CN1285916A - 白细胞计数方法和白细胞计数装置 - Google Patents

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Abstract

一种白细胞计数方法,包括在一种血小板制品溶液或一种红细胞制品溶液中添加一种溶细胞试剂,以溶解在一个白细胞容器里相应的溶液中的血小板或红细胞,将容器进行离心,使白细胞聚集在底部部分,并对所聚集的白细胞进行计数,所述容器包括一个开口,一个侧壁部分和一个底部部分,且其中的侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口部分的方向逐渐增加的水平横截面积。

Description

白细胞计数方法和白细胞计数装置
技术领域
本发明涉及用于白细胞计数的一种方法和用于白细胞计数的装置。特别是，本发明涉及适合于对血小板制品和红细胞制品中的白细胞进行计数的方法和装置。
背景技术
血小板制品和红细胞制品主要用于缓解血小板减少症和贫血症，外科手术等病症。考虑到副作用等因素，为保证质量起见，在血小板制品和红细胞制品中最好没有白细胞存在。因此，为控制质量，应计量存留在血小板制品或红细胞制品中的少量的白细胞的数量。
通常，通过暴露白细胞的细胞核并将其进行染色，对血小板制品和红细胞制品中的白细胞进行计数。即，将白细胞用离心机等进行聚集，染色和随后放置在Nageotte室(血细胞计)中由观测者利用显微镜用肉眼计数。由于在此方法中血小板很难溶解，但是，白细胞隐蔽在血小板中，这将导致降低测量的精度。另外，用肉眼观测效率非常低下。再有，在该测量方法中，观测者常接触到血液制品而有受到生物危害(生物的污染)的可能性。因此，现在就需要有一种可以自动化和方便地进行操作以及能改善测量精度的安全的方法。
另一方面，通常为进行测量必须暴露白细胞的细胞核以对白细胞进行染色。已知为此目的添加了一种表面活性剂。但是，没有已知的用于白细胞计数的方法，其中使用了一种能暴露白细胞的细胞核并能溶解血小板或红细胞的溶细胞试剂以便溶解血小板制品或红细胞制品中的血小板或红细胞。
发明内容
鉴于上述情况完成了本发明。本发明的目的是要提供一种便于测量血小板制品或红细胞制品中白细胞数量的方法和装置。
作为本发明为达到上述目的的努力结果，可以看到白细胞计数的测量得到简化，和得到一种不需要肉眼观测的测量装置，这是通过使用一种能够暴露白细胞细胞核并能溶解血小板或红细胞的溶细胞试剂而做到的，因为这种溶细胞试剂在将其添加于血小板制品溶液或红细胞制品溶液时，能够暴露白细胞细胞核并能溶解血小板或红细胞。
这就是说，本发明提供了一种通过为白细胞染色对血小板制品中的白细胞进行计数的方法，包括添加能够暴露白细胞细胞核和将血小板溶解于血小板制品中的溶细胞试剂，从而暴露白细胞细胞核并将血小板溶解于血小板制品溶液中。
在本说明中，使用了术语“血小板制品”和“血小板制品溶液”。关于这些术语，如果血小板制品原来就是溶液的形式，“血小板制品”就等价于“血小板制品溶液”。即使在血小板制品为固体或类似的形式的情况下，制品在溶解以后也可以作为溶液使用。
本发明还提供了一种通过对白细胞染色用以计算血小板制品中的白细胞数量的方法，包括：
混合并摇动在一个汇集容器中的血小板制品溶液，一种能够暴露白细胞细胞核和溶解血小板的溶细胞试剂和一种染料的溶液，以溶解血小板，暴露白细胞的细胞核和为白细胞染色，该容器包括一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部或全部的水平横截面沿着由底部部分向开口的方向逐渐增大，
将汇集容器放在一个离心机上使着色的白细胞聚集在汇集容器的底部部分，和
计算着色的白细胞的数目。
在通过暴露白细胞细胞核和使白细胞着色进行测量时，真正计量的通常是个别的白细胞暴露了的着色的细胞核DNA团粒。在本说明书中，术语“白细胞”所说的不仅是正常状态下的白细胞，也包括白细胞暴露了的着色的细胞核DNA团粒。
在上述的用于血小板制品中白细胞计数的方法中，添加于血小板制品溶液中的溶细胞试剂优选选自阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。添加于血小板制品溶液中的溶细胞试剂的量优选地为0.2到5％(w/v)。
本发明还提供了一种用于通过对白细胞进行着色计算血小板制品中白细胞数目的方法，包括：
将血小板制品溶液放在一个汇集容器中，该容器包括一个开口，一个侧壁部分，和一个具有一个白细胞不能通过的薄膜过滤器的底部部分，侧壁部分的一部或全部的水平横截面沿着由底部部分到开口的方向逐渐增大，
通过配置在含有血小板制品溶液的汇集容器底部部分的薄膜过滤器过滤血小板制品溶液以便在底部部分聚集白细胞，
在聚集在底部部分的白细胞中添加一种表面活性剂和一种染料以暴露白细胞的细胞核并使白细胞着色，和
计算着色的白细胞的数目。
本发明还提供了一种用于通过对白细胞进行着色计算红细胞制品中白细胞数目的方法，包括将一种能够暴露白细胞细胞核并能溶解红细胞的溶细胞试剂添加于红细胞制品溶液以暴露白细胞细胞核和溶解红细胞制品溶液中的红细胞。
