂、至少一个下游寡核苷酸及至少一组诊断的寡核苷酸结合，该至少一组
诊断的寡核苷酸具有在至少一个位置A彼此不同的核苷酸序列，并且含有至
少一个LNA，
b)延长任何杂交到该核酸的寡核苷酸以形成延长产物，其中该核酸用作模板，
c)形成延长产物之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离延长产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于核苷三磷酸盐聚合的试剂存在下，使步骤c)的
单链核酸与至少一个下游寡核苷酸及至少一组诊断的寡核苷酸杂交以合成进
一步的延长产物，该组诊断的寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A
不同，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测量的延长产物，
f)检测形成的延长产物。
7.一种检测靶核酸的方法，该靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)在杂交条件下，使该核酸与适量的核苷三磷酸盐、至少两个寡核苷酸以及
用于寡核苷酸连接的试剂结合，其中至少一个所述的寡核苷酸为诊断寡核苷
酸，该至少一个诊断寡核苷酸为在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，所述核苷
酸与待检测的靶核酸位置A的核苷酸互补，该诊断寡核苷酸含有至少一个
LNA，
b)连接任何在相邻位置杂交到该核酸的寡核苷酸以形成连接产物，其中该核
酸用作模板，
c)检测步骤b)形成的核酸。
8.一种检测靶核酸的方法，该靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一个位置A不同，该方法包括下列步骤：
a)在杂交条件下，使该核酸与适量的核苷三磷酸盐、至少两个寡核苷酸以及
用于寡核苷酸连接的试剂结合，其中至少一个该寡核苷酸为诊断寡核苷酸，
该至少一个诊断寡核苷酸为在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，该核苷酸与待
检测的靶核酸位置A的核苷酸互补，该诊断寡核苷酸含有至少一个LNA，
b)连接任何在相邻位置杂交到该核酸的寡核苷酸以形成连接产物，其中该核
酸用作模板，
c)在连接之后，在变性条件下处理反应混合物从模板分离连接产物，
d)在适量核苷三磷酸盐及用于寡核苷酸连接的试剂存在下，使步骤c)的单链
核酸与至少一个与步骤b)连接产物互补的寡核苷酸及至少两个寡核苷酸杂
交，该至少一个诊断寡核苷酸为在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，该核苷酸
与待检测的靶核酸位置A的核苷酸互补，该诊断寡核苷酸含有至少一个LNA，
e)重复步骤c)至d)足够次数以产生可检测量的连接产物，
f)检测形成的连接产物。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该诊断寡核苷酸序列至少一个位置A与待检测的核酸序列的位置A互补，但与其它核酸序列的位置A不互补。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在该诊断寡核苷酸至少一个位置A的核苷酸为LNA。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该诊断寡核苷酸具有如下通式a)               5’-Nua(NubLNAc)mNudAeNuf-3’
其中A为在位置A的LNA，在此该靶核酸的不同核酸序列彼此不同；LNA为LNA；Nu为选自除可与不同核酸形成特异的碱基配对的LNA以外的任何核苷酸的单体；a、b、c、d与f为0至30的整数，m为1至8的整数，e为1至6的整数，条件是a、b、c、d、e与f的总和至少为5。
12.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10，b＝0，c＝4，d＝8，e＝1，f＝0，m＝0。
13.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝0，b＝1，c＝1，d＝8，e＝1，f＝0，m＝5。
14.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1-4，f＝1-8，m＝0。
15.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1-4，f＝1，m＝0。
16.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1-4，f＝0，m＝0。
17.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1，f＝0，m＝0。
18.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10，b＝0，c＝0，d＝0，e＝4，f＝8，m＝0。
19.如权利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝24，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1，f＝0，m＝0。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一个诊断寡核苷酸被共价地附着至一固体支持体上。
21.如权利要求20所述的方法，其中该不同的诊断寡核苷酸在固体表面上点成数组形式。
22.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中该不同的下游寡核苷酸在固体表面上点成数组形式。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中利用蒽醌光化学作用进行所述附着。
