KR20020007331A - 특이 ｌｎａ 프라이머에 의한 유전자중의 돌연변이 검출 - Google Patents

특이 ｌｎａ 프라이머에 의한 유전자중의 돌연변이 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치에서 상이한 변형 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 한 세트의 DNA 모노머 및 신규한 클래스의 DNA 유사체, 록(locked) 핵산(LNA)을 포함하는 키메라 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. LNA 올리고머는 왁슨-크릭 염기쌍 법칙을 따르고 DNA에 의해 형성된 유사한 이중나선보다 더욱 현저하게 안정한 이중나선 구조를 형성한다. "대립형질-특이" LNA-포함 올리고뉴클레오타이드(여기에서, LNA 뉴클레오타이드(들)는 3' 위치에서 발견됨)를 신장 방향으로 말단인 그의 뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 핵산(의 대립형질)의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 효소를 사용하여 신장시킬 수 있다. 따라서, 순차적으로 별개의 혼성화없이 대립형질을 식별할 수 있다. 본 발명은 또한 본 방법을 시행하기 위한 시약 및 본 방법의 적용에 관한 것이다.

Description

특이 ＬＮＡ 프라이머에 의한 유전자중의 돌연변이 검출{Detection of mutations in genes by specific LNA primers}
현재, 핵산 서열중 특정 핵산의 존재여부에 대하여 샘플을 시험하는 것이 점점더 중요시되고 있다. 이것은 부분적으로는 핵산의 뉴클레오타이드 서열이 각 유기체의 독특한 특성이라는 사실 때문이다. 첫째, "정상" 유전자에 대한 뉴클레오타이드 서열은 여러 방식으로 변화된다는 점에서 다수의 질병은 유전성이다. 그러한 변화는 하나의 염기가 또다른 염기로 치환됨으로써 발생할 수 있다. 하나 이상의 염기를 포함하는 변화 또한 이해될 것이다. 하나의 아미노산에 대하여 세개의 염기가 주어지는 경우, 하나의 염기 변화(점돌연변이(point mutation)에 의해 아미노산이 변할 수 있고, 결국은 세포에서 결함 단백질(defective protein)이 생성될 수 있다. 겸형적혈구빈혈은 단일 유전자중에 하나의 염기의 변화; 베타-글로빈 유전자(코돈 6번 위치에서 A→T 전이)에 발생하는 그러한 유전적 결함의 대표적인 예이다. 중요한 점돌염변이는 또한 예를 들면, LDL 수용체(Atherosclerosis(1992),96:91-107) 또는 아포지단백-B-유전자(코돈 3500의 CGG→CAG 돌연변이(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (1989) 86:587-591)에서 발견될 수 있다. 단일 유전자 결함에 의해 발생하는 질환의 또다른 예는 팩터 IX 및 팩터 VIII 결핍증(Factor IX and Factor VIII defiency), 유방암, 낭성섬유증, 팩터 V 레이덴(Factor V Leiden), 프레질 X(Fragil X), 헌팅돈 질환, 근긴장성 이영양증, 혈우병 A, 혈우병 B, 신경섬유종증형 I, 아데노신 디아미네이즈 결핍증, 퓨린 뉴클레오타이드 포스포릴레이즈 결핍증, 오르니틴 트랜스카바밀레이즈 결핍증, 아르기닌숙신네이트 신타아제 결핍증, 베타-탈라세미아, 알파-1 항트립신 결핍증, 글루코세레브로시다아제 결핍증, 페닐알라닌 하이드록실라아제 결핍증 및 하이폭사틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 결핍증을 포함한다.
둘째, 암의 주 원인은 직접 또는 간접적으로 세포 성장 및 분화를 조정하는 세포 유전자의 변화라고 사료된다. 인간 종양 형성과 연관된 온코진(oncogene)으로 불리는, 적어도 30종의 패밀리 유전자가 존재한다. 그러한 패밀리의 구성원인ras유전자 패밀리가 인간 종양에서 빈번하게 발견된다. 정상 상태에서,ras유전자에 의해 생성된 단백질은 정상의 세포 성장 및 성숙에 포함된다. 단백질 산물에서 3개의 중요한 위치중 하나에서 아미노산을 변화시키는ras유전자의 돌연변이가 종양 형성과 연관되는 형태로 전환시킨다. 그러한 돌연변이를 갖는 유전자를 "돌연변이체" 또는 "활성(active)"으로 언급한다. 비돌연변이성ras는 "야생형" 또는 "정상"ras로 명명된다.ras를 활성화시키는 그러한 점돌연변이는 발암물질 또는 다른 환경 인자에 의해 유도될 수 있다고 사료된다. 90%이상의 췌장 선암종, 약 50%의 결장 선암 및 선암종, 약 50%의 폐 선암종 및 갑상선 선암, 및 급성 골수성 백혈병, 림프종 및 척수이형성 증후군과 같은 거대 분획의 혈액암이 활성화된ras온코진을 포함한다는 것이 발견되었다. 전체적으로 인간 종양의 10 내지 20%는 세개의ras유전자(H-ras, Ki-ras, 또는 N-ras)중 하나에서 돌열변이를 갖는다.
암 발생에 고도로 포함되는 또다른 유전자의 예는 TP35 유전자이다. 반 이상의 모든 인간 암에서 돌연변이 및/또는 결실에 의해 변화된다. 점돌연변이는 250개 이상의 코돈에 분산되어 있고 주로 미스센스 돌연변이(missense mutation)로서 발생한다. 이와 관련하여, TP53 유전자는 결실 또는 난센스 돌연변이(nonsense mutation)에 의해 주로 빈번하게 불활성화되는 망막모세포종 종양 억제 유전자(Rb1) 및 p16 유전자와 같은 다른 종양 억제 유전자와 상이하다.
주로 악성 종양은 TP53 유전자의 둘 모두의 대립형질에 변화를 보인다. 이것은 일반적으로 하나의 유전자의 완전 결실 및 미스센스 돌연변이에 의한 나머지 하나의 대립형질의 불활성을 포함한다. 결과는 TP53 단백질의 완전 결핍 또는 변화된 단백질의 발현중 어느 하나이다. TP53의 고도로 보존되는 영역에서 미스센스 돌연변이가 또한 증가된 수준의 TP53 단백질과 연관된다. 이것은 단백질을 안정화시키고 그의 반감기를 4시간에서 8시간으로 연장시키는 구조 변화에 의해 유도된 돌연변이로부터 발생하는 것처럼 보인다. 대다수의 미스센스 돌연변이는 단백질의 중심 핵중 고도로 보존되는 4개의 도메인(domain)에 군집한다. 이 영역이 서열 특이적 DNA 결합의 원인이 되며 따라서 이것이 TP53의 작용 보전에 중요하다. 일부의 돌연변이성 핫 스팟(hot spot)이 이들 도메인내에서 동정되었다. 이들은 아미노산 잔기의 175, 213, 245, 248,249, 273, 및 282에 위치한다.
세째, 감염성 질환은 자기 자신의 핵산을 갖는 기생충, 미생물 및 바이러스에 의해 발생한다. 다수의 통상적인 방법(예: 배양)에 의해 생물학적 물질의 샘플중 이들 유기체의 존재여부를 측정한다.
각 유기체는 그 자신의 독특한 게놈을 갖고 단일종(내지 수개의 관련 종, 내지 속 또는 내지 고등의 관련 종(higher level of relationship)에 특이적인 핵산의 서열 또는 유전자가 존재하는 경우, 이 서열은 그 유기체(또는 종 등)에 대하여 '핑거프린트(fingerprint)"를 제공할 것이고, 예를 들면, HIV 바이러스의 역전사 효소의 유전자(코돈 215에서 A→T 돌연변이: Science (1998)246:1155-1158)이다. 다른 바이러스의 예는 HPV, EBV, HSV, 간염 B 및 C 및 CMV를 포함한다. 미생물의 예는 박테리아를 포함하고 더욱 특히 미코플라스마, 레지오넬라, 미코박테리아, 클라미디아, 캔디다, 고노키, 시겔라 및 살모넬라의 다양한 품종를 포함한다. 과학 집단에 의해 더욱 많은 유기체로부터 게놈에 대한 정보를 습득함으로써, 본 발명에 의해 동정될 수 있는 미생물의 레파토리는 증가할 것이다. 일부의 박테리아 품종의 핵산에서, 그들의 리보점 유전자 및 rRNA의 서열이 특히 현저하게 유사하다고 밝혀졌다.
현재 상이한 뉴클레오타이드 서열에 대한 샘플 조사 분야에서는 핵산들 사이의 식별을 위해 뉴클레오타이드의 서열에서 단지 하나의 단일 차이(difference)를 사용하는 것을 집중적으로 시도하고 있다. 그러한 차이는 예를 들면, 점돌연변이에 의해 발생하는 뉴클레오타이드 교환의 결과이거나 미생물의 경우에는 종간의 차이의 결과일 수 있다. 그와 밀접하게 연관된 자연발생의 예는 대립형질, 즉, 염색체상의 정의된 위치상의 주어진 유전자 서열의 대체 변이체(alternative variant)이다.
상기 언급된 각 예에서, 샘플로부터 핵산을 분리하고 질환 또는 유기체에 특이적인 하나 이상의 서열을 확인함으로써 샘플이 상기 언급된 서열, 즉, "유전병", 암, 감염성 질환 또는 감염성 유기체에 특이적인 서열중 어느 하나를 포함하는지를 측정할 수 있다. 그러나, 샘플중에 존재하는 표적 서열의 카피(copy)의 수가 낮은 경우 검출은 용이하게 적용될 수 없다는 것이 뉴클레오타이드 서열에서 이들의 차이 또는 변화를 확인시의 난점이다. 그러한 경우 시그날을 노이즈(noise)로부터 식별하는 것은 어렵다. 이런 문제점과 관련하여 하나의 방법은 시그날을 증가시키는 것이다. 따라서, 샘플중에 존재하는 표적 서열을 증폭시키는 다수의 방법이 기술되었다. 가장 잘 공지되어 있고 광범위하게 사용되는 증폭 방법 중 하나는 중합효소 연쇄반응(PCR로 언급됨)으로서, 이것은 US 4,683,195 호, US 4,683,202호 및 US 4,800,159호에 상세히 기재되어 있다.
PCR 기술에 기초하여, 서열 변이를 검출하는 다수의 방법이 기술되었다. [Oncogene Research 1 (1989), 235-241 and Nucl.Acids Res. 17(1989), 8093-8099]로부터 공지된 방법은 우선 대립 변이체를 포함할 것으로 예측되는 부위(area)를 특정하게 작제된 프라이머를 사용하여 PCR에서 증폭시킨 후 제한효소를 사용하여 처리하는 것이다. 대립형질이 일단 제한단편길이다형성(restriction fragment length polymorphisms(RFLP)으로 분석되면 이어서 진단될 수 있다. 크기에 따른 절단 산물의 전기 영동 분리에 의해 탐침중 상응하는 대립형질이 포함되는지 여부를 밝힌다. 이 방법의 단점은 특이적인 제한 분해를 필요로 한다는 것이다. 이것은 RFLP를 생산하지 않는 각 돌연변이에 대하여는 복잡한 방법이라는 사실과는 별도로, 주어진 위치에서 정확하게 절단하는 제한 효소를 사용하여 분해할 수 있도록 하기 위하여 프라이머를 점돌연변이에 인접하게 작제하여야 한다. 이것은 언급된 문헌에 나열된 이유 때문에 어려울 수 있다.
EP-1-0 332 435 및 US 5,605,794에는 단지 하나의 뉴클레오타이드에 의해 인접한 핵산과 상이한 핵산을 선택적으로 검출하는 방법이 기재되어 있다. 본 발명에서 사용되는 효과는 하기의 것이다: 검출하고자 하는 핵산에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드로부터 이론적으로는 효소에 의해 신장시킬 수 있고, 거기에서, 신장 방향으로 말단에 위치하는 하나의 뉴클레오타이드는 검출하고자 하는 핵산(의 대립형질)의 상응하는 핵산에 상보적이다. 그러므로, 시험하고자 하는 핵산에 유일하게 상보적이기 때문에 올리고뉴클레오타이드가 식별된다. 따라서, 다른 하나의 대립형질에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드는 이론상 신장되지 않는다. 그러나, 실제로는 비록 극히 소수일지라도, 다른 하나의 대립형질에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드는 또한 신장된다. 이것이 방법의 감수성 및 특히 특이성을 감소시킨다. 특히, T가 3'-말단의 미스매치(mismatch)의 일부이거나 미스매치가 C:A 미스매치인 경우 비특이적 신장은 용이하게 발생할 수 있다(Kwok et al., (1990). Nucleic Acids Research, 18:999-1005). 특이성을 증가시키기 위해, EP-A-0 332 435는 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 식별하는 것을 제안하였다. 말단 부위가 두개의 핵산의 상응하는 뉴클레오타이드에 비상보적인 또다른 뉴클레오타이드를 포함하도록 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 식별할 것을 제안하다. 둘 모두의 대립형질을 검출하기 위하여, 각 반응당 두개의 대립형질중 검출하고자 하는 하는 것 하나만을 사용하여 두개의 반응을 수행하여야 한다. 이 방법은 두개의 대립형질-특이 프라이머 및 하나의 상보적인 스트랜드 프라이머의 합성을 필요로 한다. 샘플은 두개의 반응에서 증폭된다: 1차 PCR에서 상보적 스트랜드 프라이머 및 대립형질-특이 프라이머중 하나를 사용하고, 2차의 동일한 반응, PCR에서는 상보적 스트랜드 프라이머 및 제 2의 대립형질-특이 프라이머를 사용하여 샘플이 증가된다. 상기 반응들중 하나에서 예측되는 대립형질-특이 PCR 산물이 검출되지 않는 경우, 각 대립형질이 샘플중에 존재하지 않는 것으로 간주한다. 동형 DNA-샘플은 두개의 반응중 하나에서만 검출될 수 있는 두개의 대립형질중 하나만을 포함하기 때문에, 모든 반응에서 동일한 대조군 산물을 생성하는 두개의 첨가된 프라이머를 사용하는 것이 필요하다. 이 대조군 산물은 다른 대립형질의 각 PCR 효율을 조절하고 각 대립형질의 부재를 구축하기 때문에 특이성 산물과 상이하다. 대조군 산물이 PCR 산물중에 존재하지만 대립형질의 특이 산물은 발견되지 않는 경우, 샘플은 반응에서 시험하고자 하는 대립형질을 포함하고 있지 않을 수 있다. 이 방법에서, 두개의 대립형질의 존재여부는 두개의 분리된 반응에서 확인될 수 있고 각 개개의 PCR은 대조군 PCR을 포함할 수 있다.
