JP2004113240A - 二次構造形成の破壊による向上したハイブリダイゼーションアッセイを提供するための二目的プライマーおよびプローブ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための二目的プライマーであって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、該プライマーの非存在下において、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を生じて、該目的の部位の検出を妨げ、ここで、該プライマーが、(a)該二次構造形成領域以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的なプライマー配列;および(b)該望ましくない二次構造の形成を妨げるための、該二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列を含む、プライマー。
【選択図】 図10
Description
標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための二目的プライマーであって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、該プライマーの非存在下において、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない(unwanted)二次構造を生じて、該目的の部位の検出を妨げ、ここで、該プライマーが、(a)該二次構造形成領域以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的なプライマー配列;および(b)該望ましくない二次構造の形成を妨げるための、該二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列を含む、プライマー。
項目1に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、核酸配列である、プライマー。
項目2に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、単一ヌクレオチド多型である、プライマー。
項目1に記載のプライマーであって、ここで、前記プライマー配列が、前記標的ヌクレオチド配列を含む標的分子の1つの末端に相補的である、プライマー。
項目1に記載のプライマーであって、前記プライマー配列と前記ブロッキング配列との間に、非ハイブリダイズスペーサーをさらに備える、プライマー。
項目5に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非ヌクレオチドである、プライマー。
項目6に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、合成親水性オリゴマーから構成される、プライマー。
項目7に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、エチレンオキシド、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの組み合わせから選択される、約3〜約50のアルキレンオキシド単位から構成される、プライマー。
項目5に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、ヌクレオチドである、プライマー。
項目9に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非天然ヌクレオチドの配列から構成される、プライマー。
項目10に記載のプライマーであって、ここで、前記非天然のヌクレオチドが、イソグアニンおよびイソシトシンから選択される、プライマー。
項目9に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、反復する単一ヌクレオチド(a recurring single nucleotide)から構成されるオリゴマーセグメントである、プライマー。
項目9に記載のプライマーであって、ここで、前記プローブ配列および前記スペーサーが、該プローブ配列と該スペーサーとの間の転写を停止させるための手段によって、互いに分離されている、プライマー。
項目13に記載のプライマーであって、ここで、前記転写を停止させるための手段が、停止リンカーである、プライマー。
項目14に記載のプライマーであって、ここで、前記停止リンカーが、少なくとも1つの改変ヌクレオシドを含む、プライマー。
項目15に記載のプライマーであって、ここで、前記改変ヌクレオシドが、N4−改変ピリミジンである、プライマー。
項目1に記載のプライマーであって、検出可能な標識をさらに備える、プライマー。
項目17に記載のプライマーであって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬(electron−dense reagent)、および放射性同位体からなる群より選択される、プライマー。
標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、ここで、前記標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下:
該標的ヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーション条件下で、該標的分子の第1鎖の1つの末端に相補的な項目1に記載の二目的プライマー、該標的分子の第2鎖の反対の末端に相補的な第2プライマー、該増幅に適切なヌクレオチド、および該ヌクレオチドの重合のための薬剤と、一緒にまたは連続的に接触させる工程であって、ここで、該方法の間に形成されるアンプリコンが、該望ましくない二次構造を含まず、その結果、該目的の部位が、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接近可能である、工程、
