KR100440725B1 - 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을증가시키는 방법 - Google Patents

비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자의 융합유전자(TPSP)를 포함하는 재조합 플라스미드로 단자엽 식물을 형질전환시켜TPSP유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 다양한 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시킬 수 있으므로, 유용한 농경작물의 생산과 품질향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법{A Method for Increasing an Abiotic-Resistance in Monocot Plants}
본 발명은 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS)와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP)를 단자엽 식물에서 발현시켜서, 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
트레할로스(α-D-glucopyranosyl-[1,1]-α-D-glucopyranose)는 박테리아, 조류, 곰팡이, 효모, 곤충 및 일부 식물 등의 다양한 개체에서 발견되는 비-환원성 디글루코시드로, 탄수화물의 저장소로서 뿐만 아니라, 다양한 물리적, 화학적 스트레스에 대한 보호제의 역할을 한다(참조: Elbein A, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 30:227-256, 1974; Eleutherio ECAet al., Cryobiology, 30:591-596, 1993; Strom AR and Kaasen I, Mol. Microbiol., 8:205-210, 1993; van Laere A, FEMS Microbiol. Rev., 63:201-210, 1989; 및, Wiemken A, J. Gen. Microbiol., 58:209-217, 1990). 또한, 트레할로스는 탈수조건에서 높은 수분보유 활성을 나타내어, 세포막의 유동성을 유지시키고, 탈수화와 재수화의 순환이 이루어지는 동안 자연적으로 발생하는 스트레스에 대하여 식물체가 내성을 가질 수 있도록 한다는 것이 알려져 있다(참조: Leslie SBet al., Appl. Environ. Microbiol., 61:3592-3597, 1995; Drennan PMet al., J. Plant Physiol., 142:493-496, 1993; 및, Muller Jet al., Plant Sci., 112:1-9, 1995). 이와 같은 스트레스 내성에 대한 트레할로스의 효과는 탈수-내성을 가진S.레피도필라(S. lepidophylla) 등의 은폐식물(cryptobiotic plant)에서 증명되었는데, 이들 식물의 탈수화시에는 트레할로스가 식물 건조질량의 12% 수준으로 축적되고, 재수화시에는 축적수준이 감소되었음이 보고되었다(참조: Goddijn OJM and van Dun K, Trends Plant Sci., 4:315-319, 1999).
트레할로스의 이와 같은 특성을 이용하여, 식물체의 스트레스 내성을 증가시키려는 시도가 있었는 바, 현재까지는 쌍자엽 식물에서 대장균 또는 효모 유래의 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자 및/또는 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자가 발현되는 유전자도입 식물(transgenic plant)이 알려져 있으며, 이들 유전자도입 식물은 일반적으로 트레할로스를 매우 낮은 수준으로 발현한다. 그러나, 이들 유전자도입 식물에서 스트레스 내성은 다소 증가하였지만, 성장이 심각하게 저해되고, 뿌리가 휘어지는 등의 부작용이 발생하였고, 이러한 현상은 심지어 트레할로스의 축적이 없을 때에도 나타났다(참조: Holmstrom K-Oet al., Nature, 379:683-684, 1996; Goddijn OJMet al., Plant Physiol., 113:181-190, 1997; Mulleret al., Plant Sci., 147:37-47, 1999; Pilon-Smits EAHet al., J. Plant Physiol., 152:525-532, 1998; 및, Romeo Cet al., Planta, 201:293-297, 1997).
한편, 인류의 복지와 생존을 위한 식량생산에 있어 중요한 식물은 벼, 보리,밀, 옥수수 등의 단자엽 식물이다. 따라서, 이들 작물의 생산성과 품질을 높이기 위한 많은 노력들이 있어 왔으며, 특히, 가뭄, 염농도의 증가, 저온 등의 비생물성(abiotic) 자연조건에 대해 내성을 갖는 작물을 생산하려는 노력이 끊임없이 계속되고 있다.
이에, 본 발명자들은 단자엽 식물의 비생물성 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자의 융합유전자를 단자엽 식물체에 도입하여 발현시킬 경우, 성장수준은 억제되지 않으면서도 탈수, 높은 염농도, 저온 등에 대한 그의 스트레스 내성은 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은TPS유전자 및TPP유전자의 융합유전자를 발현시킴으로써, 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은TPS유전자 및TPP유전자의 융합유전자를 발현시킴으로써, 비생물성 스트레스 내성이 증가된 단자엽 식물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은TPS와TPP의 융합 재조합 유전자인TPSP의 유전자 지도를 나타내는 그림이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pSB-UTPSP의 유전자 지도를 나타내는 그림이다.