[Biochem. Biophys. Res. Commun.(1989), 160:441-447]은 dNTP 농도를 감소시킴으로써 특이성을 증가시키는 것을 제안하다. 추가적 측정 방법을 수행하여도,분리된 배치(batch)에서 대립형질의 검출은 비특이성 산물을 수득시킬 수 있다.
리가아제 연쇄반응(WO 89/09835)에서, 열안정성 리가아제를 사용하여 두개의 인접한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 특이적으로 연결시킨다. 이것은 엄격한 혼성화 온도에서 상보적인 표적에 혼성화되는 경우 및 연결 부위에 염기-쌍이 완전한 경우에만 발생한다. 연결 부위에서의 돌연변이의 결과로서 두개의 대립형질이 서로 상이한 경우, 완전 염기-쌍의 상기 조건은 대립형질중 하나만에 대하여 이행된다. 이어서, 리가아제 연쇄 반응에서 결찰 산물을 증폭시기기 위해 처음 두개에 상보적인 두개의 추가 올리고뉴클레오타이드가 필요하다. 현재까지, 두개의 대립형질을 검출하기 위해서는 적어도 6개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 두개의 반응이 요구시되고, 증폭 산물은 방사선 표지에 의해 검출된다(Pro. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1991), 88:189-193).
[Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1985), 82:1585-1588] 및 [New England Journal of Medicine (1987), 317:985]로부터 공지된 대립형질 검출 방법은 "대립형질-특이" 올리고뉴클레오타이드(ASO)을 연구중인 대립형질과 상이하게 혼성화시키는 것에 기초한다. 예를 들면, 각각 길이 20bP인 두개의 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 각각은 두개의 상이한 대립형질중 하나와 매치(match)되지만 올리고뉴클레오타이드 서열의 중앙에 위치하는 다른 하나의 대립형질에 미스매치된다. 이어서, 표지된 올리고뉴클레오타이드와의 상이한 혼성화에 의해 대립형질을 식별할 수 있다. 이것을 인간 게놈 DNA 및 PCR 산물 분석에 적용시킨다. 본 방법으로 게놈 DNA을 직접적이고 분리하여 분석할 수 있지만 추가적으로 분해법 및 전기영동이 요구된다.
[Nucleic Acids Research(1989), 17:2437-2448] 및 EP-A-0 333 465에는 대립형질-특이 프라이머의 경합(경합적 올리고뉴클레오타이드 프라이밍(priming)=COP)에 의해 몇회의 추가적인 PCR 사이클후 다양한 대립형질의 존재에 대하여 전-증폭된 인간 게놈 DNA를 시험하는 방법이 기재되어 있다. 이어서, 상기 기재된 ASO-기술을 PCR 기술로 전환시킨다. 본래의 ASO-기술에서, 상응되는 조정단계에서 시그날 비교로 결과의 해석을 명확하게 하기 때문에, 교차 혼성화에 의해 발생하는 5%의 오차율은 허용가능하다. 그러나, 프라이머가 대립형질-특이 올리고뉴클레오타이드인 PCR 반응에서, 두개의 대립형질이 증폭된 시약 혼합물중 오차가 발생하는 경우, 12회의 사이클후 대립형질중 하나만을 포함만을 포함하는 샘플에 대한 오차율은 12%에 이를 것이다. 그러나, 게놈 DNA의 관심의 대상이 되는 영역을 우선 PCR에서 증폭시키고 10회의 순차된 사이클에서 상이한 대립형질에 대한 분석을 수행하여, 프라이머 경합이 선택성을 증가시킨다는 것을 입증할 수 있다. 두개의 대립형질-특이 프라이머 및 상보적 스트랜드 프라이머를 이들 사이클에서 사용하였고 두개의 반응에서 대립형질-특이 프라이머중 하나를 형광 표지하였다. 길이 12 내지 16 염기의 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상이한 대립형질의 선택적 검출이 입증되었고 주어진 조건하에서 좀 더 긴 올리고뉴클레오타이드 또한 비-특이 산물을 생성하였다.
게놈 DNA와 같은 핵산을 포함하는 샘플중에서 적어도 하나의 단일 염기 차이를 직접 검출하는, 최소의 조작 기술로 신속, 정확 및 용이하게 수행될 수 있는 방법으로 검출 단계를 최소화하는 간편하고 좀더 특이적인 방법이 요구되고 있다.
상이한 혼성화에 기초하는 방법은 단지 특정한 상황에만 적용될 수 있고 매우 복잡하여 간섭에 대하여 민감하다. 또한, 전-증폭은 예를 들면, COP동안의 처리 단계이고, 이것은 바람직하게 삭제된다.
상기 언급된 변형 핵산을 검출하는 모든 방법은 변형 핵산의 검출에서 식별 인자로서 변형되지 않은 뉴클레오타이드에 의존적이라는 동일한 특성을 갖는다.
발명의 요약
본 발명은 제한 효소에 의한 분해를 필요로 하지 않는고, 하나의시약 혼합물중에서 핵산들을 증폭시킬 수 있고 순차적 효소 반응에 따라 변하지 않는 변형 핵산의 간단한 특정 검출 방법을 제공한다. 본 발명에서 중요한 성분은 시험관내 DNA 진단을 향상시키기 위하여 중요한 캔디데이트를 제조할 수 있는 독특한 특성을 갖는 신규한 클래스의 DNA 유사체인 LNA이다. LNA 모노머는 구조적으로 RNA-모노머와 유사한 2원환 화합물이다(식 I 참조). LNA는 DNA 및 RNA와 화학적 특성이 유사하고, 수용성이고, 전기영동, 에탄올 침전 등에 의해 분리될 수 있다(Tetrahedron, 54, 3607-3630(1998)). 그러나, LNA 모노머를 DNA 또는 RNA 올리고중 어느 하나에 도입은 왁스-크릭 염기-쌍 법칙을 따르면서 동시에 상보적인 DNA 또는 RNA와 상보적이고 고온 안정성인 신규한 이중가닥(duplex)이 형성된다. 3' 위치하는 LNA(s)를 포함하는 프라이머는 효소성 신장, 예를 들면, PCR 반응에 대한 기질이라는 발견과 함께, LNA 올리고머로 형성된 이중가닥의 고온 안정성을 본 발명에서 사용함으로써 본 명세서에 기재된 시험관내 분석에서 변형 핵산의 검출 특이성을 현저하게 증가시킬 수 있다. 개개 대립형질을 증폭 방법은 고도로 분리되어 수행되고(교차 반응은 관찰될 수 없다) 동일한 베슬에서 수회의 반응이 수행될 수 있다.
본 발명은 변형(variant) 핵산 검출 방법, 상기 목적에 적절한 올리고뉴클레오타이드 세트, 본 발명의 방법을 시행하기 위한 시약 키트 및 특정 유전자 서열 확인 및 질환 및 감염 진단시 상기 방법의 용도 및 적용을 포함한다.
본 발명은 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 적어도 두개의 단계를 포함한다:
a) 신장 반응을 위한 프라이머로서 적어도 하나의 LNA-함유 올리고뉴클레오타이드인 진단 올리고뉴클레오타이드로 신장 반응을 수행하고, 여기에서 LNA(s)는 바람직하게 위치 A 또는 위치 A의 주변 위치, 가장 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에서 발견되며;
b) 예를 들면, 표준 전기영동, 모세관 전기영동 또는 다양한 혼성화 분석법에 의해 신장 산물을 검출한다.
본 발명의 다른 일면은 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 한 세트, 상이한 올리고뉴클레오타이드 세트, 시약 키트를 사용하는 추가의 신장 및 증폭 및 다양한 적용 및 언급된 방법의 용도이다.
본 발명에 따라 "표적 핵산"은 샘플중에 포함될 수 있고 그의 존재여부가 관심의 대상이 되는 핵산이고, 표적 핵산(Q 및 Q')의 뉴클레오타이드 서열은 실질적으로 동일하지만, 핵산 Q'는 핵산 Q의 뉴클레오타이드 서열과 그의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 위치에서 상이하다. 뉴클레오타이드 서열에서 상이한 위치를 "위치 A"로서 언급한다. 위치 A는 또한 다형위치로서 언급되고 핵산에 위치 A의 존재는 유전자 다형으로서 언급된다. 변형 뉴클레오타이드 서열이 일부의 상이한 핵산(Q'1,Q'2,...Q'e)을 포함하는 경우 상이한 위치는 A1,A2,...Ae으로 언급될 것이다. 그러한 차이는 예를 들면, 점돌연변이의 결과로서 발생할 수 있거나 하나 또는 몇개의 염기의 결실 또는 삽입에 의해 발생할 수 있다. 검출하고자 하는 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있고 특히 박테리아성 rRNA의 진단에 특히 적절하다고 입증되었다.
용어 " 진단 올리고뉴클레오타이드"는 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에 갖고 주어진 혼성화 조건하에서 상이한 표적 핵산 서열(Q, Q'1,Q'2,...Q'e)를 식별할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 언급하고 위치 A의 진단 올리고뉴클레오타이드의 위치 A의 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 핵산 서열의 신장을 개시한다.
용어 "산물 표적"은 원(original) 표적 핵산의 신장 산물인 뉴클레오타이드를 언급한다. 산물 표적은 또한 표적 핵산으로서 사용될 수 있고 일반적으로 원 표적보다 작다.
용어 "위치"는 핵산상의 정의된 사이트를 언급한다. 그러한 위치는 예를 들면, 뉴클레오타이드에 의해 사용될 수 있다.
용어 "대립형질"는 상동 염색체상의 동일한 유전자좌에서 발생하지만 상이한 염기서열을 갖는 동일한 유전자의 어느 형태를 언급한다.
뉴클레오타이드는 일반 왁슨-크릭 염기-쌍이 확인되는 경우 상보적인 것으로서 언급된다(예:G-C, A-T, 또는 A-U). 상보적인 염기-쌍이 매치시키는 반면,, 비-상보적 염기-쌍은 미스매치시킨다. 그러한 염기-쌍을 만드는 어느 뉴클레오염기(예: 7-데자-dGTP, dIPT, LNA-염기 유사체 등) 또한 상보적인 것으로서 언급된다.
본 발명의 방법을 수행하기 위하여, 검출하고자 하는 핵산은 시험관내 반응에 적절한 형태로 존재하여야 한다. 연구하고자 샘플, 예를 들면, 조직 샘플, 조직 추출물, 개개 세포 또는 세포-함유 체액을 공지된 방법(예: 열, 효소 또는 화학적 용균 또는 그의 조합)에 의해 세포 벽을 파괴하여 분해하여 핵산을 방출시킨다.
이어서 샘플을 본 발명의 진단 올리고뉴클레오타이드과 접촉시킨다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 핵산의 상응하는 부위와 혼성화되도록 조건을 선택한다. 이 혼성화는 일반적으로 어닐링(annealing)으로서 공지되어 있다. 적절한 뉴클레오타이드 서열, 뉴클레오타이드의 길이, 혼성화 온도, 어쥬반트 등을 선택하여 관련되지 않는 핵산, 즉, 검출하고자 하는 것이 아닌 것과의 혼성을 피한다(참조, Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, pub. John Wiley & Sons (1998) 및 실시예의 설명).
본 발명의 상이한 진단 올리고뉴클레오타이드의 수는 적어도 검출하고자 하는 상이한 표적 핵산의 수와 일치한다. 그러므로, 두개의 상이한 돌연변이의 검출시 각각 표적 핵산의 A 위치에 존재할 수 있는 뉴클레오타이드중 단지 하나에 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 두개의 상이한 진단 올리고뉴클레오타이드가 필요하다. 사용되는 진단 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 길이는 50 뉴클레오타이드 이하이고, 바람직하게는 5 내지 40 뉴클레오타이드 범위, 더욱 바람직하게5 내지 30 뉴클레오타이드 범위, 더욱더 바람직하게 5 내지 25 뉴클레오타이드 예로서, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 또는 25이다. 각 진단 올리고뉴클레오타이드는 위치 A에 인접한 부위와 관련하여 고도로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖고 이 올리고뉴클레오타이드는 검출하고자 하는 핵산과 혼성화될 수 있다.
본 발명의 방법은 경합 프라이밍 또는 미스매치-프라이밍-방법 및 연관 방법의 원리에 기초하는 방법의 개선안이다. 그러나, 적용된 다양한 방법과 상관없이, 표적 핵산 검출에서 사용되는 각 진단 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 LNA를 포함한다. 이 LNA는 바람직하게 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상응하고 상보적이다.
본 발명의 일면은 하기 단계를 포함하는, 샘플중에서 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 표적 핵산 Q'의 존재를 검출하는 방법이다:
a) 혼성화 조건하에서 샘플중에 존재하는 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
b) 샘플중에 존재하는 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
c) 단계 b)에서 형성된 어느 핵산을 검출하여 샘플중에 핵산 Q'의 존재를 검출한다.
이 방법은 예를 들면, RNA로부터 cDNA로의 역전사 및 다른 제 1의 스트랜드 합성 적용에 적용될 수 있다. 본 방법은 단계 c)를 대신하여 하기 단계들을 추가하여 신장 반응을 사이클링함으로써 더욱 효율적으로 구성될 수 있다:
c1) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
d1) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c1)의 싱글 스트랜드 핵산을 혼성화 조건하에서 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시키고;
e1) 단계 c1)로부터 d1)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 신장 산물을 수득하고;
f1) 형성된 신장 산물을 검출한다.
본 발명은 결과적으로 선형으로 증폭시킬 것이고 추가로 PCR 형의 지수증폭을 위해 표적 핵산중 반대 스트랜드의 신장 산물의 합성을 위한 프라이머로서 "하류 올리고뉴클레오타이드"를 포함하는 재-증폭 단계를 포함시켜 연장될 수 있다.샘플중의 뉴클레오타이드가 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 표적 핵산 Q'의 존재를 검출하는 방법은 하기의 단계를 포함할 것이다:
a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제, 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
c) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
d) 혼성화 조건하에서 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시키고;
e) 단계 c) 내지 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
f) 형성된 신장 산물을 검출한다.
본 발명에 따라 선택되는 방법에 따라, LNA-뉴크레오타이드(s)는 진단 올리고뉴클레오타이드의 주어진 위치, 바람직하게, 위치 A, 예를 들면, 진단 올리고뉴클레오타이드의 내부 위치 또는, 바람직하게, 진단 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 위치한다.
