CN102016035A - 可用于等位基因特异pcr的寡聚核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明有关于一个与特定靶多聚核苷酸互补的寡聚核苷酸，其中寡聚核苷酸包含：一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核碱基和一个对应于该多聚核苷酸某等位基因的特异性核碱基。本发明进而包括使用此寡聚核苷酸检测并定量分析某多聚核苷酸的特定等位基因出现频率的方法。
Description
在先申请的优先权文件
本申请案主张2007年11月2日申请的35 U.S.C.§119(e)美国临时专利申请案第60/864,099号之优先权，该申请案之整体揭示内容全文以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明是关于新型的可用于等位基因特异PCR的寡聚核苷酸。
背景技术
目前在分子生物学研究和临床诊断中，有许多种技术被应用于鉴定DNA或RNA的多态性，如识别单核苷酸多态性和突变。这些技术包括实时PCR，微阵列，RNA干扰，反义核酸抑制和纳米传感器等。检测***基于某一杂交探针形成的完全匹配或错配核酸双链其退火温度的不同，可识别不同多态性。这种基于杂交的方法在应用上具有一定的局限性，因为一般来说无法通过退火温度的差异识别出探针中单碱基的错配。尽管减短探针的长度能够提高对单碱基错配的识别能力，但在用于分析复杂核酸样品时却减弱了其识别的特异性。
近来有报道表明，在某些位置被选择性地修饰了锁定核苷酸(LNAs)的嵌合探针既能增强核酸双链的稳定性，又能提高错配分辨率。LNA单体包含一个被修饰了的核糖半族，除了O-甲基桥和呋喃糖环中锁定的C2’和C4’以外，其余结构与2’-O-甲基RNA类似。这个共价桥有效地将呋喃糖的结构锁定在C3’内型的N构型，该结构比A型的DNA和RNA更有优势。这种锁定的构象能增强碱基堆积，磷酸骨架的预组织，显著提高寡聚核苷酸的热稳定性，进行增强对互补DNA或RNA序列的亲和力(更高的Tm值)。
LNA核苷酸具有更高的亲和力，在用于cDNA微阵列的表达分析，FISH探针，实时PCR探针和其它基于寡聚核苷酸杂交的分子生物学技术时具有更高的灵敏度和特异性。例如，研究表明，整合入了LNA的嵌合寡聚核苷酸可用于等位基因特异PCR检测多态性。Johnson等人(Nucleic Acids Research，2004，Vol.32，No，6e55)表明在引物中几个位置引入了LNA的寡聚核苷酸可用于等位基因特异PCR。Chou等人(BioTechniques 39：644-650(November 2005))发明了-5位的LNA寡聚核苷酸。Latorra等人在Human Mutation 22：79-85(2003)和BioTechniques 34：1150-1158(June 2003)中也应用了在引物3’端引入了LNA的寡聚核苷酸。You等人在Nucleic Acids Research，2006，Vol.34，No，8 e60中揭示，基于熔解曲线分析，可利用LNA寡聚核苷酸来检测SNPs。在引物中特意整合入错配是另一项可用来提高分辨率的技术。例如，Song等人，在AAPS PharmSci 2002；4(4)article 29(http://www.aapspharmsci.org)中，设计了在-3位中特意引入了一个错配碱基的引物。
本发明旨在设计出能更好的可应用于基于单核苷酸多态性来区别等位基因的寡聚核苷酸。
发明内容
总的来说，本发明针对设计了整合了锁定核苷酸(LNA)和一个错配核苷酸的寡聚核苷酸。
其一，本发明包括可与靶多聚核苷酸互补的寡聚核苷酸，在该寡聚核苷酸中包含有LNA，错配核碱基和针对靶多聚核苷酸某一等位基因的特异性核碱基。
其二，本发明包括寡聚核苷酸与靶多聚核苷酸杂交形成的双链，其中寡聚核苷酸可与靶多聚核苷酸互补并包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一等位基因的特异性核碱基。
其三，本发明包括一种检测生物样品中是否含有靶多聚核苷酸的方法：
(a)提供的寡聚核苷酸可与靶多聚核苷酸互补，在该寡聚核苷酸中包含有一个LNA单位，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一等位基因的特异性核碱基；
(b)将(a)中的寡聚核苷酸与可能含有靶多聚核苷酸的生物样品混合；
(c)检测是否存在寡聚核苷酸和靶多聚核苷酸的杂交和延伸，其中寡聚核苷酸和靶多聚核苷酸的杂交和延伸显示样品中存在有某一特异性核碱基相应的等位基因。
其四，本发明包括一种检测生物样品中靶多聚核苷是否含有某一多态性的方法：
(a)提供的寡聚核苷酸可与靶多聚核苷酸互补，在该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一等位基因的特异性核碱基；
(b)将寡聚核苷酸(a)和聚合酶与可能含有靶多聚核苷酸的生物样品混合，置于适合寡聚核苷酸引物与靶多聚核苷酸杂交和合成引物延伸产物的条件下。
(c)检测是否存在引物延伸产物，其中引物延伸产物的存在显示某一特异性核碱基相应的等位基因的存在。
其五，本发明包括一种定量检测生物样品中靶多聚核苷酸的某一种等位基因和另一种等位基因频率的方法：
(a)利用与靶多聚核苷酸的某一种等位基因互补的某一种寡聚核苷酸扩增生物样品中的靶多聚核苷酸，该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一种等位基因的特异性核碱基；
(b)利用与靶多聚核苷酸的另一种等位基因互补的另一种寡聚核苷酸扩增生物样品中的靶多聚核苷酸，该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸另一种等位基因的特异性核碱基；
(c)比较扩增(a)和(b)的循环阈值；
(d)确定某一种等位基因和另一种等位基因的频率。
其六，本发明包括一种定量检测生物样品中靶多聚核苷酸的某一种等位基因频率的方法：
(a)利用与靶多聚核苷酸的某一种等位基因互补的某一种寡聚核苷酸扩增生物样品中的靶多聚核苷酸，该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一种等位基因的特异性核碱基；
(b)计算(a)的循环阈值；
(c)比较(a)的循环阈值和扩增一个已知标准品的循环阈值；
(d)确定某一种等位基因的频率。
在本发明的某些实施方案中，LNA碱基和错配核碱基是相邻的。在另外一些实施方案中，错配核碱基和等位基因特异性核碱基是相邻的。还有一些情况下，LNA碱基，错配核碱基和等位基因特异性核碱基彼此相邻的。
在本发明的某些实施方案中，LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位。在另外一些特殊实施方案中，错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。还有一些实施方案中，LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位，同时错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。错配核碱基为非LNA。
在本发明的某些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置。在另外一些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置，同时LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位。还有一些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置，同时错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。
在更为特殊的一些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置，同时LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位，并且错配核碱基在等位基因特异性核碱基的-1位。
在本发明的某些实施方案中，等位基因特异性核碱基与靶多聚核苷酸互补。在另外一些实施方案中，等位基因特异性核碱基不与靶多聚核苷酸互补。
在本发明的某些实施方案中，寡聚核苷酸是引物。
附图说明
图1.本项发明中所用引物作用的原理图。该图显示了用来进行等位基因特异性配对和延伸的核酸链。利用通用引物配对并延伸的核酸链的情况没有在图中显示。第一步，准备进行两种不同的反应，其中每种反应都包含通用引物和一种等位基因特异性引物。第二步，在热变性之后，等位基因特异性引物退火结合，之后由3’端杂交的稳定性来决定Taq DNA聚合酶是否开始延伸。最后，第三步，一旦延伸开始，Taq DNA聚合酶5’端到3’端外切酶的活性就可以逐个切断偶联的信号元件和淬灭元件之间的序列。后续的PCR(链式聚合反应)循环更倾向于以新合成的核酸链作为模板，因为其中包括了错配核苷。在我们的引物设计方案中，LNA(锁定核苷酸)可以帮助PCR反应中3’端的退火结合并且增加Tm值(融链温度)，因此可以增加PCR反应的特异性和扩增效率。
图2.利用柱状图比较了此引物修饰方式对于野生型JAK2等位基因和突变的JAK2V617F等位基因区分能力。来自一个健康的捐赠人(纯合的JAK2野生型个体)和一个PV病人(纯合的突JAK2变型个体)基因组DNA作为模板来衡量含有各种错配组合和LNA修饰的G和T等位基因特异性引物，和不含有LNA修饰的相应引物的表现。(A)G等位基因特异性引物的ΔCt值，负值的绝对值越大表示区分能力越高。(B)T等位基因特异性引物的ΔCt值，负值的绝对值越大表示区分能力越高。(C)和没有修饰的G等位基因特异引物相比，由于在G等位基因特异引物中引入LNA修饰而造成了Ct值延迟。(D)和没有修饰的T等位基因特异引物相比，由于在T等位基因特异引物中引入LNA修饰而造成了Ct值延迟。图中显示的数值为三次独立实验结果的“平均值±标准偏差”。
图3.显示该方法在大量野生型等位基因中找到突变等位基因的下限。来源于HEL细胞株的基因组DNA(纯合的JAK2突变体)以含量递减的方式同来源于健康捐赠人的DNA(纯合的JAK2野生型个体)混合在一起。我们确保使用的混合DNA分别含有10％，1％，0.1％和0.01％的HEL基因组DNA，然后混合DNA被用来鉴定其中JAK2V617F的比例。动态AS-PCR结果的线性回归和预期的突变等位基因比例有很高的相关性(R2＝0.996；P＜0.002)。图中显示的数值为三次独立实验结果的“平均值±标准偏差”。
图4.利用BFU-E(红细胞系爆裂样生成单位)群落分析显示T等位基因频率的三峰分布结果。所有选取并用于JAK2V617F基因型鉴定的BFU-E(红细胞系爆裂样生成单位)频率分布同下面例子中的详细描述。用来确定基因型的cutoff(标准)在表3中列出。
具体实施方式
除非另有界定，此处所使用的技术和科学术语与熟习本发明所属技术领域的一般技艺之人士所理解的意思相同。单位，前缀，符号均使用国际单位制形式。除非另加说明，核酸以从左到右，对应从5’到3’端形式书写。此处的数字范围限定不包含界定范围的数字本身，包含和支持在限定范围内的每一个整数。氨基酸在此处要么用广为人知的三字母符号表示，要么用IUPAC-IUBMB命名委员会推荐的一个字母符号表示。类似地，核苷酸使用广为接受的一个字母代码表示。除非另有说明，量词“一个”是指至少一个。此处使用的章节标题仅为写作组织所用，并不用于限定主体内容的描述。在此处申请中所引用的所有文献，或一部分文献包括，但不限于，专利，专利申请，论文，书籍和论述，不管出于何用途都据此全部明确纳入参考。在本申请中任何涉及氨基酸或核酸序列的差异性，由数字显示。熟悉本技术的人将认可，在本发明的实践中可应用此处所描述的相似或相同的材料或方法。本发明绝非仅仅局限于此处描述的材料和方法，可理解，本发明可能会存在一些此处未明确描述的情况。特此限定以下的术语。
“等位基因”，是指某一特定的基因的突变体或基因序列中的多态性，代表基因的另一种可变形式。
“靶多聚核苷酸”，是指多聚核苷酸模板序列中被检测和扩增的某一段区域。靶多聚核苷酸可是一个野生型的或是一致性的序列，某一基因显性形式的特征序列，或是能代表在群体中以低频率存在的某一多态性突变体序列。
“等位基因特异的”使用于涉及核苷酸序列，如寡聚核苷酸和引物时，表示和靶多聚核苷酸序列互补的某一特定位置的核苷酸序列。等位基因特异的引物能区分靶多聚核苷酸的不同等位基因。而本发明中，寡聚核苷酸中等位基因特异的核碱基能十分特异性的与靶多聚核苷酸的某一种等位基因互补，补充而言，该等位基因特异的核碱基不能与靶多聚核苷酸的其它任何形式的等位基因互补。另外，本发明中包含特意引入了错配碱基的寡聚核苷酸(在与等位基因特异的核碱基不同的位置)，不能十分精确的与靶多聚核苷酸互补。本发明中等位基因特异的寡聚核苷酸的功能是促进具有等位基因特异的核碱基的引物的杂交和PCR条件下的延伸，反之，抑制不含有等位基因特异的核碱基的引物的杂交和PCR条件下的延伸。
“互补的”和“互补”，使用于涉及两段核酸序列时，当这两段核酸序列以反向平行的方式进行联配(一段序列的5’端与另一段序列的3’端配对)时，相应的核苷酸G和C匹配，A和T匹配。术语“互补的”不仅仅局限于经典的Waston-Crick的A/T，G/C，A/U的碱基配对。因此，一个或两个碱基中含有除了A，G，C，T的通用核碱基或兼并碱基，也可认为是配对的。例如，本发明中可能包含一些在天然核苷酸碱基中不普遍存在的碱基，如次黄嘌呤和7-氮杂鸟嘌呤。能和两个或更多相应碱基互补的兼并或通用碱基被认为能和两个或更多的相应核碱基进行非特异性的杂交。术语“互补的”也指能杂交的反向平行的多聚核苷酸(相对于单个核苷酸碱基配对)。术语“互补的”可指两段核苷酸序列或两个核苷酸碱基，暗示这两段核苷酸序列或两个核苷酸碱基是相对应的。
此处被选择出的引物能与需要扩增的不同特异性序列充分互补，这些引物能有效地与各自对应的核酸链进行互补杂交。典型地来说，具有精确互补型的引物能获得最佳检测结果，但根据本研究，错配碱基被引入到寡聚核苷酸引物中导致这些引物与模板链大致互补。除了错配碱基的位置以外，引物序列不需要精确反应模板序列。例如，寡聚核苷酸不仅包含一个错配碱基，还可能在距LNA相当距离的其它位置也存在其它的错配碱基(如寡聚核苷酸的5’端)，不会干扰寡聚核苷酸分辨功能的错配碱基和等位基因特异性核碱基。
“相应的”使用于涉及两段核苷酸序列或一段序列中的两个核碱基时，是指其关于位置/互补性具有相同或相似关系，或关于结构，功能，基因编码(如，基因和该基因编码的相应蛋白)具有相同或相似关系。例如，一个核苷酸序列和一段多聚核苷酸相应是指这两段序列互补或部分互补。类似地，寡聚体的一个核碱基和多聚核苷酸模板的一个核碱基相应是指该寡聚体和多聚核苷酸模板杂交时这两个碱基彼此配对。术语“相应的”并不意味着互补，相应的核碱基可能互补，也可能不互补。
