CN103146595B - 一种枯草芽孢杆菌及用于发酵生产d-核糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种枯草芽孢杆菌（ Bacillussubtilis ）BAV20120416菌株及用其发酵生产D-核糖的方法，该菌株已于2012年4月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC NO.6013。该菌株是枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变株，具有遗传稳定性好、不易产芽孢等特点；能够在以葡萄糖、玉米浆为主要原料的发酵培养基中积累90g/L以上D-核糖，约为其亲株枯草芽孢杆菌ATCC21360的三倍，发酵周期短，一般控制在50小时左右，低于现有技术约1/3，特别是杂质少，最终发酵液残糖降为0，特别适用于医药生产要求。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及用该菌发酵生产D-核糖的方法。
背景技术
D-核糖是一种极重要的戊醛糖，是生物体内遗传物质核酸的重要组成成分，也是生物体合成部分氨基酸、碱基等的重要中间代谢物，具有重要的生理功能。
D-核糖最先被用于半合成法生产维生素B2。随着D-核糖工业的发展及其应用研究的深入开展，其在食品工业和医药工业等方面的前景也逐渐被认识到，D-核糖可以作为生产原料合成核苷酸类风味增强剂，如5’-IMP、5’-GMP等；在医药工业上，其作为合成抗病毒、抗癌药物的原料药的研究和应用也越来越广泛。同时D-核糖作为存在于所有细胞中的天然成份，与腺苷酸的形成和ATP的再生有着密切的关系，是生命代谢最基本的能量来源之一，在心脏和骨骼肌代谢中起关键作用，能够促进局部组织缺血、缺氧的恢复，在治疗心肌局部缺血、防治因运动引起的肌肉酸痛和抗疲劳方面也具有良好作用。总之，D-核糖具有非常广阔的应用前景。
从十九世纪末人类鉴定出D-核糖以来，D-核糖的生产方法主要经历了酶法水解RNA、以其他糖或有机酸为原料化学合成和利用微生物发酵生产三类。其中，酶法水解RNA分离D-核糖的方法过程繁杂、制造成本高、收率低，不适宜进行大规模生产；化学合成法生产过程中因会用到汞电极点解的工艺过程，易造成严重的环境污染。进入上世纪七十年代，人们开始以代谢控制发酵理论为指导，利用微生物营养缺陷型菌株进行发酵法生产D-核糖的研究。Sasajima在1971年的研究中发现了枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷型菌株在以12.5%葡萄糖为碳源时经过6天发酵，最终发酵液中D-核糖的积累量为35g/L；1976年用改良后的枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株进行好氧发酵，D-核糖的积累量达到72.3g/L。1988年Kishimoto等用短小芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株，在添加芳香族氨基酸的培养基中，D-核糖的产量达92.1 g/L。1997年Wulf用短小芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株生产D-核糖，其产率为45 g/L。1997年江苏微生物研究所邓崇亮等选育的枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株以葡萄糖为底物进行好氧发酵，D-核糖产量高达92 g/L。
经过上述研究者们的研究发现枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株能大量积累D-核糖。另外，通过研究D-核糖生物合成及其相关代谢途径可知，要使微生物大量积累D-核糖除了阻断其下游代谢途径的进行，还应当增加D-核糖前体物的合成，即增加葡萄糖脱氢酶的活力。葡萄糖脱氢酶是该生物合成途径的调节酶，不可逆反应，其活力的大小决定了D-核糖产量高低。在芽孢杆菌中，葡萄糖脱氢酶与芽孢的形成有关，在芽孢形成过程中被诱导产生。然而芽孢的形成会改变微生物体内酶的种类和数量，影响其正常代谢活动，不利于D-核糖的积累。从枯草芽孢杆菌中分离得到的D-核糖高产菌株，葡萄糖脱氢酶的合成不受抑制，能够独立存在于营养体细胞中，Sasajima的研究也印证这一点，他对D-核糖生产菌株进行反复诱变，在维持转酮酶缺失的情况下，选育出一株葡萄糖脱氢酶活力高和芽孢生成能力丧失的突变株，D-核糖产量达70 g/L。
上述的国内外报道中，通过选育枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株进行D-核糖发酵，在D-核糖的产量上达到一个较高的水平，但是还存在残糖高、发酵液杂质多的缺点，不利于D-核糖的后续提取；发酵过程易生成芽孢，影响D-核糖的产量；发酵周期长，一般大于70小时。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丧失芽孢生成能力、稳定高产D-核糖的枯草芽孢杆菌，及该菌种发酵生产D-核糖的方法，以克服现有技术残糖高、易产生芽孢、发酵周期长的缺陷。