在本说明中，使用了术语“红细胞制品”和“红细胞制品溶液”。关于这些术语，如果红细胞制品原来就是溶液的形式，“红细胞制品”就等价于“红细胞制品溶液”。即使在红细胞制品为固体形式的情况下，制品在溶解以后也可以作为溶液使用。
本发明还提供了一种通过对白细胞染色用以计算红细胞制品中的白细胞数量的方法，包括：
混合并摇动在一个汇集容器中的红细胞制品溶液，一种能够暴露白细胞细胞核和溶解红细胞的溶细胞试剂和一种染料的溶液，以溶解红细胞，暴露白细胞的细胞核和为白细胞染色，该容器包括一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部或全部的水平横截面沿着由底部部分向开口的方向逐渐增大，
将汇集容器放在一个离心机上使着色的白细胞聚集在汇集容器的底部部分，和
计算着色的白细胞的数目。
在上述的用于红细胞制品中白细胞计数的方法中，溶细胞试剂优选选自阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。添加于红细胞制品溶液中的溶细胞试剂的量优选地为0.1到10％(w/v)。
本发明还提供了一种白细胞汇集容器，该容器包括一个开口，一个底部部分，和一个侧壁部分，侧壁部分的一部或全部的水平横截面沿着由底部部分到开口的方向逐渐增大。本发明还提供了这样一种白细胞汇集容器，其中底部部分具有具有一个白细胞不能通过的薄膜过滤器。根据本发明的汇集容器的底部部分的最大直径优选地为0.2到5mm。底部部分的最大直径意味着与底部部分的形状无关的最长的直径。例如，如果底部部分为圆形，该圆的直径为最大直径。如果其为四边形，对角线的长度为最大直径。
本发明还提供了一种用于白细胞计数的装置，包括：
上述的具有一个开口，一个底部部分和一个侧壁部分的任何一种白细胞汇集容器，其侧壁部分的一部或全部的水平横截面沿着由底部部分向开口的方向逐渐增大，
一个用于将该白细胞汇集容器底部部分的状态反射成一个图像的透镜部分，其放大率可随透镜的位置而改变，
用于通过对由透镜部分反射出的白细胞汇集容器底部部分的图像的分析，检测聚集在白细胞汇集容器底部部分上的白细胞数目的检测装置，和
用以输出由检测装置所得到的检测结果的输出装置，
其中的检测装置包括一个图像-捕获部分，该部分具有一个用以捕获由透镜部分反射的白细胞汇集容器底部部分的图像的图像-捕获表面，一个图像分析处理器，用以识别图像-捕获表面上的白细胞汇集容器底部部分图像中的白细胞，和一个用于白细胞计数的计数器，和
白细胞汇集容器底部部分的大小应使检测装置的图像-捕获表面中的整个底部部分的图像是一个图像。图像-捕获部分优选地包括有CCD图像-处理装置。
以下将对本发明作详细的说明。&#60计算血小板制品中白细胞数目的方法&#62
在本发明的白细胞计数的第一种方法中，将一种能够暴露白细胞细胞核和溶解血小板的溶细胞试剂添加于血小板制品溶液中以暴露白细胞细胞核和溶解血小板制品溶液中的血小板；使用了染料等对白细胞进行染色；随后对血小板制品溶液中的白细胞进行计数。在添加溶细胞试剂以后，优选地要适当摇动血小板制品溶液使溶细胞试剂充分地扩散于溶液中。
在本发明的方法中使用的溶细胞试剂没有特别的限制，只要其能够暴露白细胞细胞核和溶解血小板即可。具体的例子包括阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂，非离子表面活性剂，等等。
上述的阴离子表面活性剂具体包括十二烷基硫酸钠，牛磺脱氧胆酸钠，脱氧胆酸钠，十四烷基硫酸钠，十二烷基磺酸钠，十四烷基磺酸钠，胆酸钠，牛磺胆酸钠等等。上述的阳离子表面活性剂具体包括溴化十六烷基三甲基铵，氯化十四烷基三甲基铵，溴化十二烷基嘧啶，氯化十六烷基嘧啶等等。上述的两性离子表面活性剂具体包括CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-丙烷磺酸盐)，CHAPSO(3-[3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐)，十六酰溶血卵磷脂，十二烷基-N-甜菜碱等等。
上述非离子表面活性剂具体包括Triton x-100(商品名)，Nonidet P-40(商品名)，Igepal CA-630(商品名)，辛基葡糖苷，Tween 20(商品名)，Tween 80(商品名)，Triton x-405(商品名)，十二烷基葡糖苷，Sterox 67-K(商品名)，Triton x-102(商品名)，庚基硫代葡糖苷，癸基葡糖苷，壬基葡糖苷，辛基麦芽苷，十二烷基麦芽苷，癸酰基-N-甲基葡糖胺，聚氧乙烯十二烷基醚(例如，那些可购到的商品名为Brij系列，Lubrol W和AL系列等)，聚氧乙烯七甲基己基醚(例如，那些可购到的商品名为Nikkol BTD系列等)，聚氧乙烯异辛苯基醚(例如，那些可购到的商品名为Triton x系列，Nikkol OP系列等等)，聚氧乙烯壬基苯基醚(例如，那些可购到的商品名为Triton N系列，Nikkol NP系列等等)，聚氧乙烯脂肪酸酯(例如，那些可购到的商品名为Span系列，Sterox CO系列等等)，蔗糖脂肪酸酯，聚氧乙烯山梨醇酯(例如，那些可购到的商品名为Tween系列，Emasol系列等等)等等。