“双链”是指两分子的核苷酸形成的复合物，通常是通过一系列的碱基对之间的相互作用联系形成的，该碱基对中的两个碱基分别来自该复合物中的两个核苷酸分子。通过自身折叠在分子内与互补序列杂交，单个核苷酸分子中也存在双链区。
“锁定核苷酸”或“LNA”是指一种合成的，整合了呋喃糖环内键桥的核苷酸类似物，如2’-4’和2’-3’相连的或其它双糖环修饰。当LNA和DNA杂交时，其热稳定性比DNA/DNA之间的杂交更高，LNA能由传统的核苷酸合成仪合成。LNA分子合成及其在寡聚核苷酸中应用的方法在本领域中熟为人知，在以下的文献中都有报道：美国专利号6,316,198；称6,794,499；7,034,133；7,060,809；和7,034,133；WO98/22489；WO 98/39352；WO99/14226；Nielsen et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，3423(1997)；Koshkin et al.，Tetrahedron Letters39，4381(1998)；Singh & Wengel，Chem.Commun.1247(1998)；Singh etal.，Chem.Commun.455(1998)；这些文献的内容全都引入此处。
“错配碱基”是指不和反义多聚核苷酸上的相应核碱基互补的天然核碱基。术语“错配碱基”不包括LNA，因为其并非天然核碱基。
“核酸”是指由核苷酸或核苷酸类似物骨架形成核苷酸多聚体。核酸和多聚核苷酸可被认为是相等的可互换的两个术语，是指由包含嘌呤，嘧啶，醣类和磷酸的一组复合物所形成的核苷酸多聚体。核酸通常有DNA和RNA两种形式。”核酸”包含基因组DNA或RNA，cDNA，半合成的或合成来源的多聚核苷酸。核酸可用核苷酸异构体类似物来替代标准核苷酸碱基，包含，但不仅仅限于，更易或更难与标准核苷酸碱基杂交的iso-C和iso-G碱基，这些碱基更易与与之互补的核苷酸异构体类似物杂交。许多这种碱基在www.idtdna.com中有描述。在表示兼并引物或在不同位置有一个或几个突变的不同核苷酸链混合物时，R代表G或A，Y代表T/U或C，M代表A或C，K代表G或T/U，S代表G或C，W代表A或T/U，B代表非A，D代表非C，H代表非G，V代表非T/U，N代表任意核苷酸。
“核酸聚合酶”是指能催化核苷三磷酸聚合形成与每个核酸链互补的引物衍生产物的酶。核酸聚合酶从与靶序列退火的引物的3’末端开始启动合成，沿着模板链从5’到3’端进行延伸，最后形成延伸产物。本发明中使用的合适的核酸聚合酶缺乏3’到5’端的核酸外切酶活性(也叫较读功能)，为熟知本领域的人所了解。
“核碱基”是指能形成Waston-Crick型氢键的，在整合到多聚体结构中时能与互补核碱基或核碱基类似物(如核碱基衍生物)配对产生堆积互作的含N杂环半族。“杂环的”是指一个含有环状结构的分子如嘌呤，嘧啶及其类似物，其环中含有一个或多个杂环原子，如N，O，或S(即非C原子)。
已知的核碱基，核碱基类似物，核碱基衍生物有许多。包含嘌呤，嘧啶和及其修饰形式等，如7-氮杂嘌呤。典型的核碱基有天然产生的核碱基：腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶和天然产生的核碱基类似物(Seela，U.S.Pat.No.5,446,139)，如7-氮杂腺嘌呤，7-氮杂鸟嘌呤，7-8-氮杂鸟嘌呤，7-8-氮杂腺嘌呤，腺苷，水粉蕈素，硝基吡咯(Bergstrom，J.Amer.Chem.Soc.，117：1201-1209[1995])，硝基吲哚，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2-6-二氨基嘌呤，次黄嘌呤，假尿嘧啶核苷，假胞嘧啶核苷，假异胞嘧啶核苷，5-丙炔基胞嘧啶，异胞嘧啶，异腺嘌呤(Seela，U.S.Pat.No.6,147,199)，7-氮杂鸟嘌呤(Seela，U.S.Pat.No.5,990,303)，2-氮杂嘌呤(Seela，WO 01/16149)，2-硫嘧啶，6-硫鸟嘌呤，4-硫胸腺嘧啶，4-硫尿嘧啶，O.sup.6-甲基鸟嘌呤，N.sup.6-甲基腺嘌呤，N.sup.4-甲基胸腺嘧啶，5-6-二氢胸腺嘧啶，5-6-二氢尿嘧啶，4-甲基吲哚，吡唑啉[3，4-D]嘧啶类物质，“PPG”(Meyer，美国专利号6,143,877and 6,127,121；Gall，WO 01/38584)和亚乙烯腺嘌呤(Fasman(1989)inPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology，pp.385-394，CRC Press，Boca Raton，Fla.)
“核苷”是指与醣类链接的核碱基。核苷通过嘧啶碱的第一位氮原子或嘌呤碱的第九位氮原子与醣类的第一个不对称碳原子之间形成N-糖苷键，从而与D-核糖(RNA)或2’-脱氧-D-核糖(DNA)相连。当核苷为嘌呤时，如A或G，核糖与嘌呤碱的第九位氮原子相连。当核苷为嘧啶时，核糖与嘧啶碱的第一位氮原子相连。醣类可能是替代的或非替代的。替代的核糖包含，但不仅仅限于，一个或多个碳原子，如2’-C，被一个或多个相同的或不同的Cl，F，--R，--OR，--NR2或卤素基团所替代，每一个R是一个独立的H，Cl-C6烷基或C5-C4芳基。核糖包括核糖，2’-脱氧核糖，2’，3’-双脱氧核糖，2’-haloribose，2’-氟核糖，2’-氯核糖，和2’-烷基核糖，如，2’-O-甲基-4’-a-异头核苷酸，和1’-a-异头核苷酸(Asseline et al.，Nucl.Acids Res.，19：4067-74[1991])。
醣类(也叫糖)可含有2’-或3’-位修饰，如甲氧基，乙氧基，烯丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，甲氧乙氧基，烷氧基，酚氧基，叠氮基，氨基，烷氨基，氟，氯和溴。核苷和核苷酸包括天然的D构象异构物和L构象的异构物(Beigelman，美国专利号6,251,666；Chu，美国专利号5,753,789；Shudo，EP0540742；Garbesi et al.，Nucl.AcidsRes.，21：4159-4165(1993)；Fujimori，J.Amer.Chem.Soc.，112：7345(1990)；Urata，(1993)Nucleic Acids Symposium Ser.No.29：69-70)。
“核苷酸”是指核苷的磷酸化形式-核苷磷酸酯，以单体存在或组成多聚核苷酸聚合物。“5’-三磷酸核苷酸”是指在5’位有一个三磷酸酯，为指出核糖的结构特征，有时将之命名为“NTP”，“dNTP”和“ddNTP”。三磷酸酯包含各种硫代氧半族，如a-thio-核苷酸-5’-三磷酸。核苷酸有单-，二-和三-磷酸化几种行式。关于多聚核苷酸和核酸化学的综述请参考Shabarova，Z.and Bogdanov，A.Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids，VCH，New York，1994。
“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”可交换使用，是指核苷酸单体所形成的
链或双链聚合体，包括2’-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)通过磷酸二酯键彼此相连，有5’3’的线性结构，分枝结构或环形多聚体等。多聚核苷酸序列是指多聚体中核苷酸单体的序列或特定核苷酸单体的排列顺序。多聚核苷酸不限于某一特定长度的核苷酸，”多聚核苷酸”包含任意长度的核苷酸聚合体形式。包含5到40个单体的多聚核苷酸被称为寡聚核苷酸。包含几千个或更多单体核苷酸的多聚核苷酸通常称之为核酸。多聚核苷酸可是线性的，分枝线性的，或是环形分子。多聚核苷酸也可与平衡离子相连，如H+，NH4+，三烷基铵，Mg2+，Na+等。
由5’-3’磷酸二酯键相连形成多聚核苷酸有5’末端和3’末端，因为反应形成多聚核苷酸的单核苷酸是通过其戊糖5’磷酸与相邻核苷酸的3’羟基形成单向的磷酸二酯键相连的。因此，多聚核苷酸分子的5’端的戊糖环5’位有一个游离的磷酸基或羟基，而3’端戊糖环3’位有一个游离的磷酸基或羟基。在一个多聚核苷酸分子中，一个位置或序列在另一位置或序列的5’端称之为“上游”，而一个位置在另一位置的3’端称之为“下游”。此术语表明核酸聚合酶沿着模板链从5’到3’的方式进行加工和延伸。
多聚核苷酸可全部由脱氧核糖核酸或核糖核酸组成，也可由其混合物形成成嵌合体。多聚核苷酸可能含有核碱基和糖的类似物。除非另加声明，核酸序列以从左到右为5’到3’端形式来表示。
“寡聚核苷酸”是指含有少于100个核苷酸的较短的多聚核苷酸，更常见的是含10到35个核苷酸，能和基因组DNA分子，cDNA分子，mRNA，或其它感兴趣的核酸杂交。寡聚核苷酸可被标记，如32P-核苷酸，用生物素或荧光染料(Cy3或Cy5)共价结合标记。在某些情况下，标记了的核酸可用作探针来检测某种核酸的存在。在另外一些情况下，一个或两个都标记的寡聚核苷酸引物可用来起始模板多聚核苷酸第二条链的合成。
总的来说，寡聚核苷酸更适宜在核酸合成仪上预先合成。因此，寡聚核苷酸也能通过天然磷酸酯键的类似键连接，如硫酯键等。
特异性的合成型寡聚核苷酸有包含硫代磷酸，磷酸三酯，甲基磷酸盐，短链芳基，cycloalkl糖环内连接，和短链杂原子的或杂环的糖环内连接。最常见的有带CH2-NH-O-CH2，CH2-N(CH3)-O-CH2，CH2-O-N(CH3)-CH2，CH2-O-N(CH3)-N(CH3)--CH2和O-N(CH3)--CH2--CH2骨架的(磷酸二酯键是O-PO2-O-CH2)。U.S.Pat.No.5,637,684中也描述了的氨基磷酸酯和氨基硫磷酸酯寡聚体化合物。预计也可有以吗啉为骨架的寡聚核苷酸。在另外一些情况下，缩氨酸-核酸骨架，寡聚核苷酸的磷酸二酯键骨架可为聚酰胺所替代，其它组分与聚酰胺骨架上的杂氮原子直接或间接相连(Nielsen et al.，Science 254：1497(1991))。其它的合成寡聚核苷酸可能含有替代糖半族，其2’位可能有OH，SH，SCH3，F，OCN，O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3(n大于小于10)；C1至C10的低分子量烷基；替代的低分子量烷基；烷基芳基；芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O--；S--；N-alkyl；O-；S-；N-alyenyl；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环芳烷基；氨烷基氨基；聚烷基氨基；替代硅基；荧光素半族；RNA基团；报告基团；***剂；提高寡聚核苷酸药代动力学的基团和其它相似特征的基团。寡聚核苷酸中也会有糖类似物如环丁基或其它的糖环来替代pentofuranosyl。核苷酸中除了A，T，G，C以外，也有其它核碱基，如肌苷。
在合适的温度和溶液离子强度下，单链核酸分子能与其它核酸分子退火时，寡聚核苷酸(引物或探针)能和相应的核酸分子杂交，如cDNA，基因组DNA或RNA(Sambrook et al.，supra)。温度和溶液离子决定了杂交的严格性。
除了杂交的严格性以外，杂交需要两个互补的核酸分子，碱基间的错配是容许的。适当的杂交严格性取决于核酸的长度和互补程度，具有很大的可变性。核酸分子序列间的同源性或相似性越大，退火温度Tm值越高。核酸杂交的稳定性(Tm值)从高到低依次为：RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。长度大于100个核苷酸碱基的Tm值计算公式已经被推导出来了(Sambrook et al.，supra，9.509.51)。对于较短的核酸杂交，如寡聚核苷酸而言，错配碱基的位置十分关键，寡聚核苷酸长度决定了其特异性(Sambrook et al.，supra，11.711.8)。
“引物”和“延伸引物”，无论是通过限制内切酶消化后纯化而得的，还是合成的，只要在合适的条件下：四种不同的三磷酸脱氧核苷酸，启动多聚化反应的DNA聚合酶或反转录酶，合适的缓冲体系(缓冲体系包含辅助因子和影响PH，离子强度的物质等)，和合适的温度；能够与互补链退火成为DNA合成的起始位点。“引物”指一个或多个引物。
为了保证最佳扩增效率，引物一般是单链的，但也可是双链的。如果是双链引物，在进行退火延伸之前，先进行处理使两条链解离。通常而言，引物一般是寡聚脱氧核苷酸(也称为寡聚核苷酸或寡聚体)。在的适合聚合反应体系中，寡聚核苷酸需达到一定的长度才能有效引导合成延伸产物。引物的精确长度由许多因素决定，包括温度，引物的来源和使用方法。例如，引物的长度虽然决定于靶序列的复杂程度而有长有短，但一般含15-35个核苷酸。广泛而言，较短的引物仅需要较低的退火温度就能和模板形成足够稳定的杂交复合物。一个引物虽然不需要与模板完全互补，但也需要达到一定的互补程度才能与模板杂交。在不改变引物作为DNA合成起始位点的基本功能的前提下，增加引物的附加特征可使之便于被检测和固定化。例如，引物中可能含有针对部分或所有给定的一系列不同的靶序列的一个或多个错配碱基，但含有足够的互补区，使之在合适的条件下能和每一个不同的靶序列杂交。
引物一旦和与之充分互补的核酸序列杂交(DNA，RNA，或DNA-RNA嵌合分子)，就能作为聚合酶的底物起始扩增反应。在有足够的核苷酸和聚合酶的条件下，引物的3’端可被延伸，生成与引物杂交的模板序列互补的核酸链。单链的核酸引物也能和自身的末端进行杂交，形成发夹或茎环结构。可用电脑软件(Oligo version 6.0 MolecularBiology Insights，Inc.)设计达到所需特异性和最佳扩增性能的引物。
引物可用于任何一种模板依赖性扩增反应过程来扩增给定模板样品中的靶基因序列。最常用的扩增方法是PCR，详见U.S.Pat.Nos.4,683,195，4,683,202 and 4,800,159，此处皆引为参考。
“探针”是指能和互补的核酸模板杂交，在核酸模板序列和探针核苷酸序列互补区形成双链复合物的多聚核苷酸片段。一个典型的探针包含有一个可被检测的放射性或化学标记，使之可被某些方法检测到。在此处提及的“探针”特指在3’端被锁定的多聚核苷酸片段，如用2’-3’-双脱氧核苷酸(无3’羟基)或磷酸基。
缩写“Tm”是指核酸双链的“熔解温度”或“退火温度”。熔解温度是指使一半多聚核苷酸双链分子，同源或异源的核碱基多聚物解离成单链时的温度。双链核碱基多聚物分子的Tm值受碱基类型，碱基序列，多聚体连接结构，序列中是否存在非天然的结构如人工连接等因素的影响。测定或计算Tm值的方法详见Pro.Natl.Acad.Sci.USA83：3746-3750(1986)；Baldino et al.，Methods in Enzymol.168：761-777(1989)和Breslauer，Methods in Enzymol.259：221-242(1995)。通过分析寡聚核苷酸的长度，碱基组成，寡聚核苷酸的序列，离子强度和碱基错配概率，这些成熟的核酸研究技术可凭经验确定双链的稳定性。
