WO2013153911A1 - 核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法 - Google Patents

核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法 Download PDF

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nucleic acid
probe
detection probe
detection
capture probe
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太郎 上野
高志 船津
一木　隆範
博文 塩野
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国立大学法人東京大学
株式会社ニコン
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid quantification method, a detection probe, a detection probe set, and a nucleic acid detection method.
  • DNA microarrays targeting mRNA are widely used as means for measuring the gene expression level in cells.
  • miRNA a short non-coding RNA
  • miRNA regulates gene expression in vivo
  • competition for development of DNA microarrays targeting miRNA has been developed.
  • Non-Patent Document 1 the discovery that miRNA circulates in the blood in 2008 (see Non-Patent Document 1) indicates the possibility of diagnosing cancer by simply performing a blood test.
  • the DNA microarray market is expected to expand rapidly in the near future.
  • quantitative PCR qRT-PCR
  • the quantitative PCR method is a method for estimating the amount of miRNA used as a template by converting miRNA into cDNA using reverse transcriptase and amplifying the cDNA.
  • Quantitative PCR is a method that measures the amount of cDNA amplified to a certain amount using a PCR reaction. Therefore, it is more quantitative than a DNA microarray, but parallel processing for multiple samples and various miRNAs is difficult. There is a problem.
  • miRNA target DNA microarray is a nucleic acid probe having a gene sequence that hybridizes complementary to a target miRNA on a transparent substrate.
  • miRNA quantification method using the miRNA target DNA microarray include the following methods. First, miRNA is extracted from a biological sample, the miRNA is fluorescently labeled, then added to the miRNA target DNA microarray, and hybridized to a nucleic acid probe on a substrate. Next, after miRNA adsorbed nonspecifically on the substrate is washed, the amount of miRNA is estimated using fluorescence intensity as an index.
  • miRNA since the amount of miRNA in the living body, particularly blood, is as small as 0.01% by mass in the total RNA, if such pretreatment process is complicated, miRNA is adsorbed or decomposed during pipetting. Susceptible to. Furthermore, there is a problem that fluctuation of the fluorescence labeling rate for each measurement lowers the reproducibility of the measurement results.
  • ⁇ -TAS Micro-Total Analysis Systems
  • MEMS Micro Electro Mechanical Systems
  • the fluorescent labeling method has become a bottleneck as described below, and it has not been incorporated into full automation.
  • the main fluorescent labeling method of miRNA includes a method of directly fluorescently labeling the base portion of miRNA and a method of adding a fluorescently labeled nucleotide to the 3 ′ end of miRNA using an enzyme such as T4 DNA ligase.
  • an enzyme such as T4 DNA ligase.
  • a sandwich type microarray method that can detect miRNA while omitting the separation process of unreacted fluorescent dye (see Patent Document 1).
  • Specific examples of the first method of the sandwich type microarray method include the following steps. First, a nucleic acid probe having a sequence complementary to each miRNA 103 composed of the first portion 100 and the second portion 101 is divided into two to obtain a capture probe 104 (Detect probe) and a detection probe 105 (Detect probe). Then, a group of capture probes 104 having a sequence complementary to the first portion 100 of each miRNA 103 is arranged on the substrate 106 to produce a microarray (see FIG. 5).
  • a solution containing a group of detection probes 105 having a sequence complementary to the second portion 101 of each miRNA 103 is applied to the microarray substrate (substrate 106).
  • the miRNA 103, the capture probe 104, and the detection probe 105 are hybridized (see FIG. 5). Since the detection probe 105 recognizes and binds to the second portion 101 of the miRNA 103, non-specific binding to the capture probe 104 does not occur, and it is necessary to separate the unreacted detection probe 104 by chromatography or the like. Absent.
  • the sequence complementary to miRNA 103 on one probe is about 10 bases each. Become.
  • the affinity between the miRNA 103 and the nucleic acid probe decreases, and it is difficult to accurately quantify the miRNA 103 that is present in a very small amount in blood.
  • the biological sample contains about 70 bases of pre-miRNA (a precursor of miRNA). Since pre-miRNA contains a sequence of miRNA of about 22 bases, the first method of Patent Document 1 cannot distinguish between them, and the fundamental problem is that only miRNA having a gene expression control function cannot be accurately quantified.
  • the second method described in Patent Document 1 further proposes a method of covalently binding miRNA 103 and a nucleic acid probe using ligase (see FIG. 6).
  • ligase when ligase is used, after the detection probe 105 and the capture probe 104 hybridized with the miRNA 103 are covalently bonded, the miRNA 103 is dissociated and binds to another capture probe 104. Therefore, there is a risk that the miRNA 103 of the same molecule is detected multiple times.
  • the capture probe 104 the miRNA 103, and the detection probe 109 are combined.
  • the miRNA 103 covalently bonded by ligation and captured on the substrate 106 is prevented from dissociating from the substrate 106.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a simple, highly accurate, and highly sensitive nucleic acid quantification method, and a detection probe used for the nucleic acid quantification method
  • An object of the present invention is to provide a detection probe set and a method for detecting a nucleic acid.
  • a method for quantifying a nucleic acid comprises: (A) a nucleic acid sample containing a nucleic acid comprising a first part and a second part; A detection probe that forms a stem-loop structure and includes a sequence that can hybridize with the second portion, and has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end and is labeled with a labeling substance, Contacting a capture probe having a capture probe comprising a sequence capable of hybridizing with the first portion; (B) hybridizing the second part to the detection probe, hybridizing the first part to the capture probe, and forming a nucleic acid-detection probe-capture probe complex on the substrate; (C) ligating the end of the detection
  • the detection probe according to one embodiment of the present invention is a detection probe used for detecting a nucleic acid composed of a first portion and a second portion in a nucleic acid sample, and includes two probes that form complementary strands. A stem portion, a region between the two stem portions, and a loop portion labeled with a labeling substance, and a sequence capable of hybridizing with the second portion, and a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end It is characterized by providing.
  • the detection probe set in one embodiment of the present invention is a detection probe comprising a plurality of types of detection probes used for detecting a nucleic acid comprising a plurality of types of first and second portions in a nucleic acid sample.
  • the plurality of types of detection probes include two stem portions forming complementary strands, and a region between the two stem portions, each of which is labeled with a different type of labeling substance, , Comprising a sequence capable of hybridizing with the second part, and having a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end, wherein the label of the loop part is associated with the base sequence of the second part It is characterized by.
  • the method for detecting a nucleic acid in one embodiment of the present invention comprises: (A) a nucleic acid sample containing a nucleic acid comprising a first part and a second part; A detection probe that forms a stem-loop structure and includes a sequence that can hybridize with the second portion, and has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end and is labeled with a labeling substance, Contacting a capture probe with a capture probe comprising a sequence capable of hybridizing with the first portion; (B) hybridizing the second part to the detection probe, hybridizing the first part to the capture probe, and forming a nucleic acid-detection probe-capture probe complex on the substrate; (C) hybridizing the first part to the capture probe and ligating the end of the detection probe with the end of the nucleic acid and the capture probe; (D) detecting a labeling substance in the nucleic acid-detection probe-capture probe complex formed on the substrate; It is
  • the method for detecting a nucleic acid in one embodiment of the present invention comprises: (A ′) contacting a nucleic acid sample containing a nucleic acid comprising a first part and a second part with a substrate on which a capture probe containing a sequence capable of hybridizing with the first part is immobilized; (B ′) a detection probe that forms a stem-loop structure and includes a sequence that can hybridize with the second portion, has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end, and is labeled with a labeling substance, Contacting the substrate to hybridize the second portion to the detection probe, hybridizing the first portion to the capture probe, and forming a nucleic acid-detection probe-capture probe complex on the substrate When, (C) hybridizing the first portion to the capture probe and ligating the end of the detection probe with the end of the nucleic acid and the capture probe; (D) detecting a labeling substance in the nucleic acid-det
  • nucleic acids can be quantified with high accuracy.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a microchip in Example 5.
  • FIG. 6 is a fluorescence image of a detection probe fixed on a glass substrate in Example 5.
  • FIG. 6 is a fluorescence image of a capture probe or a detection probe fixed on a glass substrate in Example 5.
  • FIG. 6 is a fluorescence image of a capture probe or a detection probe fixed on a glass substrate in Example 5.
  • the nucleic acid to be detected is not particularly limited, but miRNA and short-chain RNA such as short-chain mRNA in which transcription is stopped in the middle are preferable, and there are many types of miRNA that are involved in the control of gene expression. More preferred.
  • the nucleic acid quantification method of the present embodiment includes: (A) a nucleic acid sample containing miRNA consisting of a first part and a second part; A detection probe that forms a stem-loop structure and includes a sequence that can hybridize with the second portion, and has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end and is labeled with a labeling substance, Contacting a capture probe having a capture probe comprising a sequence capable of hybridizing with the first portion; (B) hybridizing the second part to the detection probe, hybridizing the first part to the capture probe, and forming a miRNA-detection probe-capture probe complex on the substrate; (C) ligating the end of the detection probe with the end of the miRNA and the capture probe; (D) quantitatively detecting a labeling substance in the miRNA-detection probe-capture probe complex formed on the substrate, and quantifying miRNA in the nucleic acid sample from the detection result;
  • a detection probe that forms a
  • Step (a) includes a nucleic acid sample containing miRNA 3 composed of the first part 1 and the second part 2, and a sequence 5b that forms a stem-loop structure and can hybridize with the second part 2.
  • a capture probe 4 containing a sequence capable of hybridizing with the first portion 1 is immobilized on a solution containing a detection probe 5 having a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end and labeled with a labeling substance 5a.
  • This is a step of contacting the substrate 6.
  • the miRNA 3 to be detected is divided into a first part 1 and a second part 2. That is, miRNA3 consists of a first part and a second part.
  • the capture probe 4 and the detection probe 5 are capable of hybridizing to the first portion 1 and the second portion 2 of the miRNA 3, respectively. Therefore, the length of the first part 1 and the second part 2 is preferably 5 to 17 bases, and more preferably 7 to 15 bases from the viewpoint of the number of bases obtained by dividing the miRNA consisting of about 22 bases into two.
  • the lengths of the first part 1 and the second part 2 are as follows: (1) the Tm values of the first part 1 and the second part 2 are close to the optimum temperature (37 ° C.) of T4 DNA ligase; And (2) It is not limited to the said number of bases, if 2 points
  • the above two points are affected by the GC content of the first part 1 and the second part 2, the presence of nucleic acids similar to the target miRNA, and the like.
  • the 5 ′ portion of miRNA 3 is referred to as a first portion 1
  • the 3 ′ portion of miRNA 3 is referred to as a second portion 2.