在这些表面活性剂中，优选地在本发明中用作溶细胞试剂为十二烷基硫酸钠，牛磺脱氧胆酸钠，Triton X-100，Nonidet P-40，IgepalCA-630，辛基葡糖苷Tween 20等等。更为优选地，使用Triton X-100，Nonidet P-40，Igepal CA-630等等。Triton X-100等是特别优选的。
在本发明中，可以使用一种或多种溶细胞试剂。
添加于血小板制品溶液中的溶细胞试剂的优选的数量(溶细胞试剂在血小板制品溶液中的浓度)可以通过进行一次预先的试验来确定。尽管这依赖于血小板制品和溶细胞试剂的类型，离心作用的条件等因素，溶细胞试剂在血小板制品溶液中的浓度优选地为0.2到5％(w/v)，更为优选地为0.5到4％(w/v)，特别优选地为0.8到2％(w/v)。浓度在此范围内时，差不多所有的血小板都被溶解而且所添加的溶细胞试剂极少发生沉积。因此，血小板制品溶液显示出很好的透光度。此外，该范围为在其中使白细胞的细胞核可以暴露到能够充分进行染色和精确进行计数的程度。
按照本发明的方法，甚至在样本包含很少量白细胞的情况下，由于血小板被溶解，白细胞不可能为血小板所覆盖，也可很容易地获得精确的白细胞计数。
当本发明所使用的溶细胞试剂的浓度在上述的适合于溶解血小板的范围之内时，也能暴露白细胞的细胞核。即，该溶细胞试剂可用以暴露血小板制品溶液中的白细胞细胞核并溶解其中的血小板。
在添加溶细胞试剂之后，优选地使用一种通常用于测量器具的搅拌器搅动血小板制品溶液以暴露白细胞细胞核和溶解血小板。优选地搅动溶液5秒到2分钟，特别是，优选地搅动10秒到1分钟。如果在此时间范围的持续进行搅拌，白细胞的细胞核将会暴露得足以进行着色并且暴露了的细胞核很难受到破坏。
在本发明的方法中，白细胞可以用通常的方法进行染色。例如，将一种能暴露白细胞细胞核并溶解血小板的溶细胞试剂添加于血小板制品溶液中；用一个搅拌器搅动混合物以暴露白细胞细胞核；在其中添加染料对暴露的细胞核进行染色。作为另一种选择，溶细胞试剂和染料二者可以在溶液被搅拌之前添加，这也包含在本发明的方法之内。如果溶细胞试剂和染料同时添加，它们可以是分别地添加于血小板制品溶液中。但是，从可操作性的角度讲，优选地可以将预先混合的两种试剂所得到的混合物添加于血小板制品溶液中。
优选地用于对暴露的白细胞细胞核进行着色的染料包括花青，菲啶/吖啶和吲哚/咪唑。特别是，在菲啶/吖啶染料中，碘化丙锭，溴化乙锭和乙锭均二聚体(ethidium homodimer)是优选的。在吲哚/咪唑染料中Hoechst 33258，Hoechst 33342，DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)，DIPI(4’，6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)等等。
此外，在本发明中通过“染色”检测白细胞包括利用广泛用于免疫分析方法中的“冷光”，“荧光”等检测白细胞。例如，为检测和区分具有不同抗原决定簇的两类白细胞，通过将第一荧光染料结合在与一类白细胞特异的抗原决定簇相应的抗体上制成第一抗体-荧光染料耦合物，同时将第二荧光染料结合在与另一类白细胞特异的抗原决定簇相应的抗体上制成第二抗体-荧光染料耦合物，两种耦合物一并添加于含有多种白细胞类型的样本中。第一抗体-荧光染料耦合物和第二抗体-荧光染料耦合物分别结合在与每一种抗体相应的白细胞上。具有两种不同抗原决定簇中每一种的白细胞可以利用荧光过滤器分别计数，该过滤器能够有区分地检测第一荧光染料和第二荧光染料中的每一种。当测量出度量样本中总的白细胞计数时，结合在第一抗体-荧光染料耦合物上的白细胞的数量或结合在第二抗体-荧光染料耦合物上的白细胞的数量也可测量出来。
利用上述白细胞计数的第一种方法，血小板制品溶液中的白细胞可以通过白细胞着色以简单的方式进行计数。即，本发明的白细胞计数的第二种方法是根据上述的第一种方法利用一个汇集容器进行白细胞计数的方法，其中的容器包括一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积。
特别是，在第二种白细胞计数的方法中，血小板制品溶液，能够暴露白细胞细胞核并能溶解血小板的溶细胞试剂和染料三者的溶液被混合于一个汇集容器中，该容器具有一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积；随后摇动所得到的溶液以溶解血小板，暴露白细胞细胞核和使白细胞着色；将汇集容器放置在一个离心机上在汇集容器的底部部分聚集着色的白细胞细胞核；对白细胞细胞核进行计数。至于这里所使用的汇集容器，可优选地使用下面所描述的一种白细胞汇集容器。白细胞可以在如上所述的白细胞细胞核被暴露的同时进行染色，也可在白细胞细胞核被暴露以后在一个单独的过程中进行着色。
白细胞计数的第三种方法为通过对白细胞进行染色计算血小板制品中白细胞数量的方法，其中血小板是利用一个汇集容器用过滤除去，容器包括一个开口，一个侧壁部分，和一个带有一个白细胞不能通过的薄膜过滤器的底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积，不需要溶解血小板。