除非另加说明，本发明的实践将应用到传统的分子生物学，微生物学，DNA重组技术和寡聚核苷酸合成等本领域广为人知的技术。有些技术在文献中详细的说明。酶促反应和纯化技术依据在本领域成熟广泛使用的技术的说明书。总的来说，前述的技术和操作都根据在本领域熟知的传统的方法，引用文献详见如下：Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to MolecularCloning(B.Perbal，1984)和一系列Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)，内容皆引为参考。
本发明涉及的方法旨在利用一个或几个核苷酸的差异来进行等位基因特异PCR(AS-PCR)，来优先或有选择性地扩增一个相对于其它多聚核苷酸而言更加特异的多聚核苷酸片段。尤其是，本发明的相关方法利用一个或几个核苷酸的差异来进行等位基因特异PCR扩增，提高了等位基因特异PCR区别两个等位基因的能力。本发明是相当有用的，如，通过选择性扩增已知含一个或多个等位基因的多聚核苷酸序列来确定哪个等位基因存在于样品中。本发明所具有分辨率能够选择性地扩增仅有单碱基多态性的多聚核苷酸序列。
利用本发明中包含一个锁定核苷酸(LNA)，一个错配碱基和一个等位基因特异性核碱基的寡聚核苷酸进行等位基因特异PCR可检测到某一特定的已知等位基因的存在与否。本发明中寡聚核苷酸的使用方法能有效抑制错误等位基因的延伸，保证特异性等位基因的优先扩增。
总的来说，本发明中包含一个锁定核苷酸(LNA)，一个错配碱基和一个等位基因特异性核碱基的寡聚核苷酸与靶多聚核苷酸互补。等位基因特异的核碱基能更好的对应于靶多聚核苷酸中的某一特定等位基因。然而，等位基因特异的核碱基在该位点可能和靶多聚核苷酸中的所有等位基因都形成错配。
另一方面，本发明包括寡聚核苷酸和靶多聚核苷酸杂交形成的双链复合物，其中的寡聚核苷酸和靶多聚核苷酸是互补的，包含一个锁定核苷酸(LNA)，一个错配碱基和一个等位基因特异性核碱基。
另一方面，本发明包括一种检测生物样品中是否含有靶多聚核苷酸的方法：
(a)提供的寡聚核苷酸可与靶多聚核苷酸互补，在该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一等位基因的特异性核碱基；
(b)将寡聚核苷酸(a)与可能含有靶多聚核苷酸的生物样品混合；
(c)检测是否存在寡聚核苷酸和靶多聚核苷酸的杂交和延伸，其中寡聚核苷酸和靶多聚核苷酸的杂交和延伸显示样品中存在有某一特异性核碱基相应的等位基因。
其四，本发明包括一种检测生物样品中靶多聚核苷是否含有某一多态性的方法：
(a)提供的寡聚核苷酸可与靶多聚核苷酸互补，在该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一等位基因的特异性核碱基；
(b)将寡聚核苷酸(a)和聚合酶与可能含有靶多聚核苷酸的生物样品混合，置于适合寡聚核苷酸引物与靶多聚核苷酸杂交和合成引物延伸产物的条件下。
(c)检测是否存在引物延伸产物，其中引物延伸产物的存在显示某一特异性核碱基相应的等位基因的存在。
其五，本发明包括一种定量检测生物样品中靶多聚核苷酸的某一种等位基因和另一种等位基因频率的方法：
(a)利用与靶多聚核苷酸的某一种等位基因互补的某一种寡聚核苷酸扩增生物样品中的靶多聚核苷酸，该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一种等位基因的特异性核碱基；
(b)利用与靶多聚核苷酸的另一种等位基因互补的另一种寡聚核苷酸扩增生物样品中的靶多聚核苷酸，该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸另一种等位基因的特异性核碱基；
(c)比较扩增(a)和(b)的循环阈值；
(d)确定某一种等位基因和另一种等位基因的频率。
其六，本发明包括一种定量检测生物样品中靶多聚核苷酸的某一种等位基因频率的方法：
(a)利用与靶多聚核苷酸的某一种等位基因互补的某一种寡聚核苷酸扩增生物样品中的靶多聚核苷酸，该寡聚核苷酸中包含有一个LNA碱基，一个错配的核碱基和一个针对靶多聚核苷酸某一种等位基因的特异性核碱基；
(b)计算(a)的循环阈值；
(c)比较(a)的循环阈值和扩增一个已知标准品的循环阈值；
(d)确定某一种等位基因的频率。
在本发明的某些实施方案中，LNA碱基和错配核碱基是相邻的。在另外实施方案中，错配核碱基和等位基因特异性核碱基是相邻的。还有实施方案中，LNA碱基，错配核碱基和等位基因特异性核碱基彼此相邻的。
在本发明的某些特殊实施方案中，LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位。在另外一些特殊实施方案中，错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。还有一些特殊实施方案中，LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位，同时错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。
在本发明的某些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置。在另外一些情况下，等位基因特异性核碱基在3’末端位置，同时LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位。还有一些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置，同时错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。
在更为特殊的一些实施方案中，等位基因特异性核碱基在3’末端位置，同时LNA碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-2位，并且错配核碱基在相对于等位基因特异性核碱基的-1位。
在本发明的某些实施方案中，等位基因特异性核碱基与靶多聚核苷酸互补。在另外一些实施方案中，等位基因特异性核碱基不与靶多聚核苷酸互补。
在本发明的某些实施方案中，寡聚核苷酸是引物。
PCR扩增：
本发明设计利用聚合酶链式反应(PCR)来选择性地从不同多态性序列中扩增并区别一个或多个特异性的核酸序列。聚合酶链式反应(PCR)在本领域中已广泛使用。例如，美国专利号4,683,195，4,683,202and 4,800,159；K.Mullis，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263-273(1986)和C.R.Newton & A.Graham，Introduction toBiotechniques：PCR，2.sup.nd Ed.，Springer-Verlag(New York：1997)，这些相关文献阐述了利用与样品模板杂交的引物延伸进行PCR扩增核酸模板的过程，都被引为参考。当PCR扩增引物被DNA聚合酶(通常是热稳定的)延伸时得到了更多的样品模板，因此更多的引物可被用来重复该过程，因此扩增了样品中的靶序列。一般来说，反应的条件在适合杂交，核酸聚合反应和双链分子变性的条件之间循环。
简而言之，在反应的第一步，样品中的核酸分子被瞬时加热，然后冷却，使双链分子变性。相对于样品的靶序列而言，反应混合体系中的正向和反向引物都是高浓度的。当样品在适宜杂交和聚合反应的条件下孵育时，引物与需要被扩增的核酸互补链杂交，结合于3’端一旦杂交，引物的3’端被聚合酶延伸。引物的延伸得到了与需扩增的靶序列精确互补的DNA分子。PCR反应可指数扩增靶核酸序列，意味着每经历一个扩增循环，靶序列的分子数目以接近翻倍的速度增加。因此，通过杂交、聚合和变性的循环，靶核酸分子的浓度可实现指数增长。
多聚核苷酸模板的制备
现有的程序可扩增任意的特定核酸序列。唯一必要的条件是：靶序列两端已知的碱基数目足够多，据此可设计一对引物与靶序列的不同的链杂交，且这对引物的相对位置合适，这样其中一条合成的延伸产物与其模板分离后，可作为另一条引物进行延伸的模板，从而扩增出一定长度的核酸。序列两端核酸的相关信息越充足，用来扩增靶核酸序列的引物的特异性就越高，整个过程的效率也就越高。
任何纯化或未纯化的多聚核苷酸分子，只要包含了要检测的序列，都可作为起始的核酸模板。因此，此反应可利用双链或单链的DNA或RNA分子，包括信使RNA。此外，DNA和RNA形成的杂合双链也能被利用。上述各种分子的混合物、之前扩增反应形成的产物也可在目前的反应中用同样的或不同的引物进行扩增。要进行扩增的特异核酸序列可以是一个大分子的一部分，或者本身就是一个独立的分子，即整个核酸分子由目的序列组成。
要扩增的目的序列并不要求是纯化好的形式，它可以是一个复杂的混合物的一小部分，例如在人类整个基因组DNA中包含的beta-球蛋白基因，或是某个生物样本中含量甚微的一种特定微生物的一段核酸序列。起始的核酸可包含多个彼此相同或不同的目的序列。因此，此反应不仅可用于大量扩增一种特异核酸序列，还能同时扩增位于相同或不同分子上的多个目的核酸序列，前提是序列中包含一个以上的碱基对的区别。
核酸模板可以从很多来源获取，比如，质粒如pBR322，克隆的DNA或RNA，以及任何天然来源的DNA或RNA，包括细菌，酵母，病毒，各种细胞器以及高等动物或植物来源。DNA或RNA也可以从血液或组织如滋胚层绒毛，羊膜细胞中通过一系列方法提取，提取方法可参考Maniatis等著的分子克隆手册(1982，280-281)。本发明所使用的方法尤其适用于分析基因组DNA。
若核酸来源为细胞系，则无需纯化核酸，可以直接将细胞重悬于低渗缓冲液并加热至90-100摄氏度直到细胞裂解，通常这个过程需要1至15分钟。加热过程后，可直接将扩增试剂加入裂解后的细胞进行扩增反应。此细胞直接检测法可用于外周血淋巴细胞以及羊膜细胞检测。
样品中所含靶核酸若以基因组DNA或反转录所得到的cDNA形式存在。需使用合适并广泛使用的变性方法如物理，化学或酶促方法将核酸变性。通常使用的变性方法为加热核酸直至其完全变性(＞99％)。标准热变性方法使用的温度为大约80至105摄氏度，加热时间为几秒至数分钟。若靶核酸以单链的形式存在于样品中，比如RNA或DNA病毒，则无需加热变性。
变性后的核酸链可以使用设计好的寡核苷酸引物，一般为标记的寡核苷酸引物(探针)，在有利于引物和模板结合的反应条件下检测扩增序列。引物的设计原理为在DNA双链上各选一段，选DNA一条链作为正向引物和互补链上一段作为反向引物，这样一条引物延伸所得的产物可以通过热变性分离，然后作为另一条引物的模板，如此反复，可以扩增所需目的片段。
PCR延伸引物
本发明中所用的PCR扩增是基于横跨等位基因区域的延伸引物。延伸引物必须设计得足够长以利于延伸反应的进行。引物具体长度以及碱基组成取决于很多因素，包括反应退火温度，模板来源以及碱基组成。举例来说，基于目的序列的复杂性，引物一般设计为15-30个核苷酸。虽然引物可以设计含有更多或更少核苷酸，通常引物设计为20-25核苷酸左右。引物必须与模板有足够的配对能力以便退火时能与模板结合并形成稳定的双链。
本发明所使用的方法中，等位基因特异的PCR反应是为了区分同一个基因位点上两个或更多的等位基因。这些等位基因的区别在于一个或多个核苷酸多态性。一个正向延伸引物只能与一个等位基因结合，不能与其它等位基因结合。特异之处在于，该正向引物与横跨目的等位基因的区域互补，且3’端核苷酸与其中一个已知的等位基因完全互补，但是与其它等位基因有一个或多个核苷酸不能互补。由于5’模板起始位点和3’引物末端的核苷酸错配，在合适的PCR反应条件下完全匹配引物将优先于错配引物结合并延伸。
为完成PCR反应，本发明还使用的反向延伸引物，其序列与目的等位基因和变异等位基因的共同区域互补，且这段区域应远离目的等位基因和变异等位基因所处的基因位点。反向引物与正向引物延伸方向相反，从而限定了将要被扩增的DNA区域。反向引物通常设计在与各个等位基因的下游某个共同区域互补结合(3’方向)。
本发明中使用的等位基因特异的引物序列并不反应模板中所有序列，只是特异的与其中某个序列互补结合。如果引物保持足够的互补能力与模板结合并形成双链，非互补碱基或长序列可存在于引物中或5’端。
等位基因特异的PCR扩增
本发明所使用的基于PCR的方法是为了鉴别一段已知的核酸序列存在与否，诸如突变基因(如基因多态性)，我们将其命名为等位基因特异PCR(AS-PCR或ASP)或等位基因特异扩增(ASA)，又名突变扩增检测(ARMS)及等位基因PCR扩增(PASA)，详见美国专利5,639,611号；Ruano等，Nucleic Acids Res 17：8392(1989)(等位基因特异扩增)；Ruano等，Nucleic Acids Res 19：5882-5887(1991)(扩增测序一体化)和Cheng等，Nature 368：664-665(1994)。等位基因特异PCR扩增(ASA)可以用于从同一基因位点上含多个等位基因的样品中选择性扩增某个特定的已知等位基因。
在一个典型的等位基因特异PCR(ASP)检测中，使用不同的PCR延伸引物对同一份核酸样品进行一个或多个PCR反应。PCR引物通常设计为3’末端(与模板5’起始位点互补)有一个碱基只与其中一个等位基因互补。这样PCR延伸反应将不会从存在3’末端错配的引物发生，除非DNA聚合酶具有3’至5’的校正活性，可以将错配碱基移去，***正确碱基。校正活性可以修复PCR引物错配从而不能区分不同的等位基因。因此，所使用的DNA聚合酶为缺乏3’至5’的校正活性的聚合酶，比如传统等位基因特异PCR(AS-PCR)检测中使用的Taq DNA聚合酶。
虽然等位基因特异PCR反应引物可以通过在3’末端引入多个合适的错配位点来增加对等位基因的分辨能力，但是这将会严重降低整个PCR延伸反应产物的产量，见Ruano等，Nucleic Acids Res。17：8392(1989)。其他影响ARMS检测中PCR引物与模板结合的稳定性的因素包括引物中其他碱基错配位点的位置；3’末端碱基前5至6个碱基中GC含量；和取决于等位基因间差异以及错配种类的3’末端错配碱基。第二个错配碱基越靠近3’末端错配碱基，引物与模板的结合就越不稳定。额外的错配碱基对导致ASP中引物结合不稳定性效果如下：CC＞CT＞GG＝AA＝AC＞GT.与此相反，本发明中使用的基于一个碱基错配的PCR方法被证明在合适的PCR扩增条件下能非常有效的区分等位基因，将在下面详述。
本发明中，一段特定的多聚核苷酸片段可以通过本发明所用引物特异扩增。本PCR方法反应体系中，引物与dNTP混合物以及合适的具有3’至5’外切核酸酶活性的聚合酶混合，并在合适的PCR反应条件下扩增目的片段。其中等位基因特异的延伸引物3’端稳定性由固定核苷酸(LNA)的存在以及额外的错配碱基保证。这些条件可以保证等位基因特异的延伸引物选择性与目的等位基因结合并扩增，而不能与其他等位基因结合。
PCR条件