  • “can hybridize” means that a part of the capture probe and the detection probe used in the present invention hybridizes to a target nucleic acid (target miRNA) under stringent conditions. This means that it does not hybridize to nucleic acid molecules other than nucleic acid (target miRNA).
  • stringent conditions include, for example, conditions described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the nucleic acid sample is not particularly limited as long as it is a sample containing nucleic acid.
  • a person who has been confirmed to develop cancer, Or obtained by extracting nucleic acid from samples of blood, lymph, spinal fluid, semen, saliva, urine, etc. of subjects such as those suspected of developing cancer or subjects undergoing cancer treatment It is preferable that Nucleic acid extraction from these samples can be performed by a conventional method such as using trisol, but it is preferable to use a method of extracting short-chain RNA.
  • miRNA concentrated by fractionation from total RNA extracted from a sample may be used as a nucleic acid sample.
  • a sample that has not been fractionated may be used as a nucleic acid sample.
  • the capture probe 4 includes a sequence capable of hybridizing with the first portion 1 of miRNA 3 in the 5 ′ end region. From the viewpoint of quantifying miRNA 3 with high accuracy, it is preferable that capture probe 4 does not contain a complementary sequence to second portion 2 of miRNA 3 so as not to hybridize with second portion 2 of miRNA 3. In order for the capture probe 4 fixed to the substrate 6 to hybridize with the miRNA 3, molecular freedom is required. Therefore, the capture probe 4 has a spacer 4 a at the 3 ′ end that binds to the substrate 6. It is preferable.
  • the length of the spacer 4a is not particularly limited, but is preferably 3 to 50 bases, more preferably 5 to 25 bases.
  • the base used for the spacer can be replaced with a linker such as PEG having the same length and softness.
  • the number of bases used for the spacer 4a may be 0 bases.
  • the length of the capture probe 4 is not particularly limited as long as it is a length necessary for functioning as a probe, but it is preferably 3 to 50 bases in consideration of the number of bases of the first portion 1 and the spacer 4a. 40 bases are more preferred.
  • the capture probe 4 may be DNA or RNA, and is not limited to natural and non-natural as long as it has the same function as DNA or RNA, but is not limited to natural, non-natural, PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), BNA (Bridged Nucleic Acid) or other artificial nucleic acid may be included.
  • the capture probe 4 has a high affinity with the target miRNA3, is not easily recognized by DNA-degrading enzymes and RNA-degrading enzymes, and can be a substrate for DNA ligases such as T4 DNA ligase.
  • it contains BNA.
  • the capture probe 4 is a label of a different type from the labeling substance that labels the detection probe 5. It is preferably labeled with a substance. Examples of the labeling substance for labeling the capture probe 4 are the same as those used for labeling the detection probe 5 described later.
  • Examples of the substrate 6 used for fixing the capture probe 4 include a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, and a metal substrate.
  • Examples of the method for fixing the capture probe 4 on the substrate 6 include a method for fixing the probe at a high density on the substrate using an optical lithography technique and a method for fixing the probe by spotting on a glass substrate or the like.
  • the capture probe 4 may be synthesized on the substrate 6.
  • a solid phase provided by modifying the capture probe 4 with a functional group such as an amino group, a formyl group, an SH group, or a succimidyl ester group.
  • a functional group such as an amino group, a formyl group, an SH group, or a succimidyl ester group.
  • a binding site and a solid phase binding site recognition site provided by surface-treating the substrate 6 with a silane coupling agent having an amino group, a formyl group, an epoxy group, a maleimide group, or the like, or a gold-thiol bond
  • Another method for fixing the capture probe by spotting is a method in which capture probes having cyanol groups are discharged onto a glass substrate, arranged, and covalently bonded by a silane coupling reaction.
  • the detection probe 5 includes a sequence 5b that can hybridize with the second portion 2 of the miRNA 3 in the 3 ′ terminal region. From the viewpoint of quantifying miRNA 3 with high accuracy, it is preferable that the detection probe 5 does not contain a sequence complementary to the first portion 1 of miRNA 3 so as not to hybridize with the first portion 1 of miRNA 3.
  • the detection probe 5 forms a stem loop structure.
  • a stem-loop structure in a single-stranded nucleic acid, when there are complementary sequences in two distant regions within the molecule, a complementary strand (stem structure) is formed by the interaction between the base pairs of the nucleic acid, The arrangement
  • regions says what forms a loop structure, and is also called a hairpin loop.
  • the detection probe 5 includes, from the 5 ′ end side, two stem portions 5c and 5d that form complementary strands, a loop portion 5e that is a region between the two stem portions 5c and 5d, and a second Sequence 5b which can hybridize with part 2 of That is, the detection probe 5 has a 3 ′ protruding end.
  • the detection probe has a protruding end, and whether the protruding end of the detection probe is a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end depends on whether the capture probe and the substrate are connected via the 5 ′ end of the capture probe. Depending on whether it is bound via the 3 'end.
  • the capture probe forms a complex with pre-miRNA (precursor of miRNA) containing the same base sequence region as miRNA, the detection probe has a protruding end, resulting in steric hindrance and detection probe-miRNA. -No capture probe complex is formed. Therefore, according to this embodiment, since pre-miRNA is not recognized but only target miRNA is recognized, target miRNA can be quantified with high accuracy.
  • the length of the stem portion in the detection probe 5 is determined by the balance with the length of the loop portion, and is not particularly limited as long as the detection probe 5 can stably form a stem-loop structure, but 3 to 50 bases are preferable. More preferred is 5 to 20 bases.
  • the length of the loop portion in the detection probe 5 is determined by the balance with the length of the stem portion, and is not particularly limited as long as the detection probe 5 can stably form a stem loop structure, but preferably 3 to 200 bases. More preferred is 5 to 100 bases.
  • the length of the detection probe 5 is not particularly limited as long as it can form a stem-loop structure and is necessary to function as a probe, but the number of bases of the second portion 2 and the base necessary for forming the stem-loop structure In consideration of the number, 14 to 200 bases are preferable, and 24 to 150 bases are more preferable.
  • the detection probe 5 may be DNA or RNA, and is not limited to natural and non-natural as long as it has the same function as DNA or RNA, but is not limited to PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), BNA (Bridged Nucleic). Acid) or other artificial nucleic acid may be included.
  • the detection probe 5 has a high affinity for a target miRNA, is not easily recognized by a DNA degrading enzyme or an RNA degrading enzyme, and can be a substrate for a DNA ligase such as T4 DNA ligase.
  • it contains BNA. It is preferable that at least one of the capture probe 4 and the detection probe 5 includes LNA or BNA, and it is more preferable that both the capture probe 4 and the detection probe 5 include LNA or BNA.
  • the ligation in the step (c) it is preferable to phosphorylate the 5 ′ end of the detection probe 5 using an enzyme such as T4 polynucleotide kinase.
  • the detection probe 5 is labeled with a labeling substance 5a.
  • the labeling substance 5a is preferably bound to the loop portion 5e.
  • the labeling substance include fluorescent dyes, fluorescent beads, quantum dots, biotin, antibodies, antigens, energy absorbing substances, radioisotopes, chemiluminescent substances, enzymes, and the like.
  • FAM fluorescein
  • JOE fluorescein isothiocyanate
  • TET tetrachlorofluorescein
  • HEX 5′-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite
  • Cy3 Cy5, Alexa568, Alexa647 and the like. Since only a very small amount of miRNA is present in total RNA, it is difficult to label miRNA with high efficiency without fractionation. On the other hand, in this embodiment, since a pre-labeled detection probe is used, miRNA can be quantified with high sensitivity.
  • the combination of the labeling substance that labels the capture probe 4 and the labeling substance that labels the detection probe 5 can cause FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). There may be no combination, or a combination in which FRET may occur. From the viewpoint that the FRET efficiency varies depending on the sequence or length of the target miRNA, a combination in which FRET cannot occur is preferable. Even when a combination of labeling substances that can cause FRET is used, for example, the end near the substrate of the capture probe is labeled with FAM, and the loop portion farthest from the substrate of the detection probe is labeled with Alexa647, etc. It can also be designed so that FRET does not occur.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • a combination that can cause FRET is preferable.
  • a fluorescent dye having an excitation wavelength of about 490 nm for example, FITC, rhodamine green, Alexa (registered trademark) fluor 488, Body P FL, etc.
  • a fluorescent dye having an excitation wavelength of about 540 nm for example, TAMRA, tetramethylrhodamine, Cy3
  • a combination of a fluorescent dye having an excitation wavelength near 540 nm and a fluorescent dye having an excitation wavelength near 630 nm for example, Cy5
  • the two probes, the capture probe and the detection probe recognize the first part and the second part of the target miRNA, respectively.
  • the miRNA is let-7a (5′-UGAGGUAGUAG G UUGUAUAGUUU-3 ′)
  • the first part of let-7a is 5′-UGAGGUAGUAG-3 ′
  • the second part is 5′- G
  • Capture probes and detection probes containing sequences that can be hybridized to UUGUAUAGUU-3 ′ are prepared.
  • the detection probe when the sequence capable of hybridizing with the second portion is 5′-AACTATACA C- 3 ′, let 1 in which the first base guanine in the second portion of let-7a is replaced with adenine.
  • -7f (5′-UGAGGUAGUAG A UUGUAUAGUUU-3 ′) cannot form a covalent bond by ligation with the detection probe.
  • a difference in one base in miRNA can be strictly identified, and the target miRNA can be quantified with high accuracy.
  • the solution preferably includes a plurality of types of detection probes that are labeled with different types of labeling substances. This is because the detection probe (let-7a) and detection probe (let-7f) that hybridize with the second part of let-7a and let-7f, respectively, are labeled with different labeling substances, and the respective signals are individually quantified. It is a method to do.
  • the labeling substance include a method of labeling both detection probes using Alexa532 or Alexa647, which are fluorescent substances having different wavelengths.
  • the nucleic acid sample contains a plurality of types of miRNAs to be detected, and the 5 ′ of the capture probe does not overlap each other so that the first parts of the plurality of types of miRNAs do not overlap each other. It is preferable to select which side of the end and the 3 ′ end is fixed to the substrate. This is a method of using, as a capture probe, a probe that hybridizes to a portion having a different sequence among similar miRNAs.
  • let-7a and let-7f as an example, 5′- G UUGUAUAGUUU-3 ′ and 5′- A UUGUAAUGUUU-3 ′ on the 3 ′ terminal side having different sequences are used as a first part, and 5 ′ 'Terminal 5'-UGAGGUAGUAG-3' is the second part.
  • a capture probe 4-detection probe 5-miRNA3 complex in which the 5 ′ end side of the complementary probe 4 is immobilized on the substrate can be formed. It becomes possible.