即，第三种白细胞计数方法的特征在于将血小板制品溶液放置在前述的底部具有薄膜过滤器的汇集容器内，通过含有血小板制品溶液的汇集容器底部部分上的薄膜过滤器过滤血小板制品溶液，使白细胞聚集在底部部分，将一种表面活性剂和一种染料添加于聚集在底部部分的白细胞，以暴露白细胞细胞核并对其进行染色，对白细胞细胞核进行计数。至于汇集容器，可优选地使用下面所描述的本发明的白细胞汇集容器。如果一种血小板制品被用作一个样本，在汇集容器的底部部分可以使用任何一种血小板可以通过而白细胞不能通过的薄膜过滤器。优选地，孔的大小为约3到7μm，特别优选地为约4到6μm。
在白细胞计数的第三种方法中，白细胞细胞核用表面活性剂和染料暴露和着色是充分的，而且可由通常的方法完成。例如，作为活化剂，可以使用通常浓度下的Span，Arlacel，Tween，Triton等系列的表面活性剂以暴露白细胞细胞核。在第三种白细胞计数方法中，可以使用前述的能够暴露白细胞细胞核并能溶解血小板的溶细胞试剂以代替表面活性剂。应该理解，这样一种实施方案也包括在本发明的白细胞计数的第三种方法之中。
如果白细胞聚集在上述汇集容器的底部部分而过滤未能溶解或分离和除去血小板，白细胞将埋藏在存在于血小板制品溶液中的大量血小板中，这将使检测白细胞变得困难。但是，使用第一种白细胞计数方法血小板已被溶解，或通过过滤将血小板除去。于是，甚至使用一个小面积的底部部分的白细胞汇集容器在容器底部部分汇集白细胞，白细胞也不太可能埋藏在血小板中。因此，白细胞可以在一个小面积内被检测到，从而可以减少检测所需的劳动。
检测聚集在底部部分并被着色的白细胞可以，例如，使用惯常的方法如由观测者利用显微镜用肉眼观测。下面将详细描述适合于实施上述方法的白细胞计数装置和上述的白细胞汇集容器。&#60计算红细胞制品中白细胞数量的方法&#62
利用与用于上述血小板制品相似的方法和装置，可以通过溶解红细胞，暴露白细胞细胞核并对其进行染色，计数存在于红细胞制品中的白细胞。当测量红细胞制品中白细胞的数量时，添加于红细胞制品溶液中的溶细胞试剂为能暴露白细胞细胞核并能溶解红细胞的一种。其特定的实施例和优选的实施例和前面所描述的能够暴露白细胞细胞核并能溶解血小板的溶细胞试剂相似。在需计算红细胞制品中白细胞的数量的情况下，添加于红细胞制品溶液中的溶细胞试剂的浓度如下所述。
添加于红细胞制品溶液中的溶细胞试剂的优选量(红细胞制品溶液中溶细胞试剂的浓度)也可由进行一次预先的试验来确定。尽管其依赖于红细胞制品和溶细胞试剂的类型，离心的条件等，红细胞制品溶液中溶细胞试剂的浓度优选地为0.1到10％(w/v)，更为优选地0.2到5％(w/v)，特别优选地为0.5到3％(w/v)。在此范围内的浓度，差不多溶解了所有的红细胞且所添加的溶细胞试剂很少沉积。于是，红细胞制品溶液具有很好的透光度。此外，在该范围内，白细胞细胞核被充分暴露，从而能够充分着色和进行精确的白细胞计数测量。&#60用于本发明白细胞计数的白细胞汇集容器和装置&#62
用于本发明白细胞计数的装置(下面也称之为“本发明的测量装置”)包括：
(1)一个白细胞汇集容器，包括一个开口，一个底部部分和一个侧壁部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积，
(2)一个透镜部分，用以将白细胞汇集容器底部部分的状态反射成一个图像，其放大率可由透镜的位置予以改变，
(3)检测装置，用以通过分析由透镜部分所反射的白细胞汇集容器底部部分的图像检测聚集在白细胞汇集容器底部部分的白细胞的数量，和
(4)输出装置，用以输出检测装置所得到的检测结果，
其中所说的检测装置包括：
(5)一个图像-捕获部分，具有一个图像-捕获表面用以捕获由透镜部分所反射的白细胞汇集容器底部部分的图像，
(6)一个图像分析处理器，用以由图像-捕获表面上白细胞汇集容器底部部分的图像识别白细胞，和
(7)一个计数器，用于白细胞计数，和
(8)所说的白细胞汇集容器的底部部分的大小应使检测装置的图像-捕获表面中的整个底部部分的图像是一个图像。
上述用于白细胞计数的装置使用了本发明的白细胞汇集容器，容器包括一个开口，一个底部部分和一个侧壁部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积(此后，本发明的白细胞汇集容器可称为“本发明的容器”)。本发明的该白细胞汇集容器将首先参照图4到12进行说明。&#601&#62本发明的白细胞汇集容器
本发明的容器用于通过离心等在其底部部分聚集白细胞，包括一个底部部分，一个侧壁部分和一个开口。底部部分的形状没有特殊地限制。例如，它可以是圆形，四边形等。但是，当容器连接在本发明的一个白细胞计数装置时，底部部分的形状优选地与白细胞计数装置所具有的图像-捕获表面的形状相似。尽管底部部分的最大直径依赖于包含在下面将予描述的白细胞计数装置中的图像-捕获表面的大小，其优选地为0.2到5mm，特另优选地为1到3mm。底部部分的最大直径无论其形状如何均为底部部分的最长的直径。例如，如果底部部分具有和示于图4到6中的白细胞汇集容器(1)相同的圆形的形状，圆的直径即为最大直径。若其具有和图7到9中所示的白细胞汇集容器(1A)内单独的样本溶液槽相同的四边形的形状，则对角线的长度为最大直径。