本发明中等位基因特异扩增方法使用标准的PCR反应条件。预测的Tm值可通过标准算法计算，比如最近邻近算法(Von-Ahsen等，Clinical Chemistry 45(12)：2094-2101(1999))。这种用于计算寡核苷酸Tm值的方法可以在网址http://www.idtdna.com中找到。
检测PCR扩增产物
等位基因特异扩增引物延伸反应可以通过任何合适的动态PCR检测平台监测，或者通过PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测。下面列举一些检测***和平台，但不仅限于这些平台：单核苷酸延伸(Orchid)；荧光探针融合(Roche，Epoch)；杂交印记(Innova，Roche)，多支持寡核苷酸芯片(Nanogen，Luminex，Motorola)；Taqman探针(AppliedBiosystems)；lux引物(Invitrogen)。很多其它已知方法可与本发明兼容用于检测扩增中或扩增后的PCR扩增产物。
在检测PCR扩增产物时，每个等位基因都被单独分析，以免等位基因特异引物间相互竞争导致问题。举例来说，疾病相关的等位基因可以根据已扩增出来的野生型等位基因进行特异扩增。每个等位基因特异引物在PCR反应线性期所得到的产物比例与起始模板量以及每个目标等位基因出现频率成正比。
等位基因PCR应用
本发明所用等位基因特异PCR方法可用于选择性从任何原核或真核生物基因中扩增任何一段多聚核苷酸序列，包括但不仅限于植物或动物，本法尤其适用于人类。本方法特别适用于二倍体生物(每个基因有两个拷贝，每个拷贝遗传自每个父母)中基因单体型分析。等位基因特异PCR特别适用与人类遗传学(用于鉴别复杂疾病的决定基因)和人类学(用于鉴别特定人种中基因单体型从而了解人种起源与迁移方式)领域。
本发明可用于分子诊断领域以利于诊断与化疗后微小残留病，药物遗传学及药物基因组学，癌症遗传学和传染病等相关的基因型突变或多态性。本发明可用于药物遗传学领域，研究特定个体基因多态性与个体对特定药物反应的相关性。本发明也可用于癌基因以及肿瘤抑制基因的基因单体型分析，这些基因可能与癌症易感率相关。
本发明使用方法
本发明使用新型引物用于等位基因特异PCR反应。该引物在-2位点上有固定核苷酸(LNA)以及-1位点上单碱基错配。引物3’末端碱基就是需要检测的单核苷酸多态性(SNP)。若单核苷酸多态性存在，引物将特异扩增出含SNP的序列。引物特意设计为有利于灵敏的定量SNP，比如定量白血病中突变发生与药物抗性相关性，或其他目的序列以极低的比例存在的情况。虽然LNA和改造的碱基错配在AS-PCR引物设计中应用过，但是同时使用LNA和碱基错配这两种修饰的协同作用却从未被提及过。尝试了一些碱基错配与LNA位点不同组合，取得了成功组合，包括现在这个优化的-2位LNA和-1位碱基错配组合。当然，其他LNA和碱基错配组合也能得到较好的分辨能力。特定等位基因引物延伸反应也可以通过比较不同的LNA/碱基错配组合进行优化。
本AS-PCR所用新型引物采取了-2位LNA和-1位突变的设计，可广泛用于任何实时定量PCR反应。该引物已被证明可用于任何实时PCR平台检测特定SNP变化，如ABI，Light Cycler等平台。
一般来说，AS-PCR被单独用于定性检测等位基因而非定量检测。本发明提供了一种简单的方法用于设计引物从而极大的增强了等位基因分辨率且无需进一步优化PCR扩增条件。更为重要的是，本发明使用的方法简单，成本低廉，并且极易在任何实时PCR平台上操作。
SNP定量分析用途广泛，例如，判断携带体细胞突变或基因嵌合体细胞所占比例；母亲来源的胚胎细胞所占比例；检测体细胞突变导致的微小残留病如为减少恶性细胞的化疗或抗性克隆的重新出现；快速检测新药在体外***以及临床试验中的效果。本检测同样可用于诸如检测导致恶性病变的体细胞突变导致的微小残留病；监测致病线粒体基因组突变导致的异种移植和同种移植紊乱；监测RH胚胎不兼容及其治疗方法；监测传染病进程及治疗方法的效果；监测抗性克隆如HIV感染中出现的及其治疗方法，监测白血病及其他体细胞突变导致的疾病；监测移植措施的效果等。
本发明中所用寡核苷酸引物可用于从采集自某些个体的DNA样品混合物中通过测定带同一个SNP的两个等位基因的相对含量来定量测定带该SNP的等位基因发生频率。这可以用于准确估计等位基因在样品采集的群落中的发生频率。在此方法中，等量的DNA样品被用于进行两个PCR反应，每个PCR反应中含有一对引物特异与某个SNP等位基因结合。PCR扩增中特异性由本发明使用的引物保证，该引物带有3’末端等位基因特异的碱基，只能与一个等位基因互补，这样极大的增强了特异性以及对等位基因的区分能力。理想情况下，只有完全互补的引物才能进行延伸反应，同理只有完全匹配的等位基因才能被扩增。实际上，存在错配的等位基因也能被扩增，但是扩增效率很低因此需要很多扩增循环才能被检测。用双链DNA结合荧光染料如SYBRGreen I对PCR扩增循环进行检测，发现错配存在时扩增通常会延迟10个循环以上。大约六个左右的循环延迟已足够用于分析等位基因中SNP发生频率，其中发生频率最少的等位基因只占几个百分点。
如果每个等位基因发生频率为50％，假设两对等位基因特异PCR引物扩增效率相同，那么可以预期每个PCR反应需要相同的循环数来获得同样的荧光信号强度。各个反应到达指定的阈值所需要的循环数(Ct)是不一样的。当某个等位基因发生频率越高，扩增该等位基因到达阈值时所需的循环数越少，也就是Ct值越小。两个PCR反应的Ct值之差，ΔCt，可用于衡量各等位基因发生频率。一个循环的延迟意味着两等位基因含量之比为1∶2，两个循环延迟为1∶4，概括来说，1∶2ΔCt。将比例转换为发生频率可通过分子除以分子加分母，将在下面举例说明。
ΔCt值可正可负，取决于哪个PCR反应呈现出最低的ΔCt。分母中的2实际应该为“1+起始扩增效率”。通常其实扩增效率接近100％，故“2”可以当做合理的近似。两个不同的等位基因特异PCR反应扩增效率可能有轻微差异。这种差异可以通过检测已知的带有目的SNP的DNA杂合体进行测量和补偿。若两个PCR扩增效率相同，那么ΔCt就为零。若ΔCt不为零，意味着两个PCR反应扩增效率不一样。那么所有实际测定的ΔCt都需要减去该ΔCt用以补偿扩增效率不同导致的差异。
试剂盒
本发明同样提供含有寡核苷酸引物的试剂盒。如上所述，试剂盒中该寡核苷酸与目的多聚核苷酸互补，并带有LNA，一个错配碱基以及一个等位基因特异的碱基。本试剂盒中使用的寡核苷酸可能包括上面所述的任意一种寡核苷酸。
本试剂盒同样含有扩增目的多聚核苷酸必须或有用的试剂，可能含有下列一种或几种：聚合酶，引物延伸用dNTP，引物中止用ddNTP以及一些PCR常用缓冲液及其他溶液。
下面将列举一些例子用于阐述如何实际运用本发明。需要指出的是，下列例子仅用于阐述本发明的某些特定用途，其他用途需要使用者自行设计。本方法用途不仅限于例子中列举的用途。
例一
为了阐述本发明的用途，使用多种实时PCR平台定量分析了JAK2基因中的G1898T位点体细胞突变SNP，并检验了本法的灵敏度，特异性以及可重复性。引物位于多态性位点的-1位碱基以及-2位LNA在检测中表现优异。实际上，-2位LNA有助于稳定引物3’端，同时-1位碱基保证了特异性。
骨髓增生性疾病(MPDs)是一种干细胞克隆性增生导致的恶性血液病。世界卫生组织(WHO)最初将MPDs分为下述四种典型临床疾病：真性红细胞增多症(PV)，原发性血小板增多症(ET)，骨髓性化生并骨髓纤维化(MMM)，以及慢性骨髓性血癌(CML)。后来，其他相关疾病也被陆续加入此分类。染色体t(9，22)易位导致Bcr-Abl基因编码的融合蛋白形成，从而促使CML中的骨髓前体细胞增殖。近年来，一个新型位于9p染色体区域的体细胞点突变在一些MPDs中被发现，该区域编码酪氨酸激酶基因JAK2(G1849T)。该突变导致了位于JH2伪激酶自抑制区域的617位氨基酸非保守替换(由缬氨酸变为苯丙氨酸)，从而使该激酶持续激活。该突变在小鼠模型中可导致细胞因子高度敏感以及红血球增多症。据报道，有超过80％的PV病人以及大约一半的ET或MMM病人带有该JAK2V617F突变。含有该突变的等位基因所占比例极其不定，有大约30％的PV病人在染色体9p杂合性丢失，大多由单亲二体症导致。
对MPD的研究表明JAK2V617F突变是由于一个体细胞突变事件导致。在病人外周血液一个粒细胞克隆群落中，含有JAK2突变等位基因所占比例可以从0到100％。根据已有研究，该突变并不是最先发生的致病因素。这个论点得到了易患PV的PV家族的存在的进一步证实。另外，携带JAK2V617F突变的病人可以同时具有多种接合性，如野生纯和，杂合，突变纯和克隆同时存在。JAK2突变在病理学以及疾病尤其是PV发生进程中临床重要性以及扮演的角色目前正在被深入研究。目前看来，一些MPD并发症如骨髓纤维化及血栓形成与血液细胞中突变等位基因所占的比例正相关。JAK2V617F突变与PV及BFU-E内源性PV克隆的紧密联系使得该突变可作为一个极好的疾病标签。因此，疾病进程，疗法，新疗法的发展可以很容易通过突变JAK2等位基因在粒细胞克隆中所占比例的变化来衡量。
目前，数种方法已经被研发用于定量分析采集的DNA样品中单核苷酸多态性(SNP)所占比例。其中包括：等位基因特异PCR(AS-PCR)和焦磷酸测序技术。很多策略被用于改善AS-PCR特异性与可靠性并使其能进行实时监测。这些改进使得AS-PCR可以作为一个可靠的工具用于基因型测定。另一方面，焦磷酸测序技术成本高昂，且仪器不易获得。更为重要的是，焦磷酸测序技术不能用于常规筛选残余疾病或早期病变，因为此时JAk2突变等位基因所占比例低于最低检测阈值5％。
下面将要阐述如何使用改善的AS-PCR定量分析野生型以及突变JAK2等位基因所占比例。此处描述的方法具有高灵敏度，特异性以及可重复性，因此可用于使用常用实时动态PCR仪准确定量JAK2V617F突变等位基因所占比例。而且此方法中等位基因引物设计简单明了，无需优化PCR反应条件，使用的核苷酸很容易从各个寡核苷酸合成公司获得。此方法曾经为证明JAK2V617F突变不是PV起始致病因素提供了坚实的证据。
材料和方法
样品。采用IRB批准的流程从20个不相关PV患者以及3个正常志愿者中采集血样。使用标准方法从外周血中收集粒细胞。使用制造商(Gentra，Minneapolis，MN)推荐的Puregene DNA纯化试剂盒从外周血白细胞及纯化的粒细胞中提取基因组DNA(gDNA)。
BFU-E克隆培养。使用以前描述的方法体外分析红细胞前体细胞对***(Epo)的反应。简单来说，使用Histopaque 1077(Sigma，Saint Louis，MO)从外周血中分离单核细胞并在35mm培养皿中用Methocult H-4531培养基(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，Canada)培养至密度为每毫升3×105个细胞。培养时按需加入3U/mlEpo。培养时保持37摄氏度以及含5％二氧化碳的空气中。培养14天后，按标准流程使用微型移液器挑取单个红细胞克隆。
实时AS-PCR。实时AS-PCR在Applied Biosyste 7000序列检测***(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行。典型反应(25微升)包括1×Taqman通用PCR混合物(Applied Biosystems，FosterCity，CA)；300nM JAK2通用正向引物及等位基因特异反向引物；125nM FAM标记JAK2 MGBNFQ探针(Biosystems，Foster City，CA)；以及1-50ng纯化的基因组DNA。先95摄氏度10分钟热激活聚合酶，然后进行50个循环。每个循环包括95度15秒和60度一分钟。等位基因特异的引物使用Oligo 6.7软件程序(Molecular Biology Insights，Inc.，Cascade，CO)设计并由IDT公司(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)合成。反向引物(C或A)-gJAK2-R 3’端序列用于特异扩增突变等位基因。如扩增突变***(ARMS，14)中所述，在引物3’末端-1位人为引入错配(T：T)用以增强等位基因分辨能力。另一个被修饰的固定核碱基(LNA，15)位于-2位(G)。只修饰一处或无修饰的对照引物如前所述进行测试。所有引物及检测探针序列及说明见下表1。
表1：引物及探针序列
| (A)引物或探针 | 修饰 | (B)5’到3’顺序 |
| FAM-AS-JAK2-MGB | FAM标记的带非荧光淬灭元件(NFQ)的MGB探针 | 5’6FAM-TTGCTCATCATACTTGC-MGBNFQ 3’(SEQ ID NO：1) |
| gJAK2-F | N/A | TTATGGACAACAGTCAAACAAC |
| AAT(SEQ ID NO：2) | ||
| G-gJAK2-R | 无 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGAC(SEQ ID NO：3) |
| T-gJAK2-R | 无 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGAA(SEQ ID NO：4) |
| G-gJAK2-LNA-(no-1mut)-R | LNA在-2位置 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGAC(SEQ ID NO：5) |
| T-gJAK2-LNA-(no-1mut)-R | LNA在-2位置 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGAA(SEQ ID NO：6) |
| G-gJAK2-(-1mut)-R | -1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtC(SEQ ID NO：7) |
| T-gJAK2-(-1mut)-R | -1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtA(SEQ ID NO：8) |
| G-gJAK2-(0)LNA-R | 0位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtC(SEQ ID NO：9) |
| T-gJAK2-(0)LNA-R | 0位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtA(SEQ ID NO：10) |
| G-gJAK2-(-1)LNA-R | -1位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtC(SEQ ID NO：11) |
| T-gJAK2-(-1)LNA-R | -1位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtA(SEQ ID NO：12) |