を包含する、方法。
項目19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、DNAポリメラーゼである、方法。
項目19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、DNAリガーゼである、方法。
項目19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、RNAポリメラーゼである、方法。
項目19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、RNA逆転写酵素である、方法。
第1末端および第2末端を有する二本鎖標的DNA分子の配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行するための方法であって、該方法が、(a)該二本鎖DNAを含むサンプルを、該DNAを変性させるのに有効な温度まで加熱し、そしてそれによって、DNAの第1鎖およびDNAの第2鎖を提供する工程、(b)該変性されたDNAを第1オリゴヌクレオチドプライマーおよび第2オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、各プライマーが、それぞれ、第1DNA鎖の第1末端および第2DNA鎖の第2末端に相補的な標的結合配列から構成される、工程、(c)該サンプルを冷却して、第1オリゴヌクレオチドプライマーおよび第2ヌクレオチドプライマーを、それぞれ、該DNAの第1鎖および第2鎖にハイブリダイズさせる、工程、(d)DNAポリメラーゼを使用して該DNAを複製し、そして上記工程(a)〜(d)を繰り返して、2本鎖DNAの配列の複数のコピーを提供する、工程を包含し、項目1に記載の二目的プライマーを第1プライマーとして使用することを改良として包含する、方法。
項目24に記載の方法であって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体からなる群より選択される、方法。
標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする項目1に記載のプライマーに対するDNAポリメラーゼの作用によって形成される、アンプリコン。
個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、項目1に記載の二目的プライマー、オリゴヌクレオチド配列の増幅に適切なヌクレオチド、およびヌクレオチドの重合のための薬剤を含む、キット。
個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、項目1に記載の二目的プライマー、第2プライマー、DNA増幅に適切なヌクレオチド、ヌクレオチドの重合のための薬剤、ヌクレオチド捕捉領域を有する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)プローブ、および該ASHプローブ上に該ヌクレオチド捕捉領域に相補的なヌクレオチド捕捉領域を有する色コード化決定手段を含み、
ここで、該検出手段上の該ヌクレオチド捕捉領域が該ASHプローブに相補的であり、その結果、該標的ヌクレオチド配列が該検出手段の該色コードによって同定される、
キット。
項目28に記載のキットであって、ここで、前記検出手段が、多重検出手段である、キット。
項目29に記載のキットであって、ここで、前記多重検出手段が、検出可能な固体基材を含む、キット。
項目30に記載のキットであって、ここで、前記検出可能な固体基材が、検出可能なミクロスフェアである、キット。
ハイブリダイゼーションプローブであって、(a)標的分子内の第1ヌクレオチド配列に相補的なプローブヌクレオチド配列、および(b)標的分子内の第2ヌクレオチド配列に実質的に相補的なブロッキング配列を含み、ここで、該ブロッキング配列と該第2ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが、第2ヌクレオチド配列における二次構造形成を妨げ、該二次構造が、該プローブ配列と該第1ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを妨害する、ハイブリダイゼーションプローブ。
項目32に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、検出可能な標識をさらに備える、ハイブリダイゼーションプローブ。
項目33に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、ここで、前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、多量体DNA標識、色素、酵素、酵素モジュレーター、検出可能な固体基材、および金属イオンからなる群より選択される、ハイブリダイゼーションプローブ。
標的分子内の標的ヌクレオチド配列の存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイを実行する方法であって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位であるかまたは二次構造形成領域内に含まれ、該二次構造形成領域が、該標的ヌクレオチド配列の検出を妨げる望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下:
該標的分子を、ハイブリダイゼーション条件下で、項目33に記載のハイブリダイゼーションプローブと接触させて、その結果、該標的分子への該プローブのハイブリダイゼーションが、該望ましくない二次構造の形成を妨げ、そして該標的ヌクレオチド配列の検出を可能にする、工程、
を包含する、方法。
項目35に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ヒト個体から得られている、方法。
項目35に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、細菌起源である、方法。
項目35に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ウイルス起源である、方法。
項目38に記載の方法であって、ここで、前記第1ハイブリダイゼーションプローブ配列と前記標的ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが、前記ウイルスによって引き起こされる疾患の診断である、方法。
本発明は、当該分野における上記の要求を扱い、第1の実施形態において、標的分子中の標的ヌクレオチド配列を増幅するのに有効なプライマー配列、および標的分子の一本鎖形態、または増幅アッセイの間に形成されるアンプリコンにおける二次構造の形成を破壊するブロッキング配列の両方を含むプライマーを提供する(従って、このプライマーは、時々、本明細書中で、「二目的(dual−purpose)」プライマーといわれる)。これらの組み合わされた性質を有するプライマーは、二次構造形成領域内に含まれるか、またはこの領域に近接する目的の部位(例えば、SNP)の存在または非存在を検出するための方法において有用であり、ここで、目的の部位は、プライマーの非存在下で、望ましくない二次構造の形成により隠される。上で議論した方法のような、二次構造内に潜在的に「隠される」核酸配列を検出するための従来の方法とは対照的に、本発明は、単一のプライマーオリゴヌクレオチドを用いる増幅を可能にし、ここで、このプライマーは、従来技術のブロッキングプローブ(例えば、Hoganらにより記載されるもの)よりも実質的により短いものであり得るブロッキング配列を含み、そして望ましくない二次構造を形成する標的分子の領域と完全な相補性を有さない。
本発明を詳細に記載する前に、他に示されない限り、本発明は、DNAの特定の供給源、特定の配列、または特定のアッセイ形式に制限されず、それ自体変化し得ることを理解するべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するのみの目的のためのものであり、そして限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
以下の実験手順は、本明細書中に開示されそして特許請求されるハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーをいかに作製しそして使用するのかについて、そしてこの同じハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを使用する方法をどのように実施するのかについての完全な開示および記載を、当業者に提供するために示される;実施例は、本発明者らが自身の発明であると認識する発明の範囲を制限することを意図されない。数(例えば、量、温度など)に関する精度を保証するように努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他で示されない限り、部は、重量部であり、温度は、摂氏度(℃)であり、そして圧力は、海面での大気圧またはほぼ大気圧である。
C 摂氏または百分度
mM ミリモル濃度
μM マイクロモル濃度
pmol ピコモル(10−12モル)
mg ミリグラム
μg マイクログラム
mL ミルリットル
μL マイクロリットル
μm マイクロメートル
Tm 融解温度
U 単位。
以下の手順を、独立したブロッカーを使用する二目的プライマー系と使用しない二目的プライマー系とを比較するために実施した。
ヒトゲノムDNAを、QIAmp(登録商標)DNA Blood Mini Kit製造業者(Qiagen)によって記載されるようにを使用して、EDTA処理した200μLの全血より抽出した。
プライマー配列を、シトクロムp450 CPY2D6遺伝子(目的の4つのSNP部位を含むエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9)に対応するDNAの特定の領域を増幅するために設計した。ビオチン化配列もまた、4つのSNP部位についての対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブとして作用する。
2μL(50〜70ng)の単離したゲノムDNAを用いて、多重ではない反応または多重反応を実施した。25μlの反応容量が、1×Titanium Taq PCR緩衝液、各々2.5mMのdNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP);各々0.2μMの順方向(ビオチン化)プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに2.5U Titanium Taq DNAポリメラーゼを含んだ。PE9600サーモサイクラーを使用した。熱サイクリング条件は、94℃で2分間、その後に95℃で30秒間と68℃で1分間とを30サイクル、その後に最終伸長68℃で5分間であった。