  • the detection probes 5 for let-7a and let-7f have the same sequence, and the labeled substances to be labeled are also the same.
  • the solution preferably includes a plurality of detection probes having different base lengths and a plurality of capture probes having different base lengths.
  • a probe for let-7a A complementary probe having a 14-base capture probe (5′-AACCACTACTCTCA-3 ′; C-probe-let7a-D8) and an 8-base detection probe (5′-AACTATAC-3 ′; D-probe-let7a-D8)
  • a 13-base capture probe (5′-ACCACTACTCTCA-3 ′; C-probe-let7b-D9) and a 9-base detection probe (5′-AACCACACA-3 ′); D-probe— let7b-D9) is prepared.
  • let-7a reacts only with an 8-base detection probe (D-probe-let7a-D8) to form a bipartite complex, and further hybridizes with a 14-base capture probe (C-probe-let7a-D8).
  • C-probe-let7a-D8 a 14-base capture probe
  • the binary complex of let-7a and D-probe-let7a-D8 can hybridize with 13-base C-probe-let7b-D9 (provided that the bases are aligned side by side). Since there is no Stacking effect that occurs, the affinity is low.) As shown in the upper right of FIG.
  • let-7a When ligation is not performed as described in Example 2 described later, the signal is 1 / 50,000, and thus the signal of let-7a does not appear on the spot where C-probe-let7b-D9 is fixed.
  • let-7b reacts only with a 9-base detection probe (D-probe-let7b-D9) to form a bipartite complex, and further hybridizes with 13-base C-probe-let7b-D9.
  • T4 DNA ligase To form a ternary complex that is covalently linked by T4 DNA ligase.
  • the bipartite complex of let-7b and D-probe-let7b-D9 can hybridize with 14-base C-probe-let7b-D9, but there is an extra 1 base as shown in the lower right of FIG. Therefore, it is not ligated.
  • Example 4 to be described later a signal is obtained when the capture probe and the detection probe are adjacent to each other as shown in the upper left of FIG. 7, but no signal is obtained when one base is insufficient as shown in the upper right of FIG. Have confirmed.
  • let-7a and D-probe-let7a-D8 are mixed with C-probe-let7a-D8 or C-probe-let7b-D9 as a capture probe for immobilization on the substrate. After the reaction, formation of a ternary complex was confirmed by acrylamide electrophoresis. As a result, it was confirmed that a triplet complex was formed only when mixed with C-probe-let7a-D8.
  • the present embodiment it is possible to strictly distinguish similar miRNAs and quantify target miRNAs with high accuracy.
  • a small amount of a target miRNA can be accurately quantified.
  • Examples of the liquid used for the solution containing the nucleic acid sample containing miRNA3 and the detection probe 5 include a buffer used for normal hybridization.
  • step (b) the second portion 2 is hybridized to the detection probe 5, the first portion 1 is hybridized to the capture probe 4, and the miRNA3-detection probe 5-capture probe 4 complex is formed on the substrate 6. It is a process of forming.
  • step (b) since miRNA tends to form a three-dimensional structure, it is preferable to incubate at 95 ° C. for about 5 minutes to thermally denature the miRNA so that it can easily hybridize with the probe.
  • Hybridization is not particularly limited, and can be performed under normal conditions such as temperature, pH, salt concentration, buffer solution, etc. in consideration of the Tm value of each probe. From the viewpoint of quantitative determination, it is preferable to carry out under stringent conditions. Examples of the stringent condition include a temperature condition of about 30 ° C. (a temperature condition higher by about 5 ° C. to 10 ° C. than the Tm of the probe sequence), a salt concentration condition of less than 1M, and the like.
  • Step (c) is a step of ligating the end of the detection probe 5 with the ends of the miRNA 3 and the capture probe 4.
  • the 5 ′ end of the detection probe 5 and the 3 ′ end of the miRNA 3 are ligated to form 3 of the detection probe 5.
  • the 'end and the 5' end of the capture probe 4 are ligated.
  • Ligation can prevent miRNA3 from being detected in plural in step (e).
  • the enzyme used for ligation is preferably a DNA ligase, such as T4 DNA ligase.
  • Step (b) and step (c) may be performed simultaneously. That is, hybridization and ligation may be performed simultaneously.
  • a detection probe having a 5 ′ protruding end is used, and the capture probe and the substrate are connected to the 5 ′ end of the capture probe.
  • the 3 ′ end of the detection probe and the 5 ′ end of the miRNA can be ligated, and the 5 ′ end of the detection probe and the 3 ′ end of the capture probe can be ligated.
  • the affinity between each probe and the target miRNA 3 is slightly reduced. (1) As described above, the substrate 6 and the capture probe 4 are separated from the spacer 4a. (2) Increasing the affinity between each probe and miRNA 3 by including LNA or BNA in the capture probe 4 and / or the detection probe 5 Thus, the affinity between each probe and the target miRNA 3 can be increased.
  • the washing method can be performed under normal conditions. From the viewpoint of quantifying miRNA with high accuracy, it is preferably carried out under stringent conditions. For example, a method of washing the substrate 6 several times by shaking in a solution having a low salt concentration can be mentioned.
  • Step (d) is a step of quantitatively detecting the labeling substance 5a in the miRNA3-detection probe 5-capture probe 4 complex formed on the substrate 6, and quantifying miRNA3 in the nucleic acid sample from the detection result.
  • the detection probe 5 since the detection probe 5 is labeled with the labeling substance 5a, the labeling substance 5a in the miRNA3-detection probe 5-capture probe 4 complex is quantitatively detected.
  • detection results can be used to quantify miRNA3 in the nucleic acid sample.
  • the method for detecting the labeling substance in step (d) is not particularly limited.
  • the detection method is usually performed when nucleic acid is detected, for example, by measuring the fluorescence intensity of the complex using a nucleic acid microarray automatic detection device. Can be used.
  • the miRNA quantification method of the present embodiment since a bridging probe that has been necessary in the past is unnecessary, the operation is simplified, and further, there is no need to label the miRNA itself with a labeling substance.
  • the target miRNA can be quantified.
  • a detection probe that forms a stem-loop structure since a detection probe that forms a stem-loop structure is used, a single base difference in the miRNA is accurately identified without recognizing pre-miRNA, and high accuracy is achieved.
  • the target miRNA can be quantified.
  • the detection probe of this embodiment is a detection probe 5 used for detecting a nucleic acid composed of a first portion and a second portion in a nucleic acid sample.
  • the detection probe 5 includes, from the 5 ′ end side, two stem portions 5c and 5d that form complementary strands, and a loop portion 5e that is a region between the two stem portions 5c and 5d and is labeled with a labeling substance.
  • the sequence 5b capable of hybridizing with the second portion. That is, the detection probe 5 has a 3 ′ protruding end.
  • the detection probe of this embodiment may have a 5 ′ protruding end.
  • the detection probe of the present embodiment has a sequence capable of hybridizing with the second portion on the 5 ′ end region side.
  • the label of the loop portion is preferably associated with the base sequence of the second portion.
  • the target nucleic acid of the detection probe 5 is preferably miRNA.
  • the detection probe 5 may be labeled with one labeling substance, or may be labeled with a plurality of labeling substances 5a1 and 5a2 as shown in FIG.
  • the labeling substances 5a1 and 5a2 may be the same substance or different substances.
  • the intensity of the labeling can be increased and the target miRNA can be detected with higher sensitivity.
  • different substances for example, by using the labeling substance in a combination in which FRET can occur, the presence or absence of the stem loop structure of the detection probe is confirmed using FRET as an index. be able to.
  • the detection probe set of this embodiment is a detection probe set composed of a plurality of types of detection probes used for detecting nucleic acids composed of a plurality of types of first and second portions in a nucleic acid sample.
  • the plurality of types of detection probes are obtained by labeling the loop portions with different types of labeling substances, and labeling the loop portions and the base sequence of the second portion. Are associated.
  • the target nucleic acid of the detection probe set of this embodiment is miRNA.
  • the sequence information (base sequence of the second part) of the target miRNA recognized by the detection probes constituting the detection probe set is associated with different types of labels. Each miRNA can be strictly identified.
  • the method for detecting a nucleic acid of the present embodiment includes: (A) a nucleic acid sample containing a nucleic acid comprising a first part and a second part; A detection probe that forms a stem-loop structure and includes a sequence that can hybridize with the second portion, and has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end and is labeled with a labeling substance, Contacting a capture probe having a capture probe comprising a sequence capable of hybridizing with the first portion; (B) hybridizing the second part to the detection probe, hybridizing the first part to the capture probe, and forming a nucleic acid-detection probe-capture probe complex on the substrate; (C) hybridizing the first part to the capture probe and ligating the end of the detection probe with the end of the nucleic acid and the capture probe; (D) detecting a labeling substance in the nucleic acid-detection probe-
  • the method for detecting a nucleic acid of the present embodiment includes: (A ′) contacting a nucleic acid sample containing a nucleic acid comprising a first part and a second part with a substrate on which a capture probe containing a sequence capable of hybridizing with the first part is immobilized; (B ′) a detection probe that forms a stem-loop structure and includes a sequence that can hybridize with the second portion, has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end, and is labeled with a labeling substance, Contacting the substrate to hybridize the second portion to the detection probe, hybridizing the first portion to the capture probe, and forming a nucleic acid-detection probe-capture probe complex on the substrate When, (C) hybridizing the first part to the capture probe and ligating the end of the detection probe with the end of the nucleic acid and the capture probe; (D) detecting a labeling substance in the nucle
  • the miRNA detection method of the present embodiment since a bridging probe, which has been conventionally required, is unnecessary, the operation is simplified, and further, there is no need to label the miRNA itself with a labeling substance. Target miRNA can be detected.
  • Target miRNA As the target miRNA, RNA having the miR-141 sequence was synthesized. In addition, two types of nucleic acid probes, a capture probe and a detection probe having a complementary sequence thereto, were designed and synthesized. The sequences of the target miRNA, capture probe, and detection probe used are shown below.
  • Target miRNA miR-141 [Sequence: 5′-UAACACUGUGUGGUAAAAUGUG-3 ′] (SEQ ID NO: 22mer)
  • Capture probe 1 (Capture probe 1) [Sequence: 5′-p-X1-fS-3 ′]
  • X1 represents the following sequence, p represents phosphoric acid, S represents a thiol group, and f represents 6-FAM (6-fluorocein).
  • X1 ACCAGACAGGTTATACAACAACAACAACAACAACAACA (SEQ ID NO: 35 mer)
  • Detect probe 1 [Sequence: 5′-p-X2-Al-X3-3 ′]
  • X2 and X3 represent the following sequences, p represents phosphoric acid, and Al represents Alexa647-AminoC6-dA.