| G-gJAK2-(-2)LNA-R | -2位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtC(SEQ ID NO：13) |
| T-gJAK2-(-2)LNA-R | -2位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtA(SEQ ID NO：14) |
| G-gJAK2-(-3)LNA-R | -3位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtC(SEQ ID NO：15) |
| T-gJAK2-(-3)LNA-R | -3位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtA(SEQ ID NO：16) |
| G-gJAK2-(-4)LNA-R | -4位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtC(SEQ ID NO：17) |
| T-gJAK2-(-4)LNA-R | -4位LNA，-1位错配核碱基 | TTTACTTACTCTCGTCTCCACAGtA(SEQ ID NO：18) |
A)等位基因特异引物命名根据同意链序列分别以大写的G或T打头。G打头的引物为野生型等位基因特异引物，T打头的引物为突变等位基因特异引物。
B)LNA碱基用大写、粗体带下划线的斜体字母表示，同时错配碱基用粗体小写字母表明。碱基位点从引物3’末端开始计算。
焦磷酸测序。焦磷酸测序定量分析JAK2V617F突变等位基因如前所述(16)已经用PSQ HS 96焦磷酸测序仪(Biotage，Uppsala，Sweden)完成。
等位基因出现频率计算。等位基因出现频率可由Germer等描述的方法计算。假设起始扩增效率都为100％，完全匹配与错配等位基因特异PCR反应的达到阈值循环数之差ΔCt可用于计算等位基因出现频率。如果两个等位基因特异PCR反应扩增效率有轻微差异，该差异可以用测量已知带有目的点突变的杂合DNA样品得到的ΔCt值进行弥补。若测得该杂合DNA样品的ΔCt不为零，需要从实际测量的ΔCt值减去该ΔCt值来补偿扩增效率差异，这可用杂合子纠正因子HC表示。因此，HCΔCt值表示杂合子纠正后的两等位基因特异的PCR反应到达阈值所需循环数之差。
ΔCt＝Ct allele1-Ct allele2(1)；和
HCΔCt＝ΔCt-(HC Ct allele1-HC Ct allele2)(2)
方程式1和2得到的结果可代入方程式3用于计算等位基因出现频率：
Freq.allele1＝1/(EHCΔCt+1)(3)
公式中E代表等位基因1PCR扩增效率，可以用梯度稀释样品计算。
统计计算。单因子方差分析及多重比较(Newman-Keuls氏检测)可用于比较不同引物修饰时统计分析ΔCt和延迟结果差异显著性。P＜0.05时被认为统计上差异显著。
结果
检测设计。等位基因特异PCR广泛用于SNP分型，它是根据等位基因特异引物3’末端碱基与一个多态性匹配从而扩增出DNA。理论上，带有3’末端错配碱基的等位基因特异引物不能在Taq DNA聚合酶的作用下延伸。但实际上，实验表明Taq酶可以延伸错配等位基因特异引物，从而造成假阳性结果。一系列策略被用于改善此技术的特异性与可靠性。
本发明所用新方法有两点创新：引入第二个错配碱基以及一个修饰后的LNA碱基。据假设在-1位点引入第二个错配碱基使得等位基因特异引物3’端更加不稳定，但是可以提高第一个PCR循环后完全匹配引物的特异性。带有LNA的寡核苷酸据悉有利于形成A型DNA双螺旋结构，改善碱基对堆积以及提高解链温度(Tm)。进一步假设-2位的LNA有助于稳定等位基因特异引物中匹配碱基并稳定3’端，从而增加引物Tm值，这样可以大大提高等位基因特异扩增，降低检测间差异。本检测设计示意图见图一。
实时AS-PCR。从一个正常人对照(Ctl)及一个PV患者(PV4)中提取的基因组DNA代表两种纯和JAK2基因型(GG和TT)，由焦磷酸测序法证实。使用两种纯和基因型样品，通过实时PCR比较了我们的新型等位基因特异引物与带有一个错配及LNA，无修饰的对照引物(表1)，结果见图2。可以在所有设计的引物中观察到反应探针裂解的动态荧光信号增加。在没有任何修饰的情况下，G等位基因特异引物可以有效地同时扩增出匹配与错配目标，导致对两种基因型较差的分辨率。带有LNA修饰碱基的等位基因特异引物只有较小的改善(图2A和2B)。同时带有LNA和额外错配碱基的引物可以极好的分辨两种基因型(图2A和2B)，并且匹配与错配等位基因间循环数差异ΔCt值大于14.这表明与无修饰相比额外引入错配碱基有助于改善分辨能力。
紧接着，结果的可重复性由三个独立测定匹配与错配引物的ΔCt值的实验验证(图2A和2B)。结果表明，-1位引入的错配极大的提高了分辨能力，同时-2位LNA碱基也增强了可重复性。同时发现LNA碱基在-1或-4位轻微增加了分辨能力，但这是以降低反应灵敏度为代价的(图2C和2D)。从带有一个错配(gJAK2-(-1mut)-R)或错配和-2位LNA修饰(gJAK2-(-2)LNA-R)的G等位基因特异引物得到的ΔCt差异并不显著(P＞0.05)。以此相反，与上面带有一样修饰的T等位基因特异引物得到的ΔCt差异显著(P＜0.05)。
对野生型及突变纯和基因组DNA进行一系列稀释，然后使用本发明所用等位基因特异引物进行实时PCR检测。同时检测两对等位基因特异引物的PCR扩增效率，发现他们都大于92％。等位基因检测极限估计在50pg基因组DNA左右。因为JAK2V617F为体细胞突变，不同等位基因特异引物的杂合纠正因子(HC)可以由测定等比例混合的野生型和突变纯和DNA样品的ΔCt值计算从而确定不同的扩增效率。
实时PCR与焦磷酸测序比较。因为焦磷酸测序被认为可靠的定量检测SNP的技术，故将实时PCR与焦磷酸测序得到的等位基因发生频率结果进行盲比。表2显示用实时PCR以及焦磷酸测序从不同的PV患者粒细胞中得到的突变T等位基因估计发生频率。结果表明，两者得到的结果极好的符合线性回归模型(y＝1.01x+2.6，R2＝0.99，P＜0.0001)。
表2
焦磷酸测序法和本发明中方法所得到的JAK2T等位基因频率的比较
| 病人编号 | 样品日期 | T-等位基因(％)(焦磷酸测序法) | T-等位基因(％)(AS-PCR) |
| PV1 | 11/3/2005 | 57.0 | 64.8 |
| PV2 | 3/1/2005 | 78.3 | 80.7 |
| PV3 | 4/13/2005 | 21.3 | 23.4 |
| PV3 | 6/30/2005 | 28.7 | 30 |
| PV4 | 12/29/2004 | 69.4 | 66.4 |
| PV4 | 3/1/2005 | 59.2 | 60.4 |
| PV4 | 5/26/2005 | 57.9 | 68.4 |
| PV4 | 6/30/2005 | 18.8 | 24.1 |
| PV5 | 8/2/2005 | 44.9 | 46.6 |
| PV6 | 8/31/2005 | 0.0 | 0.0 |
| PV7 | 1/4/2005 | 84.1 | 88.5 |
| PV7 | 3/30/2005 | 66.7 | 73.4 |
| PV7 | 6/30/2005 | 80.2 | 82.2 |
| PV7 | 7/12/2005 | 78.4 | 84.1 |
| PV7 | 10/14/2005 | 79.0 | 81.4 |
| PV8 | 10/19/2005 | 96.0 | 97.0 |
| PV9 | 8/22/2005 | 83.0 | 87.3 |
| PV10 | 5/11/2005 | 80 | 84.2 |
检测的可重复性。为了测试本设计的鲁棒性，从31份来自不同PV患者外周血及粒细胞的基因组DNA样品中检验JAK2突变T等位基因发生频率(表3)。每份样品进行三次测量。结果表明所有测试的样品的平均等位基因发生频率偏差不超过1.5％(表3)。
表3
由三次独立检测估算出的可重复性
| 病人编号 | 样品日期 | ％T-等位基因(PB-DNA) | ％T-等位基因(GNC-DNA) |
| PV3 | 4/13/2005 | 16.4(±0.8) | 23.4 |
| PV4 | 3/1/2005 | 38.8(±3.0) | 60.4 |
| PV4 | 6/30/2005 | 16.8(±0.9) | 27.2(±4.7) |
| PV4 | 12/27/2005 | 41.1(±2.8) | 55.1(±2.0) |
| PV6 | 8/31/2005 | N.D. | 0.0(±0.0) |
| PV7 | 1/4/2005 | 74.8(±1.0) | 88.2(±0.7) |
| PV7 | 7/12/2005 | 74.6(±0.6) | 84.8(±1.6) |
| PV7 | 10/14/2005 | 67.3(±4.4) | 82.2(±1.6) |
| PV8 | 10/19/2005 | 89.7(±0.3) | 97.4(±0.5) |
| PV10 | 5/11/2005 | 63.4(±1.3) | 84.2(±1.0) |
| PV12 | 9/3/2005 | 27.3(±1.9) | 40.7(±1.0) |
| PV14 | 11/30/2005 | 74.7(±2.0) | 78.1(±1.1) |
| PV15 | 11/8/2005 | 0.1(±0.0) | 0.0(±0.1) |
| PV17 | 12/8/2005 | 37.1(±0.4) | 44.9(±1.3) |
| PV18 | 11/8/2005 | 85.8(±0.8) | 91.4(±0.3) |
| PV19 | 11/15/2005 | 66.5(±0.7) | 92.5(±4.9) |
| PV21 | 3/15/2005 | 95.8(±0.4) | 99.9(±0.0) |
同时从外周血基因组DNA(PB-DNA)及粒细胞基因组DNA(GNC-DNA)中测定T等位基因发生频率。结果为三次测量平均值，括弧中为标准偏差。N.D.为未测定。
检测突变等位基因频率的敏感性。JAK2突变等位基因检测敏感度通过混合正常对照基因组DNA减少红白血病细胞系(HEL)基因组DNA比例来确定。HEL细胞系为JAK2V617F纯和突变(图3)。目前最敏感的用于检测低水平SNP的技术仍然受限于所分析的基因组DNA质量。一个人类基因组单倍体质量估计为3.7pg。因此，若从40ng基因组DNA中检测发生频率为0.01％的突变等位基因，可能只能随机检测到一个拷贝。大多数检测基因组DNA用量为20至50ng，因此，合理的发生频率检测极限应该为0.1％。使用40至50ng基因组DNA检测时，JAK2突变等位基因能可靠的在0.1％发生频率上检出(图3)。但是，若使用的基因组DNA超过400ng，那么突变等位基因发生率低于0.01％仍可能被可靠检出(图3)。
JAK2V617F是否为致病突变？本发明所用引物相关性及重要性已经在数名女性PV患者中研究JAK2突变T等位基因发生频率及克隆性时得到证实。来自10名女性PV患者粒细胞的基因组DNA被用于研究JAK2突变等位基因发生频率。这些女性被X染色体转录克隆性分析证实为克隆性。这10名具有克隆性粒细胞增生的女患者中，3名突变等位基因发生频率低于50％(27.5+-11)，另外7名发生频率大于50％(75+-10.5)。结合克隆性分析数据，这个结果表明患者粒细胞群落具有不同的JAK2V617F基因型(GG，GT或TT)，加强了该突变并非疾病起始因素的模型。
为JAK2V617F突变为次发事件提供直接证据。因为不依赖于***的BFU-E克隆(也叫EEC)增殖被认为是PV病变的标志，本方法被用于检测单个克隆中JAK2T突变等位基因发生频率。使用JAK2测序以及实时PCR区分等位基因初步表明，大多数未经过治疗以及已经对各自疗法适应的PV患者都具有纯和JAK2V617F突变的不依赖于***BFU-E克隆。然而，有些克隆是杂合的，甚至极少数克隆具有野生型JAK2基因型。使用本新型且更加灵敏的方法重新研究了这个问题。因为单个EEC克隆是由一个受影响的细胞克隆性增值得来，等位基因发生频率应该反映在任何生殖细胞系中正常观察到的SNP分型(0，50及100)。从两男两女PV患者中采集的单核细胞被用于培养并得到89个BFU-E克隆，测定了其中69个克隆基因型。结果与预期的等位基因发生频率差别较小，这个差异可能是由于采集克隆时被其他克隆污染的原因导致。根据JAK2突变T等位基因分布(图4)，任何差异大于10％的克隆被排除以免导致基因型测定时出现偏差(表4)。JAK2V617F杂合及纯和克隆都被检测到(表4)。
表4：分离出的BFU-E克隆中的JAKV617F等位基因频率
基因型代表定量分析突变等位基因发生频率，划分标准如下：G/G(0-10％)；G/T(40-60％)；以及T/T(90-100％)。不在此划分范围内的克隆被认为采集时受到其他细胞污染被排除。N.D.＝未测定。
JAK2突变在病理学和疾病进程尤其是PV中的临床重要性以及扮演角色正在被深入研究。目前看来，一些MPD并发症如骨髓纤维化及血栓形成与血液细胞中突变等位基因所占的比例正相关。JAK2V617F在PV中的高发性使得该突变可作为一个极好的疾病标签。因此，疾病进程，疗法，新疗法的发展可以很容易通过突变JAK2等位基因在粒细胞克隆中所占比例的变化来衡量。
AS-PCR通过测定达到可检测产物量所需的PCR循环数差异来确定具有多态性或突变的等位基因发生频率。AS-PCR同样可作为一个很有价值的工具用作测定体细胞突变只存在于组织样品中少数细胞时罕见等位基因发生频率。在引物中引入额外错配碱基时需谨慎设计，合理选择引物区域以及尽量优化可能导致引物稳定性以及目标扩增能力的变量。另外，设计引物时使用LNA可以提高特异性以及等位基因分辨能力。但是，AS-PCR引物同时带有一个错配碱基以及LNA修饰时两者的协同作用却没有被研究过。
如上所述，利用本发明所设计的新型引物进行AS-PCR可用于定量分析体细胞突变，并保证灵敏，准确以及高度可重复的结果。多个实验室的独立研究人员已经使用两种动态PCR平台(Applied Biosystems公司的ABI7000和Roche Applied Science公司的Light Cycler)验证了此设计。从不同平台中得到的结果基本相同，而且与先前使用焦磷酸测序的得到的等位基因发生频率结果近似(结果未显示)。另外，在动态AS-PCR扩增过程中研究者可以根据自己的研究目的使用很多常用技术(如SYBR-Green，Taqman探针，Molecular Beacon，Hybridization探针)进行扩增子检测。
目前定量分析PV患者mRNA中表达的突变等位基因发生频率已经得到初步结果。同样的引物设计策略也可用于确定具有其他SNP或突变的等位基因发生频率。例如，本方法可以用于检测表达的X染色体SNP来确定克隆性。通常女性中有一个X染色体失活。初步试验结果表明使用本法所用的引物设计可以完美且无需很多优化的定量分析5个不同的表达的X染色体SNP来确定女性中的克隆性。
