CN1335393A - 碱性海藻多糖裂解酶的发酵生产方法和生产该酶的微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的专性嗜碱菌N19－2,以及用该菌种生产碱性海藻多糖裂解酶的微生物发酵生产方法。本发明用新的专性嗜碱菌N19－2以海藻酸钠、蛋白胨等为原料,发酵生产碱性海藻多糖裂解酶,生产方法简单,发酵液的酶活力达100u/ml以上,后提取收率80%以上。该酶的最适反应pH为9.5,最适反应温度为55℃,在海藻寡糖生产方面具有重要的应有价值。
Description
本发明涉及一种新的微生物，和利用该微生物发酵生产酶的方法。
海藻多糖裂解酶或藻酸盐裂解酶(Alginate lyase.EC4.2.2.3.)，通过β-消除机制将海藻多糖降解为不饱和糖醛酸寡聚物-海藻酸寡糖(alginicacid oilgosaccharides)和不饱和糖醛酸单体(uronic acid)，根据酶对底物的作用，该酶分为两种类型即polyM裂解酶及polyG裂解酶。
自90年代以来，海藻酸裂解酶在生物工程产品研发中的应用价值引起关注，它不仅可开发新生理活性物质，更重要的是开拓了一个新的工业应用领域。除了直接作为药品酶应用于治疗由致病菌铜绿假单胞菌引起的肺炎外，海藻多糖裂解酶应用的重要方向是酶法生产海藻寡糖，为新药、新功能食品的开发提供了新手段。特别是被称为寡糖素(oligosaccharins)的酶解产物——海藻寡糖的生理功能不断被揭示，引起了人们更大的兴趣。海藻寡糖的生理功能包括促进植物生长、刺激双歧杆菌的增殖、抑制肿瘤、降低血压、活化人表皮角质细胞等。1997年英国人又发现海藻寡糖素可使青霉素G产量增加50-150％(Ariyo B.T.et al.，Biotechnol.Bioeng.53∶17-20，1997)。
已经对海藻多糖裂解酶进行了大量研究，包括了海洋微生物及陆生微生物产生的该酶，涉及该酶的产生、纯化、基因分析等各方面。主要参考文献包括Marcello，A.et al.：FEMS Microbiol.Lett.；136(1)：39-44，1996；Aasen I.M.et al，37：55-60，1992；Ostgarol K.et al.：EnzymeMicrobiol.Technol.1993，15：756-763；Kinoshita，S.et al.：J.Ferment.Bioeng.72：74-78，1991；Murata，K.et al.：Comments Agric.& FoodChemistry，3(2)：87-110，1994；Sutherland，Ian W.：Polysaccharide lyases，FEMS Microbiology Reviews，16：323-347，1995；Sawabe，T.et al.：Carbohydr.Res.；304(1)：69-76，1997；Shimokawa T.et al.：Biosci.Biotech.Biochem.，61(4)：636-640，1997；Malissard M.et al.：FEMS Microbiol.Lett，126(2)：105-111，1995；Dyrset N.et al.：Appl.Microbiol.Biotechnol.41：523-530，1994；Nakagawa，A.et al.：J.Appl.Microbiol.；84(3)：328-335，1998；Ertesvag，H.et al.：J.Bacteriol.，180(15)：3779-3784，1998；Baron，A.J.et al.：Gene，143(1)：61-66，1994；Brown，B.J.et al.：Appl.Environ.Microbiol.57(6)：1870-1872，1991；Hicks，S.J.et al.：Enzyme Microbiol.Technol.，19(1)：68-73，1996。
已经作出了一些努力，试图将海藻多糖裂解酶应用于海藻寡糖的生产，如JP63039581A2，JP63214192A2，US05516666，US04958016，EP00979301A1等专利，所述裂解酶来自Altermonas sp.，Flavobacterium sp.，Bacillus sp.，Psudomonas sp.等，而且也有开发特性酶的尝试，如US05139945，WO09002794A1，AU04335189A1等报道的来自Bacillussteraothermophilus的高温酶，但目前这些酶在酶活力、稳定性、半衰期等方面尚无法满足应用于寡糖生产的实际需要，现有的海藻多糖裂解酶应用于海藻寡糖生产主要存在两个问题，即酶活力低及活性复杂。因此实际应用的酶尚非常缺乏。
