CN110093297A - 硝酸盐还原菌mcda3-3及其产几丁质脱乙酰酶的方法 - Google Patents

硝酸盐还原菌mcda3-3及其产几丁质脱乙酰酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硝酸盐还原菌MCDA3‑3(Nitratireductor aquimarinus)CGMCC NO.16934。该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。在2216E培养基上25℃生长3天，菌落呈圆形，灰褐色半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径0.1‑0.5mm，易挑取。在含有对硝基‑N‑乙酰苯胺和粉末几丁质的筛选培养基上能够产生黄色透明圈。本发明还公开了一种利用菌株MCDA3‑3产几丁质脱乙酰酶的方法，其最适发酵条件为：接种量4％、30℃、180rpm发酵48h。本发明的硝酸盐还原菌MCDA3‑3所产的几丁质脱乙酰酶的最适温度为30℃，最适pH为8.0，Sr2+等金属离子对几丁质脱乙酰酶活性有促进作用。

Description

硝酸盐还原菌MCDA3-3及其产几丁质脱乙酰酶的方法
技术领域
本发明涉及一种菌株，特别是一种分离自连云港市高公岛海域海泥的硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3；该菌株已经于2018年12月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16934；本发明还涉及该菌株产几丁质脱乙酰酶的方法。
背景技术
几丁质又称甲壳质、甲壳素，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4糖苷键连接而成的天然高分子多糖，在自然界中的含量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于无脊椎动物的外骨骼或角质层、大多数真菌的细胞壁中。几丁质具有牢固的氢键结构，性质及其稳定，不易被稀酸、稀碱及有机试剂溶解，因此限制了它在各个领域的应用。壳聚糖是几丁质通过脱除乙酰基后的产物，具有更好的溶解性和生物相容性，脱乙酰氨基含量越少，壳聚糖的结晶度越小，溶解性越大，反应活性也更强。因此，壳聚糖在食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域具有很大的开发和应用潜力(Kaur et al,2014)。
目前，壳聚糖的生产主要采用化学方法。传统的化学法使用大量的酸碱，能源消耗大，环境污染严重；且壳聚糖的后续纯化过程复杂，增加了生产成本；造成壳聚糖分子量及乙酰化程度的降低，从而影响壳聚糖产品品质。酶法生产壳聚糖是利用几丁质脱乙酰酶催化几丁质中脱乙酰生成壳聚糖，反应条件温和，能耗值较低，可获得脱乙酰程度均一稳定的产品，且环境友好。因此，运用几丁质脱乙酰酶生产壳聚糖将是行业未来的发展方向。
目前报道的几丁质脱乙酰酶有真菌、昆虫和细菌(Kaczmarek et al,2016)。微生物几丁质脱乙酰酶制备成本低，易于工业化生产。然而，目前报道的真菌几丁质脱乙酰酶产酶水平较低，催化温度较高。细菌可以的几丁质脱乙酰酶几乎全部只能催化几丁寡糖脱乙酰基，不催花高聚合度几丁质脱乙酰基。细菌在发酵产酶方面较真菌有优势，因此，发现产低温催化高聚合度几丁质脱乙酰基的酶更具有工业应用潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的来自海洋产几丁质脱乙酰酶的硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述硝酸盐还原菌MCDA3-3产几丁质脱乙酰酶的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3(以下简称菌株MCDA3-3)，其特点是，其保藏号为CGMCC NO.16934。
本发明涉及的菌株MCDA3-3是在连云港市高公岛海域的海泥中分离到的硝酸盐还原菌MCDA3-3，该菌株已经与2018年12月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16934。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。联系电话为010-64807355。
本发明菌株MCDA3-3的形态特征与生理生化特征如下：
1.1形态特征：
该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。在2216E培养基上25℃生长3天，菌落呈圆形，灰褐色半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径0.1-0.5mm，易挑取。在含有对硝基-N-乙酰苯胺和粉末几丁质的筛选培养基上能够产生黄色透明圈。
1.2生理生化特征：
该菌株H2O2试验、明胶液化试验、反硝化、果糖试验均呈阳性，吲哚试验、三梨醇、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸盐试验均为阴性。部分生理生化结果见表1。
表1 MCDA3-3菌株的生理生化试验结果
注：+：阳性；-：阴性；
1.3菌株MCDA3-3 16S rDNA序列的扩增和分析
用Axygen试剂盒提取得到MCDA3-3的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物于PCR mix体系中反应。
所述用于PCR反应的通用引物：27F：5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
所述反应体系(50μL)为：Premix(25μL)，ddH2O(22μL)，上下游引物(各1μL)，DNA模板(1μL)。反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸5min。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现与菌株Nitratireductor aquimarinus(登录号：HQ176466.1)16S rDNA相似度达99％。***发育树表明菌株MCDA3-3与Nitratireductor aquimarinus亲缘关系最近。