底部部分可以带有一个白细胞不能通过的薄膜过滤器，通过过滤使白细胞聚集在底部部分。利用薄膜过滤器的白细胞汇集容器特别适用于血小板制品中白细胞的计数。
开口的形状也没有特别的限制。最大直径优选地为2到20mm，特别优选地为3到15mm。
本发明的容器具有一个侧壁部分，其一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积(此后，该部分可称为“锥形部分”)。由于设置了锥形，一个数量足以进行测定的样本溶液甚至在样本溶液中包含很少量的白细胞的情况下如同血小板制品溶液等也可以放置在容器中，容器的底部部分具有如上所述的优选的小直径。在利用离心作用使白细胞聚集时，可以通过一次离心分离使白细胞基本上聚集在底部部分(当然这有赖于离心的条件)，从而使测量变得简单。
锥形部分可以构成侧壁部分的全部或一部分。优选地，例如，由靠近底部部分的部位设置锥形部分，或由靠近底部部分的部位配置具有等水平横截面的部分并将锥形部分设置在其上。更准确地说，可以这样讲，所设置的锥形部分可以和图4到6所示的容器那样构成侧壁部分的全部，由上面设有等水平横截面部分的底部部分进行配置的锥形部分和图7到9等所示的容器(样本溶液槽)一样。此外，还可以提及设置在一个具有等水平横截面部分上的锥形部分，它是由靠近底部部分处进行设置的，如图10到12等所示的容器那样。
可以使用通常的材料制作本发明的容器。在由下部测量白细胞时，优选地使用一种透明材料。优选地，这类材料为聚苯乙烯树脂，玻璃和丙烯酸树脂，特别优选地为聚苯乙烯树脂等。
如果需要，使用本发明的容器时以一个薄片等覆盖开口，该薄片带有一个结合部分以便在开口上放置一个盖子。
图4到6表示本发明的白细胞汇集容器的一个实施例(此后也称之为“实施方案1的容器”)。图4表示本发明的白细胞汇集容器的横截面前视图。图5为本发明的白细胞汇集容器的平面视图。图6为为本发明的白细胞汇集容器的透视图。
实施方案1的容器(1)具有一个圆形开口(11)，一个圆形的底部部分(13)和一个其全部构成一个锥形部分的侧壁部分(12)。底部部分的直径为3mm，开口的直径为10mm。高为20mm。由于容器是由聚苯乙烯树脂制成并且是透明的，由底部部分可以看到聚集的白细胞。
图7到9表示本发明的白细胞汇集容器的另一个实施例(此后也称之为“实施方案1A的容器”)。图7为本发明的收集型白细胞汇集容器实施例的平面视图。图8为本发明的收集型白细胞汇集容器实施例的横截面前视图。图9为本发明的收集型白细胞汇集容器的收集型容器实施例的横截面侧视图。
实施方案1A的容器(1A)为一个收集型白细胞汇集容器，带有许多样本溶液槽(10)。每一个样本溶液槽(10)为一个储存每一个样本溶液的容器。样本溶液槽(10)具有一个方形的底部部分(13A)和一个方形的开口(11A)。由靠近底部部分的侧壁部分(12A)的一个部位设置了一个锥形部分。此外，在锥形部分上面设置了一个带有等水平横截面的部分。
实施方案1A的容器具有的长度为48mm，宽为88mm和高为22mm。样本溶液槽底部部分的最大直径(方形底部部分的对角线)约为2.8mm。使用了和用于实施方案1的容器的材料相同的材料。
使用了一个可将容器放置在离心机上的可放置实施方案1A的容器的一个槽。该槽可以是通常用于将一个类似于实施方案1A的容器的收集型容器放置在离心机上的那一种。
图10到12表示本发明的白细胞汇集容器的又一个实施例(此后也称之为“实施方案1C的容器”)。图10为本发明的白细胞汇集容器又一个实施例的前视横截面视图。图11为本发明的白细胞汇集容器又一个实施例的平面视图。图12为本发明的白细胞汇集容器又一个实施例的透视图。
实施方案1C的容器(1C)具有一个带有一个锥形部分(12Ba)和一个圆柱部分(12Bb)的侧壁部分。实施方案1C的圆柱部分连接在底部部分(13B)的周边上并具有等水平横截面。在圆柱部分上直到开口(11B)配置了锥形部分(12Ba)。&#60本发明的白细胞计数装置&#62
本发明的白细胞计数装置为一个用于检测聚集在本发明的上述的白细胞汇集容器底部部分的白细胞和进行白细胞计数的装置。
在本发明的一个用于白细胞计数的装置中，白细胞汇集容器的底部部分的状况通过一个透镜部分被反射成一个图像，利用透镜部分可以改变所得图像的放大率并且所得的图像为具有一个图像-捕获表面的检测装置所捕获。即，能够将白细胞汇集容器的底部部分的状态反射成一个图像，并具有能将检测装置的图像-捕获表面上的底部部分的图像的大小改变成白细胞能为检测装置所识别并能进行计数的大小的放大率的任何透镜部分都可以使用。优选地，可以使用1到10的放大率。任何通常用以改变测量器具中图像的放大率的透镜部分只要能如上所述地改变图像放大率即可使用。尽管为简化对***和测量器具的原理的说明，在图15和16所示实施例中只示出了一个透镜，也可以采用多个透镜。
检测装置包括一个具有一个图像-捕获表面的图像-捕获部分，一个用以识别图像-捕获表面上的底部部分图像中的白细胞的图像分析处理器和一个用于白细胞计数的计数器。
图像-捕获部分捕获底部部分的一个图像。在图像-捕获部分上所配置的图像-捕获表面的大小应能使由透镜所反射整个底部部分的图像在一个视野之内。为此目的，应使底部部分的大小，透镜的放大率和图像-捕获表面的大小，或其组合是匹配的。在本发明中，图像-捕获表面的大小通过利用本发明上述的白细胞汇集容器可在通常用于测量器具中的范围之内选定。