本发明的目的在于提供一种新的碱性海藻多糖裂解酶的生产菌株及碱性海藻多糖裂解酶的大量生产方法。
嗜碱微生物的极端酶对于海藻多糖裂解酶的发展具特殊意义，首先可避免糖苷酶活性的干扰，克服一般海藻多糖裂解酶活性复杂的缺陷；另外由于海藻多糖的分子特性，酸性条件下变性形成不可逆的凝胶，而碱性条件下其分子易溶胀，也有利于酶的裂解，而且，金属离子络合物多在碱性条件下形成，并随处理过程中pH的不同，金属离子可相互替代，因此嗜碱菌的碱性藻酸盐裂解酶具有特殊优势。在已发现的裂解酶中，其反应pH多在7-11之间，但已报道的海藻多糖裂解酶的反应pH一般是中性，只有一个兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.M-2的报道(日本专利，特公昭52-2997)，其最适反应pH为9，产酶量低，仅有3u/ml，也没有进行发酵工艺的研究。专性嗜碱的革兰氏阴性菌尚未见报道。
本发明所涉及的菌种是专性嗜碱革兰氏阴性菌，该菌种在pH8以下不生长，产生的酶的最适反应pH为9.5，发酵液酶活力高达100单位/毫升发酵液以上。
本发明所采用的菌株为分离自中国沿海的嗜碱菌N19-2(alkaliphilicsp.N19-2)。菌株N19-2不产生芽胞，G-，生长的pH范围为pH8-11.5，最适生长pH9.5-10，在0.5-8％的NaCl中生长良好，最适为3％。该菌株的培养特征与生理生化特征列于下表。
表1，菌株N19-2的特征
| 细胞形态芽胞革兰氏染色鞭毛氧化酶接触酶淀粉水解明胶液化脲酶酪素水解硝酸盐还原吲哚产生H2SVp反应利用碳水化合物产酸葡萄糖半乳糖***糖甘露糖生长温度厌氧生长DNAG＋C％ | 杆状不产生阴性极生阳性阳性+---++--+--+20-50℃，最适35℃+52％ |
该菌株于2000年6月28日在中国科学院微生物所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京中关村北一条13号微生物所)进行了保藏，保藏号为CGMCC No.0464。
本发明所采用的液体种子培养基含有(克/升)：淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O0.15，NaCl30，Na2CO310。固体斜面种子培养基为上述培养基中添加2％的琼脂粉。发酵培养基(克/升)：海藻酸钠10-18，蛋白胨5-9，酵母粉5-7，K2HPO41-3，MgSO47H2O0.1-0.3，NaCl10-30，Na2CO38-15，豆油2-5ml。
取固体斜面培养基上生长良好的培养物少许，接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，置37℃，220转/分的旋转摇床上培养24小时作为一级种子液。以4％的接种量将一级种子转接于装有1000ml种子培养基的3000ml三角瓶中，上述条件培养24小时，作为二级种子液，再以3-5％的接种量，将二级种子液转接于种子罐或发酵罐中。种子罐为50升罐，装料体积20-30升，发酵温度32-37℃，通气量1∶0.5-1∶1.0，转速400-450转/分，时间20-28小时。发酵罐为250升-1吨罐，装料量120-600升。发酵温度32-37℃，通气量1∶0.5-1∶1.0，转速200-450转/分。发酵时间36-48小时。
对于按上述方法得到的发酵液，其中碱性海藻多糖裂解酶的酶活力在100u/ml以上，酶活力测定方法参照Horikoshi K..et al.JP877677的方法测定。具体地说，以0.9ml，0.5％(W/V)海藻多糖作底物，用pH10，0.05MOL/L甘氨酸-NaOH缓冲液加入0.1ml稀释酶液，55℃保温10分钟，用二硝基水杨酸试剂测产生的还原糖，1个酶活力单位定义为上述反应条件下，一分钟释放1mMOL相当于D-甘露糖的还原糖的酶量。
发酵液经板框过滤、中空纤维柱超滤浓缩即可获得纯净的浓缩酶液，浓缩倍数10倍，酶收率85％以上。
利用本发明新的嗜碱菌和本发明的方法生产的新型海藻多糖裂解酶，与现有技术披露的酶相比，其酶活性高、专一，热稳定性好，用于裂解海藻多糖具有显著的优势。本发明提供了专性嗜碱海藻多糖裂解酶产生菌，为实现碱性海藻多糖裂解酶大量生产提供了可行的工艺，该酶活力属世界先进水平，酶的热稳定性较好。该酶可有效地降解海藻多糖生成不饱和的海藻寡糖，为海洋资源的高价值转化利用创造了条件。
实施例1.