본 명세서에 기재된 발명은 특히 멀티플렉스 분석에 적절하다. 다수의 경우에서, 다수의 코돈에 돌연변이를 갖는 TP53 유전자와 같이 상이한 위치에 다수의 상이한 돌연변이를 포함할 수 있는 유전자를 분석하다. 각각은 특정 돌연변이로 향하고 그의 각각은 특징적으로 단편을 크기로 분류할 수 있거나 특징적으로 단편을 표지할 수 있는, 다수의 주의깊게 매치된 LNA-올리고/DNA-올리고 쌍을 포함하여, 생성된 단편의 크기 분류법 또는 단편의 표지 검출법에 의해 다수의 상이한 돌연변이를 식별할 수 있다. 상기 언급된 것과 유사하지만 여기서 진단 올리고뉴크레오타이드가 하나 이상의 서열로 구성된 경우, 뉴클레오타이드가 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 뉴클레오사이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
c) 단계 b)에서 형성된 핵산을 검출한다.
방법은 예를 들면, 상이한 핵산 서열의 제 1 스트랜드에 특이적인 서열로서 사용할 수 있고 RNA의 역전사에 특이적인 서열로서 사용할 수 있는 것을 포함한다. 상기 기재된 바와 같이 단계 c) 대신 하기 단계를 추가하여 신장 반응을 수회 반복함으로써 또한 상기 기재된 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산 검출 방법을 더욱 효율적으로 수행할 수 있다:
c1) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
d1) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c1)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화하여 추가의 신장 산물을 합성하고;
e1) 단계 c1)로부터 d1)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
f1) 형성된 신장 산물을 검출한다.
본 방법은 사용된 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 상이한 핵산의 선형적으로 증폭시킬 것이고 추가로 PCR 형의 지수증폭을 위해 표적 핵산중 반대 스트랜드의 신장 산물의 합성을 위한 프라이머로서 하나 이상의 하류 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 재-증폭 단계를 포함시켜 연장될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법은 하기의 단계를 포함할 것이다:
a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제, 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
c) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
d) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오사이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시켜 추가의 신장 산물을 합성하고;
e) 단계 c) 및 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
f) 형성된 신장 산물을 검출한다.
또한, 본 발명의 변형되 형태로, 이들 조건하에서의 혼성화는 더욱 고도로선택적이고 특이성이기때문에 바람직하게 진단 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 LNA-뉴클레오타이드는 돌연변이의 위치(표적 핵산의 위치 A)에 상응하는 것이 바람직하다.
상기 언급된 모든 방법에서 중합제는 효소, 예를 들면, RNA 폴리머라아제, 역전자 효소 또는 DNA 폴리머라아제인 것이 바람직하다. DNA 폴리머라아제는 바람직하게 열안정성의 DNA 폴리머라아제, 예를 들면, Taq, Pfu, Pwo 또는 Tth이다.
변형 핵산을 검출하는 원리를 하기 실시예로 설명할 수 있다. 하나의 유전자의 두개의 대립형질을 동시에 검출하기 위하여 하나의 단일 반응 베슬은 PCR용 시약 혼합물을 포함한다. 이들 대립형질는 하나의 염기 위치(대립형질 Q'(돌연변이체)의 위치 A 및 대립형질 Q(정상)의 위치 A)에서 상이하다. 두개의 대립형질에서 발견되는 서열에 상보적인 하나의 유전자 프라이머 및 각각 두개의 대립형질중 하나에만 선택적인 두개의 프라이머인 세개의 프라이머를 반응에서 사용한다. 프라이머는 하나의 선택적 프라이머의 3'-말단에 염기가 Q'의 위치 A에 상보적이고, 또다른 프라이머의 염기는 Q의 위치 A에 상보적인 것에 의해 선택된다.둘 모두의 프라이머는 3'-말단에 위치 A에 상응하는 LNA를 포함한다. 또한, 생성된 PCR 산물을 용이하게 식별하기 위하여, 예를 들면, 대립형질-특이 프라이머를 선택하여, 상이한 길이의 PCR 산물 또는 상이한 표지를 갖는 PCR 산물을 제조하고 겔 전기영동, 모세관 전기영동 또는 본 분야에 공지되어 있는 다양한 혼성화 기술에 의해 용이하게 검출할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열에서 단일-염기에서의 차이의 검출에 대한 혼성화의 민감성은 리가아제 반응의 사용에 의해 증진될 수 있다. 일반적으로 주어진 올리고뉴클레오타이드의 길이가 짧을수록 단일 염기 차이에 대한 식별은 우수하다는 것이 관찰되었다(Nature 327, 293-297(1987) and Nature 327, 298-303(1987)). 그러나, 단쇄의 DNA-올리고는 매우 낮은 Tm을 가지므로, DNA-올리고의 길이에 최소한도로 세팅한다. LNA 변경에 의해 매우 현저하게 Tm(3-8℃로 바람직하게 변경)이 증가되므로, 4-25 뉴클레오타이드의 더욱 단쇄의 프라이머를 표준 PCR 및 LCR(리가아제 연쇄 반응) 조건과 동일한 조건에서 표적 핵산에 혼성화 시킬 수 있고 또한, 단일 염기 상이성에 대한 식별을 개선시킬 수 있다. PCR과 같이 LCR도 다중 사이클의 변화 온도를 사용하여 DNA의 표적 서열의 수를 증폭시킨다. 그러나, LCR는 주형 신장을 위한 개개의 뉴클레오타이드를 사용하지 않고, 대신 두개의 스트랜드의 표적 영역에 상보적인 과량의 올리고뉴클레오타이드에 의존한다. 더블-스트랜드의 주형 DNA를 변성시킨 후, LCR 방법은 표적 스트랜드중 하나의 인접 영역에 상보적인 두개(이상)의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 결찰로 개시된다. 스트랜드중 어느 하나에 상보적인 올리고뉴크레오타이드를 포함시킬 수 있다. 결찰 및 제 2의 변성 단계 후, 원 주형 스트랜드 및 두개(이상)의 신규하게 포함된 산물을 추가의 결찰을 위해 주형으로서 사용하여 표적되는 서열을 지수적으로 증폭시킨다. 이 방법은 [Genomics, 4:560-569(1989)]에 상세히 설명되어 있고, 이것은 본 명세서에서 참고 문헌으로서 인용된다. 본 발명에서, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 바람직하게 4 내지 25 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 5 내지 20 뉴클레오타이드, 더욱더 바람직하게 6 내지 15 뉴클레오타이드, 예, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 뉴클레오타이드를 포함하는 하나의 단쇄 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것을 제안한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 "LCR"-방법에서 유전자-다형에 대하여 디렉트된다. 변화 온도의 다중 사이클 후, 표적 서열의 수는 증폭되노 겔 전기 영동, "샌드위치"-혼성화, 또는 본 분야에서 언급된 다수의 방법중 어느 것에 의해 검출될 수 있다. 이것을 하기 단계에 의해 설명한다:
a) 혼성화 조건하에서 표적 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 이중 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는 올리고뉴클레오타이드이고, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 진단 올리고뉴클레오타이드인 적어도 두개의 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 결찰제와 배합시키고:
b) 인접 위치에서 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화되는 어느 올리고뉴클레오타이드를 결찰시켜 결찰 산물을 형성하고;
c) 결찰 후 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 결찰 산물을 분리하고;
d) 혼성화 존건하에서 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 올리고뉴클레오사이드 결찰제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 단계 b)로부터의 결찰 산물에 상보적인 적어도 하나의 진다 올리고뉴클레오타이드 및 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는 올리고뉴클레오타이드이고, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 혼성화하고;
e) 단계 c)로부터 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 결찰 산물을 수득하고;
f) 형성된 결찰 산물을 검출한다.
단계 b)후 방법을 중단하고 즉시 가시화할 수 있다.
바람직한 결찰제는 효소, 예를 들면, 리가아제, 바람직하게 DNA-리가아제, 예를 들면, T4-DNA 리가아제, 더욱 바람직하게 열안정성 리가아제, 예를 들면, Taq DNA 리가아제이다.
본 발명의 또다른 개선안은 LCR 및 PCR의 결합된 사용과 관련된다. 따라서, 하나의 상류 프라이머를 대신하여 두개(이상)의 단쇄(예: 8bp) 상류 LNA-프라이머를 주형에 혼성화시키는 것을 제안한다. 두개(이상)의 단쇄의 상류 LNA-프라이머를 이웃하는 서로에게 혼성화하는 경우, 결찰 반응에서 그들은 하나로 조인(join)될 수 있다. 따라서, 결찰이 충분하게 특이성임을 확신할 것이다. 결찰 후 결찰된 프라이머를 신장시킬 수 있다. 두개의 열안정성 리가아제 및 폴리머라아제가 기술되었기 때문에, 변화 온도의 다중 사이클을 사용하여 DNA의 표적화되는 서열의 수을 증폭시킬 것을 제안하다. 더블 스트랜드의 주형 DNA를 변성시킨 후, 방법은 표적 스트랜드중 하나의 인접 영역에 상보적인 두개(이상)의 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 결찰로 개시된다. 조인(join)/결찰된 올리고뉴클레오타이드은 폴리머라아제에 의해 신장된 하나의 상류 "프라이머"를 형성한다. 제 2의 변성 단계 후, 원 주형 스트랜드 및 두개(이상)의 신규하게 형성된 산물을 추가의 결찰 및 신장을 위해 주형으로서 사용하여 표적되는 서열을 지수적으로 증폭시킨다. 변화 온도의 다중 사이클 후, 표적되는 서열의 수를 증폭시킨다.
상기 언급된 모든 방법에서 진다 올리고뉴클레오타이드는 하기 일반식 a)를 갖는다:
a)
상기 식에서, A는 표적 핵산의 변형 핵산 서열이 서로 상이한 위치 A의 LNA이고; LNA는 하나의 LNA이며; Nu는 변형 핵산과 특이 염기쌍을 형성할 수 있는 LNA외의 어느 뉴클레오타이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 모노머이고; a,b,c,d 및 f는 0 내지 30의 정수이며, m은 1 내지 8의 정수이고, e는 1 내지 6의 정수이며, 단, a,b,c,d,e 및 f의 합은 적어도 5이다.
이것은 진단 올리고뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 위치 A는 검출되는 표적 핵산 서열의 위치 A에 상보적이지만 다른 표적 핵산 서열의 위치 A에는 상보적이지 않은 것이 바람직하다는 것을 의미한다. 또한, 진단 올리고뉴클레오타이드에서 적어도 하나의 위치 A는 LNA이다.
예를 들면, 사용되는 올리고뉴클레오타이드를 하나의 추가적인 특성에 의해 식별한다는 사실의 사용에 의해 샘플중의 검출하고자 하는 핵산의 존재여부 또는 양에 대한 측정인, 신장 산물의 특이 검출 또한 가능한다. 그것은 예를 들면, 한 세트의 올리고뉴클레오타이드의 길이를 다양화하여 식별할 수 있다. 이어서 상이한진단 올리고뉴클레오타이드의 신장은 상이한 길이의 신장 산물을 생성한다. 진단 올리고뉴클레오타이드는 또한 상이한 표지에 의해 식별할 수 있다. 그러한 표지는 예를 들면, 순차 반응에서 검출가능한 그룹에 의해 검출될 수 있는 발색 또는 형광 분자 또는 화학 그룹를 포함한다. 이러한 종류의 화학 그룹은 예를 들면, 디곡신 및 디곡시게닌과 같은 헵텐을 포함한다. 햅텐에 대하여 표진된 항체와 반응시킨 후, 표지를 검출하여 햅텐을 검출할 수 있다. 또다른 햅텐은 예를 들면, 상이하게 표지되는 항체를 사용하여 검출될 수 있는 바이오틴 또는 스트랍타키딘일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "표지"는 스스로 또는 검출 시리즈의 일부로서 검출될 수 있는 그룹을 의미한다. 리포터 그룹의 작용성 부분의 예는 바이오틴, 디옥시게닌, 형광 그룹(특정 파장의 전자파 방사선(예: 광선 또는 X-레이)을 흡수할 수 있고, 순차하여 흡수된 에너지를 장파의 방사선으로서 재방출하는 그룹이다: 실례는 단실(5-디메틸아미노)-1-나프탈렌설포닐), DOXYL(N-옥실-4,4-디메틸옥사졸리딘), PROXYL(N-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘), TEMPO(N-옥실-2,2,6,6-테트라메틸리레리딘), 디니트로페닐, 아크리딘, 코우마린, Cy3 및 Cy5(바이오로지컬 디텍션 시스템사의 상표명), 으레트로신, 코우마린산, 움베릴페론, 텍사스 레드, 로다민, 테트라메틸 로다민, 록스, 7-니트로벤조-2-옥사-1-디아졸(NBD), 피렌, 플루오레슨, 유로피움, 루테늄, 사마리움, 및 다른 희귀 토금속), 방사선 동위 원소 표지, 화학발광 표지(화학반응동안 광선의 방출에 의해 검출가능한 표지), 자기(spin) 표지(자유 라디칼(예: 치환된 유기 니트로옥사이드) 또는 전자 자기 공명 분광기에 의해 검출될 수 있는 생물학적 분자에 결합된 상자성(paramagnetic) 탐침(예: Cu+2,Mg+2)), 효소(예: 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, β-갈락노시다아제 및 글리코오스 옥시다아제), 항원, 항체, 헵텐(항체와 결합할 수 있지만, 스스로는 면역 반응을 개시할 수 없는 그룹, 예를 들면, 페티드 및 스테로이드계 호르몬), 세포막 투과에 대한 운반 시스템(예: 지방산 잔기, 스테로이드 부위(콜레스테릴), 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 콜릭산 특히 수용체에 대한 펩티드, 엔도사이토시스를 매개하는 그룹, 표피성장인자(EGF), 브라드키닌, 및 성장인자로부터 유래된 혈소판 (PDGF)이다. 특히 관심의 대상이 되는 예는 바이오틴, 형광물질, 텍사스 레드, 로다민, 디니트로페닐, 디곡시게닌, 유로리움, Cy3, Cy5 등이다.
검출하고자 하는 핵산의 양 및 존재여부에 대한 측정인 댜양한 신장 산물이 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 시약 혼합물이 일단 수득되면 시약 혼합물을 분리시킨 후 또는 순차적으로 그것을 별개로 공지된 방법에 따라 검출할 수 있거나, 적절한 표지를 사용하는 경우에는 동시에 검출할 수 있다. 바람직하게 각 올리고뉴클레오타이드 세트에서 개개의 올리고뉴클레오타이드는 각 개개의 진단 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상이한 검출가능한 그룹으로 표지된다.