本发明还公开了一种利用所述的硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3产几丁质脱乙酰酶的方法，其特点是，其步骤如下：将硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3接种到种子培养基中，180rpm、30℃培养24h，得种子液；将种子液以4％的接种量接种于发酵培养基中，180rpm、30℃培养48h，12000×g、4℃离心10min，取上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶液；种子培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，陈海水配制，pH7.0；发酵培养基：木薯淀粉1.07％，玉米浆1.0％，FeCl3·6H200.045％，陈海水配制，pH5.7。
与现有技术相比，本发明提供了一种新的可以几丁质脱乙酰酶的产硝酸盐还原菌MCDA3-3，该菌株所产的几丁质脱乙酰酶的最适温度为30℃，最适pH为8.0，Sr2+等金属离子对几丁质脱乙酰酶活性有促进作用，具有很好的应用前景。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行进一步的描述：
实施例1，一种硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3，其保藏号为CGMCC NO.16934。该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。在2216E培养基上25℃生长3天，菌落呈圆形，灰褐色半透明，表面湿润，边缘规则，无晕环，中央突起，直径0.1-0.5mm，易挑取。在含有对硝基-N-乙酰苯胺和粉末几丁质的筛选培养基上能够产生黄色透明圈。
利用该硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3产几丁质脱乙酰酶的方法，其步骤如下：将硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3接种到种子培养基中，180rpm、30℃培养24h，得种子液；将种子液以4％的接种量接种于发酵培养基中，180rpm、30℃培养48h，12000×g、4℃离心10min，取上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶液；种子培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，陈海水配制，pH7.0；发酵培养基：木薯淀粉1.07％，玉米浆1.0％，FeCl3·6H20 0.045％，陈海水配制，pH5.7。
实施例2，菌株MCDA3-3发酵生产几丁质脱乙酰酶的方法研究实验：
1.1本发明涉及的培养基
种子培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，陈海水配制，pH7.0。
发酵培养基：木薯淀粉1.07％，玉米浆1.0％，FeCl3·6H20 0.045％，陈海水配制，pH5.7。
1.2种子液的制备：将菌株MCDA3-3的单菌落接种到种子培养基中装液量20％，30℃，180rpm培养24h。
1.3碳源对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、30℃、180rpm，分别添加不同碳源发酵48h取样测定酶活力，研究碳源对菌株MCDA3-3产酶的影响，结果表明添加木薯淀粉时产酶最高。
1.4氮源对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、30℃、180rpm，分别添加不同氮源发酵48h取样测定酶活力，研究氮源对菌株MCDA3-3产酶的影响，结果表明，添加豆粕时产酶最高，其次为玉米浆，由于豆粕成本较高，故确定玉米浆为培养基氮源。
1.5无机盐对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、30℃、180rpm，分别添加不同金属离子发酵48h取样测定酶活力，研究无机盐对菌株MCDA3-3产酶的影响，结果表明添加Fe3+时产酶最高。
1.6发酵时间对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、30℃、180rpm发酵，每隔12h取样测定酶活力，结果表明48h产酶最高。
1.7发酵温度对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、180rpm，在不同温度下发酵48h，结果显示，30℃时产酶最高，20℃时有较高的产酶量，达到最高产酶的70％。
1.8培养基初始pH对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，装液量20％、30℃、180rpm，调节发酵培养基不同初始pH发酵48h后测定酶活力，结果表明，pH为6.0时产酶最高。
1.9接种量对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以不同接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、30℃、180rpm发酵48h后测定酶活力，结果表明，接种量4％时产酶最高。
1.10转速对菌株MCDA3-3产酶的影响
将种子液以4％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH6.0、装液量20％、30℃，以不同转速发酵48h后测定酶活力，结果表明，转速为180rpm时产酶最高。
1.11几丁质脱乙酰酶活性测定方法
试管中加入30℃预保温的0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液3mL，200mg/L的对硝基乙酰苯胺水溶液1mL，酶液1mL，30℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000×g离心10min，测定上清液的吸光度。以添加1mL同样浓度沸水浴灭活15min的酶液作为对照。酶活单位(U)定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
实施例3，响应面法优化菌株MCDA3-3产几丁质脱乙酰酶的发酵条件实验：