最終pH7.5を有する50mM Hepes(500mM LiCl、1% LDS、1%ウシ血清アルブミン、10mM MgCl2、0.01mM ZnCl2、防腐剤としての0.5%アジ化ナトリウムおよびProclin−300(HIV3.0 Label Diluent,Bayer Diagnostics)を含む)25μL当たり、4つのSNP領域についての各々0.1pmolの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)プローブ、および各々2000個の個別のLuminexTMミクロスフェアを混合することによって、多重作業試薬を調製した。
上記に示したPCR反応の完了後、25μLの多重作業試薬(ASHプローブを含む)を、マルチプレックスPCR産物を含有する個々のウェルに添加した。このプレートを、Mylarでシールし、そしてインキュベーションを、PE9600サーモサイクラー中で継続した。多重作業試薬を含むこのPCRプレートを、95℃で10分間インキュベートして、二本鎖DNAを解離させ、その後、対立遺伝子ハイブリダイゼーションを達成するために50℃で30分間インキュベートした。このプレートを取り出し、そして100μLの洗浄緩衝液(HIV3.0 Wash A,Bayer Diagnostics)を、各ウェルに添加した。このウェルの内容物を、予め湿らせた96ウェルのフィルタープレート(Multiscreen(登録商標)−BV1.2μm,Millipore,Bedford MA)に移した。洗浄緩衝液を、穏やかな減圧で吸引し、そして200μLの洗浄を繰り返した。ミクロスフェアを、50μLのストレプトアビジン−フィコエリトリン(0.05μg/50μL)TTL緩衝液(50mM Tris、400mM LiCl、0.1% Tween−20(pH8.0))混合液中で再懸濁した。次いで、このプレートを、アルミニウムホイルで被い、そして穏やかに振盪しながら25℃で15分間インキュベートした(Titer Plateシェーカー、Labline Instruments)。上記洗浄工程を繰り返し、そしてミクロスフェアを、80μLのTTL緩衝液中に再懸濁し、そしてLuminexTM100で読み取った。ここで、フィコエリトリン(つまり、元々の順方向プライマー)および特定のASH各々に特異的なミクロスフェアの存在を検出した。
上記の従来のPCR産物に対する、独立したブロッカー分子の有効性を決定するために、25μLの多重作業試薬中1pmolのブロッカーを、従来のシトクロムP450 CPY2D6エキソン1 PCR産物に添加した。図4に示すように、この多重作業試薬にブロッカー分子を添加すると、シグナルが、多重作業試薬にブロッカーを添加しない場合に生成されるシグナルの30倍に増加した。
図1において観察されるように、シトクロムP450 CPY2D6遺伝子のエキソン1は、そのSNPにて最大量の二次構造を有する。図6中のゲルは、エキソン1が、検出可能なSNP産物バンドを生成しないことを示す。エキソン1のシグナルを増加させるために、8ヌクレオチド、10ヌクレオチドおよび12ヌクレオチドのブロッキング配列を、以下に示すようなシトクロムP450 CPY2D6遺伝子のエキソン1のビオチン化順方向プライマーに挿入した;4番目のエキソン1プライマーは、逆方向プライマーを示す。
シトクロムP450 CPY2Dエキソン1 PCRアンプリコン内に形成される二次構造を破壊する際の二目的プライマー分子の有効性を決定するために、上記に示したような8ヌクレオチド、10ヌクレオチドおよび12ヌクレオチドのブロッキング配列を有する1pmol/25μLの個々の二目的プライマー分子を、多重作業試薬に添加した。コントロールブロッカー分子を、同濃度で添加した。次いで、上記に示したようなシトクロムP450 SNPアッセイを、この二目的プライマーを使用して実施した。図7は、このプロトコルの概略図である。図8に示されるように、SNPアッセイで検出された正味のシグナルは、このブロッキング配列の長さの増加とともに増加した。対照的に、ブロッカー配列を使用しなかった場合、シグナルがほとんど生成されなかった(図8中「従来の」と示したカラムを参照のこと)。25ヌクレオチドの外部ブロッカー配列を従来のプライマーとともに使用した場合、ブロッカーを有さないプライマーに対して15〜20倍のシグナルの増加が、観察された(図8中「従来の+ブロッカー」と示したカラムを参照のこと);しかし、25ヌクレオチドの外部ブロッカーの有効性は、12ヌクレオチドブロッカー挿入物を有する二目的プライマーの有効性よりも顕著に低かった;12ヌクレオチドブロッカー挿入物を有する二目的プライマーは、25ヌクレオチドの外部ブロッカーに対して正味2倍のシグナル増加を示した。
シトクロムP450 CPY2D6遺伝子のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9についての野生型対立遺伝子または変異体対立遺伝子を検出するために、上記に示したマルチプレックスPCRアッセイを使用して、この4つのエキソンの各々におけるSNPを検出した。この手順を実施するために、シトクロムP450 CPY2D6遺伝子のエキソン1、エキソン2、エキソン6およびエキソン9に対応する特定領域を増幅するためのプライマーセットを設計した。生じたアンプリコンを、野生型対立遺伝子に特異的なASHプローブおよび変異体対立遺伝子に特異的なASHプローブの直接捕捉を介してハイブリダイズした。適切な場合、二目的プライマーを使用して、二次構造を破壊した。ASHプローブの各々は、特定色でコードされたLuminexTMミクロスフェア上の標的配列に相補的な、独特な配列ドメインを含んだ。このASHプローブ上の捕捉配列とLuminexTMミクロスフェアとの間の潜在的な交差反応性を低減させるために、非天然のイソシステイン塩基およびイソグアニン塩基を、ASHプローブ上の捕捉配列およびLuminexTMミクロスフェアに組み込んだ。この多重アッセイを使用して、変異体対立遺伝子および野生型対立遺伝子は、LuminexTMミクロスフェアの色に従って容易に同定可能であった。
Claims (39)