本发明所用引物设计还有很多潜在用途。比如，定量分析嵌合性，母血中胚胎细胞所占比例，检测与已知体细胞突变(如化疗导致的恶性细胞减少或抗性克隆的重新出现)相关的微量残余疾病，快速检测新药在体外***以及临床试验中的效果，以及其他需要定量分析等位基因出现频率的时候。
此处所述定量AS-PCR检测阐述了在PV克隆性造血过程的个体发生中导致JAK2V617F突变的遗传事件发生顺序。与近期报道的JAK2V617F阴性EPO不依赖BFU-E克隆缺乏矛盾的是，这些克隆可以PV患者样品中发现。对此矛盾一个可能的解释是所用检测等位基因方法的灵敏度所致。Scott及其同事从PV患者中提前6个月采集样品进行集落生成试验用以分析粒细胞接合性。目前已经证明基于甲基化的X染色体克隆性分析与基于转录的X染色体克隆性分析相比具有重大缺陷。另外，Scott及其同事使用了一种定性PCR和限制性核酸内切酶酶切的检测方法用于确定样品基因型，但是这些方法并不能排除潜在的克隆被其他细胞污染的可能。在他们所用的方法中，JAK2野生基因性的确定需要PCR产物完全被BsaXI酶切。但实际上，纯和或杂合JAK2突变等位基因由于不能被完全酶切可能得到错误的基因型。因为本方法使用PCR扩增实时监测，所得到的为定量数据，基因型确定具有相当高的可信度。通常体外分析BFU-E克隆对***反应(集落生成试验)工作量很大且数据难于分析，但是此方法早在1974年就被发明并作为常规方法沿用至今。集落生成试验的用途以及可重复性已在我们对大量先天以及获得性红血球增多症如原发性及获得性红血球增多症和Chuvash红血球增多症的研究中得到证实。
野生型JAK2***不依赖克隆的存在表明一种目前未知的替代机制在红细胞生成及造血过程中发挥作用。更为重要的是，这些结果表明存在一种发生于JAK2V617F突变之前的未知分子损害。总之，此数据表明，仅仅针对JAK2V617F克隆性细胞的化疗方法可能不足以治愈PV。
例二：对于费城型染色体阴性骨髓增殖性疾病(Ph-MPDs)中cMPL突变的分析
cMPL是编码血小板生成素受体的基因，血小板生成素受体在血小板的生成过程中起着重要的作用，同时还在多功能造血干细胞的扩增中起作用。cMPL基因的一个功能获得性突变MPLW515L首先从原发性骨髓纤维化(PMF)病人的骨髓细胞中被克隆鉴定出来。在后续的研究工作中，另外一个功能获得性突变MPLW515K在原发性骨髓纤维化(PMF)和原发性血小板增多症(ET)的病人中被鉴定。W515L是相应位置发生了TGG→TTG的突变所导致。而W515K是相应位置发生了TGG→AAG的改变所导致的。
现在，一种快速、灵敏的实时定量PCR方法已经被用于增强cMPL突变的检测分辨率，这种方法利用了一种在-2位引入错位匹配的引物，和在-3位引入锁定核苷酸(LNA)的等位基因特异性引物。从197个MPD病人的外周血粒细胞中提取的基因组DNA被用来进行分析。结果显示，10/197(5.1％)的样本带有至少一个cMPL突变。进一步分析显示，5个病人同时也是JAK2V617F突变的阳性携带者。cMPL突变在1/78(1.3％)的PV病人中出现，在3/56(5.4％)的ET病人中出现，在4/49(8.2％)的PMF病人中出现，也在2/11(18％)的非典型的MPD病人中出现。W515L可以解释在9/10的病例，而W515K只能解释1/10。每10个阳性样本中，5个(包括PV病人)带有不大于1％的等位基因突变。
为了验证这种方法的准确性，96个正常人的DNA也用相同的方法进行了检验。没有W515L和W515K突变被检出(和Ph-MPD的病人相比p值为0.03)。进一步的结果显示，来源于含有0.70％突变等位基因的病人巨核细胞群落DNA的检验分析结果是12.5％的细胞群落被发现含有cMPLW515L的杂合突变。而且在血小板依赖性和非依赖性细胞群落中我们得到了类似的结果。
表5.用于分辨cMPL等位突变的引物和探针
| 引物和探针 | 5’到3’顺序 |
| cMPL-R(W515L)cMPL-LNA-G-FcMPL-LNA-A-F | GGGTCACAGAGCGAACCA(SEQ ID NO：19)GCCTGCTGCTGCTGAGcTG(SEQ ID NO：20)GCCTGCTGCTGCTGAGcTT(SEQ ID NO：21) |
| cMPL-R(W515K)cMPL-LNA-TG-FcMPL-LNA-AA-F | GGGTCACAGAGCGAACCA(SEQ ID NO：22)GCCTGCTGCTGCTGAGcT(SEQ ID NO：23)GCCTGCTGCTGCTGAGcA(SEQ ID NO：24) |
试验用基因组DNA提取与外周血粒细胞。实时AS-PCR应用了Applied Biosystem 7500 Sequence Dectection System(美国，加州福斯特市，Applied Biosystem公司)。标准的PCR体系包括1X的TaqManUniversal PCR master mix(Applied Biosystem公司)；PCR酶系在95℃下激活10分钟，然后按照95℃15秒，60℃1分钟的模式进行45个循环反应。
标准的PCR体系包括1X的TaqMan Universal PCR master mix(Applied Biosystem公司)；300nM的通用反向引物和正向的等位基因特异性引物；125nM的FAM-标记-cMPL-MGBNFQ探针(AppliedBiosystem公司)，(如表1中所示)；和1ng-50ng的基因组DNA(根据需要加入)。等位基因特异性引物用Oligo 6.7软件设计(美国，MolecularBiology Insight公司)并在IDT(美国，Coralville城，IntegratedTechnologies公司)合成。
表6.比较用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)和我们的方法得到的W515L突变中T等位基因的频率和W515K突变中A等位基因的频率
结果：
从197个病人的外周血粒细胞中得到的DNA中的分析结果显示，10/197(5.1％)的病人带有两个cMPL突变，而且这些病人中的5个同时也是JAK2V617F阳性突变的携带者。诊断结果显示，1/78(1.3％)的PV病人，3/56(5.4％)的ET病人，4/49(8.2％)的PMF病人和2/11(18％)的非典型性MPD病人收到影响。W515L可以解释在9/10的病例，而W515K只能解释1/10。每10个阳性样本中，5个(包括PV病人)带有不大于1％的等位基因突变。
为了验证这种方法的准确性，96个正常人的DNA也用相同的方法进行了检验。没有W515L和W515K突变被检出(和Ph-MPD的病人相比p值为0.03)。进一步的结果显示，来源于含有0.70％突变等位基因的病人巨核细胞群落DNA的检验分析结果是12.5％的细胞群落被发现含有cMPLW515L的杂合突变。
这些研究结果证明了该方法的灵敏性和准确性，而且发现cMPL活性的突变在ET病人中要远比先前报道的普遍。而突变等位基因的频率在巨核细胞群落中更高则暗示这些cMPL突变群落在增值上的优势。cMPL突变可以和JAK2V617F在同一样本中被鉴定则说明Ph-MPD这种疾病在分子水平上的异质性，并且更加说明我们还需要更加深入的研究来区分和确定病人基因型和临川表型之间的联系。
例三：利用实时定量PCR的方法来检验造血作用中的克隆形成能力
这种检测表观水平的克隆形成能力的方法其原理依赖于X染色体失活原理(XCIP)。这种现象只在女性中出现，而且取决于失活的X染色体基因上的转录活跃基因和不活跃基因的区分。
克隆形成能力研究利用了BTK，FHL1，IDS，G6PD和MPP1的外显子多态性。我们利用TaqMan等位基因分辨检验试验来从基因组DNA中鉴定这些基因的外显子多态性。基因组DNA和总RNA则都是来源于外周血粒细胞和血小板。
实时AS-PCR应用了Applied Biosystem 7500 Sequence DectectionSystem(美国，加州福斯特市，Applied Biosystem公司)。标准的PCR体系(15ul)包括1X的TaqMan Universal PCR master mix(AppliedBiosystem公司)；20X TaqMan SNP(单核苷酸多态性)GenotypingAssay Mix(Applied Biosystem公司)；和1-20ng纯化的基因组DNA。PCR酶系在95℃下激活10分钟，然后按照92℃15秒，60℃1分钟的模式进行45个循环反应。
转录克隆形成能力检验(TCA)是检验总RNA。用来进行实时AS-PCR的cDNA模板是使用SuperScript III First-Strand SynthesisSuperMix for qRT-PCR(invitrogen公司)***从50ng细胞总RNA反转录得到的。被设计来鉴定BTK，FHL1，IDS，G6PD和MPP1基因外显子多态性的等位基因特异性引物和本发明解释的一致，包括一个-1位置的错位匹配，和一个-2位置的锁定核苷酸。这些引物都被用来在实时定量PCR反应中鉴定老年女性对象造血作用中的克隆形成能力。
标准的PCR体系(15ul)包括1X的TaqMan Universal PCR mastermix(Applied Biosystem公司)；300nM的通用反向引物和正向的等位基因特异性引物；125nM的FAM-标记-cMPL-MGBNFQ探针(AppliedBiosystem公司)，(如表1中所示)；和2ul cDNA。等位基因特异性引物用Oligo 6.7软件设计(美国，Molecular Biology Insight公司)，并在IDT(美国，Coralville城，Integrated Technologies公司)合成。
表7.造血作用中的克隆检验所用的引物和探针
| 引物或探针 | 5’到3’顺序 |
| FAM-AS-MPP1-MGBcMPP1-RcMPP1-LNA-G-FcMPP1-LNA-T-F | 6FAM-ACAGTCCTGTACGGTGG-MGBNFQ(SEQ ID NO：25)GGAGCCTTGTCTATGGATCATGC(SEQ ID NO：26)CACAGAAGAGCCCATAGGAATCAgG(SEQ ID NO：27)CACAGAAGAGCCCATAGGAATCAgT(SEQ ID NO：28) |
| FAM-AS-FHL1-MGBcFHL1-FcFHL1-LNA-G-R | 6FAM-TGCAGGAACATCTGAGG-MGBNFQ(SEQ ID NO：29)TTTATGGGTTTGGAAACTTGCAT(SEQ ID NO：30)CTAGAGTTTTGCGGTTACTTgC |
| cFHL1-LNA-T-R | (SEQ ID NO：31)CTAGAGTTTTGCGGTTACTTgT(SEQ ID NO：32) |
| FAM-AS-IDS-MGBcIDS-RcIDS-LNA-C-FcIDS-LNA-T-F | 6FAM-CCTTCCTCTGAGAAGTAT-MGBNFQ(SEQ ID NO：33)CCTCGACATGTCTTAGTGTTT(SEQ ID NO：34)TGGGATATCTTCTAACCATAgC(SEQ ID NO：35)TGGGATATCTTCTAACCATAgT(SEQ ID NO：36) |
| FAM-AS-G6PD-MGBcG6PD-RcG6PD-LNA-C-FcG6PD-LNA-T-F | 6FAM-AGCGCCTCATCCTG-MGBNFQ(SEQ ID NO：37)CAGTGGGGTGAAAATACGC(SEQ ID NO：38)AGCTCCCTGACGCCTtC(SEQ ID NO：39)AGCTCCCTGACGCCTtT(SEQ ID NO：40) |
| FAM-AS-BTK-MGBcBTK-FcBTK-LNA-C-RcBTK-LNA-T-R | 6FAM-TACCTTCTCTGAAGCCAG-MGBNFQ(SEQ ID NO：41)GAGACTGCTGAACACATTGC(SEQ ID NO：42)CATCTGCTTTCTCATGCCtC(SEQ ID NO：43)CATCTGCTTTCTCATGCCtA(SEQ ID NO：44) |
结果：
26个健康的女性样本使用我们新型的实时定量PCR检测方法进行了检验。这些女性对象年龄都不小于65岁，并没有既往恶性疾病、不明原因的贫血和自身免疫性疾病的病史。在所有的研究对象中，没有任何一例出现克隆性XCIP或者极端偏离的XCIP。相对的PCR结果列在表8中。
表8.不小于65岁的健康女性的外显子多态性基因型和等位基因频率
例四：本发明的方法和思路也可以用来检验在血影蛋白中2号外显子，第34个核苷酸一个新突变(CGG→CCG：Arg→Pro)影响下的等位基因转录产物的不同水平。
血影蛋白(Sp)在Sp蛋白同源二聚体结合区(Sp蛋白的I结构域)的突变是造成遗传性椭圆红细胞增多症(HE)中膜骨架***缺陷的最重要原因，同时也和另外一种遗传性疾病，遗传性热异形细胞增多症(HPP)的发病有着密切联系。HPP的典型症状是严重的不等细胞的小红细胞症，这是由于严重的血影蛋白二聚体形成困难和血影蛋白缺乏造成的。对于HPP的不同表型，传统解释是Sp蛋白的杂合体突变影响了Sp四聚体的形成，并且可以造成有活性的正常Sp蛋白的合成水平降低。
相比较而言，HE病人拥有正常的Sp蛋白水平，而且Sp蛋白形成多聚体的缺陷程度也较轻。HE和HPP的临床表现是受遗传性的调节因子的影响，例如Sp的亚等位基因LELY。LELY是Sp基因等位基因的一种，是由于在第40个外显子的1857位的C＞G的突变和在第45个内含子-12位C＞T的突变引起的表达水平降低。而在第45个内含子中的C＞T突变和造成部分产物剪切的时候跳过第46个外显子，而这个外显子对于形成正常的有活性的Sp二聚体是至关重要的。
这里，我们给出一个北欧家系的例子，这个家系的成员具有不同形态的红细胞，从非典型的HPP，HE病理形态，到正常人的形态。而且发现这个家系的成员带有一个新的Sp突变。对于表现出非典型性小红细胞HPP先证者的RBC膜蛋白定量分析结果显示48％的血影蛋白二聚体(对照组此数据为10％)，其原因是因为74KD I型血影蛋白肽链的显著增加。其中，我们发现血影蛋白/带三蛋白的比例只有轻微下降，而这个比例常常认为是同正常红血球的形态维持密切联系的。41KD的非正常Sp蛋白的出现提示可能存在着LELY突变。病人Sp基因的测序结果显示在第2外显子，第34个核苷酸的位置出现了一个新的杂合子突变(CGG→CCG：Arg＞Pro)，并且的确是LELY突变的杂合体。这些突变同样也出现在病人的兄弟和女儿，这些人被证实患有HE，而他的另外一个只带有第2外显子Arg34Pro而没有LELY突变儿子被证实产生正常形态的红细胞。
从这个家系得到的不断增加的临床数据、Sp蛋白分析结果、DNA和实时定量PCR的mRNA结果提示我们，在34位核苷酸突变、LELY等位基因突变和Sp转录产物水平之间可能有着复杂的联系。一种基于独特的引物设计的新的实时定量PCR的方法可以被用来鉴定带有这个新突变的Sp不同等位基因转录产物的转录水平。引物的设计方法和本发明中所描述的一致，包括：-1位置的错配和-2位置的锁定核苷酸。表9中列出了在这些实验中用来检测等位基因频率的引物。