도 3a는 트레할로스의 표준 HPIC 크로마토그램이다.
도 3b는Ubi1::TPSP식물의 잎의 탄수화물 프로필(profile)을 나타내는 HPIC 크로마토그램이다.
도 3c는Ubi1::TPSP식물의 낟알 추출물의 탄수화물 프로필을 나타내는 HPIC 크로마토그램이다.
도 4a는 탈수-스트레스 처리된Ubi1::TPSP벼의 클로로필 형광을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 염-스트레스 처리된Ubi1::TPSP벼의 클로로필 형광을 나타내는 그래프이다.
도 4c는 저온-스트레스 처리된Ubi1::TPSP벼의 클로로필 형광을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법은 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자의 융합유전자(TPSP)를 포함하는 재조합 플라스미드로 단자엽 식물을 형질전환시켜TPSP유전자를 발현시키는 단계를 포함한다: 이때,TPS유전자 및TPP유전자는 대장균 또는 효모로부터 유래된 것으로, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개에 의한 방법에 의하여 벼, 보리, 밀 또는 옥수수 등의 단자엽 식물로 도입되며, 비생물성 스트레스는 특별히 제한되는 것은 아니나, 탈수-스트레스, 염-스트레스 또는 저온-스트레스가 될 수 있다.
본 발명의 비생물성 스트레스 내성이 증가된 단자엽 식물을 생산하는 방법은TPSP유전자를 포함하는 재조합 플라스미드가 단자엽 식물 또는 그의 조상으로 도입된다는 사실을 제외하고는 상기 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법과 동일한 단계를 거쳐 수행된다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
트레할로스를 이용하여 식물체의 스트레스 내성을 증가시키려는 시도는 단자엽 식물을 위한 적절한 벡터의 부재나 연구 결과의 미비 등의 어려움으로 인하여 그동안 쌍자엽 식물에서만 있어 왔다. 그러나, 트레할로스의 발현이 비록 쌍자엽 식물에서 스트레스-내성을 증가시키기는 하였지만, 식물체의 성장을 심각하게 억제하는 부작용으로 인하여 주목할만한 효과를 거두지 못하였고, 이에 단자엽 식물에서는 이와 같은 시도조차도 있지 않았었다.
본 발명자들은 중요한 식량자원인 단자엽 식물의 스트레스 내성을 증가시키기 위하여, 트레할로스의 합성에 필요한 두 효소인 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS)와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP)를 암호화하는 유전자의 융합유전자를 단자엽 식물에서 비교적 높은 활성을 나타내는Ubi1프로모터를 포함하는 벡터에 연결하여 재조합 플라스미드를 작제하고, 그를 아그로박테리움 투메파시엔스에 의한 형질전환 방법을 통하여 벼에 도입시켰다.
그런 다음, 전기 형질전환된 벼의 유전체를 서던 블랏으로 분석하여, 도입된 유전자가 벼의 염색체 내로 안정하게 통합되었음을 확인하였고, 전기 벼의 잎에서 추출한 벼의 RNA를 노던 블랏으로 분석하여, 도입된 유전자가 정상적으로 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 탄수화물 정량분석을 통하여 트레할로스가 종래TPS또는TPP로 형질전환된 담배에서 알려진 발현수준에 비하여 약 200배 이상의 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였고, 배양수준을 관찰하여, 쌍자엽 식물에서와는 달리 벼에서는 트레할로스의 과잉발현이 단자엽 식물인 벼에서는 성장에 큰 영향을 끼치지 않는다는 것을 확인하였으며, 트레할로스가 탈수, 염 및 저온 등의 비생물성 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 다양한 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시킬 수 있으므로, 유용한 농경작물의 생산과 품질향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 플라스미드의 작제와 벼의 형질전환
대장균의TPS유전자의 정지코돈을 PCR을 통해 제거하고, 그 뒤에TPP유전자를 연결하여,TPS와TPP의 융합 재조합 유전자인TPSP를 작제하였다(참조: 도 1, Seo HS et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:2484-2490, 2000). 전기TPSP를 옥수수의 유비퀴틴 프로모터에 연결시켜Ubi1::TPSP를 작제하고, 이를 35S 프로모터와 바(bar,phosphinothricin acetyltransferase gene)의 암호화 부위를 포함하는 발현벡터에 삽입시켜, 재조합 플라스미드 pSB-UTPSP를 작제하였다(참조: 도 2). 도 2는 재조합 플라스미드 pSB-UTPSP의 유전자 지도를 나타내는 그림으로, BR은 오른쪽 경계서열(right-border sequence), BL은 왼쪽 경계서열, 3'pinII는 감자의 프로테아제 억제제 II(protease inhibitor II) 유전자의 3'-부위, 35S는 35S 프로모터, 3'nos는 노팔린 신타제(nopaline synthase) 유전자의 3'-부위를 나타낸다. 바 유전자에 암호화되어 있는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제는 포스피노트리신-유래 제초제의 독성을 해독하는 기능을 하므로, 선택적인 마커로서 작용할 수있다. 전기 pSB-UTPSP를 삼중 교배(triparental mating)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입하였다.