EP-A-0 324 474에 기재된 방법이 마커로서 스테로이드계 호르몬의 사용에 대한 바람직한 방법으로 판명되었다. 또다른 방법은 상이한 형광 염색의 사용이다. 올리고뉴클레오타이드는 직접 표지될 수 있거나 화학 그룹에 대한 항체는 예를 들면, 상응하는 형과 표지로 제공된다. 다수의 방법으로 상이한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 수와 일치하는 형광을 동시에 측정하여 다양한 대립형질 산물을 검출할 수 있다. 또한, 상물의 일부는 형광 표지로 표지할 수 있지만, 동일한 시약혼합물로부터 효소를 다른 산물에 대하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 공지된 어느 표지 및 검출 방법을 사용할 수 있다.
순차 또는 동시 검출방법에서, 예를 들면, 두개의 상이한 그룹, 바람직하게 두개의 항체에 의해 검출되는 햅텐을 사용하여 두개의 올리고뉴클레오타이드를 표지할 수 있다. 그러한 햅텐은 디옥시게닌, 바이오틴, 및 형광물질을 포함한다. 바람직하게, 이어서 형광에 대한 항체 및 디옥시게닌에 대한 항체는 표지로서 상이한 효소를 갖는다 이어서 순차적으로 또는 동시에 효소-특이 검출가능한 기질과 접촉시켜 핵산을 검출한다.
그룹(예: 바이오틴)에 의해 고정되거나 고정될 수 있는 포획(capture) 탐침을 사용하여 순차적으로 고형상에 싱글 스트랜드 신장 산물을 결합시키기 위해 공동의 신장 반응의 혼합물을 또한 연속적으로 변성 반응시킬 수 있다. 또한, 포획 탐침을 예를 들면, 아트라퀴논 광화학법에 의해 고형 상에 영구적으로 결합시킬 수 있다(WO 96/31557). 이 방법에서, 반응의 신장 산물을 검출하고자 핵산과 함께 고정시킨다. 포획 탐침의 특이성 때문에, 핵산은 연속적으로 검출될 수 있다(세척단계에 의해 분리됨). 검출하고자 하는 시그날이 하나의 베슬에서 동시에 생성되고 검출될 수 있는 경우, 그러한 세척 단계는 생략될 수 있다.
신장 반응후, 시약 혼합물로부터 변이체중에서 두개(검출이 두개 이상의 대립형질을 포함하는 경우 및 두개 이상의 특이 프라이머가 사용되는 경우에는 둘 이상)의 충분한 분취량의 액상을 채취하고, 각 분취량을 신장 산물에 대하여 시험한다. 분취량을 다중 반응으로부터 채취하고, 올리고뉴클레오타이드용의 상이한 표지의 수에 따라, 동일한 수의 증폭 산물을 각 분취량에서 검출할 수 있다.
본 발명의 방법은 다양하게 적용될 수 있다. 예를 들면, 하나의 단일 시험 대상(개인 진단)으로부터 검출하고자 하는 표적 핵산을 특정 질환, 예를 들면, 대사질환, 생활 양식(life style) 질환, 암 또는 유전병과 연관시킬 수 있다. 생활 양식 질환의 예는 비만, 가계 고콜레스테롤혈증, 아테로마성 동맥 경화증 및 당뇨병이다.
검출하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플은 대표적으로 세포, 조직 샘플 또는 원시(archae), 원핵 또는 진핵 기원중 어느 하나의 조직 추출물 일 것이다. 샘풀이 동물, 예를 들면, 포유동물 또는 인간으로부터 기원하는 경우, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 망상적혈구, 림프구, 뇨, 골수조직, 뇌척수액 또는 혈액 또는 림프로부터 제조되는 어느 산물로부터 유래하고 조직샘플은 조직 생검, 예를 들면, 근육생검, 간생검, 신장생검, 방광생검, 골생검, 연골생검, 피부생검, 췌장생검, 내장관 생검, 갑상선 생검, 유방생검, 자궁생검, 고환생검, 안구생검 또는 뇌생검으로부터 유래한다.
또한, 우수한 특이성 때문에, 상기 방법은 또한 탐침을 풀-스크리닝(pool-screening)시키는 분석에 적절하다. 이 원리에 따라, 상이한 시험 대상자의 다수의 개개 탐침을 혼합한다. 예를 들면, 당뇨병, 가계 고콜레스테롤혈증, 아테로마성 동맥 경화증 또는 비만과 연관되는 apo B 3500-유전자에서의 결함을 진단하는 경우, 하나의 풀에서 64개의 탐침을 결합시키는 것이 적절하다고 판명되었다. 본 발명의 방법으로 풀중에 포함된 탐침에서 이 결함의 존재여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 양성 결과를 갖는 풀로부터의 일부의 풀을 순차적으로 수회 시험하는 경우, 적은 수(선행 기술과 비교하여)의 측정으로도 결함을 갖는 유전자를 검출하기에 충분하다.
본 발명의 방법에서 결함을 포함하지 않는 유전자가 존재하는 경우 이 유전자를 동시에 검출하는 것이 특히 유리하다고 판명되었다. 풀을 스크리닝하는 경우, 돌연변이 사물을 다르게 검출할 수 있거나, 돌연변이 대립형질이 존재하지 않는 경우, 정상 산물을 검출할 수 있다. 반응을 위한 대조군으로서의 그의 작용외에도, 둘 모두의 대립형질 검출은 또한 검출하고자 하는 핵산을 측량하는 방법이다.
풀-스크리닝 방법에서 사용되는 샘플은 환자-비특이성이고 공지되어 있지 않기 때문에, 이 방법은 특히 역학적으로 연관된 질환의 시험, 예를 들면, AIDS 바이러스의 오염율 또는 예를 들면 증가한 콜레스테롤 수준의 빈도, 고혈압 또는 당뇨(대량 스크린)에 사용될 수 있다. 이들 방법을 사용하여 대립형질의 빈도수를 측정한다.
동일한 것을 특정 종, 아종 또는 품종의 유기체, 미생물 또는 특히 특정 종, 아종 또는 품종의 박테리아 및 일부 경우에는 바이러스의 전염체의 검출 또는 진단에 사용한다. 특히 관심이 되는 부위가 밀접하게 연관된 병원성/비병원성 종 또는 품종에 집중된다. 또한 본 발명은 공지된 A-T 서열로 예를 들면,E.ColiK 12(유전자 기술의 법칙에 따라 평가됨)를 확실하게 검출하여E.Coli의 다양한 품종를 판별하는데 적합하다. 그러므로 본 발명은 또한 환경 조건의 분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 중요한 내용은 예를 들면, 어레이 포맷(array format)으로(NatureGenetics, suppl. vol.21, Jan 1999, 1-60)f로, 예를 들면, 아트라퀴논 광화학에 의해 고체 표면에 공유 결합된(WO 96/31557) 적어도 하나의 LNA을 포함하는진단 올리고뉴크레오타이드의 용도이다. 상이한 표적 핵산 서열에 대하여 검출하고자 하는 적어도 하나의 LNA를 포함하는 상이한 진단 올리고뉴클레오타이드를 어레이에 스팟팅시키고 고체 표면상에 영구적으로 고정시킬 수 있다. 그러한 어레이를 순차적으로 신장 반응 또는 PCR 반응 시킬 수 있다. 진단 올리고뉴클레오타이드가 적절한 현미경적 슬라이드, 예를 들면, 표면-처리된 글래스 또는 폴리카보네이트 슬라이드에 결합된 경우, 신장 반응 또는 PCR 반응을 상업상 이용가능한 동소(in situ) PCR 써모사이클러(thermocyclers)중 하나에서 수행할 수 있다. PCR 후 양성 스팟(특정 돌연변이의 표시)를 적절한 표지에 의해 검출할 수 있다. 그러한 방법의 결과는 다수의 상이한 표적 핵산의 반-수량적 측정일 것이다.
선행 기술에 대한 본 발명의 주된 장점은 하나의 단일 베슬에 포함된 혼합물중 대립형질을 실제적으로 2차 반응없이 동시에 검출할 수 있다는 것이다. 제한 효소를 사용하는 분해 또는 순차적인 혼성화는 필요하지 않다. 이 목적은 LNA 올리고머는 왁슨-크릭 염기쌍 법칙을 따르고 DNA:DNA에 의해 형성된 유사한 이중구조보다 더욱 현저하게 안정성인 이중구조를 형성하고, 3' 위치 LNA(s)를 포함하는 프라이머가 PCR 반응에 대하여 기질이라는 사실에 의해 달성된다. 개개의 대립형질의 증폭 과정은 고도로 분리되어(교차 반응은 관찰되지 않음) 발생하고 수개의 반응은 동일한 베슬중에서 진행될 수 있다.
본 발명은 또다른 내용은 핵산 검출용 시약 키트이다. 언급된 키트는 본 발명에 따른 한 세트의 올리고뉴클레오타이드 및, 필요한 경우, 추가의 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 신장을 위해 필요한 어쥬반트를 포함한다. 또한, 시약 키트는 추가의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면, 상보적 스트랜드 프라이머를 포함할 수 있다. 바람직하게, 키트는 효소 및 올리고뉴클레오타이드 및 다른 분리된 컨테이너중의 시약을 제공한다.
여기서 사용된, 용어 "LNA" 또는 "LNA-포함 올리고뉴클레오타이드"는 일반식 Ⅰ의 뉴클레오사이드 유사체를 적어도 하나 포함하는 올리고머 및 그의 염기염 및 산부가염을 가리킨다:
상기 식에서, X는 -O-, -S-, -N(RN*)-, -CR6(R6*)-로부터 선택되고;
B는 뉴클레오염기로부터 선택되며;
P는 후행(succeeding) 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹을 위한 라디칼 위치를 나타내고, 그러한 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹은 임의로 치환체 R5를 포함하고;
R3또는 R3*는 선행(preceding) 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 3'-말단 그룹을 나타내는 P*이며;
R4*및 R2*는 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Ra)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로부터 선택되는 1-4 개의 그룹/원자로 구성된 바이라디칼을 나타내고,
여기서 Z는 -O-, -S- 및 -N(Ra)-로부터 선택되고, 각각의 Ra및 Rb는 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 하이드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알케닐옥시, 카복시, C1-12-알콕시카보닐, C1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬-티오, 할로겐, DNA 삽입제(intercalaters), 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트화 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환되고, 2 개의 제미날 치환체 Ra및 Rb는 함께 임의로 치환된 메틸렌(=CH2, 임의로 아릴에 대한 임의의 치환체로서정의된 바와 같은 치환체로 1 또는 2 회 치환된다)이고,
P 또는 P*에 존재하고 그에 관여하지 않는 각각의 치환체 R1*, R2, R3, R3*, R5, R5*, R6및 R6*는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 하이드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알케닐옥시, 카복시, C1-12-알콕시카보닐, C1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트화 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 독립적으로 선택되고(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다), 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환되고, 2 개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노, 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있거나, 함께 임의로 -O-, -S-, 및 -(NRN)-으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 중간과/이나 말단에 존재하는 1-5 개의 탄소 원자(들)의 알킬렌쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있으며(여기서 RN은 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다), 두 개의 인접한 (제미날이 아닌) 치환체는 이중 결합을 형성하는 부가적인 결합을 나타낼 수 있고; RN*는 바이라디칼에 존재하고 그에 관여하지 않을때, 수소 및 C1-4알킬로부터 선택된다.
여기서 사용된, 용어 "LNA"(록 뉴클레오사이드 유사체(LockedNucleosideAnalogues)는 올리고머(일반식 Ⅰ)에 도입된 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체를 가리킨다.
본 명세서에서, 용어 "뉴클레오염기"는 자연 발생 뉴클레오염기 및 비-자연 발생 뉴클레오염기를 포함한다. 이전에는 "비-자연 발생"의 것으로 여겨져왔던 다양한 뉴클레오염기가 이후 자연계에서 발견되었다는 것은 당업자에게 명확하다. 따라서, "뉴클레오염기"는 알려진 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클뿐만 아니라 그의 헤테로사이클릭 유사체 및 토토머를 포함한다. 뉴클레오염기의 구체적인 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 우라실, 퓨린, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노사이토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸사이토신, 5-(C3-C6)-알키닐사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner 등, U.S. 특허 제5,432,272호에 기재된"비-자연 발생" 뉴클레오염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오염기"는 이들 예 및 그의 유사체 및 토토머 모두를 포함하고자 하는 것이다. 특히 흥미로운 뉴클레오염기는 인간의 치료상 및 진단상 적용과 관련하여 자연 발생 뉴클레오염기로 간주되는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 및 우라실이다.
여기서 사용된, 용어 "DNA 삽입제"는 DNA 또는 RNA 나선, 2중쇄 또는 3중쇄내로 삽입할 수 있는 그룹을 의미한다. DNA 삽입제의 기능성 부분의 예는 아크리딘, 안트라센, 안트라퀴논과 같은 퀴논, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 디하이드로퀴논, 안트라사이클린, 테트라사이클린, 메틸렌 블루, 안트라사이클리논, 소랄렌, 쿠마린, 에티디움-할라이드, 다이네미신, 1,10-페난트롤린-구리와 같은 금속 복합체, 칼케아미신과 트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테늄-코발트-엔디인, 포피린, 디스타미신, 네트로프신, 바이올로겐, 다우노마이신이다. 특히 흥미로운 예는 아크리딘, 안트라퀴논과 같은 퀴논, 메틸렌 블루, 소랄렌, 쿠마린, 및 에티디움-할라이드이다.
본 명세서에서, 용어 "광화학적 활성 그룹"은 광조사시 화학 반응을 일으킬 수 있는 화합물을 포함한다. 그의 기능기의 구체적인 예는 퀴논, 특히 6-메틸-1,4-나프토퀴논, 안트라퀴논, 나프토퀴논, 및 1,4-디메틸-안트라퀴논, 디아지린, 방향족 아지드, 벤조페논, 소랄렌, 디아조 화합물, 및 디아지리노 화합물이다.
본 명세서에서 "열화학적 활성 그룹"은 다른 그룹과 열화학적으로 유도되는 공유결합을 형성할 수 있는 기능기로 정의된다. 열화학적 활성 그룹의 기능성 부분의 구체적인 예는 카복실산, 활성화된 에스테르와 같은 카복실산 에스테르, 산플루오라이드, 산 클로라이드, 산 브로마이드 및 산 요오다이드와 같은 카복실산 할라이드, 카복실산 아지드, 카복실산 하이드라지드, 설폰산, 설폰산 에스테르, 설폰산 할라이드, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 알데히드, 케톤, 1급 알콜, 2급 알콜, 3급 알콜, 페놀, 알킬 할라이드, 티올, 디설파이드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 하이드라진, 에폭사이드, 말레이미드, 및 붕산 유도체이다.