  • the composition of 20 ⁇ SSC buffer is 3M NaCl, 0.3M sodium citrate.
  • the hybridization reaction solution was incubated at 95 ° C. for 5 minutes, then returned to room temperature, and T4 DNA ligase was added thereto so that the final concentration was 5 units / ⁇ l. Next, this hybridization reaction solution was sealed in contact with the microarray substrate, and hybridized at 30 ° C. for 2 hours while shaking on a shaker at a speed of 1000 rpm.
  • the microarray substrate was washed by shaking in 0.2 ⁇ SSC buffer (30 mM NaCl, 3 mM sodium citrate) for 10 minutes, and this washing operation was repeated twice. Subsequently, the substrate was dried, observed with a fluorescence microscope, and the fluorescence intensity was measured. The results are shown in FIG. In each spot where the probe was immobilized, a fluorescence image of the detection probe labeled with Alexa 647 was observed, and linearity was confirmed in the range of 0.5 fmol to 50 fmol of miR-141 molecules used in the hybridization reaction. From this, it was confirmed that the fluorescence intensity of the entire spot increased depending on the miRNA concentration.
  • Target miRNA As another type of target miRNA, RNA having the sequence of miR-143 was synthesized. In addition, two types of nucleic acid probes, a capture probe and a detection probe having a complementary sequence thereto, were designed and synthesized. The sequences of the target miRNA, capture probe, and detection probe used are shown below.
  • Target miRNA miR-143 [Sequence: 5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGUCUC-3 ′] (SEQ ID NO: 5: 21mer)
  • Capture probe 2 (Capture probe 1) [Sequence: 5′-p-X4-fS-3 ′]
  • X4 represents the following sequence, p represents phosphoric acid, S represents a thiol group, and f represents 6-FAM (6-fluorocein).
  • X4 GTGCTTCATCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACA (SEQ ID NO: 6: 34mer)
  • Detection probe 2 (Detect probe 1) [Sequence: 5′-p-X5-Al-X6-3 ′]
  • X5 and X6 represent the following sequences, p represents phosphoric acid, and Al represents Alexa647-AminoC6-dA.
  • X5 CTCAACTGGGTGTGTGG (SEQ ID NO: 7: 17mer)
  • X6 GTCGGCCAATTCAGTTGAGGAGCTACCA (SEQ ID NO: 8: 26mer)
  • a microarray was prepared by the same method as in Example 1, hybridization was performed, and the fluorescence intensity of the entire spot on the substrate was measured.
  • Example 2 In Example 2, except that T4 DNA ligase was not added, a microarray was prepared and hybridized by the same method as in Example 2, and the fluorescence intensity of the entire spot on the substrate was measured.
  • Example 2 The results of Example 2 and Comparative Example 1 are shown in FIG.
  • Example 2 linearity was confirmed in the range of the number of molecules of miR-143 used in the hybridization reaction from 0.03 fmol to 10 fmol.
  • Target miRNA miR-141 [Sequence: 5′-UAACACUGUGUGGUAAAAUGUG-3 ′] (SEQ ID NO: 22mer)
  • Target miRNA miR-200a [Sequence: 5′-UAACACUGUCUGGUAA C GAUG U ⁇ 3 ′] (SEQ ID NO: 9: 22mer)
  • Capture probe 1 (Capture probe 1) [Sequence: 5′-p-X1-fS-3 ′]
  • X1 represents the following sequence, p represents phosphoric acid, S represents a thiol group, and f represents 6-FAM (6-fluorocein).
  • X1 ACCAGACAGGTTATACAACAACAACAACAACAACAACA (SEQ ID NO: 35 mer)
  • Detect probe 1 [Sequence: 5′-p-X2-Al-X3-3 ′]
  • X2 and X3 represent the following sequences, p represents phosphoric acid, and Al represents Alexa647-AminoC6-dA.
  • Detection probe 3 [Sequence: 5′-p-X2-Al-X7-3 ′]
  • X2 and X3 represent the following sequences, p represents phosphoric acid, and Al represents Alexa532-AminoC6-dA.
  • a microarray was produced in the same manner as in Example 1. Furthermore, hybridization reaction solutions containing miR-141 or miR-200a, detection probe 1 and detection probe 3 were prepared as shown in Table 3.
  • Hybridization was performed in the same manner as in Example 1, and the fluorescence intensity of the entire spot on the substrate was measured. The results are shown in Table 4.
  • fluorescence images of the detection probe labeled with Alexa647 or Alexa532 were observed, and miR-141 and miR-200a were quantified from the fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity of a detection probe having a sequence completely complementary to the target miRNA is 100%, the fluorescence intensity is 1% or less in the presence of miRNA having a sequence different by 2 bases, and the detection probe has high specificity. It was confirmed that
  • Target miRNA As the target miRNA, RNA having the let-7a sequence was synthesized. In addition, a total of three types of nucleic acid probes having two types of capture probes and detection probes having a complementary sequence but different lengths were designed and synthesized. The sequences of the target miRNA, capture probe, and detection probe used are shown below.
  • Target miRNA let-7a [Sequence: 5′-UGAGGUAGUAGGUUGAUAUGUUU-3 ′] (SEQ ID NO: 11: 22mer)
  • Capture probe 4 (Capture probe 4) [Sequence: 5′-p-X10-fS-3 ′]
  • X10 represents the following sequence
  • p represents phosphoric acid
  • S represents a thiol group
  • f represents 6-FAM (6-fluorocein).
  • X10 ACCACTACTCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACA (SEQ ID NO: 13: 34mer)
  • Detect probe 4 [Sequence: 5′-p-X11-Al-X12-3 ′]
  • X11 and X12 represent the following sequences, p represents phosphoric acid, and Al represents Alexa647-AminoC6-dA.
  • X12: GTCGGCCAATTCAGTTGAGAACTATAC SEQ ID NO: 15: 26mer
  • the hybridization reaction solution was incubated at 95 ° C. for 5 minutes, then returned to room temperature, and T4 DNA ligase was added thereto so that the final concentration was 5 units / ⁇ l. Next, this hybridization reaction solution was hybridized at 30 ° C. for 2 hours.
  • urea-denaturing acrylamide gel electrophoresis was performed to confirm the formation of a ternary complex consisting of a capture probe-detection probe 4-let-7a.
  • the results are shown in FIG.
  • the gel after electrophoresis was photographed using the fluorescence of Alexa 647 bound to the detection probe 4 as an index, a band of a triplet complex was seen at a position of about 130 bases long when the capture probe 3 was included.
  • the capture probe 4 was included, no signal was output, indicating that the formation of the ternary complex can be controlled by changing the base length of the capture probe. That is, when the capture probes 3 and 4 are fixed to different regions on the substrate, the signals of let-7a and let-7b are detected in different regions.
  • similar miRNA groups can be specifically quantified.
  • Example 5 The microchip shown in FIG. 9 was produced by PDMS (Polydimethylsiloxane), and the reagent of Example 1 was used to try to quantify miRNA on the microchip.
  • Each flow path has a width of 200 ⁇ m and a height of 20 ⁇ m, and two solution inlets are arranged, each of which is separated by a valve that opens and closes by gas pressure. Six sets of such flow channel sets are arranged in parallel on a 30 mm square glass substrate.
  • a capture probe fixing flow path (PDMS flow path surrounded by a broken-line square) was attached to a glass substrate, and a FAM-labeled capture probe solution was introduced from one inlet and fixed on the glass substrate. Thereafter, washing was performed and the flow path was removed. As a result, as shown in FIG. 10, the detection probe could be fixed linearly.
  • the hybridization channel is bonded to the glass substrate from which the capture probe fixing channel has been removed, and the sample solution (25 nM-miR-) is closed while closing the cleaning solution channel valve with “nitrogen gas B”.
  • 141 100 nM Alexa647-labeled detection probe, 4T4 DNA ligase and the like were introduced from a “sample solution inlet” with a syringe pump (flow rate: 0.8 ⁇ l / min, 10 minutes).
  • the valve was switched and the washing solution was allowed to flow, and the amount of Alexa647-labeled detection probe bound to the region where the capture probe was immobilized was measured.
  • the results are shown in FIG. In the intersection with the capture probe fixed to the broken line portion shown in the left diagram of FIG. 11, the miRNA and the detection probe that have flowed through the broken line portion shown in the right diagram of FIG. It was confirmed that the miRNA quantification method was applicable.
  • nucleic acids can be quantified simply, with high accuracy and with high sensitivity.
  • nucleic acid quantification method capable of quantifying nucleic acids with high accuracy and high sensitivity, and a detection probe and a detection probe set used in the nucleic acid quantification method.