试验中的总RNA从外周血粒细胞，血小板和网织红细胞里提取。转录克隆形成能力检验(TCA)是检验总RNA。实时AS-PCR应用了AppliedBiosystem 7500 Sequence Dectection System(美国，加州福斯特市，Applied Biosystem公司)。用来进行实时AS-PCR的cDNA模板是使用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(invitrogen公司)***从50ng细胞总RNA反转录得到的。标准的PCR体系(15ul)包括1X的TaqMan Universal PCR master mix(AppliedBiosystem公司)；300nM的通用反向引物和正向的等位基因特异性引物；125nM的FAM-标记-cMPL-MGBNFQ探针(Applied Biosystem公司)，(如表1中所示)；和2ul cDNA。等位基因特异性引物用Oligo 6.7软件设计(美国，Molecular Biology Insight公司)，并在IDT(美国，Coralville城，Integrated Technologies公司)合成。表10中记录了在该实验中得到的等位基因的频率。
表9.用来定量检测血影蛋白编码基因的第2外显子，34位新突变(CGG→CCG)的引物和探针。
| 引物或探针 | 5’到3’顺序 |
| FAM-AS-SP-MGBcSP-FcSP-LNA-G-RcSP-LNA-C-R | 6FAM-CACTTCCTGACGCCTC-MGBNFQ(SEQ ID NO：45)GAAACCGTTGTGGAGAGCAGT(SEQ ID NO：46)CGCTCCTTGAAACTTTGATAgG(SEQ ID NO：47)CGCTCCTTGAAACTTTGATAgC(SEQ ID NO：48) |
表10.一个北欧家系中不同个体网织红细胞中Sp基因G等位基因和C等位基因的频率比较
| 病人编号 | 新发现突变的杂合或纯合 | G-等位基因(％) | C-等位基因(％) |
| PSp 1 | 杂合 | 28 | 72 |
| PSp 2 | 杂合 | 18 | 82 |
| PSp 3 | 杂合 | 30 | 70 |
| PSp 4 | 纯合 | 100 | 0 |
| PSp 5 | 纯合 | 100 | 0 |
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序列表
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<120>可用于等位基因特异PCR的寡聚核苷酸
<130>50407-24
<140>Not yet assigned
<141>2009-05-04
<150>60/864,099
<151>2006-11-02
<150>PCT/US07/83456
<151>2007-11-02
<160>48
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
cttgctcatc atacttgc 18
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
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ttatggacaa cagtcaaaca acaat 25
<210>3
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<212>DNA
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tttacttact ctcgtctcca cagac 25
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gggtcacaga gcgaacca 18
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gggtcacaga gcgaacca 18
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ggagccttgt ctatggatca tgc 23
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
cacagaagag cccataggaa tcagg 25
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<212>DNA
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cacagaagag cccataggaa tcagt 25
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<212>DNA
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tgcaggaaca tctgagg 17
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<212>DNA
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<400>30
tttatgggtt tggaaacttg cat 23
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<212>DNA
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ctagagtttt gcggttactt gc 22
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
ctagagtttt gcggttactt gt 22
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
ccttcctctg agaagtat 18
<210>34
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<212>DNA
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cctcgacatg tcttagtgtt t 21
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<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
tgggatatct tctaaccata gc 22
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
tgggatatct tctaaccata gt 22
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
agcgcctcat cctg 14
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
cagtggggtg aaaatacgc 19
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<211>17
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
agctccctga cgccttc 17
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<211>17
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
agctccctga cgccttt 17
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
taccttctct gaagccag 18
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
gagactgctg aacacattgc 20
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
catctgcttt ctcatgcctc 20
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<400>44
catctgcttt ctcatgccta 20
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<213>智人(Homo sapiens)
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cacttcctga cgcctc 16
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<213>智人(Homo sapiens)
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gaaaccgttg tggagagcag t 21
<210>47
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
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cgctccttga aactttgata gg 22
<210>48
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
cgctccttga aactttgata gc 22
Claims (107)
1.互补于靶多聚核苷酸的一条寡聚核苷酸链，其中该寡聚核苷酸链包括一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配的核碱基，和一个对应于靶多聚核苷酸等位基因之一的特异性核碱基。
2.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中锁定核苷酸(LNA)单位和错配的核碱基是毗邻的(连续的)。
3.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中错配碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
4.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中锁定核苷酸(LNA)单位、错配的核碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
5.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置。
6.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置。
7.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-1位置。
8.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-2位置。
9.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置，错配核苷酸是在-1位置。
10.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置，错配核苷酸是在-2位置。
11.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置。
12.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
13.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置。
14.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-1位置。
15.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
16.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置，并且错配碱基位于-1位置。
17.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置，并且错配碱基位于-2位置。
18.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基互补于靶多聚核苷酸。
19.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中等位基因特异性碱基不互补于靶多聚核苷酸。
20.权利要求1中的寡聚核苷酸，其中该寡聚核苷酸为一条引物。
21.权利要求1中的寡聚核苷酸，进一步偶联一个荧光基团和一个淬灭元件，并位于当等位基因特异性引物介导的DNA聚合酶成功延伸的位置，该寡聚核苷酸可以被聚合酶降解并改变检测到的荧光信号。
22.包含杂交于特定靶多聚核苷酸的寡聚核苷酸的双链分子，其中寡聚核苷酸互补于靶多聚核苷酸，并有一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核苷酸碱基和一个对应于靶多聚核苷酸某等位基因形式的等位基因特异性碱基组成。
23.权利要求22中的双链，其中锁定核苷酸(LNA)单位和错配碱基是毗邻的。
24.权利要求22中的双链，其中错配碱基和等位基因特异性核苷酸碱基是毗邻的。
25.权利要求22中的双链，其中锁定核苷酸(LNA)单位、错配碱基和等位基因特异性核苷酸碱基是毗邻的。
26.权利要求22中的双链，其中相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-2位置。
27.权利要求22中的双链，其中相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-3位置。
28.权利要求22中的双链，其中相对于等位基因特异性核苷酸碱基，错配核苷酸位于-1位置。
29.权利要求22中的双链，其中相对于等位基因特异性核苷酸碱基，错配核苷酸位于-2位置。