본 명세서에서, 용어 "킬레이트화 그룹"는 하나를 초과하는 결합 위치를 갖고 빈번하게 다른 분자, 원자 또는 이온과 하나를 초과하는 결합 위치를 통해 동시에 결합하는 분자를 의미한다. 킬레이트 그룹의 기능성 부분의 예는 이미노디아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 아미노포스폰산 등이다.
본 명세서에서 "리간드"는 결합하는 무엇인가를 의미한다. 리간드는 방향족 그룹(예: 벤젠, 피리딘, 나프탈렌, 안트라센, 및 페난트렌), 헤테로방향족 그룹(예: 티오펜, 퓨란, 테트라하이드로퓨란, 피리딘, 디옥산, 및 피리미딘), 카복실산, 카복실산 에스테르, 카복실산 할라이드, 카복실산 아지드, 카복실산 하이드라지드, 설폰산, 설폰산 에스테르, 설폰산 할라이드, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 알데히드, 케톤, 1급 알콜, 2급 알콜, 3급 알콜, 페놀, 알킬 할라이드, 티올, 디설파이드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 하이드라진, 에폭사이드, 말레이미드, 임의로 방향족 또는 일/다불포화 탄화수소를 함유하는 산소 원자, 질소 원자, 및/또는 황 원자와 같은 하나 이상의 헤테로원자가 임의로 중간 또는 말단에 존재하는 C1-C20알킬 그룹, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시에틸렌, 폴리-β-알라닌과 같은 올리고/폴리아미드, 폴리글리신, 폴리라이신, 펩타이드, 올리고/폴리사카라이드, 올리고/폴리포스페이트, 독소, 항생제, 세포 독, 및 스테로이드:와 같은 기능기 및 또한 "친화성 리간드", 즉 특정 단백질, 항체, 폴리- 및 올리고사카라이드, 및 다른 생분자상의 위치에 대해 특이적 친화성을 갖는 기능기 또는 생분자를 포함할 수 있다.
DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드의 상기한 특정 예가 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분에 상응한다는 것은 당업자에게 분명하다. 또한 당업자에게 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드가 전형적으로 M-K-(여기서 M은 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분이고 K는 "활성/기능성" 부분이 5- 또는 6-원 환에 결합되는 스페이서이다) 형태로 나타내어지는 것이 분명하다. 따라서, B가 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되는 경우, 그룹 B는 M-K-(여기서 M은 각각 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드의 "활성/기능성" 부분이고, K는 5- 또는 6-원 환과 "활성/기능성" 부분사이에 1-50 개의 원자, 바람직하게는 1-30 개의 원자, 특히 1-15 개의 원자를 포함하는 임의의 스페이서이다) 형태를 가짐을 이해하여야 한다.
본 명세서에서, 용어 "스페이서"는 위에서 정의된 바와 같은 타입의 두 개이상의 다른 부위를 연결하는데 사용되는 열화학적 및 광화학적 비-활성 거리-유지 그룹을 의미한다. 스페이서는 그의 소수성, 친수성, 분자 유연성 및 길이를 포함한 다양한 특징에 기초하여 선택된다(참조: 예를 들어 Hermanson 등, "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, San Diego, California(1992), p.137-ff). 일반적으로, 스페이서의 길이는 약 400 Å 또는 그 미만, 일부 적용에서 바람직하게는 100 Å 미만이다. 따라서, 스페이서는 임의로 산소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자와 같은, 하나 이상의 헤테로원자가 중간 또는 말단에 존재하는 탄소 원자쇄를 포함한다. 따라서, 스페이서 K는 하나 이상의 아미드, 에스테르, 아미노, 에테르, 및/또는 티오에테르 기능기, 및 임의로 방향족 또는 일/다불포화 탄화수소, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시에틸렌, 폴리-β-알라닌과 같은 올리고/폴리아미드, 폴리글리신, 폴리라이신, 및 일반적인 펩타이드, 올리고사카라이드, 올리고/폴리포스페이트를 포함할 수 있다. 또한 스페이서는 그의 결합된 단위로 구성될 수 있다. 스페이서의 길이는 5- 또는 6-원 환과 관련하여 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분의 원하거나 필요한 위치 및 공간적 배향을 고려하여 변화될 수 있다. 특히 흥미로운 구체예에서, 스페이서는 화학적으로 절단될 수 있는 그룹을 포함한다. 그러한 화학적으로 절단가능한 그룹의 예는 환원전 조건하에서 절단가능한 디설파이드 그룹, 펩티다제로 절단가능한 펩타이드 단편 등을 포함한다.
하나의 변형예에서, K는 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분이 5- 또는 6-원 환에 직접 결합할 수 있도록 하는 단일 결합을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 일반식 Ⅰ 및 Ⅱ에서 치환체 B는 바람직하게는 뉴클레오염기, 특히 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택된다.
올리고머(화학식 Ⅰ)에서, P는 후행 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합을 위한 라디칼 위치, 또는 5'-말단 그룹을 나타낸다. 첫번째 가능성은 해당 LNA가 5'-말단 "모노머"가 아닐때 적용되는 반면, 두번째 가능성은 해당 "LNA"가 5'-말단 "모노머"일때 적용된다. 그러한 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹은 치환체 R5(또한 동일하게 적용가능한: 치환체 R5*)를 포함하여 그룹 P와 이중결합을 형성할 수 있음이 이해되어야 한다(이하 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹의 정의로부터도 분명하다)(5'-말단은 뉴클레오사이드에서 리보스 부위의 5' 탄소원자에 상응하는 위치를 가리킨다).
한편, 선행 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 3'-말단 그룹(P*)은 치환체 R3또는 R3*의 하나에 의해 정의된 위치, 바람직하게는 치환체 R3*에 의해 정의된 위치로부터 기원될 수 있다(3'-말단은 뉴클레오사이드에서 리보스 부위의 3' 탄소 원자에 상응하는 위치를 말한다).
R3*로서("정상" 위치) 또는 R3로서의(자일로 배열) 그룹 P*의 배향은 2 개의 동일한 흥미로운 가능성을 나타냄이 이해되어야 한다. 모든 "정상"(R3*=P*) 올리고머 및 "정상" LNA 모노머와 뉴클레오타이드(2-데옥시뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드)가 결합된 올리고머가 DNA, RNA 및 기타 LNA 올리고머에 강력하게(증가하는 친화성으로) 혼성화하는 것이 이해되어야 한다. 현재 모든-자일로 LNA 올리고머와 자일로 LNA(R3=P*) 모노머와 예를 들어, 자일로 뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 및/또는 2-데옥시뉴클레오타이드)를 갖는 올리고머의 배합물이 비교할만한 혼성화 성질을 유발하는 것으로 믿어진다. "정상" 배열(R3*=P*)을 갖는 올리고머는 DNA, RNA 또는 또다른 LNA 올리고머에 혼성화될때(증가하는 친화성으로) LNA 올리고머의 역-평행 배향을 유발하는 것으로 나타났다. 따라서 자일로 배열(R3=P*)을 갖는 올리고머가 DNA, RNA 또는 또다른 LNA에 혼성화될때 평행 배향을 유발하는 것으로 생각된다.
상기한 바에 비추어, 하나의 올리고머에서 "정상" LNAs와 자일로-LNAs의 결합은 상이한 타입의 이들 모노머가 도메인에 위치하여, 즉 적어도 5 개, 예를 들어 적어도 10 개의 모노머(예를 들어, 자일로-LNA, 자일로-뉴클레오타이드 등 모노머)가 적어도 5 개, 예를 들어 적어도 10 개의 다른 타입의 모노머의 방해받지 않은 도메인이 뒤따르는 한 흥미로운 성질을 일으킬 수 있을 것으로 생각된다. 그러한 키메라 타입 올리고머는 예를 들어 핵산을 포획하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "모노머"는 자연적으로 존재하는 뉴클레오사이드, 비-자연 발생 뉴클레오사이드, PNAs 등 및 LNAs에 관한 것이다. 따라서, 용어 "후행 모노머"는 5'-말단 방향에 있는 이웃 모노머에 관한 것이고 "선행 모노머"는 3'-말단 방향에 있는 이웃 모노머에 관한 것이다. LNA 모노머의 위치로부터 알 수 있는, 그러한 후행 및 선행 모노머는 자연 발생 뉴클레오사이드 또는 비-자연 발생 뉴클레오사이드, 또는 심지어 추가의 LNA 모노머일 수 있다.
결과적으로, 본 명세서에서(상기 정의로부터 유추될 수 있는 바와 같이), 용어 "올리고머"는 하나 이상의 LNAs의 도입에 의해 변형된 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에서, 바이라디칼(R2*-R4*)의 배향은 좌측편이 가장 낮은 수의 치환체를 나타내고 우측편이 가장 높은 수의 치환체를 나타내게 하고, 따라서, R2*및 R4*가 함께 바이라디칼 "-O-CH2-"를 나타내는 경우, 산소 원자는 R2*를 나타내고, 따라서 산소 원자는 예를 들어 R2*의 위치에 결합되고 메틸렌 그룹은 R4*를 나타낸다.
올리고머에 혼입된 LNA(s)에서 바이라디칼(R2*-R4*)의 구조에 대한 수많은 흥미로운 가능성을 고려하여, 바이라디칼은 바람직하게는 -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-, -Y-(CR*R*)r+s-Y-, -Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r+s-, -Y-, -Y-Y-로부터 선택되고, 여기서 각각의 Y는 -O-, -S-, -Si(R*)2-, -N(R*)-, >C=O, -C(=O)-N(R*)-, 및 -N(R*)-C(=O)-로부터 선택되며, 각각의 R*는 독립적으로 수소, 할로겐, 아지도, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, 아미노, 모노- 또는 디(C1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되고/거나, 두 개의 인접한(제미날이 아닌) R*는 함께 이중 결합을 나타낼 수 있고; 각각의 r 및 s는 0-4이고 단 r+s의 합은 1-4이다. 특히 흥미로운 상황은 바이라디칼이 -Y-, (CR*R*)r+s-, -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-, 및 -Y-(CR*R*)r+s-Y-로부터 선택되고, 여기서 각각의 r 및 s는 0-3이며, 단 r+s의 합은 1-4인 것이다.
특히 흥미로운 올리고머는 올리고머중의 적어도 하나의 LNA의 R2*및 R4*가 함께 -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)r+s+1-, -(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-, -O-(CR*R*)r+s-O-, -S-(CR*R*)r+s-O-, -O-(CR*R*)r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)r+s-O-, -O-(CR*R*)r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)r+s-S-, 및 -S-(CR*R*)r+s-N(R*)-로부터 선택된 바이라디칼을 나타내는 것이다.
하나의 R*는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되고 모든 남은 치환체 R*는 수소인 것이 더욱 바람직하다.
하나의 바람직한 변형예에서, 적어도 하나의 LNA의 바이라디칼에서 하나의 그룹 R*은 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).
바람직하게는, P 또는 P*에 존재하고 그에 관여하지 않는, LNA(s)의 각각의 치환체 R1*, R2, R3, R3*, R5, R5*, R6및 R6*는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알케닐옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 포밀, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, 아지도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, 설파닐, C1-6-알킬티오, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드 및 할로겐으로부터 선택되고, 두 개의 제미날 치환체는 함께 옥소를 나타내며, RN*는, 바이라디칼에 존재하고 그에 관여하지 않을때, 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다.
LNAs의 바람직한 변형예에서, X는 -O-, -S-, 및 -NRN*-, 특히 -O-로부터 선택되고 P 또는 P*에 존재하고 그에 관여하지 않는, LNA(s)의 각각의 치환체 R1*, R2,R3, R3*, R5, R5*, R6및 R6*는 수소를 나타낸다.
더욱 바람직한 변형예에서, X는 -O-이고, R2는 수소, 하이드록시 및 임의로 치환된 C1-6-알콕시로부터 선택되며, R3및 R3*의 하나는 P*이고 다른 것은 수소이며, R1*, R5및 R5*는 수소를 나타내고, 더욱 구체적으로, 바이라디칼(R2*-R4*)는 -O-, -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-, -(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-, -(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-, 및 -(CH2)2-4-, 특히 -O-CH2-, -S-CH2-, 및 -NRH-CH2-로부터 선택된다. 일반적으로, 이제까지 얻어진 결과에 관하여, R2*및 R4*로 구성된 바이라디칼은 두 개의 탄소원자 브릿지를 형성하고, 즉, 바이라디칼은 퓨라노스 환(X=O)을 갖는 5 원 환을 형성한다. 또한 특히 흥미로운 것은 화학식 Ⅰ의 도입된 LNA의 R2*및 R4*가 함께 -O-CH2-, -S-CH2- 및 -NRH-CH2-로부터 선택된 바이라디칼을 나타내고; X가 O이고, B는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택된 뉴클레오염기를 나타내며; R2가 수소이고 R3또는 R3*의 하나가 P*이고 다른 것은 수소이며, R1*, R3, R5및 R5*는 수소를 나타내는 그들 올리고머이다.
이들 구체예에서, 올리고머에 도입된 적어도 하나의 LNA는 아데닌 및 구아닌으로부터 선택된 뉴클레오염기(치환체 B)를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 특히 그에 도입된 LNA를 갖는 올리고머는 티민, 우라실 및 사이토신으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오염기와 아데닌 및 구아닌으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오염기를 포함한다. LNA 모노머를 위해, 뉴클레오염기가 아데닌 및 구아닌으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
이들 흥미로운 구체예에서, 모든 올리고뉴클레오타이드의 모노머는 LNA 모노머이다.
일반식 Ⅰ(올리고머중의 LNA(s)) 및 그와 관련된 정의로부터 명백해지듯이, 하기와 같이 치환체의 성질 및 가능한 바이라디칼에 따라 올리고머에 존재하는 하나 또는 몇몇 비대칭 탄소 원자가 존재할 수 있다.
하나의 변형예에서, R3*는 P*를 나타낸다. 다른 변형예에서, R3은 P*를 나타내고, 제3의 변형예에서 올리고머내에서 일부 R3*는 일부 LNAs의 P*를 나타내고 R3는 다른 LNAs의 P*를 나타낸다.
올리고머는 전형적으로 일반식 Ⅰ의 1-10000 개의 LNA(s) 및 자연 발생 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택된 0-10000 개의 뉴클레오사이드를 포함한다. 뉴클레오사이드의 수와 LNA(s)의 수의 합은 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3, 특히 적어도 5, 특히 적어도 7, 예를 들어 2-15000 범위, 바람직하게는 2-100 범위, 예를 들어 3-100, 특히 2-50 범위, 예를 들어 3-50 또는 5-50 또는 7-50 범위이다.