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Abstract

（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５'突出末端又は３'突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、（ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を定量的に検出し、検出結果から前記核酸試料中の核酸を定量する工程と、を有することを特徴とする核酸の定量方法。

Description

核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法
本発明は、核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法に関する。
　従来、細胞内の遺伝子発現量を測定する手段としてｍＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイが広く用いられている。２１世紀に入って、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。このような知見に基づき、ｍｉＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイの開発競争が繰り広げられている。
更に、２００８年にｍｉＲＮＡが血液中を循環していることが発見されたことにより（非特許文献１参照）、血液検査するだけでがんの診断ができる可能性が示され、ｍｉＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイ市場が近い将来急拡大するものと見込まれている。
一方、ｃＤＮＡへの逆転写反応を利用した定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）法もｍｉＲＮＡを定量する技術として広く実用化されている。定量ＰＣＲ法は、逆転写酵素を用いてｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、該ｃＤＮＡを増幅することにより、鋳型となったｍｉＲＮＡ量を見積もる方法である。定量ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応を用いて一定量まで増幅したｃＤＮＡ量を測定する方法であるため、ＤＮＡマイクロアレイに比べて定量性が高い一方で、複数のサンプルや多種のｍｉＲＮＡに対する並列処理が難しいという問題点がある。
ｍｉＲＮＡをターゲットとした既存のＤＮＡマイクロアレイ（以下、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイという。）は、目的となるｍｉＲＮＡに相補的にハイブリダイズする遺伝子配列を持つ核酸プローブを透明基板上に並べたものである。
ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイを用いたｍｉＲＮＡの定量方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、生体サンプルからｍｉＲＮＡを抽出し、該ｍｉＲＮＡを蛍光標識した後に、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに添加し、基板上の核酸プローブにハイブリダイズさせる。次いで、基板に非特異的に吸着したｍｉＲＮＡを洗浄した後、蛍光強度を指標にｍｉＲＮＡ量を見積もる。
生体サンプルからｍｉＲＮＡを調製する際には、生体サンプルから全ＲＮＡを抽出・精製し、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを蛍光標識した後に、蛍光標識ｍｉＲＮＡを含む蛍光標識全ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに接触させる。
しかし、生体内、特に血液中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ないため、このような前処理の過程が複雑な場合、ｍｉＲＮＡは、ピペット操作の途中で吸着や分解の影響を受けやすい。さらに、測定ごとの蛍光標識率の変動が測定結果の再現性を低くしてしまうという問題点も持ち合わせている。
また、このような手作業による前処理は、研究者や臨床検査技師の技術差によって影響を受けるため、将来的にはμ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて、全ての前処理工程をチップ上で行えるように全自動化されることが望まれている。ここで、μ－ＴＡＳとは、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いて、チップ上に微小な流路や反応室、混合室を設け、一つのチップ上で生体分子を分析するマイクロ流体デバイスを意味する。
しかしながら、以下のように蛍光標識法がボトルネックとなり、全自動化への組み込みが進んでいない。
ｍｉＲＮＡの主な蛍光標識法として、ｍｉＲＮＡの塩基部分に直接蛍光標識する方法や、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどの酵素を用いてｍｉＲＮＡの３’末端に蛍光標識したヌクレオチドを付加する方法が挙げられる。
しかし、これらの方法では全ての核酸が非特異的に蛍光標識されるため、基板上の核酸プローブにハイブリダイゼーションさせる前に、予め蛍光標識された標的ｍｉＲＮＡから未反応の蛍光試薬等を取り除く必要がある。これらの分離にはゲルろ過クロマトグラフィーを用いるのが一般的であり、約２２塩基と短いｍｉＲＮＡを、未反応の蛍光試薬から精度良く分離する必要がある。例えば、μ－ＴＡＳを用いて分離する場合には、生体サンプルを、樹脂の詰まった領域を長距離移動させる工程が必要であり、スペースの限られたチップ内でかかる工程を行うのは極めて難しい。また、例え可能であっても、連続して実験を繰り返すためには、未反応の蛍光試薬を洗い流すために長時間の洗浄が必要であり、現実的ではない。
上記の問題点に対し、未反応の蛍光色素の分離過程を省いてｍｉＲＮＡを検出できるサンドイッチ型マイクロアレイ法が考案されている（特許文献１参照。）。
係るサンドイッチ型マイクロアレイ法の第１の方法として、具体的には、以下の工程が挙げられる。先ず、第１の部分１００及び第２の部分１０１からなる各ｍｉＲＮＡ１０３に相補的な配列を有する核酸プローブを二分割し、捕捉プローブ１０４（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ）と検出プローブ１０５（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ）とする。そして、各ｍｉＲＮＡ１０３の第１の部分１００に相補的な配列を有する捕捉プローブ１０４群を基板１０６上に配列させてマイクロアレイを作製する（図５参照）。
次いで、各ｍｉＲＮＡ１０３を、作製したマイクロアレイ基板（基板１０６）に接触させた後、各ｍｉＲＮＡ１０３の第２の部分１０１に相補的な配列を有する検出プローブ１０５群を含む溶液をマイクロアレイ基板（基板１０６）に接触させることで、ｍｉＲＮＡ１０３、捕捉プローブ１０４、検出プローブ１０５の３者をハイブリダイゼーションさせる（図５参照）。検出プローブ１０５は、ｍｉＲＮＡ１０３の第２の部分１０１を認識して結合するため、捕捉プローブ１０４への非特異的な結合は起こらず、未反応の検出プローブ１０４をクロマトクラフィーなどで分離する必要がない。
しかしながら、特許文献１に記載の第１の方法では、ｍｉＲＮＡ１０３に相補的な配列を有する核酸プローブを２つに分割することにより、１つのプローブ上のｍｉＲＮＡ１０３に相補的な配列はそれぞれ１０塩基程度となる。その結果、ｍｉＲＮＡ１０３と核酸プローブとの親和性が減少し、血液中に極微量しか存在しないｍｉＲＮＡ１０３を正確に定量することが難しい。
また、生体サンプル中には約７０塩基のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）が含まれている。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは約２２塩基のｍｉＲＮＡの配列を含んでいるため、特許文献１の第１の方法では両者を区別できず、遺伝子発現制御機能を有するｍｉＲＮＡのみを正確に定量できないという根本的な問題を抱えている。
この解決策として特許文献１に記載の第２の方法では、更に、リガーゼを用いてｍｉＲＮＡ１０３と核酸プローブを共有結合させる方法が提案されている（図６参照）。しかしながら、図５に示される第１の方法において、リガーゼを用いた場合、ｍｉＲＮＡ１０３とハイブリダイズした検出プローブ１０５と捕捉プローブ１０４が共有結合した後、ｍｉＲＮＡ１０３が解離して他の捕捉プローブ１０４に結合することにより、同一分子のｍｉＲＮＡ１０３が複数回に亘って検出される危険がある。
一方、図６に示される第２の方法においては、さらに２種類の橋渡し用プローブ１０７，１０８（ｃ－ｂｒｉｄｇｅ１０７, ｄ－ｂｒｉｄｇｅ１０８）を使用することで、捕捉プローブ１０４とｍｉＲＮＡ１０３と検出プローブ１０９とをライゲーションにより共有結合させ、基板１０６上に捕捉されたｍｉＲＮＡ１０３が基板１０６から解離することを防いでいる。
国際公開第２００８／０５２７７４号
Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第１０５巻、第１０５１３～１０５１８頁、２００８年
しかしながら、例えば、特許文献１に記載の第２の方法では、ｍｉＲＮＡ１０３と４種類のプローブが全て衝突して５種類の分子が複合体を形成した場合のみシグナルが検出されるため、定量性が悪くなるという問題を抱えており、操作も煩雑で時間を要する。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便で、高精度かつ高感度に、核酸を定量することができる核酸の定量方法、並びに、該核酸の定量方法に用いられる検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、ステムループ構造を形成する検出プローブを用いることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）～（５）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸の定量方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
（ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を定量的に検出し、検出結果から前記核酸試料中の核酸を定量する工程と、
を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における検出プローブは、核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、相補鎖を形成する２つのステム部と、前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における検出プローブセットは、核酸試料中の複数種類の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる複数種類の検出プローブからなる検出プローブセットであって、前記複数種類の検出プローブは、相補鎖を形成する２つのステム部と、前記２つのステム部間の領域であり、それぞれ、異なる種類の標識物質により標識されているループ部と、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、５’突出末端又は３’突出末端と、を備え、前記ループ部の標識と前記第２の部分の塩基配列が対応づけられていることを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
（ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ’）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料を、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
（ｂ’）ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブを、前記基板に接触させて前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
（ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
本発明によれば、高精度に、核酸を定量することができる。
本実施形態における核酸の定量方法の一態様の模式図である。 本実施形態における検出プローブの一態様の模式図である。 実施例１におけるｍｉＲＮＡの定量結果である。 実施例２におけるｍｉＲＮＡの定量結果である。 従来の核酸の定量方法の一態様の模式図である。 従来の核酸の定量方法の一態様の模式図である。 本実施形態における核酸の定量方法の一態様の模式図である。 実施例４における電気泳動の結果である。 実施例５におけるマイクロチップの模式図である。 実施例５におけるガラス基板上に固定した検出プローブの蛍光像である。 実施例５におけるガラス基板上に固定した捕捉プローブ又は検出プローブの蛍光像である。
≪核酸の定量方法≫
検出対象の核酸としては、特に限定されないが、ｍｉＲＮＡや転写が途中で止まった短鎖ｍＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡが好ましく、生体内に多種類存在し、遺伝子発現の制御に関与しているｍｉＲＮＡがより好ましい。
一例として、本実施形態の核酸の定量方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなるｍｉＲＮＡを含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記検出プローブの末端と、前記ｍｉＲＮＡ及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
（ｄ）前記基板上に形成された前記ｍｉＲＮＡ－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を定量的に検出し、検出結果から前記核酸試料中のｍｉＲＮＡを定量する工程と、
を有する。
以下、図１を参照しながら、本実施形態における各工程について説明する。
工程（ａ）は、第１の部分１及び第２の部分２からなるｍｉＲＮＡ３を含有する核酸試料と、ステムループ構造を形成し、前記第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂを含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質５ａにより標識されている検出プローブ５と、を含む溶液を、第１の部分１とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ４が固定された基板６に接触させる工程である。
図１に示すように、検出対象のｍｉＲＮＡ３を、第１の部分１及び第２の部分２に２分割する。即ち、ｍｉＲＮＡ３は、第１の部分及び第２の部分からなる。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５は、それぞれ、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１及び第２の部分２にハイブリダイズし得るものである。そのため、第１の部分１及び第２の部分２の長さは、５～１７塩基が好ましく、約２２塩基からなるｍｉＲＮＡを２分割した塩基数という観点から、７～１５塩基がより好ましい。
これら第１の部分１及び第２の部分２の長さは、（１）第１の部分１及び第２の部分２のＴｍ値がＴ４ＤＮＡリガーゼの至適温度（３７℃）付近であること、及び（２）配列特異性が保たれること、の２点が担保されていれば上記塩基数に限定されない。上記２点は、第１の部分１及び第２の部分２のＧＣ含有量や標的ｍｉＲＮＡに類似の核酸の存在などによって影響される。
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ３の５’側の部分を第１の部分１とし、ｍｉＲＮＡ３の３’側の部分を第２の部分２とする。
尚、本発明及び本願明細書において「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられる捕捉プローブ及び検出プローブの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。
　核酸試料は、核酸を含有する試料であれば、特に限定されないが、例えば、本実施形態の核酸の定量方法をがんの診断に用いる場合には、がんの発症が確認されている者、若しくはがんの発症が疑われている者、又はがん治療を受けている患者等の被験者の血液、リンパ液、髄液、***、唾液、尿等のサンプルから核酸を抽出することにより得られるものであることが好ましい。これらのサンプルからの核酸抽出は、トリゾルを用いる等、定法により行うことができるが、短鎖ＲＮＡを抽出する方法を利用することが好ましい。
上述したように、血液中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ないため、サンプルから抽出された全ＲＮＡから分画により濃縮したｍｉＲＮＡを核酸試料として用いてもよいが、本実施形態においては、検出対象のｍｉＲＮＡ自体を標識物質で標識する必要が無いため、分画操作をしていないものを核酸試料といて用いてもよい。