30.权利要求22中的双链，其中相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-2位置而错配核苷酸位于-1位置。
31.权利要求22中的双链，其中相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-3位置而错配核苷酸位于-2位置。
32.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置。
33.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，而相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-2位置。
34.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，而相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-3位置。
35.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，而相对于等位基因特异性核苷酸碱基，错配核苷酸位于-1位置。
36.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，而相对于等位基因特异性核苷酸碱基，错配核苷酸位于-2位置。
37.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，而相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-2位置而错配核苷酸位于-1位置。
38.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，而相对于等位基因特异性核苷酸碱基，锁定核苷酸(LNA)单位位于-3位置而错配核苷酸位于-2位置。
39.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基互补于靶多聚核苷酸。
40.权利要求22中的双链，其中等位基因特异性碱基不互补于靶多聚核苷酸。
41.权利要求22中的双链，其中寡聚核苷酸链是一条引物。
42.权利要求22中的双链，进一步偶联一个荧光基团和一个淬灭元件，并位于当等位基因特异性引物介导的DNA聚合酶成功延伸的位置，该寡聚核苷酸可以被聚合酶降解并改变检测到的荧光信号。
43.一种用于检测某生物样品中是否含有某特定靶多聚核苷酸的方法，包括：
(a)一条寡聚核苷酸链可以互补于靶多聚核苷酸，它包括：一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核苷酸和一个对应于靶多聚核苷酸某等位基因型的等位基因特异性核苷酸。
(b)将(a)中所述的寡聚核苷酸链同怀疑含有靶多聚核苷酸的生物样品混合。
(c)检测是否有寡聚核苷酸与靶多聚核苷酸的杂交和延伸出现，其中寡聚核苷酸与靶多聚核苷酸的杂交和延伸提示有该等位基因特异性碱基对应等位基因出现。
44.权利要求43中的方法，其中锁定核苷酸(LNA)单位和错配的核碱基是毗邻的(连续的)。
45.权利要求43中的方法，其中错配碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
46.权利要求43中的方法，其中锁定核苷酸(LNA)单位、错配的核碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
47.权利要求43中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置。
48.权利要求43中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置。
49.权利要求43中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-1位置。
50.权利要求43中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-2位置。
51.权利要求43中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置，错配核苷酸是在-1位置。
52.权利要求43中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置，错配核苷酸是在-2位置。
53.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置。
54.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
55.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置。
56.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-1位置。
57.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
58.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置，并且错配碱基位于-1位置。
59.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置，并且错配碱基位于-2位置。
60.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基互补于靶多聚核苷酸。
61.权利要求43中的方法，其中等位基因特异性碱基不互补于靶多聚核苷酸。
62.权利要求43中的方法，进一步偶联一个荧光基团和一个淬灭元件，并位于当等位基因特异性引物介导的DNA聚合酶成功延伸的位置，该寡聚核苷酸可以被聚合酶降解并改变检测到的荧光信号。
63.一种用于检测某生物样品中靶核苷酸位置中是否存在多态性的方法，
包括：
(a)一条寡聚核苷酸链可以互补于靶多聚核苷酸，它包括：一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核苷酸和一个对应于靶多聚核苷酸某等位基因型的等位基因特异性核苷酸。
(b)将(a)中所述的寡聚核苷酸链引物，DNA聚合酶分子，和怀疑含有靶多聚核苷酸的生物样品在易于控制的条件下混合，让寡聚核苷酸引物同靶多聚核苷酸杂交，并延伸生成引物延伸产物。
(c)检测是否有引物延伸产物，其中存在引物延伸产物提示有该等位基因特异性碱基对应等位基因出现。
64.权利要求63中的方法，其中锁定核苷酸(LNA)单位和错配的核碱基是毗邻的(连续的)。
65.权利要求63中的方法，其中错配碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
66.权利要求63中的方法，其中锁定核苷酸(LNA)单位、错配的核碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
67.权利要求63中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置。
68.权利要求63中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置。
69.权利要求63中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-1位置。
70.权利要求63中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-2位置。
71.权利要求63中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置，错配核苷酸是在-1位置。
72.权利要求63中的方法，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置，错配核苷酸是在-2位置。
73.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置。
74.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
75.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置。
76.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-1位置。
77.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
78.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置，并且错配碱基位于-1位置。
79.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置，并且错配碱基位于-2位置。
80.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基互补于靶多聚核苷酸。
81.权利要求63中的方法，其中等位基因特异性碱基不互补于靶多聚核苷酸。
82.权利要求63中的方法，进一步偶联一个荧光基团和一个淬灭元件，并位于当等位基因特异性引物介导的DNA聚合酶成功延伸的位置，该寡聚核苷酸可以被聚合酶降解并改变检测到的荧光信号。
83.一种用于定量检测某生物样品中某特定靶多聚核苷酸的第一等位基因和第二等位基因和出现频率的方法，包括：
(a)利用与该靶多聚核苷酸第一等位基因互补的第一特异性寡聚核苷酸链在生物样品中扩增靶多聚核苷酸。其中第一寡聚核苷酸链包括一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核苷酸碱基和一个对应于该靶多聚核苷酸第一等位基因的特异性核碱基。
(b)利用与该靶多聚核苷酸第二等位基因互补的第二特异性寡聚核苷酸链在生物样品中扩增靶多聚核苷酸。其中第二寡聚核苷酸链包括一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核苷酸碱基和一个对应于该靶多聚核苷酸第二等位基因的特异性核碱基。
(c)比较(a)和(b)中扩增过程中的循环阈值。
(d)计算第一等位基因和第二等位基因的频率。
84.一种用于定量检测某生物样品中某特定靶多聚核苷酸的某等位基因出现频率的方法，包括：
(a)利用与该靶多聚核苷酸第一等位基因互补的第一特异性寡聚核苷酸链在生物样品中扩增靶多聚核苷酸。其中第一寡聚核苷酸链包括一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核苷酸碱基和一个对应于该靶多聚核苷酸第一等位基因的特异性核碱基。
(b)计算(a)过程的循环阈值。
(c)比较(a)和某已知扩增过程的循环阈值。
(d)计算该等位基因的频率。
85.一个包含与特定靶多聚核苷酸互补的寡聚核苷酸的试剂盒，其中包括：一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核碱基和一个对应于该多聚核苷酸某等位基因的等位基因特异性碱基。
86.权利要求85中的试剂盒，其中锁定核苷酸(LNA)单位和错配的核碱基是毗邻的(连续的)。
87.权利要求85中的试剂盒，其中错配碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
88.权利要求85中的试剂盒，其中锁定核苷酸(LNA)单位、错配的核碱基和等位基因特异性碱基是毗邻的。
89.权利要求85中的试剂盒，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置。
90.权利要求85中的试剂盒，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置。
91.权利要求85中的试剂盒，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-1位置。
92.权利要求85中的试剂盒，其中相对于等位基因特异性碱基，错配核苷酸是在-2位置。
93.权利要求85中的试剂盒，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-2位置，错配核苷酸是在-1位置。
94.权利要求85中的试剂盒，其中相对于等位基因特异性碱基，锁定核苷酸(LNA)单位是在-3位置，错配核苷酸是在-2位置。
95.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置。
96.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
97.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置。
98.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-1位置。
99.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置并且错配碱基位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置。
100.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-2位置，并且错配碱基位于-1位置。
101.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基在位于核苷酸链3’端位置，锁定核苷酸(LNA)单位位于相对于等位基因特异性碱基的-3位置，并且错配碱基位于-2位置。
102.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基互补于靶多聚核苷酸。
103.权利要求85中的试剂盒，其中等位基因特异性碱基不互补于靶多聚核苷酸。
104.权利要求85中的试剂盒，其中该寡聚核苷酸为一条引物。
105.权利要求85中的试剂盒，进一步偶联一个荧光基团和一个淬灭元件，并位于当等位基因特异性引物介导的DNA聚合酶成功延伸的位置，该寡聚核苷酸可以被聚合酶降解并改变检测到的荧光信号。
106.权利要求85中的试剂盒，进一步包含与特定靶多聚核苷酸第二等位基因互补的第二条寡聚核苷酸链，其中包括：一个锁定核苷酸(LNA)单位，一个错配核碱基和一个对应于该多聚核苷酸某等位基因的第二等位基因特异性碱基。
107.权利要求85中的试剂盒，进一步包含以下一项或多项：一种核酸聚合酶，引物延伸的脱氧核酸，和引物终止的双脱氧核酸。
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