본 명세서에서, 용어 "뉴클레오사이드"는 헤테로사이클릭 염기의 글라이코사이드를 의미한다. 용어 "뉴클레오사이드"는 비-자연 발생 뉴클레오사이드, 자연 발생 뉴클레오사이드 및 기타 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 것으로서 넓은 의미로 사용된다. 뉴클레오사이드의 구체적인 예는 리보스 부위를 포함하는 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보스 부위를 포함하는 데옥시리보뉴클레오사이드이다. 그러한 뉴클레오사이드의 염기에 관하여, 이것은 모든 자연 발생 염기, 예를 들어 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 및 우라실, 및 그의 모든 변형된 변이체 또는 모든 가능한 비자연적 염기일 수 있음을 이해하여야 한다.
정의 및 알려진 뉴클레오사이드(자연 발생 및 비-자연 발생) 및 뉴클레오사이드 유사체(알려진 바이- 및 트리사이클릭 유사체 포함)를 고려할때, 올리고머가 하나 이상의 LNA(s)(치환체의 선택 및 바이라디칼의 선택에 관하여 동일하거나 상이할 수 있는) 및 하나 이상의 뉴클레오사이드 및/또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있음이 분명하다. 본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 결합된 뉴클레오사이드의 연속된 쇄를 의미한다: 그러나, 올리고머(올리고뉴클레오타이드)에 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위(모노머)의 뉴클레오염기는 상기 정의된 바와 같이 치환체 B에 관하여 변형될 수 있음을 이해하여야 한다.
상기 언급한 바와 같이, 올리고머의 LNA(s)는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 다른 모노머와 결합된다. 본 명세서에서, 용어 "뉴클레오사이드간 결합"은 -CH2-,-O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3)-, -P(O,S)-, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3)-, 및 -PO(NHRH)-(여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다)로부터 선택되는 2 내지 4 개, 바람직하게는 3 개의 그룹/원자로 구성된 결합을 의미한다. 그러한 뉴클레오사이드간 결합의 구체적인 예는 -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R5포함), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2-, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R5포함), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-O-, -CH2-NRH-CO-, -O-NRH-CH2-, -O-NRH-, -O-CH2-S, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R5포함), -S-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(OCH2CH3)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2-CH2-, 및 -O-Si(R")2-O-이며; 그중 -CH2-CO-NRH-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O-, 및 -O-PO(NHRN)-O-(여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다)가 특히 바람직하다.
추가의 구체적 예는 Mesmaeker 등, Current Opinion in Structural Biology 1995, 5, 343-355에 제공되어 있다. 뉴클레오사이드간 결합의 좌측편은 우측편이 선행 모노머의 5'-위치에 결합되는 반면, 치환체 P*로서 5-원 환에 결합된다.
또한 해당 LNA가 5'-말단 모노머인 경우 그룹 P가 또한 5'-말단 그룹을 나타낼 수 있음이 상기로부터 분명하다. 그러한 5'-말단 그룹의 예는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 및 -W-A'-이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(RH)-이며, 여기서 RH는 수소 및 C1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).
본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서, 용어 "모노포스페이트", "디포스페이트", 및 "트리포스페이트"는 각각 하기 화학식의 그룹을 의미한다:
-O-P(O)2-O-, -O-P(O)2-O-P(O)2-O-, 및 -O-P(O)2-O-P(O)2-O-P(O)2-O-
특히 흥미로운 구체예에서, 그룹 P는 모노포스페이트, 디포스페이드 및 트리포스페이트로부터 선택되는 5'-말단 그룹을 나타낸다. 특히 트리포스페이트 변형체가 핵산 중합효소의 기질로서 흥미롭다.
유사하게, 그룹 P*는 해당 LNA가 3'-말단 모노머인 경우 3'-말단 그룹을 나타낼 수 있다. 그러한 3'-말단 그룹의 예는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 및 -W-A'-이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(RH)-로부터 선택되며, 여기서 RH는 수소 및 C1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).
LNAs의 바람직한 변형예에서, 올리고머는 하기 화학식 Ⅴ를 갖는다:
G-[Nu-L]n(o)-{[LNA-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*Ⅴ
상기 식에서
q는 1-50이고;
각각의 n(0)...n(q)는 독립적으로 0-10000이며;
각각의 m(1)...m(q)는 독립적으로 1-10000이고;
단 n(0)...n(q)와 m(1)...m(q)의 합은 2-15000이며;
G는 5'-말단 그룹을 나타내고;
각각의 Nu는 독립적으로 자연 발생 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오사이드를 나타내며;
각각의 LNA는 독립적으로 뉴클레오사이드 유사체를 나타내고;
각각의 L은 독립적으로 Nu 및 LNA로부터 선택되는 두 그룹간의 뉴클레오사이드간 결합을 나타내거나, L은 G*와 함께 3'-말단 그룹을 나타내며;
각각의 LNA-L은 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 일반식 Ⅰ의 뉴클레오사이드 유사체를 나타낸다.
이 변형예내에서 및 일반적으로, LNAs는 바람직하게는 상이한 뉴클레오염기,특히 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택되는 뉴클레오염기 및 아데닌 및 구아닌으로부터 선택되는 뉴클레오염기 모두를 포함한다.
올리고머는 또한 키메라 올리고머를 포함하는 것이다. 용어 "키메라 올리고머"는 서로 직접적으로 또는 스페이서를 통해 결합된 상이한 기원의 모노머를 갖는 2 개 이상의 올리고머를 의미한다. 결합될 수 있는 그러한 올리고머의 구체적 예는 펩타이드, PNA-올리고머, LNAs를 함유하는 올리고머, 및 올리고뉴클레오타이드 올리고머이다. 자일로-LNA(R3=P*) 도메인(들) 및 "정상" LNA(R3*=P*) 도메인(들)을 갖는 올리고머의 결합은 다양한 도메인이 상이한 친화성 및 특이성 프로파일을 가질 수 있으므로 키메라 올리고머의 예로 해석될 수 있다.
일반적으로, 올리고머는 친화성 및 특이성에 관하여 놀랍게도 우수한 혼성화 성질을 갖는다. 따라서, 올리고머는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하지 않는 상응하는 비변형된 참조 올리고뉴클레오타이드 보다 적어도 2.5 ℃ 높은, 바람직하게는 적어도 3.5 ℃ 높은, 특히 적어도 4.0 ℃ 높은, 특히 적어도 5.0 ℃ 높은, 상보적 DNA 올리고뉴클레오타이드와의 Tm을 올리고머에게 부여하는, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체를 포함한다. 특히, 올리고머의 Tm은 적어도 2.5×N ℃ 높고, 바람직하게는 적어도 3.5×N ℃ 높으며, 특히 적어도 4.0×N ℃ 높고, 특히 적어도 5.0×N ℃ 높다(여기서 N은 뉴클레오사이드 유사체의 갯수이다).
상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드와 혼성화하는 경우, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체가 올리고머에게 뉴클레오사이드 유사체를 포함하지 않는 상응하는 비변형된 참조 올리고뉴클레오타이드 보다 적어도 4.0 ℃ 높은, 바람직하게는 적어도 5.0 ℃ 높은, 특히 적어도 6.0 ℃ 높은, 특히 적어도 7.0 ℃ 높은, 상보적 DNA 올리고뉴클레오타이드와의 Tm을 부여한다. 특히, 올리고머의 Tm은 적어도 4.0×N ℃ 높고, 바람직하게는 적어도 5.0×N ℃ 높으며, 특히 적어도 6.0×N ℃ 높고, 특히 적어도 7.0×N ℃ 높다(여기서 N은 뉴클레오사이드 유사체의 갯수이다).
용어 "상응하는 비변형된 참조 올리고뉴클레오타이드"는 동일한 절대적 순서로(또한 동일한 배향으로) 동일한 뉴클레오염기를 나타내는 자연 발생 뉴클레오타이드로만 구성된 올리고뉴클레오타이드를 의미하고자 하는 것이다.
Tm은 하기 조건중의 하나에서, 바람직하게는 조건 a)에서, 동몰량(전형적으로, 1.0 μM)의 올리고머 및 상보적 DNA 올리고뉴클레오타이드에서 측정된다:
a) 10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA;
b) 10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 0.1 mM EDTA; 또는
c) 3 M 테트라메틸암모늄클로라이드(TMAC), 10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 0.1 mM EDTA.
올리고머는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체가 화학식 Ⅰ을 갖고 B가 뉴클레오염기인 경우, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다. 특히 흥미로운 것은 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체가 아데닌 및 구아닌으로부터 선택된 뉴클레오염기를 포함하는 경우이다.
또한, 특이성 및 친화성에 관하여, 올리고머는 상기 올리고머와 하나 이상의 미스매치를 갖는 부분적으로 상보적인 DNA 올리고뉴클레오타이드, 또는 부분적으로 상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될때, 미스매치의 결과로 뉴클레오사이드 유사체를 포함하지 않는 상응하는 비변형 참조 올리고뉴클레오타이드로 관찰되는 감소와 같거나 그 보다 더 큰 Tm의 감소를 나타낸다. 또한, 올리고머는 상응하는 비변형 참조 올리고뉴클레오타이드의 것과 실질적으로 동일한 혼성화 완충액의 이온 강도에 대한 Tm의 감도를 갖는다.
여기서 정의된 올리고머는 전형적으로 적어도 1% 변형되고, 예를 들어 적어도 2% 변형되며, 예를 들어 3% 변형되거나, 4% 변형되거나, 5% 변형되거나, 6% 변형되거나, 7% 변형되거나, 8% 변형되거나, 9% 변형되고, 적어도 10% 변형되며, 예를 들어 적어도 11% 변형되고, 예를 들어 12% 변형되거나, 13% 변형되거나, 14% 변형되거나, 15% 변형되고, 적어도 20% 변형되고, 예를 들어 적어도 30% 변형되거나, 적어도 50% 변형되고, 예를 들어 70% 변형되고 일부 흥미로운 적용에서 100% 변형된다.
올리고머는 바람직하게는 상응하는 비변형 참조 올리고뉴클레오타이드 보다 실질적으로 더 높은 3'-엑소뉴클레오라이시스 안정성을 갖는다.
올리고머(LNAs가 혼입된) 및 LNAs 자체는 약제학적으로 허용되는 염이 특히 관련성이 있는, 그의 가능한 염을 포함하는 것임을 이해해야만 한다. 염은 산부가염 및 염기염을 포함한다. 산부가염의 예는 염산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염 등이다. 염기염의 예는 (남아 있는) 반대 이온이 나트륨과 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘과 같은 알칼리토금속, 및 암모늄 이온(+N(Rg)3Rh(각각의 Rg및 Rh는 독립적으로 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴을 나타낸다)로부터 선택되는 염이다. 약제학적으로 허용되는 염은 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 Ed., Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mack Publishing Company, 이스톤, PA, U.S.A, 1985 및 최신판 및 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology에 기재된 것들이다. 따라서, 여기서 사용된 용어 "그의 산부가염 및 염기염"은 그러한 염을 포함하고자 하는 것이다. 또한, 올리고머 및 LNAs 및 그의 모든 중간체 또는 출발물질이 또한 수화물 형태로 존재할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 매칭(matching) 3'-말단을 포함하는 LNA 프라이머가 PCR에서 프라이머로서 사용되는 것을 설명한다.
도 2는 PCR 반응에서 3개의 DNA 올리고를 삽입시켜 수득된 올리고뉴클레오타이드-방향성(directed) 단일 염기 돌연변이이다:
A) 두개의 스트랜드 PCR 프라이머 및 하나의 돌연변이 올리고인 3개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 개시하고, 여기에서 미스매칭(mismatching) 염기를 X로 표시하고;
B) 2회의 PCR 사이클링 후, 4개의 단일-스트랜드 산물이 생성되고;
C) 추가로 몇회 PCR 사이클링한 후, 산물 1 및 4는 예측된 돌연변이를 포함하는 더블 스트랜드 PCR 산물을 생성한다.
도 3은 LNA 프라이머를 사용한 대립형질 특이 PCR이다. 왼쪽의 패널은 "야생형" 반응으로, 프라이머-세트 EQ3053/EQ3213을 사용한 결과를 나타낸다. "G"는 주형으로서 사용한 ApoB 유전자의 "G-대립형질", "A"는 주형으로서 사용한 ApoB 유전자의 "A-대립형질"를 표시한다. 오른쪽 패널은 "돌연변이형" 반응으로, 프라이머-세트 EQ3157/EQ3176을 사용한 결과를 나타낸다. 프라이머는 비-코딩 스트랜드로 향한다는 것에 주의한다. "C"는 주형으로서 사용한 ApoB 유전자의 "G-대립형질", "T"는 주형으로서 사용한 ApoB 유전자의 돌연변이 "A-대립형질"를 표시한다. 마커는 로우 DNA MassTM(GibocoBRL cat. no. 10068-013, Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA)이다.
도 4는 LNA 및 DNA 프라이머를 비교한 것이다. 왼쪽 패널은 LNA/DNA 프라이머-세트 EQ3053/EQ3213을 사용한 결과를 나타낸다. 오른쪽 패널은 모두 DNA 프라이머-세트 EQ3647/EQ3213을 사용한 결과를 나타낸다. PCR 반응에서 "G"는 주형으로서 사용한 ApoB 유전자의 "G-대립형질", "A"는 주형으로서 사용한 ApoB 유전자의 "A-대립형질", "H2O"는 주형이 포함되지 않은 것을 표시한다. 마커는 로우 DNA MassTM(GibocoBRL cat. no. 10068-013, Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA)이다.
도 5는 증폭 과정의 사이클-바이-사이클 모니터링한 것이다. EQ3053/EQ3213프라이머 세트 및 주형으로서 "A-대립형질" 프라스미드 또는 "G-대립형질" 플라스미드 중 어느 하나를 사용하여 "G-대립형질"(G, 상부 커브), 및 " A-대립형질"(A, 하부 커브)의 증폭시 형광은 증가한다.
도 6은 EQ3053/EQ3213 프라이머 세트 및 "A-대립형질" 주형(A, 하부 커브) 또는 "G-대립형질" 주형(G, 상부 커브)를 사용하여 생성된 PCR 단편의 멜팅(melting) 커브 분석이다. 상단의 패널은 더블 스트랜드 앰클리콘(amplicon)에 결합된 SyBR 그린 I 다이의 형광을 나타낸다. 하단의 패널은 상단에 메팅 커브의 제 1의 음성 유도체(-dF/dT)를 나타낸다.