捕捉プローブ４は、５’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１とハイブリダイズし得る配列を含む。
ｍｉＲＮＡ３を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ４は、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２に相補的な配列を含まないことが好ましい。
基板６に固定された捕捉プローブ４が、ｍｉＲＮＡ３とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ４は、基板６と結合する３’末端にスペーサー４ａを有していることが好ましい。スペーサー４ａの長さとしては、特に限定されないが、３～５０塩基が好ましく、５～２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
捕捉プローブ４の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第１の部分１及びスペーサー４ａの塩基数を勘案し、３～５０塩基が好ましく、５～４０塩基がより好ましい。
捕捉プローブ４は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡ３との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、捕捉プローブ４は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
　工程（ｃ）におけるライゲーションに際し、本実施形態においては、捕捉プローブ４の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化しておくことが好ましい。
　また、工程（ｄ）において、基板６上に形成されたｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５－捕捉プローブ４複合体を定量するに際し、捕捉プローブ４は、検出プローブ５を標識する標識物質とは異なる種類の標識物質で標識されていることが好ましい。捕捉プローブ４を標識する標識物質としては、後述する検出プローブ５の標識に用いられるものと同様のものが挙げられる。
捕捉プローブ４を固定するために用いられる基板６としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。捕捉プローブ４を基板６上に固定する方法としては、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法が挙げられる。
光リソグラフ技術を利用する場合には、基板６上で捕捉プローブ４を合成してもよい。スポッティングにより捕捉プローブ４を固定する場合には、捕捉プローブ４に固相結合部位を設け、基板６に固相結合部位認識部位を設けておくことが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、捕捉プローブ４をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、スクシミジルエステル基等の官能基で修飾して設けられた固相結合部位と、基板６をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等を有するシランカップリング剤で表面処理して設けられた固相結合部位認識部位との組み合わせや、金-チオール結合を利用した組合せが挙げられる。
また、スポッティングにより捕捉プローブを固定する他の方法として、シアノール基を有する捕捉プローブを、ガラス基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法も挙げられる。
本実施形態において、検出プローブ５は、３’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３の第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂを含む。
ｍｉＲＮＡ３を高精度に定量する観点から、検出プローブ５は、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３の第１の部分１に相補的な配列を含まないことが好ましい。
検出プローブ５は、ステムループ構造を形成する。ステムループ構造とは、一本鎖核酸において、分子内で離れた２箇所の領域に相補的な配列がある場合、核酸の塩基対間の相互作用によって相補鎖（ステム構造）を形成するとともに、その２箇所の領域に狭まれた配列がループ構造を形成するものをいい、ヘアピンループとも称される。
本実施形態において、検出プローブ５は、５’末端側から、相補鎖を形成する２つのステム部５ｃ，５ｄと、該２つのステム部５ｃ，５ｄ間の領域であるループ部５ｅと、第２の部分２とハイブリダイズし得る配列５ｂとからなる。即ち、検出プローブ５は、３’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、５’突出末端であるか３’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの５’末端を介して結合しているか３’末端を介して結合しているかによる。
　仮に、捕捉プローブが、ｍｉＲＮＡと同じ塩基配列領域を含むｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）と複合体を形成したとしても、検出プローブが突出末端を有するため、立体障害が生じ、検出プローブ－ｍｉＲＮＡ－捕捉プローブ複合体が形成されない。従って、本実施形態によれば、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは認識されず、標的ｍｉＲＮＡのみを認識するため、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
検出プローブ５におけるステム部の長さは、ループ部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３～５０塩基が好ましく、５～２０塩基がより好ましい。
検出プローブ５におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３～２００塩基が好ましく、５～１００塩基がより好ましい。
検出プローブ５の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第２の部分２の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、１４～２００塩基が好ましく、２４～１５０塩基がより好ましい。
検出プローブ５は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、検出プローブ５は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５の少なくともいずれか一方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ４及び検出プローブ５の両方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
　工程（ｃ）におけるライゲーションに際し、検出プローブ５の５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化しておくことが好ましい。
検出プローブ５は、標識物質５ａにより標識されている。後述するｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５－捕捉プローブ４複合体を形成する際の立体障害の観点から、標識物質５ａは、ループ部５ｅに結合していることが好ましい。
標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’ ,７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、分画せずにｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、ｍｉＲＮＡを定量することができる。
捕捉プローブ４が標識物質により標識されている場合、捕捉プローブ４を標識する標識物質と検出プローブ５を標識する標識物質との組合せは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　 Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こり得ないくみあわせであっても、ＦＲＥＴが起こり得る組合せでもあってもよい。
標的ｍｉＲＮＡの有する配列や長さによって、ＦＲＥＴ効率が異なるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得ない組合せが好ましい。ＦＲＥＴが起こり得る標識物質の組合せを用いる場合であっても、例えば、捕捉プローブの基板に近い末端をＦＡＭで標識し、検出プローブの基板から最も遠いループ部分をＡｌｅｘａ６４７で標識する等、両者間でＦＲＥＴが起きないように設計することもできる。
また、検出プローブが捕捉プローブに連結された場合と基板に吸着した場合とを区別することができるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せが好ましい。
ＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せとしては、励起波長が４９０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ（登録商標）ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｂｏｄｙ Ｐ ＦＬ等）と励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３）、または、励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素と励起波長が６３０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５等）の組み合わせが好ましい。
また、本実施形態においては、捕捉プローブ及び検出プローブの２つのプローブが、標的ｍｉＲＮＡの第１の部分及び第２の部分をそれぞれ認識する。例えば、ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ－７ａ（５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’）である場合、ｌｅｔ－７ａの第１の部分を５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧ－３’とし、第２の部分を５’－ ＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’とし、それぞれにハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ及び検出プローブを作製する。ここで、検出プローブにおいて、第２の部分とハイブリダイズし得る配列を、５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣ－３’とすると、ｌｅｔ－７ａの第２の部分の１塩基目のグアニンがアデニンに代わったｌｅｔ－７ｆ（５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’）は、検出プローブとライーゲーションによる共有結合を形成することができない。
このように、本実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ中の１塩基の違いも厳密に識別し、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
ここで、ｌｅｔ－７ａとｌｅｔ－７ｆの第１の部分の配列が全く同じであるため、それぞれ並列的に定量する場合、両者はマイクロアレイ上の同一の捕捉プローブ４にハイブリダイズし、それぞれがｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５－捕捉プローブ４複合体を形成する。従って、当該領域では両ｍｉＲＮＡが合算されたシグナルが検出され、誤った結果を導く場合がある。これは、例えば特許文献１において、致命的な問題である。
本発明者らは、以下の３点によりこの問題を解決できることを見出した。
第１に、前記工程（ａ）において、前記溶液は、異なる種類の標識物質により標識されている複数種類の検出プローブを含むことが好ましい。
これは、ｌｅｔ－７ａとｌｅｔ－７ｆの第２の部分とそれぞれハイブリダイズする検出プローブ（ｌｅｔ－７ａ）と検出プローブ（ｌｅｔ－７ｆ）を異なる標識物質により標識し、それぞれのシグナルを個別に定量する方法である。標識物質として、例えば波長の異なる蛍光物質であるＡｌｅｘａ５３２又はＡｌｅｘａ６４７を用いて、両検出プローブを標識する方法が挙げられる。
第２に、前記工程（ａ）において、前記核酸試料は、検出対象の複数種類のｍｉＲＮＡを含有し、前記複数種類のｍｉＲＮＡの第１の部分がそれぞれ重複しないように、前記捕捉プローブの５’末端と３’末端のうち、どちら側が基板に固定されるかを選択されることが好ましい。
これは、類似ｍｉＲＮＡのうち、配列の異なる部分にハイブリダイズするプローブを捕捉プローブとして用いる方法である。ｌｅｔ－７ａおよびｌｅｔ－７ｆを例にすると、配列の異なる３’末端側の５’－ＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’及び５’－ＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’を第１の部分とし、共通の配列である５’末端側の５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧ－３’を第２の部分とする。図１に記載の５’末端と３’末端の配置を反転させることで、補足プローブ４の５’末端側を基板上に固定した捕捉プローブ４－検出プローブ５－ｍｉＲＮＡ３複合体を形成させることが可能になる。この場合、ｌｅｔ－７ａ及びｌｅｔ－７ｆに対する検出プローブ５は同一の配列であり、標識される標識物質も同一となる。
また、第３に、前記工程（ａ）において、前記溶液は、塩基長の異なる複数の検出プローブと、塩基長の異なる複数の捕捉プローブを含むことが好ましい。例えば、標的対象の２種類のｍｉＲＮＡがｌｅｔ－７ａ（５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’）及びｌｅｔ－７ｂ（５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ－３’）である場合、ｌｅｔ－７ａ用のプローブとして、相補鎖が１４塩基の捕捉プローブ（５’－ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ－３’； Ｃ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８）と８塩基の検出プローブ（５’－ＡＡＣＴＡＴＡＣ－３’；Ｄ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８）を用意し、ｌｅｔ－７ｂ用プローブとして１３塩基の捕捉プローブ（５’－ＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ－３’； Ｃ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９）と９塩基の検出プローブ（５’－ＡＡＣＣＡＣＡＣＡ－３’ ； Ｄ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９）を用意する。
ｌｅｔ－７ａは８塩基の検出プローブ（Ｄ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８）のみと反応して２者複合体を形成し、さらに１４塩基の捕捉プローブ（Ｃ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８）とハイブリダイゼーションして３者複合体を形成し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅにより共有結合される。
一方、ｌｅｔ－７aとＤ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８の２者複合体は、１３塩基のＣ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９とハイブリダイゼーションすることが可能だが（但し、塩基同士が横に並んだ場合に起こるＳｔａｃｋｉｎｇ効果がないので親和性は低い）、図７右上のように１塩基分ニックが入るため、ライゲーションされない。後述する実施例２で述べるようにライゲーションされない場合、シグナルが５万分の１になるため、ｌｅｔ－７ａのシグナルはＣ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９が固定されたスポット上には表れない。