根据单因素结果确定优选的碳源、氮源、初始pH 3个因素为变量，以酶活大小为响应值，运用Design of Experiments设计3因素3水平共17个试验点的Box-Behnken响应面分析试验(表2)。对试验数据进行回归分析，得二次多项式方程：
Y＝4.07+0.2951A-0.094B-0.2624C-0.3535AB-0.3693AC+0.3475BC-0.9643A2-0.3841B2-0.5163C2
表2 Box-Behnken试验设计及结果
表3几丁质脱乙酰酶酶活的回归方差分析表
注：-为不显著，*为显著，**为极显著
由表3可知：从F值的大小可以得到，一次项中各因素对几丁质脱乙酰酶酶活的影响顺序是B>C>A。对几丁质脱乙酰酶酶活的方差分析可得模型P<0.01，表明该方程模型极显著，不同处理间的差异性极显著；失拟项P>0.05，表明模型失拟项不显著；模型的R2为0.9654，说明该模型能解释96.54％响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用于预测最优发酵条件参数。
响应面三维图表明，响应面开口朝下，响应值随各自变量的值先增加后减少，说明此模型有突出稳定点，且稳定点是该模型的最大值。具体体现：初始pH 6.0，当FeCl3·6H2O在0.043％-0.053％，木薯淀粉在0.96％-1.11％酶活最大；FeCl3·6H2O0.05％时，木署淀粉0.96％-1.12％，初始pH5.56-6.11，酶活力最大；木薯淀粉1％时，FeCl3·6H2O在0.0401-0.0535％，初始pH在5.55-6.10，酶活最大。
表4稳定点的规范分析
使用响应面法对发酵工艺条件进行优化，如表4所示，得到最佳培养基组合为：木薯淀粉1.07％、FeCl3·6H2O 0.0446％、初始pH 5.72，发酵产酶活预测值为4.2265U/mL。为了保证试验的方便可行，对各个条件做少许修正，木薯淀粉1.07％、FeCl3·6H2O 0.045％、初始pH 5.7进行验证试验，结果显示几丁质脱乙酰酶酶活为4.0734U/mL，与理论值相对误差<5％，说明该方程拟合度很好。
因此，菌株MCDA3-3产几丁质脱乙酰酶的最佳培养基配方为：木薯淀粉1.07％、玉米浆1.0％、FeCl3·6H2O 0.045％、陈海水配制，初始pH 5.7。最佳培养条件为：接种量4％、温度30℃、180rpm发酵48h。
实施例4，菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶酶学性质的实验研究：
4.1粗酶液的制备
将菌株MCDA3-3的单菌落接种到种子培养基中，装液量20％、30℃、180rpm培养24h，得到种子液。以4％接种量将种子液接种至发酵培养基，装液量20％、30℃、180rpm发酵48h，12000×g、4℃离心10min，上清即为几丁质脱乙酰酶粗酶液。
4.2温度对菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶活性的影响
将酶在pH7.0、0.05mmol/L磷酸缓冲液中于不同温度下处理1h测定酶活力，确定菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶的最适合作用温度。结果显示，酶的最适合作用温度是30℃，在20℃和45℃仍保持30％以上酶活。
4.3温度对菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶稳定性的影响
将酶在pH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液中于不同温度下保温0h-3.0h，测定酶活力，研究酶的温度稳定性。结果显示，酶在4℃时最稳定，30℃的半衰期为2.0h。
4.4pH对菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶活性的影响
配制不同pH的0.05mol/L缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0-pH6.0)磷酸盐缓冲液(pH6.0-pH8.0)，甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.0-pH9.0)。将酶在30℃、不同pH的缓冲液下处理2h测定酶活力。结果显示，酶的最适pH为8.0，pH6.0-pH9.0仍保持40％以上酶活。
4.5pH对菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶稳定性的影响
将酶在不同pH的缓冲液中，30℃保温2h、20h测定酶活力。结果显示，pH为8.0时，2h、20h处理的酶稳定性都是最好，pH6.0-pH9.0仍保持40％以上酶活。
4.6金属离子对菌株MCDA3-3几丁质脱乙酰酶活性的影响
在酶活测定体系中分别添加CaCl2、CuSO4、FeSO4、MgSO4、ZnSO4、KCl、NaCl等金属离子溶液，使终浓度分别为1mmol/L和2mmol/L，测定几丁质脱乙酰酶酶活力。结果显示，Sr2+、Na+等对几丁质脱乙酰酶活性有促进作用，Sr2+浓度为2mmol/L对酶活促进作用最强，Co2+、Ba2+、EDTA等对几丁质脱乙酰酶活性有抑制作用。

Claims (2)

1.一种硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.16934。
2.一种利用权利要求1所述的硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)MCDA3-3产几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将硝酸盐还原菌(Nitratireductoraquimarinus)MCDA3-3接种到种子培养基中，180rpm、30℃培养24h，得种子液；将种子液以4％的接种量接种于发酵培养基中，180rpm、30℃培养48h，12000×g、4℃离心10min，取上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶液；种子培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，陈海水配制，pH7.0；发酵培养基：木薯淀粉1.07％，玉米浆1.0％，FeCl3·6H20 0.045％，陈海水配制，pH5.7。
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