실시예 1
LNA 프라이머를 사용하는 서열 특이 증폭
프라이머의 합성 및 분석:
LNA 아미다이트(amidites)에 대한 커플링 시간을 표준의 2분으로부터 5분으로 증가시킨 것을 제외하고, DNA-합성기(Pharmacia Gene Assembler SpecialR, Pharmacia AB, Uppsala, Sweden)의 프로토콜에 따라 표준 커플링 조건(0.2μmol 스케일)을 사용하였다. 단계적인(stepwise) 커플링율은 대략 99%였다. 일반적으로 표준 2'-데옥시뉴클레오사이드 CPG 또는 폴리시틸렌 고체 지지체를 사용하였다. 원하는 서열을 완성시킨 후, 고체 지지체로부터 절단하고 32% 수용성 암모니아를 사용하여 보호 그룹을 제거하였다(55℃에서 5 또는 10시간동안). 5'-0-DMT-ON 모드에서합성된 LNAs를 0.05M의 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 pH 7.0(유속 1.5cm/분)에서 아세토니트릴의 농도 구배로 역상 HPLC(Delta PakC-18, 300A, 칼럼 치수 0.4 x 30cm)에 의해 정제하였다. 5'-0-DMT-ON LNAs을 포함하는 분획(정체시간 30-35분)을 증발시키고 80% 아세트산중(1cm, 상온, 1시간)에서 디트리틸레이션 (detritylation)시켰다. 증발 후, LNAs를 상기 기재된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 재정제하였다(단일 피크로서 용출).
샘플 제조
포유류 혈액용 DNA 분리 키트(Roche Molecular System cat. no. 1 667 327. Roche Molecular Biochemicals, Hvidovre, Denmark)를 사용하고 제조사의 지시에 따라 인간 게놈 DNA를 5㎖의 총 혈액으로부터 분리하였다.
ApoB3500 유전자좌(Ludwig et al. (1987) DNA 6: 363-372; 등록번호 M19828, 서열번호 ON4)를 포함하는 야생형 인간 ApoB 유전자의 일부를 PCR-증폭시켜 ApoB 유전자의 "G-대립형질"를 제조하였다. TOPOTMTA 클로닝 키트(Invitrogen, cat. no. K4500-01, Invitrogen Corporation, Carlsbad CA USA)를 사용하여 PCR 단편을 플라스미드 pCRR2.1-TOPO내로 클로닝하였다. QUIAGENR플라스미드 키트(QUIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 플라스미드 DNA를 박테리아성 배양액으로부터 정제하였다. ALFexpress II DNA 어날리시스 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하고 제조사의 지시에 따라 삽입된 DNA 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
PCR 증폭
하이베이드 PCR 익스프레스 써머사이클러(Hybaid, Middlesex, UK)를 사용하여 0.5㎖의 얇은 벽 튜브에서 PCR 반응을 수행하였다. dNTP를 스웨덴 업살라에 소재하는 아메르샴 파마시아 바이오테크 에이비사(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)로부터 구입하였다. 최종의 시약 혼합물은 하기를 포함하였다:
dATP, dGTP, dTTP, dCTP: 각각 200μM
1.5mM MgCl2
5㎕의 10 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT, USA)
1μM 프라이머 EQ 3053, 서열번호 1
1μM 프라이머 EQ 3054, 서열번호 2
1 유니트 AmpliTaq GoldR폴리머라아제(Perkin-Elmer cat. no. N808-0240, Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA).
순차적으로 희석된 2㎕의 DNA(참조 도 1).
총 용량 50㎕의 써모사이클링:
변성: 95℃ 15분
사이클링: 35회(94℃에서 30초; 63℃에서 30초; 72℃에서 30초)
최종 신장: 72℃에서 10분
4℃로 냉각시켰다.
신장 산물의 검출
10㎕의 PCR 산물을 순차적으로 2㎕의 사용 완충액(40% 수쿠로오스, 0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀, 0.1M EDTA pH8.0)과 혼합하고 아가로스 겔에서 전기영동시켰다. 겔은 1 x TAE(50 x TAE = 242g 트리스 베이스, 57.1㎖ 빙초산, 100㎖ 0.5M EDTA pH8.0), 0.5μg/㎖의 에티디움 브로마이드(Sigma-Aldrich cat. no. E7637, Sigma-Aldrich Denmark A/S, Vallenbaek Strand, Denmark)중의 1% SeaKemR, Agarose(FMC BioProducts, Philadelphia, PA, USA)로 구성되었다. 겔을 대략 5V/cm의 속도로 0.5-1시간동안 전개시켰다. 이미지-마스터 VDS 장치(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 형광을 현상하였다. 대표적인 시험을 도 1에 나타낸다.
PCR-프라이머를 LNA0-모노머로 치환시킨 3-'말단 치환체가 대립형질 특이 증폭을 수행할 수 있는지를 확인하기 위하여, 두 세트의 프라이머 EQ3053/ApoBR2 및 EQ3054/ApoBR2를 사용하여 주형 DNA를 증폭시켰다. ApoB 유전자의 "G-대립형질"(서열번호 4)를 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트 EQ3053/ApoBR2(서열번호 1, 서열번호 3)는 667bp의 PCR 산물을 제조하였지만, 30.4g이하의 ApoB 유전자의 "A-대립형질"(서열번호 5)을 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트 EQ3053/ApoBR2 프라이머는 어느 특정 PCR 산물도 제조하지 않았다. 결과를 도 1에 나타낸다.
ApoB 유전자의 "G-대립형질"(서열번호 4):
ApoB 유전자의 "A-대립형질"(서열번호 5):
실시예 2
LNA-프라이머를 사용하는 대립형질 특이 PCR에 의한 ApoB R3500Q 돌연변이의 검출
아포지단백 B(ApoB)는 LDL-수용체에 의해 인식되는 저밀도 지방단백질(LDL)중 비-교환성 단백질이다. 유전성(familial) 결함 ApoB 100은 아미노산 3500(arg→gln) 위치에서의 염기 전이(G→A 돌연변이)에 의해 발생하는 상염색체 우성질환(-ApoB R 3500Q 돌연변이)이다. 돌연변이는 LDL-수용체에 대한 LDL 복합체의 결합능을 감소시키고 혈장중의 LDL 콜레스테롤의 수준을 증가시킨다. 돌연변이의 유병율은 정상 군집에서 이형접합체에 대하여 1:500이고, 동형접합체에 대하여 1:1,000,000이다(Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition. by Fauci, A.S. et al.,(Eds) McGraw Hill).
LNA-프라이머를 사용하는 PCR의 능력을 입증시키기 위하여 ApoB R3500Q 다형의 "G-대립형질" 및 "A-대립형질"을 양성적으로 확인할 수 있는 두개의 대립형질 특이 PCR를 구성하였다.
프라이머의 합성 및 분석:
실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 LNA 프라이머의 합성 및 분석을 수행하였다. 시판(DNA Technology, Aarhus, Denmark로부터 구입)용으로부터 하류 DNA 프라이머를 HPLC 정제된 올리고로서 수득하였다.
샘플 제조
실시예 1에 기재된 바와 같이, ApoB3500 유전자좌를 포함하는 야생형 인간 ApoB 유전자의 일부를 PCR-증폭시켜 ApoB 유전자의 "G-대립형질"를 제조하였다. "G-대립형질" 플라스미드를 사용하여, ApoB3500 유전자좌(서열번호 4)를 포함하는 야생형 인간 ApoB 유전자의 일부를 PCR-증폭시키는 동안 아미노산 3500 위치에서의 올리고뉴클레오타이드-방향성 단일 염기 돌연변이(G→A 돌연변이)를 발생시켜 ApoB 유전자의 "A-대립형질"를 제조하였다. PCR 반응에서 3 DNA 올리고, 두개의 증폭 올리고 및 돌연변이화되는 위치를 포함하는, 돌연변이를 발생시키는 하나의 미스매치를 포함하는 하나의 올리고를 삽입시켜 올리고뉴클레오타이드-방향성 단일 염기 돌연변이를 수득하였다. 상기 원리를 도 2에 나타낸다. PCR 증폭 후, TOPOTMTA 클로닝R키트(Invitrogen, cat. no. K4500-01, Invitrogen Corporation, Carlsbad CA USA)를 사용하여 단편을 플라스미드 pCRR2.1-TOPO내로 클로닝하였다. QUIAGENR플라스미드 키트(QUIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 플라스미드 DNA를 박테리아성 배양액으로부터 정제하였다. ALFexpress II DNA 어날리시스 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하고 제조사의 지시에 따라 삽입된 DNA 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
PCR 증폭
에펜도프 마스터 사이클러 그라디언트 써머사이클러(Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Germany)를 사용하여 0.5㎖의 얇은 벽 튜브에서 PCR 반응을 수행하였다. dNTP를 스웨덴 업살라에 소재하는 아메르샴 파마시아 바이오테크 에이비사(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)로부터 구입하였다. 최종의 시약 혼합물을 하기를 포함하였다:
야생형(G-대립형질)의 인간 ApoB3500 유전자좌의 검출 방법
dATP, dGTP, dTTP, dCTP: 각각 200μM
1.5mM MgCl2
5㎕의 10 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA)
1μM 프라이머 EQ 3053, 서열번호 1
1μM 프라이머 EQ 3213, 서열번호 6
1 유니트 AmpliTaq GoldR폴리머라아제(Perkin-Elmer cat. no. N808-0240, Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA)
2㎕ DNA 주형(대략 50ng의 플라스미드/㎕).
총 용량 50㎕
PCR-증폭에 의해 생성되고 플라스미드 pCRR2.1-TOPO 내로 클로닝된 인간 ApoB 유전자의 "G-대립형질" 및 "A-대립형질"를 사용하였다.
써모사이클링:
변성: 95℃ 15분
사이클링: 35회(94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 30초)
최종 신장: 72℃에서 10분
4℃로 냉각시켰다.
검출
PCR 산물을 순차적으로 표준 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다(참조: 실시예 1). 2% 아가로스 및 겔 중에서 1:30,000으로 희석된 GelStarR(FMC BioPorducts, Rockland, Maine, USA)를 포함시켜 염색하는 것은 상이하였다. 영구적인 기록을 위하여, 적절한 UV-투과기(Model TM-20E UV Products, Upland, CA, USA) 및 필터(Kodak Wratten #9 Eastman Kadak Co., Rochester, NY, USA)를 사용하여 겔을 일반 폴라로이드(Polaroid LTD., St. Albans, UK) 촬영에 의해 현상하였다.
돌연변이형(A-대립형질)의 인간 ApoB3500 유전자좌의 검출 방법
dATP, dGTP, dTTP, dCTP: 각각 200μM
1.5mM MgCl2
5㎕의 10 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA)
1μM 프라이머 EQ 3053, 서열번호 7
1μM 프라이머 EQ 3213, 서열번호 8
1 유니트 AmpliTaq GoldR폴리머라아제(Perkin-Elmer cat. no. N808-0240, Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA)
2㎕ DNA 주형(대략 50ng의 플라스미드/㎕).
총 용량 50㎕
PCR-증폭에 의해 생성되고 플라스미드 pCRR2.1-TOPO 내로 클로닝된 인간 ApoB 유전자의 "G-대립형질" 및 "A-대립형질"를 사용하였다.
써모사이클링:
변성: 95℃ 15분
사이클링: 35회(94℃에서 30초; 67℃에서 30초; 72℃에서 30초)
최종 신장: 72℃에서 10분
4℃로 냉각시켰다.
검출
PCR 산물을 순차적으로 표준 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다(참조: 실시예 1). 2% 아가로스 및 겔 중에서 1:30,000으로 희석된 GelStarR(FMC BioPorducts, Rockland, Maine, USA)를 포함시켜 염색하는 것은 상이하였다. 영구적인 기록을 위하여, 적절한 UV-투과기(Model TM-20E UV Products, Upland, CA, USA) 및 필터(Kodak Wratten #9 Eastman Kadak Co., Rochester, NY, USA)를 사용하여 겔을 일반 폴라로이드(Polaroid LTD., St. Albans, UK) 촬영에 의해 현상하였다.
결과
PCR-프라이머를 LNA-프라이머로 치환한 3'-말단 치환체가 대립형질 특이 증폭시킬 수 있는지를 나타내기 위하여 두개의 프라이머 세트 EQ3053/EQ3213 및 EQ3157/EQ3176을 사용하여 인간의 ApoB 유전자의 "G-대립형질" 및 "A-대립형질" 둘 모두를 포함하는 주형 DNA's를 증폭시켰다.
ApoB 유전자의 "G-대립형질"(서열번호 4):
ApoB 유전자의 "A-대립형질"(서열번호 5):
ApoB 유전자의 "G-대립형질"(서열번호 4)를 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트 EQ3053/EQ3213(서열번호 1, 서열번호 6)은 153bp의 PCR 산물을 제조하였지만, 30.4g이하의 ApoB 유전자의 "A-대립형질"(서열번호 5)를 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트 E어느 특정 PCR 산물도 제조하지 않았다-참조 도 3.
ApoB 유전자의 "돌연변이" 또는 "A-대립형질"(서열번호 5)를 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트 EQ3157/EQ3176(서열번호 7, 서열번호 8)은 145bp의 PCR 산물을 제조하였지만, ApoB 유전자의 "야생형" 또는 "G-대립형질"(서열번호 4)를주형으로서 사용하는 경우 어느 특정 PCR 산물도 제조하지 않았다-참조 도 3. 두개의 프라이머-세트 EQ3053/EQ3213 및 EQ3157/EQ3176는 주형 분자의 상이한 스트랜드를 향한다는 것에 주의하였다.
실시예 3
DNA 프라이머는 야생형 및 돌연변이형을 식별할 수 없다
LNA 및 DNA 프라이머사이의 차이를 평가하기 위하여 두개의 PCR 반응을 수행하였다.
하나의 방법은 실시예 2에 기재된 LNA-프라이머 EQ 3053을 사용하는 인간 ApoB3500 유전자좌의 야생형(G-대립형질)의 검출을 위한 방법이다.
다른 반응은 유사하였지만 LNA-프라이머 EQ 3053을 사용하는 대신 EQ 3053과 유사한 서열을 갖는 DNA 프라이머를 사용하였다.
프라이머의 합성 및 분석:
실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 LNA 프라이머의 합성 및 분석을 수행하였다. 시판(DNA Technology, Aarhus, Denmark로부터 구입)용으로부터 DNA 프라이머를 HPLC 정제된 올리고로서 수득하였다.