その逆に、ｌｅｔ－７ｂは９塩基の検出プローブ（Ｄ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９）のみと反応して２者複合体を形成し、さらに１３塩基のＣ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９とハイブリダイゼーションして３者複合体を形成し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅにより共有結合される。
一方、ｌｅｔ－７ｂとＤ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９の２者複合体は、１４塩基のＣ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９とハイブリダイゼーションすることが可能だが、図７右下のように１塩基分余るため、ライゲーションされない。
後述する実施例４では、図７左上のように捕捉プローブと検出プローブが隣り合う場合にはシグナルが得られるが、図７右上のように１塩基不足する場合にはシグナルが全く得られなくなることを確認している。具体的には、ｌｅｔ－７ａとＤ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８に対して、基板に固定するための捕捉プローブとしてＣ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８またはＣ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ｂ－Ｄ９を混合し、溶液中で反応させたのち、アクリルアミド電気泳動により３者複合体の形成を確認した。その結果、Ｃ－ｐｒｏｂｅ－ｌｅｔ７ａ－Ｄ８と混合した時のみ３者複合体が形成されることが確認されている。
このように、本実施形態によれば、類似ｍｉＲＮＡを厳密に区別し、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。特に、標的対象の２種類のｍｉＲＮＡの存在量が大きく異なる場合、本実施形態によれば、少ない存在量の標的ｍｉＲＮＡを正確に定量することができる。
ｍｉＲＮＡ３を含有する核酸試料と、検出プローブ５と、を含む溶液に用いられる液体としては、通常のハイブリダイゼーションに用いられる緩衝液等が挙げられる。
工程（ｂ）は、第２の部分２を検出プローブ５にハイブリダイズさせ、第１の部分１を捕捉プローブ４にハイブリダイズさせ、基板６上にｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５－捕捉プローブ４複合体を形成させる工程である。
工程（ｂ）において、ｍｉＲＮＡは立体構造を形成しやすいため、９５℃で５分間程度インキュベーションして、ｍｉＲＮＡを熱変性させ、プローブとハイブリダイズしやすい状態にしておくことが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、特に限定されるものではなく、各プローブのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができるが、高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
ストリンジェントな条件とは、例えば、３０℃程度の温度条件（プローブの配列のＴｍより５℃～１０℃程高い温度条件）、１Ｍ未満の塩濃度条件等が挙げられる。
工程（ｃ）は、検出プローブ５の末端と、ｍｉＲＮＡ３及び捕捉プローブ４の末端と、をライゲーションさせる工程である。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５にハイブリダイズしたｍｉＲＮＡ３が、これらのプローブから解離することを防ぐために、検出プローブ５の５’末端と、ｍｉＲＮＡ３の３’末端と、をライゲーションさせ、検出プローブ５の３’末端と、捕捉プローブ４の５’末端と、をライゲーションさせる。
ライゲーションすることにより、工程（ｅ）において、ｍｉＲＮＡ３が複数に亘って検出されることを防ぐことができる。
ライゲーションに用いる酵素としては、ＤＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼが挙げられる。
工程（ｂ）及び工程（ｃ）は、同時に行われてもよい。即ち、ハイブリダイゼーション及びライゲーションが、同時に行われてもよい。
また、生合成の過程で、ｍｉＲＮＡの５’末端がリン酸化されるため、他の実施形態として、５’突出末端を有する検出プローブを用い、捕捉プローブと基板とを捕捉プローブの５’末端を介して結合させる場合、検出プローブの３’末端と、ｍｉＲＮＡの５’末端と、をライゲーションさせ、検出プローブの５’末端と、捕捉プローブの３’末端と、をライゲーションさせることができる。
プローブを、捕捉プローブ４と検出プローブ５の２つに分割することにより、各プローブと標的ｍｉＲＮＡ３との親和性が若干減少するが、上述した、（１）基板６と捕捉プローブ４をスペーサー４ａを介して結合させ、捕捉プローブ４に分子的な自由度を付与すること（２）捕捉プローブ４及び／又は検出プローブ５がＬＮＡ又はＢＮＡを含むことで、各プローブとｍｉＲＮＡ３との親和性を高めること、により各プローブと標的ｍｉＲＮＡ３との親和性を高めることができる。
ハイブリダイゼーション反応終了後、非特異的にハイブリダイズしたものを除去するために、基板６を洗浄することが好ましい。洗浄方法についても通常の条件下で行うことができる。高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、ストリンジェントな条件で行うことが好ましく、例えば、基板６を塩濃度の低い溶液中を振とうさせて数回洗浄する方法が挙げられる。
工程（ｄ）は基板６上に形成されたｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５－捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを定量的に検出し、検出結果から核酸試料中のｍｉＲＮＡ３を定量する工程である。
上記の様に、検出プローブ５は標識物質５ａで標識されているため、ｍｉＲＮＡ３―検出プローブ５－捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを定量的に検出する。その際、段階希釈した既知量のｍｉＲＮＡを用いて、標準曲線を作製し、該標準曲線を利用することが好ましい。かかる検出結果を用いて核酸試料中のｍｉＲＮＡ３を定量することができる。
工程（ｄ）における、標識物質の検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば、核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて、複合体の蛍光強度を測定する等、核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。
本実施形態のｍｉＲＮＡの定量方法によれば、従来必要であった橋渡し用プローブが不必要なため、操作が簡便化され、更に、ｍｉＲＮＡ自体を標識物質で標識する必要が無いため、高感度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
また、本実施形態のｍｉＲＮＡの定量方法によれば、ステムループ構造を形成する検出プローブを用いるため、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを認識することなく、ｍｉＲＮＡ中の１塩基の違いも厳密に識別し、高精度に標的ｍｉＲＮＡを定量することができる。
≪検出プローブ及び検出プローブセット≫
図２に示すように、本実施形態の検出プローブは、核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブ５である。検出プローブ５は、５’末端側から、相補鎖を形成する２つのステム部５ｃ，５ｄと、前記２つのステム部５ｃ，５ｄ間の領域であり、標識物質により標識されているループ部５ｅと、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列５ｂと、からなる。即ち、検出プローブ５は、３’突出末端を有している。また、本実施形態の検出プローブは、５’突出末端を有していてもよい。係る場合、本実施形態の検出プローブは、５’末端領域側に前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を有する。
また、類似ｍｉＲＮＡを厳密に区別して認識できる観点から、前記ループ部の標識は、前記第２の部分の塩基配列と対応づけられていることが好ましい。
また、検出プローブ５の標的核酸は、ｍｉＲＮＡであることが好ましい。
検出プローブ５は、１つの標識物質により標識されていてもよく、図３に示されるように、複数の標識物質５ａ１，５ａ２により標識されていてもよい。この標識物質５ａ１，５ａ２は、同じ物質であってもよく、異なる物質であってもよい。
標識物質５ａ１，５ａ２として、同じ物質を用いた場合には、標識の強度を上げることができ、より高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
また、標識物質５ａ１，５ａ２として、異なる物質を用いた場合、例えば、上述したＦＲＥＴが起こりうる組合せの標識物質を用いることにより、検出プローブのステムループ構造形成の有無を、ＦＲＥＴを指標に確認することができる。
本実施形態の検出プローブセットは、核酸試料中の複数種類の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる複数種類の検出プローブからなる検出プローブセットである。この複数種類の検出プローブは、上述した本実施形態の検出プローブにおいて、ループ部がそれぞれ、異なる種類の標識物質により標識されたものであり、このループ部の標識と前記第２の部分の塩基配列が対応付けられている。
また、本実施形態の検出プローブセットの標的核酸は、ｍｉＲＮＡであることが好ましい。
上述したように、検出対象の複数のｍｉＲＮＡの中には、該ｍｉＲＮＡを構成する第１の部分の塩基配列が同じものが複数存在する。
本実施形態の検出プローブセットによれば、この検出プローブセットを構成する検出プローブが認識する標的ｍｉＲＮＡの配列情報（第２の部分の塩基配列）を、それぞれ異なる種類の標識によって対応付けているため、各ｍｉＲＮＡを厳密に識別することができる。
≪核酸の検出方法≫
［第１実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、
前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
（ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
（ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
を有する。
本実施形態の核酸の検出方法における各工程は、上述した≪核酸の定量方法≫の各工程と同様であるため、その説明を省略する。
［第２実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ａ’）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料を、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
（ｂ’）ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブを、前記基板に接触させて前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
（ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
を有する。
本実施形態の核酸の検出方法においては、先ず、核酸試料を捕捉プローブが固定された基板に接触させた後に、検出プローブを該基板に接触させる。他の工程については、第１実施形態の核酸の検出方法と同様である。
本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、従来必要であった橋渡し用プローブが不必要なため、操作が簡便化され、更に、ｍｉＲＮＡ自体を標識物質で標識する必要が無いため、高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの合成）
　標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１４１の配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有する捕捉プローブと検出プローブの２種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１４１
［配列：５’－ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ－３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
（２）捕捉プローブ１（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ１－ｆＳ－３’］
Ｘ１は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６－ＦＡＭ（６－フルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号２：３５ｍｅｒ）
（３）検出プローブ１（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ２－Ａｌ－Ｘ３－３’］
Ｘ２、Ｘ３は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７－ＡｍｉｎｏＣ６－ｄＡを表す。
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号３：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号４：２６ｍｅｒ）
　インクジェット装置（ＭｉｃｒｏＪｅｔ社製ＬａｂｏＪｅｔ－５００Ｂｉｏ）を用いて、ガラス基板上に、表１に示す捕捉プローブを含む溶液を吐出し、マイクロアレイを作製した。
表１中、２０×ＳＳＣ　ｂｕｆｆｅｒの組成は、３Ｍ　ＮａＣｌ，０．３Ｍ クエン酸ナトリウムである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、任意の濃度のｍｉＲ－１４１と検出プローブ１を含有するハイブリダイゼーション反応溶液を表２のように調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ハイブリダイゼーション反応溶液を９５℃で５分間インキュベーションした後、室温に戻し、これにＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを、最終濃度が５ｕｎｉｔｓ／μｌになるよう加えた。次いで、このハイブリダイゼーション反応溶液を、マイクロアレイ基板に接触させた状態で密封し、シェーカー上で１０００ｒｐｍの速さで振とうさせながら３０℃で２時間ハイブリダイゼーションさせた。
　ハイブリダイゼーション反応終了後、マイクロアレイ基板を０．２×ＳＳＣ　ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ　ＮａＣｌ，３ｍＭ クエン酸ナトリウム）中で１０分間振とうさせて洗浄し、この洗浄操作を２回繰り返した。続いて基板を乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定した。
結果を図３に示す。プローブを固定した各スポットにおいて、Ａｌｅｘａ６４７標識された検出プローブの蛍光像が観察され、ハイブリダイゼーション反応に用いたｍｉＲ－１４１の分子数０．５ｆｍｏｌ～５０ｆｍｏｌの範囲で線形性が確認された。このことから、スポット全体の蛍光強度はｍｉＲＮＡ濃度に依存してシグナルが上昇していることが確認された。
［実施例２］
（標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの合成）
　別種の標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１４３の配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有する捕捉プローブと検出プローブの２種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１４３
［配列：５’－ ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣ－３’］ （配列番号５：２１ｍｅｒ） 
（２）捕捉プローブ２（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ４－ｆＳ－３’］
Ｘ４は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６－ＦＡＭ（６－フルオロセイン）を表す。
Ｘ４：ＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号６：３４ｍｅｒ）
（３）検出プローブ２（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ５－Ａｌ－Ｘ６－３’］
Ｘ５、Ｘ６は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７－ＡｍｉｎｏＣ６－ｄＡを表す。