从与下述的图像分析处理器相连接考虑，图像-捕获部分优选地包括CCD图像-处理装置。
图像分析处理器对被反射在图像区段的图像-捕获平面上的白细胞进行识别。只要能够识别着色的白细胞，任何图像分析处理器都可以使用，即，可以使用能够识别用于为白细胞染色的荧光染料，荧光物质，冷光物质等的图像分析处理器。为图像分析处理器所识别的白细胞由白细胞计数器进行计数。
测量所得的白细胞数量由输出装置输出。能够使测量者判明白细胞数量的任何输出装置都可使用。通常可以使用诸如打印机或利用监视器进行图像显示等装置。
一种通常用作光学测量器具的器具或装置可连接在本发明的测量装置上。例如，该器具或装置可具有一个用于照射被观测的表面在图像-捕获表面上反射出图像的光源，如氙灯，YAG激光器(532nm)，卤素灯，金属检卤灯或超高压水银灯，一个只能透过特定波长的过滤器，如受激光过滤器和荧光过滤器，一个分光镜等。
在本发明用于白细胞计数的装置中，白细胞聚集在白细胞汇集容器的底部部分上并能在一个小范围内被检测到。如果所观测的容器的底部部分在图像-捕获表面上不是一个图像，必须移动透镜部分等以扫描整个底部部分。但是，这一操作对于本发明的测量装置来讲是不需要的。因此，应能提供一种简单的测量装置，该装置不需要对透镜等器具扫描所得的许多图像进行集成的***或程序。
用于本发明的白细胞计数的装置适合于实施本发明的上述白细胞计数的方法并使血小板制品溶液或红细胞制品溶液中的白细胞计数机械化。因此，可以简单的方式进行测量。利用机械化的测量装置可使白细胞计数自动化。能够利用本发明的白细胞计数装置进行测量的样本不限于血小板制品和红细胞制品，利用所说的装置对其它血液制品中的白细胞数也能进行测量。
将参照图15到17对本发明的白细胞计数装置说明如下。图15表示本发明的白细胞计数装置的一个实施例的原理。图15(ⅰ)表示整个的测量装置(5)，和(ⅱ)表示图像-捕获表面上的一个图像。
聚集的白细胞(3)存在于白细胞汇集容器(1)的底部部分(13)。整个底部部分被透镜部分(51)放大并以一个图像反射在图像-捕获表面(521a)上。在图像-捕获表面(521a)上，白细胞汇集容器(1)整个的底部部分构成一个进行观测的视野(521c)被捕获成一张图像(521b)。一个CCD图像处理器(521)将捕获在图像-捕获表面(521a)上的图像(521b)转换成电信号并将其传输到图像分析处理器(522A)。在图像分析处理器(522A)中，对传输的图像中的着色的白细胞(3)进行识别。被识别出的白细胞(3)的数量由白细胞计数器(523)进行计数并得到总的数量。图像中的白细胞(3)的总数由输出打印机(53)输出。
图16(ⅰ)表示白细胞计数装置比较实施例的原理。图16(ⅱ)表示白细胞汇集容器底部部分可反射在图像-捕获表面的成像部位。与图15所示的白细胞计数装置相比较的差别将主要地描述如下。在图16中所示的白细胞计数装置中，底部部分的整个图像不能为透镜部分(51)所捕获。仅在(ⅱ)中的阴影线部分能够捕获成一个图像。因此，为从构成一个被观测的视野(521e)的白细胞汇集容器(1B)整个的底部部分检测白细胞，必须用透镜部分扫描底部部分以获得许多图像并加以集成从而测量出白细胞的总数。因此，比较实施例的白细胞计数装置在图像分析处理器(522B)中包括一个嵌入的图像-集成程序。对于本发明的白细胞计数装置来讲这样的程序不是必需的。
图17表示本发明的白细胞计数装置的另一个实施方案的原理。对于图17所示的白细胞计数装置，与图15所示本发明的白细胞计数装置相同的部件用相同的数字表示，仅有的几处差别将说明如下。
在图17所示的白细胞计数装置(5)中，在白细胞汇集容器(5)下面配置了一个光源(54)。在光源(54)和白细胞汇集容器(5)底部部分之间设置了一个具有三个激发光滤光器(55a，55b和55c)的激发光滤光器滑动器(55)。由于激发光滤光器滑动器55)放置在光源(54)和底部部分之间，通过滑动激发光滤光器滑动器可以选择激发光滤光器中的任何一个。
还在激发光滤光器滑动器(55)的上方设置了一个分光镜(57)。由激发光滤光器所选择的光透过分光镜(57)并照射在观测表面上。所生成的荧光被分光镜所反射，透过荧光滤光器(56a，56b或56c)并由透镜部分(51)投射到CCD图像处理装置(521)的图像段上。滑动荧光滤光器滑动器(56)可选择三种荧光滤光器中的任何一个。
通过由激发光滤光器(55a，55b和55c)和荧光滤光器(56a，56b和56c)中每一种的三类滤光器中选择合适的一个，图17所示的白细胞计数装置可以很容易地测量出有选择地用不同荧光染料染色的白细胞的数量。
附图简述
图1表示在每一种Triton X-100添加浓度下对血小板制品中血小板计数的测量结果。
图2表示血小板制品溶液在每一种Triton X-100添加浓度下的光的透射率。
图3表示在每一种Triton X-100添加浓度下通过流式细胞仪对红细胞制品中红细胞计数的测量结果和暴露的白细胞细胞核计数的测量结果。
图4为本发明的白细胞汇集容器的一个实施例的前视横截面视图。