将菌株N19-2保持并转移到试管的固体斜面培养基上，该琼脂培养基组成为：(克/升)淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O0.15，NaCl30，Na2CO310，琼脂粉2％。以蒸馏水配制。
对于每次转移，均将琼脂斜面在35℃下培养2天。然后按照如下步骤制备菌种培养物。
实施例2
将表面生长物由琼脂表面转移到装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，35℃，220转/分摇床上振荡培养24小时，然后转接于4个装有1000ml种子培养基的3000mL三角瓶中，在上述条件下培养24小时，再接种于装有120升发酵培养基的250升发酵罐中进行发酵。发酵培养基的组成为(克/升)海藻酸钠12，大豆粉4.5，味精4.5，酵母粉7，K2HPO41.5，MgSO47H2O0.3，NaCl30，Na2CO310，豆油4ml，发酵温度35℃±1℃，通气量1∶0.75，搅拌速度400转/分。发酵过程中，菌体生长延迟期约为8小时，进入对数期后，菌体迅速生长，酶量随之增长，稳定期时(32-48小时)酶活力最高。发酵40小时可放罐，发酵液酶活力100u/ml以上。
发酵液以加滤纸板的板框进行过滤，过滤压力0-2Kg/cm2，滤液由中空纤维超滤柱进行浓缩，(柱的截留分子量为6000)，基本无需压力，浓缩10倍左右后，以10mMNa2CO3-NaHCO3缓冲液(pH10)洗涤浓缩酶液，并洗涤超滤柱。最终酶的总收率85％。
实施例3.
将菌株N19-2从斜面上接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，35℃摇床培养24小时作为一级种子液。以3％的接种量将一级种子液接入一个装有1000ml种子培养基的3000ml三角瓶中，37℃摇床培养24小时作为二级种子液。将二级种子液接入装有25升种子培养基的50升种子发酵罐中，发酵温度35℃±1℃，通气量1∶1.0，搅拌速度450转/分，发酵24小时后，将其转接入装有600升发酵培养基的1吨罐中。发酵培养基的组成为(克/升)：海藻酸钠12，酵母粉7，大豆粉4.5，味精4.5，K2HPO41.5，MgSO47H2O0.1，NaCl30，Na2CO312，豆油4ml/升，发酵温度35℃，通气量1∶0.75，搅拌速度240转/分，发酵40小时，终止发酵，发酵液酶活力100u/ml以上。
发酵液以加滤纸板的板框进行过滤，并加适当硅藻土作为助滤剂。滤液如例1所述进行超滤浓缩，浓缩10倍左右，总收率85％以上。
Claims (5)
1.一种嗜碱菌N19-2，其菌种保藏号为CGMCC No.0464。
2.一种通过微生物发酵生产海藻多糖裂解酶的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1的嗜碱菌N19-2在种子培养基中，在适合种子生长的培养条件下，进行种子培养；
(2)将(1)收获的培养物在含有海藻酸钠的发酵培养基中，在适合菌体生长的培养条件下，进行发酵培养；
(3)收获的发酵液通过板框过滤和中空纤维超滤浓缩，制得碱性海藻多糖裂解酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中种子培养基为每升培养液中含有淀粉5克、蛋白胨10克、酵母粉5克、K2HPO41克、MgSO4-7H2O0.1克、NaCl20克、Na2CO310克，发酵培养基为每升培养液中含有海藻酸纳5-20克、蛋白胨5-9克、酵母粉5-7克、K2HPO41-3克、MgSO47H2O0.1-0.3克、NaCl10-50克、Na2CO38-15克、豆油2-5ml。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述适合种子生长的培养条件为温度35℃，摇床转速220转/分，振荡培养24小时；所述适合菌体生长的发酵培养条件为温度32-37℃，通气量1∶0.5-1∶1.0，转速200-450转/分，发酵时间为32-48小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其中获得的碱性海藻多糖裂解酶最适反应pH为9.5，最适反应温度为55℃。
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