Ｘ５：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号７：１７ｍｅｒ）
Ｘ６：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡ（配列番号８：２６ｍｅｒ）
　実施例１と同様の方法で、マイクロアレイを作製し、ハイブリダイゼーションを行い、基板上のスポット全体の蛍光強度を測定した。
［比較例１］
　実施例２において、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを加えない以外は、実施例２と同様の方法で、マイクロアレイを作製し、ハイブリダイゼーションを行い、基板上のスポット全体の蛍光強度を測定した。
　実施例２及び比較例１の結果を図４に示す。実施例２においては、ハイブリダイゼーション反応に用いたｍｉＲ－１４３の分子数０．０３ｆｍｏｌ～１０ｆｍｏｌの範囲で線形性が確認された。一方、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いない比較例１においては、その検出感度は１０５分の１程度まで減少したことから、標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブをライゲーションすることで検出感度が格段に上昇することが確認された。
［実施例３］
（標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの合成）
　類似の標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－２００ａの配列を有するＲＮＡを合成した。また、これらに相補的な配列を有する捕捉プローブ１種と検出プローブ２種の合計３種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１４１
［配列：５’－ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ－３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
（２）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－２００ａ
［配列：５’－ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＣＧＡＵＧＵ－３’］ （配列番号９：２２ｍｅｒ）
（３）捕捉プローブ１（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ１－ｆＳ－３’］
Ｘ１は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６－ＦＡＭ（６－フルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号２：３５ｍｅｒ）
（４）検出プローブ１（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ２－Ａｌ－Ｘ３－３’］
Ｘ２、Ｘ３は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７－ＡｍｉｎｏＣ６－ｄＡを表す。
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号３：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号４：２６ｍｅｒ）
（５）検出プローブ３（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ３）
［配列：５’－ｐ－Ｘ２－Ａｌ－Ｘ７－３’］
Ｘ２、Ｘ３は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ５３２－ＡｍｉｎｏＣ６－ｄＡを表す。
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号３：１７ｍｅｒ）
Ｘ７：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＴ（配列番号１０：２６ｍｅｒ）
　実施例１と同様の方法で、マイクロアレイを作製した。
　さらに、ｍｉＲ－１４１又はｍｉＲ－２００ａと、検出プローブ１及び検出プローブ３を含有するハイブリダイゼーション反応溶液を表３のように調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１と同様の方法で、ハイブリダイゼーションを行い、基板上のスポット全体の蛍光強度を測定した。
結果を表４に示す。プローブを固定した各スポットにおいて、Ａｌｅｘａ６４７又はＡｌｅｘａ５３２で標識された検出プローブの蛍光像がそれぞれ観察され、その蛍光強度からｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－２００ａを定量した。標的ｍｉＲＮＡに完全に相補的な配列を有する検出プローブの蛍光強度を１００％とすると、２塩基異なる配列を有するｍｉＲＮＡ存在下においては蛍光強度が１％以下となり、検出プローブが高い特異性を有していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例４］
（標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの合成）
標的ｍｉＲＮＡとして、ｌｅｔ－７ａの配列を有するＲＮＡを合成した。また、これに相補的な配列を有するが長さの異なる２種の捕捉プローブと検出プローブの合計３種の核酸プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｌｅｔ－７ａ
［配列：５’－ ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’］ （配列番号１１：２２ｍｅｒ）
（２）捕捉プローブ３（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ３）
［配列：５’－ｐ－Ｘ９－ｆＳ－３’］
Ｘ９は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６－ＦＡＭ（６－フルオロセイン）を表す。
Ｘ９：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１２：３５ｍｅｒ）
（３）捕捉プローブ４（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ４）
［配列：５’－ｐ－Ｘ１０－ｆＳ－３’］
Ｘ１０は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６－ＦＡＭ（６－フルオロセイン）を表す。
Ｘ１０：ＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１３：３４ｍｅｒ）
（４）検出プローブ４（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ４）
［配列：５’－ｐ－Ｘ１１－Ａｌ－Ｘ１２－３’］
Ｘ１１、Ｘ１２は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７－ＡｍｉｎｏＣ６－ｄＡを表す。
Ｘ１１：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号１４：１７ｍｅｒ）
Ｘ１２：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣ（配列番号１５：２６ｍｅｒ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ハイブリダイゼーション反応溶液を９５℃で５分間インキュベーションした後、室温に戻し、これにＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを、最終濃度が５ｕｎｉｔｓ／μｌになるよう加えた。次いで、このハイブリダイゼーション反応溶液を、３０℃で２時間ハイブリダイゼーションさせた。
ハイブリダイゼーション反応終了後、尿素変性アクリルアミドゲル電気泳動を行い、捕捉プローブ－検出プローブ４－ｌｅｔ－７ａからなる３者複合体の形成を確認した。
結果を図８に示す。検出プローブ４に結合しているＡｌｅｘａ６４７の蛍光を指標に泳動後のゲルを撮影したところ、捕捉プローブ３を含む場合は約１３０塩基長の位置に３者複合体のバンドが見られた。一方、捕捉プローブ４を含む場合はシグナルが全く出なかったことから、捕捉プローブの塩基長を変化させることで３者複合体の形成を制御できることが示された。すなわち、捕捉プローブ３および４を基板上の別の領域に固定した場合は、ｌｅｔ－７ａおよびｌｅｔ－７ｂのシグナルが互いに異なる領域で検出されることになる。以上のように、本実施形態によれば、類似ｍｉＲＮＡ群を特異的に定量できる。
［実施例５］
　図９に示すマイクロチップをＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）で作製し、実施例１の試薬を用いて、マイクロチップ上でｍｉＲＮＡの定量を試みた。各流路は、幅２００μｍ、高さ２０μｍであり、かつ溶液導入口が２つ配置されており、それぞれがガス圧により開閉するバルブで区切られている。このような流路セットが３０ ｍｍ角のガラス基板上に６組並列に並んでいる。
まず、捕捉プローブ固定用流路（破線の四角で囲われたＰＤＭＳ製の流路）をガラス基板に貼り付け、一方の導入口からＦＡＭ標識捕捉プローブ溶液を導入してガラス基板上に固定した。その後洗浄し、流路を取り除いた。その結果、図１０に示すように検出プローブを線状に固定することができた。
続いて、捕捉プローブ固定用流路を取り除いたガラス基板に対し、ハイブリダイゼーション用流路を貼りあわせ、「窒素ガスＢ」で洗浄溶液用流路のバルブを閉じながら、サンプル溶液（２５ ｎＭ ｍｉＲ－１４１, １００ ｎＭ　Ａｌｅｘａ６４７標識検出プローブ, Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ等を含む）を「サンプル液導入口」からシリンジポンプで導入した（流速：０．８μｌ／ｍｉｎ, １０分間）。続いてバルブを切り替えて洗浄溶液を流し、捕捉プローブが固定されている領域上に結合したＡｌｅｘａ６４７標識検出プローブの量を計測した。結果を図１１に示す。図１１左図に示す破線部分に固定された捕捉プローブとの交点において、図１１右図に示す破線部分を流れたｍｉＲＮＡおよび検出プローブが優位に結合しており、マイクロ流路においても本実施形態のｍｉＲＮＡの定量法が適用可能であることが確認された。
以上の結果から、本実施形態によれば、簡便で、高精度かつ高感度に、核酸を定量できることが明らかである。
簡便で、高精度かつ高感度に、核酸を定量することができる核酸の定量方法、並びに、該核酸の定量方法に用いられる検出プローブ及び検出プローブセットを提供できる。
１，１００…第１の部分、２，１０１…第２の部分、３，１０３…ｍｉＲＮＡ、４，１０４…捕捉プローブ、４ａ…スペーサー、５，１０５，１０９…検出プローブ、５ａ，５ａ１，５ａ２…標識物質、５ｂ…配列、５ｃ，５ｄ…ステム部、５ｅ…ループ部、６，１０６…基板、１０７，１０８…橋渡し用プローブ

Claims (13)

  1. （ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
    ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、
    前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
    （ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
    （ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
    （ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を定量的に検出し、検出結果から前記核酸試料中の核酸を定量する工程と、
    を有することを特徴とする核酸の定量方法。
  2. 前記工程（ａ）において、前記溶液は、異なる種類の標識物質により標識されている複数種類の検出プローブを含む請求項１に記載の核酸の定量方法。
  3. 前記工程（ａ）において、前記核酸試料は、検出対象の複数種類の核酸を含有し、前記複数種類の核酸の第１の部分がそれぞれ重複しないように、前記捕捉プローブの５’末端と３’末端のうち、どちら側が基板に固定されるかを選択される請求項１又は２に記載の核酸の定量方法。
  4. 前記工程（ａ）において、前記溶液は、塩基長の異なる複数の検出プローブと、塩基長の異なる複数の捕捉プローブを含む請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸の定量方法。
  5. 　前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）は、同時に行われる請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸の定量方法。
  6. 前記捕捉プローブ及び／又は前記検出プローブはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）又はＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）を含む請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸の定量方法。
  7. 核酸試料中の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる検出プローブであって、
    相補鎖を形成する２つのステム部と、
    前記２つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、
    前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、５’突出末端又は３’突出末端と、を備えることを特徴とする検出プローブ。
  8. 前記ループ部の標識は、前記第２の部分の塩基配列と対応づけられている請求項７に記載の検出プローブ。
  9. 前記核酸は、ｍｉＲＮＡである請求項７又は８に記載の検出プローブ。
  10. 核酸試料中の複数種類の第１の部分及び第２の部分からなる核酸を検出するために用いられる複数種類の検出プローブからなる検出プローブセットであって、
    前記複数種類の検出プローブは、相補鎖を形成する２つのステム部と、前記２つのステム部間の領域であり、それぞれ、異なる種類の標識物質により標識されているループ部と、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列からなり、５’突出末端又は３’突出末端と、を備え、
    前記ループ部の標識と前記第２の部分の塩基配列が対応づけられていることを特徴とする検出プローブセット。
  11. 前記核酸は、ｍｉＲＮＡである請求項１０に記載の検出プローブセット。
  12. （ａ）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料と、
    ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブと、を含む溶液を、
    前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
    （ｂ）前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
    （ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
    （ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
    を有することを特徴とする核酸の検出方法。
  13. （ａ’）第１の部分及び第２の部分からなる核酸を含有する核酸試料を、前記第１の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定された基板に接触させる工程と、
    （ｂ’）ステムループ構造を形成し、前記第２の部分とハイブリダイズし得る配列を含み、５’突出末端又は３’突出末端を有し、標識物質により標識されている検出プローブを、前記基板に接触させて前記第２の部分を前記検出プローブにハイブリダイズさせ、前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記基板上に核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体を形成させる工程と、
    （ｃ）前記第１の部分を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせ、前記検出プローブの末端と、前記核酸及び前記捕捉プローブの末端と、をライゲーションさせる工程と、
    （ｄ）前記基板上に形成された前記核酸－検出プローブ－捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程と、
    を有することを特徴とする核酸の検出方法。
     
     
     
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