图5为本发明的白细胞汇集容器的一个实施例的平面图。
图6为本发明的白细胞汇集容器的一个实施例的透视图。
图7为本发明的收集型白细胞汇集容器的一个实施例的平面图。
图8为本发明的收集型白细胞汇集容器的一个实施例的前视横截面视图。
图9为本发明的收集型白细胞汇集容器的一个实施例的横截面侧视图。
图10为本发明的白细胞汇集容器的另一个实施例的前视横截面视图。
图11为本发明的白细胞汇集容器的另一个实施例的平面视图。
图12为本发明的白细胞汇集容器的另一个实施例的透视图。
图13表示利用本发明的白细胞汇集容器在血小板制品溶液中汇集白细胞时由汇集前到汇集后的过程。提供了白细胞汇集容器的前视横截面视图。(ⅰ)表示汇集前的状态，(ⅱ)表示白细胞细胞核已经暴露和染色并且血小板已经溶解之后的状态，和(ⅲ)表示汇集之后的状态。
图14表示利用本发明的在底部部分带有薄膜过滤器的白细胞汇集容器在血小板制品溶液中汇集白细胞时由汇集前到汇集后的过程。提供了白细胞汇集容器的前视横截面视图。(ⅰ)表示汇集前的状态，(ⅱ)表示通过过滤汇集之后的状态，和(ⅲ)表示白细胞细胞核被暴露并染色之后的状态。
图15表示本发明的白细胞计数装置的一个实施例的原理。(ⅰ)表示整个测量装置，和(ⅱ)表示在图像-捕获表面上的一个图像。
图16表示一个白细胞计数装置的对比实施例的原理。(ⅰ)表示整个测量装置，和(ⅱ)表示在图像-捕获表面上的一个图像。
图17表示本发明的白细胞计数装置的另一个实施例的原理。
实施本发明的最佳方式
下面将描述本发明的实施例。实施例1：血小板制品中的白细胞计数&#601&#62溶解血小板制品溶液中的血小板
将15μL的Triton X-100表面活性剂以各种浓度添加于血小板制品溶液中使最后的浓度为0.01到10％。用涡流搅拌器(应用科学工业)将每一种添加了Triton X-100的血小板制品溶液搅拌20秒以加速白细胞细胞核的暴露，同时利用一个自动血球计数器(Sysmex(商品名)，Toa Medical Electronics Co.，Ltd.)对血小板制品溶液中的血小板数量进行测量以评估Triton X-100对血小板的溶解情况。同时，用一个分光光度计(Beckman)测量血小板制品溶液的透光率。
血小板制品溶液中的血小板数量及其透光率的测量结果示于图1和2。在图1和2中，PRP和PPP分别表示血小板含量多的血浆和血小板含量少的血浆。
如图1所示，可以看出随着Triton X-100浓度的增加血小板制品溶液中的血小板计数将降低，随着Triton X-100浓度的增加血小板将被溶解。可以看出，特别是，当Triton X-100的浓度高于0.2％时大多数的血小板被溶解。
如图2所示，可以看出，样本的透光率随着Triton X-100浓度的增加而增加直到Triton X-100浓度为1％，但是由于Triton X-100的沉积血小板制品溶液开始显现出浑浊，在其浓度超过1％时透光率降低。&#602&#62血小板制品溶液中的白细胞计数
(1)利用离心作用汇集着色的白细胞的方法
如图13所示，添加0.45ml的血小板制品(2)，浓度为10％的0.05ml的Triton X-100和浓度为1mM的碘化丙锭于上述实施方案1(图4到6)的容器中，并用涡流搅拌器搅拌20秒钟使血小板溶解和白细胞细胞核暴露并着色。在图13中，3a和3b分别表示其中的细胞核被暴露并着色前的白细胞和其中的细胞核被暴露并着色后的白细胞。汇集容器被放置在一个离心机(Tomy Seiko Co.Ltd.，ModelLC06-SP)上5分钟以聚集着色的白细胞。
白细胞汇集在其底部部分的容器被放置在配置有CCD图像处理器的白细胞计数装置上，以利用CCD图像处理器检测聚集在底部部分的白细胞并测量白细胞的数量。实施方案1中容器的底部部分的图像能够在CCD图像处理器的图像-捕获表面内形成一个图像。因此，图像-捕获表面等不需要进行扫描。
(2)利用过滤汇集白细胞，暴露细胞核和染色的方法
如图14所示，将0.5ml的血小板制品(2)放在和实施方案1相似但底部部分包括一个薄膜过滤器(131)的容器内，白细胞由抽吸过滤汇集在底部部分。添加浓度为1.0％的0.1ml的Triton X-100和浓度为1mM的0.003ml的碘化丙锭，使白细胞细胞核暴露并着色。数字3a和3b代表和前述的图13中相同的部件。
白细胞聚集在过滤器上的容器被放在一个带有CCD图像处理器的白细胞计数装置上，由CCD图像处理器检测聚集在底部部分上的白细胞并测量白细胞的数量。实施方案1容器的底部部分的图像可以在CCD图像处理器的图像-捕获表面内形成一个图像。因此，图像-捕获表面等不需要进行扫描。实施例2：红细胞制品中的白细胞计数&#601&#62溶解红细胞制品溶液中的红细胞
将15μL的表面活性剂Triton X-100以不同的浓度添加于红细胞制品溶液中使其最后的浓度为0.01到10％。将每一个添加了TritonX-100的红细胞调制溶液用一个涡流搅拌器(应用科学工业)搅拌20秒钟以加速白细胞细胞核的暴露，并用一种自动的血球计数器(Sysmex(商品名)，Toa Medical Electronics Co.，Ltd.)测量红细胞制品溶液中的红细胞数，以评估Triton X-100对红细胞的溶解情况。同时，由一个流式细胞仪(Coulter，Model EICS XL)对白细胞的暴露的细胞核(白细胞细胞核)进行计数。