전기 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404에 의한 벼의 형질전환을 위하여, 탈곡하지 않은 약 200개의 낟알(Oryza savitaL. cv Nakdong)에 70%(v/v) 에탄올을 첨가하고, 1분 동안 가볍게 혼합하여 낟알을 멸균하였다. 그런 다음, 에탄올을 제거하고, 100mL의 20%(v/v) 클로락스(Clorax)와 1시간 동안 가볍게 혼합하여 낟알을 추가로 멸균한 후, 멸균수로 여러 번 세척하였다. 이후, 전기 낟알로부터의 캘러스 유도(induction), 전기 작제한 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움과 캘러스의 동시-배양(co-cultivation) 및 형질전환된 캘러스의 선택은 장(Jang)에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다(참조: Jang, I-C.et al., Mol. Breeding, 5:453-461, 1999). 아그로박테리움-매개에 의한 방법으로 형질전환된 벼를 온실에서 배양하고, 바스타 제초제에 대하여 저항성을 가지는 벼만을 선택하였다. 전기 선택된 형질전환된 유전자도입 벼의 유전체를 서던 블랏으로 분석한 결과, 도입된 트랜스진(transgene)은 벼의 염색체 내로 통합(integration)되었고, 1 내지 3개의 복제 수를 갖는다는 것을 확인하였다. 추가의 실험을 위하여, 단일 복제수의TPSP유전자를 포함하는 식물체를 선택하였고, 선택된 식물체의 잎에서 추출한 전체 RNA를 이용하여 노던 블랏 분석을 수행한 결과, 약 2.4kb의 mRNA를 관찰할 수 있었으며, 이로써TPSP가 정상적으로 발현되었음을 확인하였다.
실시예 2: 유전자도입 식물의 트레할로스 축적수준 조사
유전자도입 식물에서의 트레할로스 축적수준 및 트레할로스가 식물체의 탄수화물 함량에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 전기 실시예 1에서 생산한 유전자도입 벼인Ubi1::TPSP벼의 잎과 낟알을 액체질소에 침지하였다가, 10mL/g의 100℃의 물에서 10분 동안 추출하고, 추출물을 원심분리하여 수득한 상층액을 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 그런 다음, 4x250mm의 카보-팩 PA1(Carbo-Pak PA1) 컬럼이 장착된 DX500 HPIC(high performance ion chromatography, Dionex 500, Dionex, USA)를 이용하여 탄수화물 정량분석을 수행하였다. HPIC는 0mM과 250mM의 소디움 아세테이트를 포함하는 150mM NaOH 용액을 이용한 30분 동안의 직선구배 조건에서 수행하였고, HPIC 결과는 ED40 전기화학적 검출기(Dionex DC Amperometry, Dionex, USA)로 모니터링하였으며, 상업적으로 입수가능한 트레할로스(Sigma Chemicals Co., USA)를 표준으로 사용하였다(참조: 도 3a).
식물체에서의 각 탄수화물의 조성비와 분포에 대한 트레할로스의 효과를 도 3b 및 3c에 나타내었다. 도 3b 및 3c는Ubi1::TPSP식물의 잎 또는 낟알 추출물의 탄수화물 프로필을 나타내는 HPIC 크로마토그램으로, 각 도에서 NT는 형질전환되지 않은 벼를 나타내고,Ubi1::TPSP-1과Ubi1::TPSP-2는 전기 실시예 1에서 선택된 단일 복제수의TPSP유전자를 포함하는 두 식물체를 나타낸다. 도 3b 및 3c에서 보듯이,Ubi1::TPSP벼의 잎과 낟알 추출물에는 트레할로스가 약 1.076mg/g으로 존재하였는데, 이것은 종래TPS또는TPP의 유전자도입 담배에서 알려진 수준에 비하여 200배 이상으로 높은 수준이다. 또한, 탄수화물의 함량은Ubi1::TPSP벼의 잎에서는 거의 변화하지 않은 반면, 낟알에서는 크게 변화되었음을 확인할 수 있었다.