- 標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための二目的プライマーであって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、該プライマーの非存在下において、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を生じて、該目的の部位の検出を妨げ、ここで、該プライマーが、(a)該二次構造形成領域以外の標的ヌクレオチド配列のセグメントに相補的なプライマー配列;および(b)該望ましくない二次構造の形成を妨げるための、該二次構造形成領域のセグメントに実質的に相補的なブロッキング配列を含む、プライマー。
- 請求項1に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、核酸配列である、プライマー。
- 請求項2に記載のプライマーであって、ここで、前記目的の部位が、単一ヌクレオチド多型である、プライマー。
- 請求項1に記載のプライマーであって、ここで、前記プライマー配列が、前記標的ヌクレオチド配列を含む標的分子の1つの末端に相補的である、プライマー。
- 請求項1に記載のプライマーであって、前記プライマー配列と前記ブロッキング配列との間に、非ハイブリダイズスペーサーをさらに備える、プライマー。
- 請求項5に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非ヌクレオチドである、プライマー。
- 請求項6に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、合成親水性オリゴマーから構成される、プライマー。
- 請求項7に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、エチレンオキシド、およびエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの組み合わせから選択される、約3〜約50のアルキレンオキシド単位から構成される、プライマー。
- 請求項5に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、ヌクレオチドである、プライマー。
- 請求項9に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、非天然ヌクレオチドの配列から構成される、プライマー。
- 請求項10に記載のプライマーであって、ここで、前記非天然のヌクレオチドが、イソグアニンおよびイソシトシンから選択される、プライマー。
- 請求項9に記載のプライマーであって、ここで、前記スペーサーが、反復する単一ヌクレオチドから構成されるオリゴマーセグメントである、プライマー。
- 請求項9に記載のプライマーであって、ここで、前記プローブ配列および前記スペーサーが、該プローブ配列と該スペーサーとの間の転写を停止させるための手段によって、互いに分離されている、プライマー。
- 請求項13に記載のプライマーであって、ここで、前記転写を停止させるための手段が、停止リンカーである、プライマー。
- 請求項14に記載のプライマーであって、ここで、前記停止リンカーが、少なくとも1つの改変ヌクレオシドを含む、プライマー。
- 請求項15に記載のプライマーであって、ここで、前記改変ヌクレオシドが、N4−改変ピリミジンである、プライマー。
- 請求項1に記載のプライマーであって、検出可能な標識をさらに備える、プライマー。
- 請求項17に記載のプライマーであって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体からなる群より選択される、プライマー。
- 標的分子内の標的ヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、ここで、前記標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位の目的部位または二次構造形成領域内に含まれる目的の部位を含み、該二次構造形成領域が、増幅条件下において形成されるアンプリコンにおいて、望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下:
該標的ヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーション条件下で、該標的分子の第1鎖の1つの末端に相補的な請求項1に記載の二目的プライマー、該標的分子の第2鎖の反対の末端に相補的な第2プライマー、該増幅に適切なヌクレオチド、および該ヌクレオチドの重合のための薬剤と、一緒にまたは連続的に接触させる工程であって、ここで、該方法の間に形成されるアンプリコンが、該望ましくない二次構造を含まず、その結果、該目的の部位が、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに接近可能である、工程、
を包含する、方法。 - 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、DNAポリメラーゼである、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、DNAリガーゼである、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、RNAポリメラーゼである、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記重合のための薬剤が、RNA逆転写酵素である、方法。