本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BAV20120416，是以购自北京北纳创联生物技术研究院的一株可少量积累D-核糖的菌株ATCC21360为出发菌株，采用常规诱变方法，对ATCC21360进行紫外线、亚硝基胍等物理、化学诱变剂处理，经过多次反复诱变筛选培育出来的，能使最终发酵液残糖降为0、其他杂质少，发酵过程不易产生芽孢，发酵周期短，且能稳定进行D-核糖工业化生产的菌株。
本发明所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BAV20120416菌株，已于2012年4月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC NO.6013，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
一、枯草芽孢杆菌BAV20120416的获得
以枯草芽孢杆菌ATCC21360为起始菌株，在斜面培养基上，32~38℃条件下培养1~2天，刮取菌体细胞于无菌生理盐水，制成菌悬液，使细胞浓度为1×108~109个/mL。按照常规诱变方法，用紫外灯、亚硝基胍等物理、化学诱变剂相间或连续处理。取上述菌悬液于培养皿中，置于15W紫外灯下，距离20cm，照射0.5~5分钟；取上述菌悬液用1mg/mL的亚硝基胍处理液，32~38℃保温震荡30~60分钟，将亚硝基胍处理过的菌体离心，用生理盐水冲洗几遍，以去除残留的亚硝基胍。将用紫外灯、亚硝基胍相间或连续处理过的菌液涂布于平板培养基上，32~38℃条件下培养1~2天，取单菌落分别点于基本培养基与补充培养基上，筛选在补充培养基上生长良好，而在基本培养基上不能生长的菌落，即枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷型菌株。将筛选的菌株经种子培养基和发酵培养基摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，选育出一株遗传性质稳定、不易生芽孢、发酵周期短、高产D-核糖的菌株，即为保藏号为CGMCC NO.6013的枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株（Bacillussubtilis）BAV20120416。
上述枯草芽孢杆菌BAV20120416生物学特征：细胞大小0.7~0.8×2~3微米，呈短杆状，单生、成对或呈链状排列，无荚膜，能运动，菌落圆形或不规则状，菌落扁平、表面粗糙不透明、污白色或微黄色。生理生化特性：革兰氏染色阳性，好氧，化能异养，液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，接触酶阳性，可同化糖类（葡萄糖、山梨醇、可溶性淀粉、甘露醇、果糖等），可利用氮源（硫酸铵、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆等），生长pH 5~8，生长温度32~38℃。
二、新菌种BAV20120416发酵生产D-核糖的方法
1、斜面培养
将上述诱变获得的枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株BAV20120416接种于斜面培养基，32~38℃培养1~2天，制得斜面菌种。
2、种子培养
取斜面菌种接种于种子培养基32~38℃摇床培养12~16h，制得发酵用种子菌液，OD值1.2-1.5。
3、发酵培养
按5%~10%（按体积%）的接种量将种子液接入预先准备好的发酵培养基中，32~38℃条件下进行发酵培养，发酵时间40~60h，发酵液初始pH 6.5~7.2，发酵过程中通过流加酸碱使发酵液pH控制在5.6~7.0，发酵过程中定时取样，观察菌种生长状态，测定发酵液中葡萄糖和D-核糖的浓度，当发酵液中葡萄糖浓度降到0，维持一段时间，D-核糖浓度不再上升时，发酵结束。
上述斜面培养基组成（%）：蛋白胨0.5~2.0，玉米浆 0.5~1.0，酵母粉 0.5~1.0，氯化钠 0.2~0.5，硫酸锰 0.005~0.01，琼脂1.2~2.0，调节pH 6.5~7.2。
上述种子培养基组成（%）：葡萄糖 1.0~3.0，玉米浆 0.5~1.0，磷酸氢二钾 0.2~0.5，磷酸二氢钾 0.05~0.2，硫酸锰 0.005~0.02，调节pH 6.5~7.2。
上述发酵培养基组成（%）：葡萄糖 12.0~20.0，玉米浆 1.0~3.0，硫酸铵 0.3~1.0，磷铵 0.2~1.0，硫酸锰 0.005~0.02，调节pH 6.5~7.2。
上述发酵液中葡萄糖的测定方法：使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-40D型生物传感分析仪，通过固定化葡萄糖氧化酶膜专一的测定发酵液中葡萄糖含量。