한편,Ubi1::TPSP벼의 배양수준을 관찰한 결과,Ubi1::TPSP벼는 형질전환되지 않은 벼와 유사한 수준으로 성장한 것을 확인할 수 있었다. 현재까지, 대장균 또는 효모의TPS및/또는TPP로 형질전환된 유전자도입 식물은 쌍자엽 식물에서만 알려져 있으며, 트레할로스를 매우 낮은 수준으로 생산함에도 불구하고, 성장발육이 심각하게 저하되고, 뿌리가 휘어지는 현상을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 그러나,Ubi1::TPSP벼는 식물체 질량의 0.1% 수준으로 트레할로스를 과량생산함에도 불구하고, 성장은 물론 뿌리에도 어떠한 변화도 일으키지 않았다. 따라서, 벼에서의 트레할로스의 과다발현은 쌍자엽 식물에서와는 달리, 식물체의 정상적인 성장을 저해하지 않는다는 사실을 알 수 있었다.
실시예 3: 트레할로스에 의한 스트레스-내성 증가
전기 실시예 1에서와 같이, 에탄올과 클로락스로 멸균하고 세척한 낟알을 성장-챔버의 토양에서 16시간의 명조건/8시간의 암조건의 28℃ 순환조건에서 발아시키고, 14일간 배양하여 어린 모로 생장시켰다. 탈수-스트레스 처리는 식물체 전체를 150㎛/m2/s의 빛 조건하에 1시간 동안 28℃에서 자연건조시켜 수행하였고, 염-스트레스 처리는 전기 어린 모를 0.1%(v/v) 히포넥스(hyponex, Hyponex, Japan)의 영양용액에서 2일 동안 배양하고, 9%(w/v) NaCl를 포함하는 신선한 영양용액으로 옮긴 다음, 150㎛/m2/s의 빛 조건하에 2시간 동안 28℃에서 배양하여 수행하였으며, 저온-스트레스 처리는 전기 어린 모를 150㎛/m2/s의 빛 조건하에 6시간 동안 4℃에서 배양하여 수행하였다. 그런 다음, 형질전환되지 않은 대조군과 다양한 조건으로 스트레스 처리된 유전자도입 시험군을 2시간 동안 암처리하고, 그들의 클로로필 형광을 펄스 모듈레이션(PAM) 형광분석기로 측정하였다. 클로로필 형광수준은 측정한 최소형광(Fv)과 최대형광(Fm)의 비(Fv/Fm)로 나타내었는데, Fv/Fm은 포토시스템 II(photosystem II)의 활성을 의미하며, 따라서, 식물체 기능손상의 척도로서 사용할 수 있다(참조: 도 4a, 4b 및 4c).
도 4a, 4b 및 4c는 탈수-, 염- 또는 저온-스트레스 처리된Ubi1::TPSP벼의 클로로필 형광을 나타내는 그래프이다. 도 4a, 4b 및 4c에서 보듯이,Ubi1::TPSP벼는 탈수-, 염- 및 저온-스트레스 처리된 벼 모두에서 대조군보다 약 15 내지 19% 정도로 높은 수준의 Fv/Fm을 나타내는 것을 알 수 있으며, 따라서, 트레할로스가 비생물성 스트레스에 대한 벼의 내성을 증가시키는 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자의 융합유전자(TPSP)를 포함하는 재조합 플라스미드로 단자엽 식물을 형질전환시켜TPSP유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 다양한 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시킬 수 있으므로, 유용한 농경작물의 생산과 품질향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자의 융합유전자(TPSP)를 포함하는 재조합 플라스미드로 단자엽 식물을 형질전환시켜TPSP유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    TPS유전자 및TPP유전자는 대장균 또는 효모로부터 유래된 것임을 특징으로 하는
    비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    단자엽 식물은 벼, 보리, 밀 또는 옥수수인 것을 특징으로 하는
    비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    형질전환은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개에 의한 방법으로 수 행되는 것을 특징으로 하는
    비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    비생물성 스트레스는 탈수-스트레스, 염-스트레스 또는 저온-스트레스 인 것을 특징으로 하는
    비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법.
  6. 트레할로스-6-포스페이트 합성효소(TPS) 유전자와 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(TPP) 유전자의 융합유전자(TPSP)를 포함하는 재조합 플라스미드로 단자엽 식물 또는 그의 조상을 형질전환시켜TPSP유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 비생물성 스트레스 내성이 증가된 단자엽 식물을 생산하는 방법.
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