- 第1末端および第2末端を有する二本鎖標的DNA分子の配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実行するための方法であって、該方法が、(a)該二本鎖DNAを含むサンプルを、該DNAを変性させるのに有効な温度まで加熱し、そしてそれによって、DNAの第1鎖およびDNAの第2鎖を提供する工程、(b)該変性されたDNAを第1オリゴヌクレオチドプライマーおよび第2オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、各プライマーが、それぞれ、第1DNA鎖の第1末端および第2DNA鎖の第2末端に相補的な標的結合配列から構成される、工程、(c)該サンプルを冷却して、第1オリゴヌクレオチドプライマーおよび第2ヌクレオチドプライマーを、それぞれ、該DNAの第1鎖および第2鎖にハイブリダイズさせる、工程、(d)DNAポリメラーゼを使用して該DNAを複製し、そして上記工程(a)〜(d)を繰り返して、2本鎖DNAの配列の複数のコピーを提供する、工程を包含し、請求項1に記載の二目的プライマーを第1プライマーとして使用することを改良として包含する、方法。
- 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記検出可能な標識が、蛍光剤、化学発光剤、色素、ビオチン、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオン、高電子密度試薬、および放射性同位体からなる群より選択される、方法。
- 標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする請求項1に記載のプライマーに対するDNAポリメラーゼの作用によって形成される、アンプリコン。
- 個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、請求項1に記載の二目的プライマー、オリゴヌクレオチド配列の増幅に適切なヌクレオチド、およびヌクレオチドの重合のための薬剤を含む、キット。
- 個体の遺伝子型を決定するためのキットであって、請求項1に記載の二目的プライマー、第2プライマー、DNA増幅に適切なヌクレオチド、ヌクレオチドの重合のための薬剤、ヌクレオチド捕捉領域を有する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)プローブ、および該ASHプローブ上に該ヌクレオチド捕捉領域に相補的なヌクレオチド捕捉領域を有する色コード化決定手段を含み、
ここで、該検出手段上の該ヌクレオチド捕捉領域が該ASHプローブに相補的であり、その結果、該標的ヌクレオチド配列が該検出手段の該色コードによって同定される、
キット。 - 請求項28に記載のキットであって、ここで、前記検出手段が、多重検出手段である、キット。
- 請求項29に記載のキットであって、ここで、前記多重検出手段が、検出可能な固体基材を含む、キット。
- 請求項30に記載のキットであって、ここで、前記検出可能な固体基材が、検出可能なミクロスフェアである、キット。
- ハイブリダイゼーションプローブであって、(a)標的分子内の第1ヌクレオチド配列に相補的なプローブヌクレオチド配列、および(b)標的分子内の第2ヌクレオチド配列に実質的に相補的なブロッキング配列を含み、ここで、該ブロッキング配列と該第2ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが、第2ヌクレオチド配列における二次構造形成を妨げ、該二次構造が、該プローブ配列と該第1ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを妨害する、ハイブリダイゼーションプローブ。
- 請求項32に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、検出可能な標識をさらに備える、ハイブリダイゼーションプローブ。
- 請求項33に記載のハイブリダイゼーションプローブであって、ここで、前記検出可能な標識が、化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、多量体DNA標識、色素、酵素、酵素モジュレーター、検出可能な固体基材、および金属イオンからなる群より選択される、ハイブリダイゼーションプローブ。
- 標的分子内の標的ヌクレオチド配列の存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイを実行する方法であって、ここで、該標的ヌクレオチド配列が、二次構造形成領域の近位であるかまたは二次構造形成領域内に含まれ、該二次構造形成領域が、該標的ヌクレオチド配列の検出を妨げる望ましくない二次構造を形成し得、該方法が、以下:
該標的分子を、ハイブリダイゼーション条件下で、請求項33に記載のハイブリダイゼーションプローブと接触させて、その結果、該標的分子への該プローブのハイブリダイゼーションが、該望ましくない二次構造の形成を妨げ、そして該標的ヌクレオチド配列の検出を可能にする、工程、
を包含する、方法。 - 請求項35に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ヒト個体から得られている、方法。
- 請求項35に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、細菌起源である、方法。
- 請求項35に記載の方法であって、ここで、前記標的分子が、ウイルス起源である、方法。
- 請求項38に記載の方法であって、ここで、前記第1ハイブリダイゼーションプローブ配列と前記標的ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが、前記ウイルスによって引き起こされる疾患の診断である、方法。
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