D-葡萄糖+H2O 葡萄糖氧化酶 D-葡萄糖酸+H2O2
上述D-核糖的测定方法：采用Dionex U3000液相色谱***测定发酵液中D-核糖的含量，具体条件如下：
泵：Dionex U3000 Pump
柱：Kromasil 100-5NH2(200×4.6mm)
流动相：乙腈：水=70:30（V：V）
流速：1.0ml/mL
柱温：40℃
检测器：Shodex RI-101示差检测器
本发明BAV20120416和亲株ATCC21360发酵葡萄糖对比结果见表1：
由上述对比结果可以看出，本发明获得的D-核糖高产菌株BAV20120416是枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变株，具有遗传稳定性好、不易产芽孢等特点；能够在以葡萄糖、玉米浆为主要原料的发酵培养基中积累90g/L以上D-核糖，约为其亲株枯草芽孢杆菌ATCC21360的三倍，发酵周期短，一般控制在50小时左右，低于现有技术约1/3，特别是杂质少，最终发酵液残糖降为0（葡萄糖和核酮糖残留量按现有测试方法，均未检出），特别适用于医药生产要求，较现有菌种有较大优势，是具有工业化应用潜力的优良菌株；而采用现有菌株发酵生产的核糖，其中约残留1%的残糖杂质，达不到医药生产标准的要求。
附图说明
图1表示本发明菌株最终发酵液D-核糖含量测定的液相色谱图
图2表示现有亲株最终发酵液D-核糖含量测定的液相色谱图
（注：样品均为稀释5倍后进样）
由图1可看出，本发明菌株BAV20120416的最终发酵液里，除溶剂峰外，只有一个D-核糖峰，D-核糖的样品量为0.0189×5g/ml，即94.5g/L。由图2可以看出，现有亲株ATCC21360的最终发酵液里，除溶剂峰、D-核糖峰，还有葡萄糖峰和核酮糖峰，D-核糖的样品量为0.0067×5g/ml，即33.5 g/L；葡萄糖的样品量为0.0010×5g/ml，即5g/L，也就是说最终发酵液里存在残糖；另外还有一个核酮糖峰，说明在现有亲株ATCC21360的发酵过程产生了其他杂质。
具体实施方式
实施例1
将枯草芽孢杆菌ATCC21360在斜面培养基上，35~38℃条件下培养2天，刮取菌体细胞于无菌生理盐水，制成菌悬液，是细胞浓度为1×108~109个/mL。按照常规诱变方法，用紫外灯、亚硝基胍等物理、化学诱变剂相间或连续处理。取上述菌悬液于培养皿中，置于15W紫外灯下，距离20cm，照射0.5~5分钟；取上述菌悬液用1mg/mL的亚硝基胍处理液，35~38℃保温震荡30~60分钟，将亚硝基胍处理过的菌体离心，用生理盐水冲洗几遍，以去除残留的亚硝基胍。将用紫外灯、亚硝基胍相间或连续处理过的菌液涂布与平板培养基上，35~38℃条件下培养1~2天，取单菌落分别点于基本培养基与补充培养基上，筛选在补充培养基上生长良好，而在基本培养基上不能生长的菌落，即枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷型菌株。将筛选的菌株经种子培养基和发酵培养基摇瓶发酵复筛和进一步分离筛选，选育出一株遗传性质稳定、不易生芽孢、发酵周期短、高产D-核糖的菌株，即枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株BAV20120416。
上述亚硝基胍处理液配制：称取10mg亚硝基胍于棕色瓶中，加入1mL丙酮使其溶解，再加入水10mL，配成1mg/mL的亚硝基胍处理液。
上述斜面培养基组成（%）：蛋白胨0.5~2.0，玉米浆 0.5~1.0，酵母粉 0.5~1.0，氯化钠 0.2~0.5，硫酸锰 0.005~0.01，琼脂1.2~2.0，调节pH 6.5~7.2。
上述平板培养基组成（%）：蛋白胨0.5~2.0，玉米浆干粉 0.5~1.0，酵母粉 0.5~1.0，氯化钠 0.2~0.5，硫酸锰 0.005~0.01，琼脂1.2~2.0，调节pH 6.5~7.2。
上述基本培养基组成（%）：葡萄糖 0.5~1.0，硫酸铵 0.1~0.3，磷酸氢二钾 0.5~1.5，磷酸二氢钾 0.3~0.8，硫酸镁 0.01~0.04，硫酸锰 0.001~0.01，琼脂 1.2~2.0，调节pH 6.5~7.2。
上述补充培养基组成（%）：在基本培养基中添加40~60mg/mL的莽草酸。
上述种子培养基组成（%）：葡萄糖 1.0~3.0，玉米浆 0.5~1.0，磷酸氢二钾 0.2~0.5，磷酸二氢钾 0.05~0.2，硫酸锰 0.005~0.02，调节pH 6.5~7.2。
上述发酵培养基组成（%）：葡萄糖 14.0~20.0，玉米浆 1.0~3.0，硫酸铵 0.3~1.0，磷铵 0.2~1.0，硫酸锰 0.005~0.02，调节pH 6.5~7.2。
实施例 2