24.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该至少一个诊断寡核苷酸用可检测基团标记。
25.如权利要求4至21中任一项所述的方法，其中该至少一个第一组诊断寡核苷酸以可检测基团标记，该可检测基团与不同的诊断寡核苷酸相异。
26.如权利要求25所述的方法，其中在各寡核苷酸组的单独寡核苷酸以可检测基团标记，该可检测基团与各单独诊断寡核苷酸相异。
27.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸来自细胞样本、组织样本或组织萃取物。
28.如权利要求27所述的方法，其中该细胞来自始生生物、原核生物或真核生物。
29.如权利要求27所述的方法，其中该细胞样本来自血液、血清、血浆、网状细胞、淋巴细胞、尿、骨髓组织、脑脊髓液或由血液或淋巴制成的任何产物。
30.如权利要求27所述的方法，其中该组织样本来自肌肉活组织检查、肝脏活组织检查、肾脏活组织检查、膀胱活组织检查、骨骼活组织检查、软骨活组织检查、皮肤活组织检查、胰腺活组织检查、肠道活组织检查、胸腺活组织检查、***活组织检查、子宫活组织检查、罩丸活组织检查、眼睛活组织检查或脑活组织检查。
31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸是至少一个序列，该序列对特种生物体有特异性。
32.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸是至少一个序列，该序列对生物体的特定物种、亚种或菌株有特异性。
33.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一个序列，该序列对特种微生物有特异性。
34.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一个序列，该序列对微生物的特定物种、亚种或菌株有特异性。
35.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一个序列，该序列对特定的传染物有特异性。
36.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一序列，该序列对传染物的特定物种、亚种或菌株有特异性。
37.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一序列，该序列对编码与遗传疾病有关的特殊蛋白质的基因有特异性。
38.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一序列，该序列对与致死性疾病相关的基因有特异性。
39.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为至少一序列，该序列对与癌症有关的特定基因有特异性。
40.如权利要求38所述的方法，其中该致死性疾病选自肥胖、家族性血胆固醇过多、动脉硬化与糖尿病。
41.如权利要求27至40中任一项所述的方法，其中该待检测的靶核酸为等位基因。
42.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该用于聚合的试剂为酶。
43.如权利要求42所述的方法，其中该用于聚合的试剂为DNA聚合酶。
44.如权利要求43所述的方法，其中该用于聚合的试剂为热稳定性DNA聚合酶。
45.如权利要求44所述的方法，其中该热稳定性DNA聚合酶选自Taq、Pfu、Pwo、Tth。
46.如权利要求42所述的方法，其中该用于聚合的试剂为RNA聚合酶。
47.如权利要求7至8中任一项所述的方法，其中该用于连接的试剂为酶。
48.如权利要求47所述的方法，其中该用于连接的试剂为连接酶。
49.一种试剂盒，用于检测样本中核酸Q’的存在，该核酸Q’的核苷酸序列与核酸Q在至少一个位置A不同，该试剂盒包括：
a)适量的核苷三磷酸盐，
b)用于核苷三磷酸盐聚合的试剂，
c)至少一个诊断寡核苷酸，该诊断寡核苷酸在位置A含有核苷酸，该核苷酸
在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不与核酸Q位置A的核
苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA。
50.一种试剂盒，用于检测样本中核酸Q’的存在，该核酸Q’的核苷酸序列与核酸Q在至少一个位置A不同，该试剂盒包括：
a)适量的核苷三磷酸盐，
b)用于核苷三磷酸盐聚合的试剂，
c)至少一个下游寡核苷酸，
d)至少一个诊断寡核苷酸，该诊断寡核苷酸在位置A含有核苷酸，该核苷酸
在杂交条件下能与核酸Q’位置A的核苷酸杂交，但不与核酸Q位置A的核
苷酸杂交，该至少一个诊断的寡核苷酸含有至少一个LNA。
51.一种试剂盒，用于检测靶核酸，该靶核酸的核苷酸序列在至少一个位置A彼此不同，该试剂盒包括：
a)适量的核苷三磷酸盐，
b)用于核苷三磷酸盐聚合的试剂，
c)至少一组诊断寡核苷酸，该诊断寡核苷酸具有在至少一个位置A彼此不同
的核苷酸序列，且含有至少一个LNA。
52.一种试剂盒，用于检测靶核酸，该靶核酸的核苷酸序列在至少一个位置A彼此不同，该试剂盒包括：
a)适量的核苷三磷酸盐，
b)用于核苷三磷酸盐聚合的试剂，
c)至少一个下游寡核苷酸，
d)至少一组诊断寡核苷酸，该诊断寡核苷酸具有在至少一个位置A彼此不同
的核苷酸序列，且含有至少一个LNA。
53.一种试剂盒，用于检测靶核酸，该靶核酸的核苷酸序列在至少一个位置A彼此不同，该试剂盒包括：
a)核苷三磷酸盐，
b)用于连接的试剂，
c)至少两个寡核苷酸，该至少一个诊断寡核苷酸为在位置A含有核苷酸的寡
核苷酸，该核苷酸与待检测的靶核酸位置A的核苷酸互补，该诊断寡核苷酸
含有至少一个LNA。
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