PCR 증폭
에펜도프 마스터 사이클러 그라디언트 써머사이클러(Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Germany)를 사용하여 0.5㎖의 얇은 벽 튜브에서 PCR 반응을 수행하였다. dNTP를 스웨덴 업살라에 소재하는 아메르샴 파마시아 바이오테크 에이비사(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)로부터 구입하였다. 최종의시약 혼합물을 하기를 포함하였다:
LNA-프라이머를 사용하는 반응은 1μM의 프라이머 EQ 3053(서열번호 1) 및 1μM의 프라이머 EQ 3213(서열번호 6)를 포함한다.
PCR-프라이머를 사용하는 반응은 1μM의 프라이머 EQ 3647(서열번호 9) 및 1μM의 프라이머 EQ 3213(서열번호 6)를 포함한다.
LNA 및 DNA를 사용하는 반응은 모든 다른 면에서는 동일한다:
dATP, dGTP, dTTP, dCTP: 각각 200μM
1.5mM MgCl2
5㎕의 10 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA)
1μM 프라이머 EQ 3053, 서열번호 7
1μM 프라이머 EQ 3213, 서열번호 8
1 유니트 AmpliTaq GoldR폴리머라아제(Perkin-Elmer cat. no. N808-0240, Perkin-Elmer corporation, Norwalk, CT, USA)
2㎕ DNA 주형(대략 50ng의 플라스미드/㎕).
총 용량 50㎕
인간 ApoB 유전자의 "G-대립형질" 및 "A-대립형질" 모두는 실시예 2에서 논의된 바와 같은 플라스미드이다.
써모사이클링:
변성: 95℃ 15분
사이클링: 35회(94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 72℃에서 30초)
최종 신장: 72℃에서 10분
4℃로 냉각시켰다.
검출
PCR 산물을 순차적으로 2% 아가로스 겔중에서 표준 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 GelStarR(FMC BioPorducts, Rockland, Maine, USA)으로 염색시켰다.
결과
도 4에 나타난 바와 같이, ApoB 유전자의 "G-대립형질"(서열번호 4)를 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트 EQ3053/EQ3213(서열번호 1, 서열번호 6)은 153bp의 PCR 산물을 제조하였지만, ApoB 유전자의 "A-대립형질"(서열번호 5)를 주형으로서 사용하는 경우 프라이머-세트는 어느 특정 PCR 산물도 제조하지 않았다-참조 도 4.
ApoB 유전자의 "G-대립형질"(서열번호 4):
ApoB 유전자의 "A-대립형질"(서열번호 5):
그러나, "G-대립형질" 또는 "A-대립형질"중 어느 하나를 주형으로서 사용하는 경우 모든 DNA 프라이머-세트 EQ3674/EQ3213(서열번호 9, 서열번호 6)은 153bp의 PCR 산물을 제조하였다-참조 도 4.
본 발명자는 DNA-프라이머와 상이한 LNA-프라이머가 ApoB R 3500Q 돌연변이의 단일 염기의 차이를 검출시킬 수 있다고 결론지었다.
실시예 4
로체(Roche)사의 라이트사이클러(Lightcycler)상에 적용된 LNA 프라이머를 사용하는 서열 특이 증폭
LNA-프라이머를 사용하는 PCR의 유연성을 설명하기 위하여, 라이트사이클러(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)상에 대립형질 특이 PCR을 장치시켰다. 라이트사이클러 기기는 1회의 조작으로 Tm 측정에 의해 증폭 및 생성된 PCR 산물을 동정하는 장치이다.
인간 ApoB R3500Q 다형의 "G-대립형질"의 양성적으로 확인할 수 있는 반응은 하기와 같다:
프라이머의 합성 및 분석:
실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 LNA 프라이머의 합성 및 분석을 수행하였다. 시판(DNA Technology, Aarhus, Denmark로부터 구입)용으로부터 DNA 프라이머를 HPLC 정제된 올리고로서 수득하였다.
PCR 증폭
장치로서 제공된 보로실리케이트 글래스 모세관을 사용하여 제조자의 지시에 따라 PCR 반응을 수행하였다.
각 반응은 하기를 포함한다:
- 2㎕의 라이트사이클러-DNA 마스터 SyBR 그린 I 믹스(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). 마스터-믹스는 뉴클레오타이드, PCR 완충액, SyBR 그린 및 Taq 폴리머라아제를 포함한다.
- 1㎕의 DNA 주형(대략 50ng의 플라스미드/㎕)
- 1μM 프라이머 EQ 3053(서열번호 1) 및 1μM 프라이머 EQ 3213(서열번호 6)
- 3mM MgCl2
총 용량 20㎕
"G-대립형질" 또는 "A-대립형질" 플라스미드중 어느 하나를 주형으로서 첨가하였다. 인간 ApoB 유전자의 "G-대립형질" 및 "A-대립형질" 주형은 실시예 2에서 논의된 플라스미드였다.
써모사이클링:
변성: 95℃ 2분, 20℃/sec
사이클링: 44회(95℃에서 0초; 55℃에서 5초; 72℃에서 7초)
Tm 측정:
단편 1: 95℃, 0초
단편 2 : 65℃. 10초
단편 3: 95℃, 0초; 0.1℃/sec. 계속 측정
냉각 : 4℃, 30초
결과
프라이머-세트 EQ3053/EQ3213(서열번호1, 서열번호 6)은 확실하게 "G-대립형질"를 증폭시켰지만 "A-대립형질"를 주형으로서 사용하는 경우 PCR 산물은 조금도 관찰되지 않았다-도 5 참조
도 6에 나타난 바와 같이, 프라이머-세트 EQ3053/EQ3213은 82℃의 정의된 Tm에서 PCR 산물을 제조하였다.
본 발명자는 EQ3053/EQ3213 프라이머-세트를 라이트사이클러에서 대립형질 특이 증폭을 위해 사용할 수 있다고 결론지었다.

Claims (53)

  1. a) 혼성화 조건하에서 샘플중에 존재하는 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
    b) 샘플중에 존재하는 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
    c) 단계 b)에서 형성된 어느 핵산을 검출하여 샘플중에 핵산 Q'의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 샘플중에서 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 핵산 Q'의 존재를 검출하는 방법.
  2. a) 혼성화 조건하에서 샘플중에 존재하는 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
    b) 샘플중에 존재하는 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
    c) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
    d) 혼성화 조건하에서 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시키고;
    e) 단계 c) 및 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
    f) 형성된 신장 산물을 검출하는 단계를 포함하는 샘플중에서 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 핵산 Q'의 존재를 검출하는 방법.
  3. a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제, 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
    b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
    c) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
    d) 혼성화 조건하에서 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하는, 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시키고;
    e) 단계 c) 및 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
    f) 형성된 신장 산물을 검출하는 단계를 포함하는 샘플중에서 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 핵산 Q'의 존재를 검출하는 방법.
  4. a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 뉴클레오사이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
    b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
    c) 단계 b)에서 형성된 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법.
  5. a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 뉴클레오사이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
    b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
    c) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
    d) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오사이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시켜 추가의 신장 산물을 합성하고;
    e) 단계 c) 및 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
    f) 형성된 신장 산물을 검출하는 단계를 포함하는 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법.
  6. a) 혼성화 조건하에서 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제, 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 배합시키고;
    b) 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화된 어느 올리고뉴클레오타이드를 신장시켜 신장 산물을 형성하고;
    c) 신장 산물의 형성 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 신장 산물을 분리하고;
    d) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오사이드 서열을 갖는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시켜 추가의 신장 산물을 합성하고;
    e) 단계 c) 및 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 신장 산물을 수득하고;
    f) 형성된 신장 산물을 검출하는 단계를 포함하는 그의 뉴클레오타이드가 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법.
  7. a) 혼성화 조건하에서 표적 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 진단 올리고뉴클레오타이드인 적어도 두개의 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 결찰제와 배합시키고:
    b) 인접 위치에서 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화되는 어느 올리고뉴클레오타이드를 결찰시켜 결찰 산물을 형성하고;
    c) 단계 b)에서 형성된 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법.
  8. a) 혼성화 조건하에서 표적 핵산을 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에서 포함하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 진단 올리고뉴클레오타이드인 적어도 두개의 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 결찰제와 배합시키고:
    b) 인접 위치에서 주형으로서 사용된 핵산에 혼성화되는 어느 올리고뉴클레오타이드를 결찰시켜 결찰 산물을 형성하고;
    c) 결찰 후, 변성 조건하에서 반응 혼합물을 처리하여 주형으로부터 결찰 산물을 분리시키고;
    d) 혼성화 조건하에서 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 올리고뉴클레오사이드 결찰제의 존재하에 단계 c)로부터의 싱글 스트랜드 핵산을 단계 b)로부터의 결찰 산물에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에 포함하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드인 적어도 두개의 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시키고;
    e) 단계 c) 및 d)를 충분한 횟수로 반복하여 검출가능한 양의 결찰 산물을 수득하고;
    f) 형성된 결찰 산물을 검출하는 단계를 포함하는 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산을 검출하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 진단 올리고뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 위치 A가 검출하고자 하는 핵산 서열의 위치 A와 상보적이지만 다른 핵산 서열의 위치 A와는 비상보적인 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 진단 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 위치 A에 뉴클레오타이드가 LNA인 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 진단 올리고뉴클레오타이드가하기 일반식 a)를 갖는 방법:
    a)
    상기 식에서, A는 표적 핵산의 변형 핵산 서열이 서로 상이한 위치 A의 LNA이고; LNA는 하나의 LNA이며; Nu는 변형 핵산과 특이 염기쌍을 형성할 수 있는 LNA외의 어느 뉴클레오타이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 모노머이고; a,b,c,d 및 f는 0 내지 30의 정수이며, m은 1 내지 8의 정수이고, e는 1 내지 6의 정수이며, 단, a,b,c,d,e 및 f의 합은 적어도 5이다.
  12. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 10이고, b는 0이며, c는 4이고, d는 8이며, e는 1이고, f는 0이며, m은 0인 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 0이고, b는 1이며, c는 1이고, d는 8이며, e는 1이고, f는 0이며, m은 5인 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 10-30이고, b는 0이며, c는 0이고, d는 0이며, e는 1-4이고, f는 1-8이며, m은 0인 방법.
  15. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 10-30이고, b는 0이며, c는 0이고, d는 0이며, e는 1-4이고, f는 1이며, m은 0인 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 10-30이고, b는 0이며, c는 0이고, d는 0이며, e는 1-4이고, f는 0이며, m은 0인 방법.
  17. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 10-30이고, b는 0이며, c는 0이고, d는 0이며, e는 1이고, f는 0이며, m은 0인 방법.
  18. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 10이고, b는 0이며, c는 0이고, d는 0이며, e는 4이고, f는 8이며, m은 0인 방법.
  19. 제 11항에 있어서, 일반식 a에서 a는 24이고, b는 0이며, c는 0이고, d는 0이며, e는 1이고, f는 0이며, m은 0인 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드가 고체 지지체에 공유결합되는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상이한 진단 올리고뉴클레오타이드가 고체 표면상에 어레이 포맷(array format)으로 스팟팅되는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, 상이한 하류 올리고뉴클레오타이드가 고체 표면상에 어레이 포맷으로 스팟팅되는 방법.
  23. 제 20항 내지 제 22항중 어느 한 항에 있어서, 결합이 안트라퀴논 광화학법에 의해 수행되는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 21항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드를 검출가능한 그룹으로 표지하는 방법.
  25. 제 4항 내지 21항중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 첫번째 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드를 상이한 진단 올리고뉴클레오타이드에 대한 것과 상이한 검출가능한 그룹으로 표지하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트중 개개의 올리고뉴클레오타이드를 각각 개개의 진단 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상이한 검출가능한 그룹으로 표지하는 방법.
  27. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 세포의 샘플, 조직 샘플 또는 조직 추출물로부터 기원되는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 세포가 원시(archae), 원핵 또는 진핵생물 기원인 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 세포의 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 망상적혈구, 림프구, 뇨, 골수조직, 뇌척수액 또는 혈액 또는 림프로부터 제조되는 어느 산물로부터 유래되는 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 조직샘플이 근육 생검, 간생검, 신장생검, 방광생검, 골생검, 연골생검, 피부생검, 췌장생검, 내장관 생검, 갑상선 생검, 유방생검, 자궁생검, 고환생검, 안구생검 또는 뇌생검으로부터 유래된 방법.
  31. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 특정 종의 유기체에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  32. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 특정 종, 아종 또는 품종의 유기체에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  33. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 특정 종의 미생물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  34. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 특정 종, 아종 또는 품종의 미생물에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  35. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 특정 전염체에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  36. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 특정 종, 아종 또는 품종의 전염체에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  37. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 유전성 질환에 관련된 특정 단백질을 코딩하는 유전자에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  38. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 생활 양식(life style) 질환과 연관된 유전자에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  39. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 암과 연관된 특정 유전자에 대하여 특이적인 적어도 하나의 서열인 방법.
  40. 제 38항에 있어서, 생활 양식 질환이 비만, 가계 고콜레스테롤혈증, 아테로마성 동맥 경화증 및 당뇨병으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  41. 제 27항 내지 제 40항중 어느 한 항에 있어서, 검출하고자 하는 표적 핵산이 대립형질인 방법.
  42. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 중합제가 효소인 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 중합제가 DNA 폴리머라아제인 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 중합제가 열안정성 DNA 폴리머라아제인 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 열안정성 DNA 폴리머라아제가 Taq, Pfu, Pwo 및 Tth로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  46. 제 42항에 있어서, 중합제가 RNA 폴리머라아제인 방법.
  47. 제 7항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 결찰제가 효소인 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 결찰제가 리가아제인 방법.
  49. a) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 중합제;
    c) 혼성화 조건하에서 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 위치 A에 포함하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 샘플에서 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 핵산 Q'의 존재를 검출하는 키트.
  50. a) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 중합제;
    c) 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드;
    d) 혼성화 조건하에서 핵산 Q'의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있지만 핵산 Q의 위치 A의 뉴클레오타이드와 혼성화될 수 없는 뉴클레오타이드를 우치 A에 포함하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 하나의 진단 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 샘플에서 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 핵산 Q와 상이한 핵산 Q'의 존재를 검출하는 키트.
  51. a) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 중합제;
    c) 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산들을 검출하는 키트.
  52. a) 적절한 양의 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 중합제;
    c) 적어도 하나의 하류 올리고뉴클레오타이드;
    d) 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 적어도 한 세트의 진단 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산들을 검출하는 키트.
  53. a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    b) 결찰제;
    c) 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드가 검출하고자 하는 표적 핵산의 위치 A에서 발견되는 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드를 위치 A에 포함하고 적어도 하나의 LNA를 포함하는 진단 올리고뉴클레오타이드인 적어도 두개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 그의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 위치 A에서 서로 상이한 표적 핵산들을 검출하는 키트.
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