将诱变获得的枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株BAV20120416接种于斜面培养基，36℃培养2天，制得斜面菌种。取一环斜面菌种接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，36℃，150 r/min摇床培养14h，按10%的接种量接入预先准备好的装有500mL发酵培养基的5L摇瓶中，36℃下，转速150r/min进行摇床发酵培养，发酵48小时后，经测定发酵液中葡萄糖含量降到0，D-核糖含量达到90.2g/L；而其亲株ATCC21360在相同条件下，需培养72小时，且发酵液中葡萄糖含量降到4 g/L后不再下降，发酵液中D-核糖含量仅为29.7g/L。
上述斜面培养基组成（%）：蛋白胨 1.0，玉米浆 0.5，酵母粉 0.5，氯化钠 0.5，硫酸锰 0.005，琼脂 2.0，调节pH 7.0~7.2。
上述种子培养基组成（%）：葡萄糖 2.0，玉米浆 0.5，磷酸氢二钾 0.3，磷酸二氢钾 0.1，硫酸锰 0.005，调节pH 6.8~7.0。
上述发酵培养基组成（%）：葡萄糖 14.0，玉米浆 2.0，硫酸铵 1.0，磷铵 0.4，硫酸锰 0.01，调节pH 6.8~7.0。
实施例 3
将上述诱变获得的枯草芽孢杆菌转酮酶缺陷突变株BAV20120416接种于茄瓶的斜面培养基上，37℃培养2天，制得大斜面菌种。往茄瓶中加入无菌水洗下菌种，制成菌悬液，将该菌悬液接种于装有800mL种子培养基的5L摇瓶中，37℃下，转速150r/min摇床培养16小时，按10%的接种量接入预先准备好的发酵培养基中，50L发酵罐装液量30L，37℃下进行通风搅拌培养，其中搅拌速度为200~300r/min，通气量为1~2Nm3/h，罐内压力0.05Mpa，发酵液初始pH6.5~7.2，发酵过程中通过流加酸碱使发酵液pH控制在5.4~7.0，发酵过程中定时取样测定发酵液中葡萄糖和D-核糖的浓度。发酵49小时后，发酵液中葡萄糖含量降到0，发酵结束，测定D-核糖浓度94.5 g/L；而其亲株在相同条件下，发酵时间74小时，且发酵液中葡萄糖含量降到6 g/L后不再下降，D-核糖含量仅为33.5g/L。
上述斜面培养基组成（%）：蛋白胨 1.0，玉米浆 0.5，酵母粉 0.5，氯化钠 0.5，硫酸锰 0.005，琼脂 2.0，调节pH 7.0~7.2。
上述种子培养基组成（%）：葡萄糖 2.0，玉米浆 0.5，磷酸氢二钾 0.3，磷酸二氢钾 0.1，硫酸锰 0.005，调节pH 6.8~7.0。
上述发酵培养基组成（%）：葡萄糖 18.0，玉米浆 2.0，硫酸铵 1.0，磷铵 0.4，硫酸锰 0.01，调节pH 6.8~7.0。
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BAV20120416菌株，已于2012年4月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC NO.6013。
2.一种应用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BAV20120416发酵生产D-核糖的方法，其特征在于通过斜面培养、种子培养和发酵培养，生产D-核糖；所述斜面培养基组成%为：蛋白胨0.5~2.0，玉米浆 0.5~1.0，酵母粉 0.5~1.0，氯化钠 0.2~0.5，硫酸锰 0.005~0.01，琼脂1.2~2.0，调节pH 6.5~7.2； 所述种子培养基组成%为：葡萄糖 1.0~3.0，玉米浆 0.5~1.0，磷酸氢二钾 0.2~0.5，磷酸二氢钾 0.05~0.2，硫酸锰 0.005~0.02，调节pH 6.5~7.2；所述发酵培养基组成%为：葡萄糖 12.0~20.0，玉米浆 1.0~3.0，硫酸铵 0.3~1.0，磷铵 0.2~1.0，硫酸锰 0.005~0.02，调节pH 6.5~7.2。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌BAV20120416发酵生产D-核糖的方法，其特征在于所述的斜面培养的操作条件为：将枯草芽孢杆菌株BAV20120416接种于斜面培养基，32~38℃培养1~2天，制得斜面菌种。
4.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌BAV20120416发酵生产D-核糖的方法，其特征在于所述的种子培养的操作条件为：取斜面菌种接种于种子培养基32~38℃摇床培养12~16h，制得发酵用种子菌液。
5.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌BAV20120416发酵生产D-核糖的方法，其特征在于所述的发酵培养的操作条件为：按5~10体积%的接种量将种子液接入预先准备好的发酵培养基中，32~38℃条件下进行发酵培养，发酵时间40~60h，发酵液初始pH 6.5~7.2，发酵过程中通过流加酸碱使发酵液pH控制在5.6~7.0，发酵过程中定时取样，观察菌种生长状态，测定发酵液中葡萄糖和D-核糖的浓度，当发酵液中葡萄糖浓度降到0，维持一段时间，D-核糖浓度不再上升时，发酵结束。
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