红细胞制品溶液中的红细胞计数的测量结果和暴露的白细胞细胞核计数的测量结果示于图3。&#602&#62红细胞制品溶液中的白细胞计数
将87μL红细胞制品，浓度为10％的10μL Triton X-100和浓度为1mM的3μL碘化丙锭添加于上述实施方案1的容器(图4到6)中，并用一个涡流搅拌器搅拌20秒钟，使红细胞溶解并使白细胞细胞核暴露和着色。将汇集容器放在一个离心机(Tomy Seiko Co.Ltd.，ModelLC06-SP)上5分钟，以聚集着色的白细胞(相应于图13中数字2表示一种红细胞制品的情况)。
白细胞汇集在其底部部分的容器被放置在配置有CCD图像处理器的白细胞计数装置上，以利用CCD图像处理器检测聚集在底部部分的白细胞并测量白细胞的数量。实施方案1中容器的底部部分的图像能够在CCD图像处理器的图像-捕获表面内形成一个图像。因此，图像-捕获表面等不需要进行扫描。
测量结果表明用作一个样本的一袋红细胞制品(200ml)中的白细胞的数量为2×107。
工业实用性
根据本发明的白细胞计数方法，即使样本包含很少量的白细胞，由于血小板或红细胞已被溶解，白细胞也很难被血小板或红细胞所掩盖，从而可以精确和方便地测量白细胞的数量。特别是，由于利用本发明的白细胞汇集容器，在很小的范围内即可检测到白细胞，从而可以减少测量所需的劳动。另外，本发明的白细胞计数装置可以由一个简单的***构成。本发明的白细胞计数装置使白细胞计数可进行机械化测量，也可自动化测量。

Claims (14)

1．一种通过使白细胞着色对血小板制品中的白细胞进行计数的方法，包括将一种能暴露白细胞细胞核和溶解血小板的溶细胞试剂添加于血小板制品溶液中以暴露血小板制品溶液中白细胞的细胞核并溶解血小板。
2．一种通过使白细胞着色对血小板制品中的白细胞进行计数的方法，包括：
混合并摇动一个汇集容器中的血小板制品溶液，一种能暴露白细胞细胞核和溶解血小板的溶细胞试剂，和一种染料，以溶解血小板，暴露白细胞细胞核并使白细胞染色，该容器包括一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积，
将汇集容器放在一个离心机上使着色的白细胞聚集在汇集容器的底部部分，和
计算着色的白细胞的数量。
3．根据权利要求1或2中所说的白细胞计数方法，其特征在于溶细胞试剂选自阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
4．根据权利要求1到3中任一项所说的白细胞计数方法，其特征在于添加于血小板制品溶液中的溶细胞试剂的量为0.2到5％(w/v)。
5．一种通过使白细胞着色对血小板制品中的白细胞进行计数的方法，包括：
将血小板制品溶液放在一个汇集容器中，该容器包括一个开口，一个侧壁部分和一个带有白细胞不能通过的一个薄膜过滤器的底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积，
通过配置在含有血小板制品溶液的汇集容器的底部部分上的薄膜过滤器对血小板制品溶液进行过滤将白细胞汇集在底部部分，
向聚集在底部部分上的白细胞中添加一种表面活性剂和一种染料以暴露白细胞细胞核并使白细胞着色，和
对着色的白细胞进行计数。
6．一种通过使白细胞着色对红细胞制品中的白细胞进行计数的方法，包括将一种能暴露白细胞细胞核和溶解红细胞的溶细胞试剂添加于红细胞制品溶液中以暴露红细胞制品溶液中白细胞的细胞核并溶解红细胞。
7．一种通过使白细胞着色对红细胞制品中的白细胞进行计数的方法，包括：
混合并摇动一个汇集容器中的红细胞制品溶液，一种能暴露白细胞细胞核和溶解红细胞的溶细胞试剂，和一种染料，以溶解红细胞，暴露白细胞细胞核并使白细胞染色，该容器包括一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积，
将汇集容器放在一个离心机上使着色的白细胞聚集在汇集容器的底部部分，和
计算着色的白细胞的数量。
8．根据权利要求6或7中所说的白细胞计数方法，其特征在于溶细胞试剂选自阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
9．根据权利要求8中所说的白细胞计数方法，其特征在于添加于红细胞制品溶液中的溶细胞试剂的量为0.1到10％(w/v)。
10．一种白细胞汇集容器，包括一个开口，一个侧壁部分和一个底部部分，侧壁部分的一部分或全部具有沿着由底部部分朝着开口的方向逐渐增加的水平横截面积。
11．根据权利要求10中所说的白细胞汇集容器，其特征在于所说的底部部分带有一个白细胞不能通过的薄膜过滤器。
12．根据权利要求10或11中所说的白细胞汇集容器，其特征在于底部部分具有的最大直径为0.2到5mm。
13．一种白细胞计数装置，包括：
如权利要求10到12中任何一个所定义的白细胞汇集容器，
一个透镜部分，用以将白细胞汇集容器的底部部分的状态反射成一幅图像，图像的放大率可由透镜部分加以改变，
检测装置，用以通过分析由透镜部分反射的白细胞汇集容器底部部分的图像检测聚集在白细胞汇集容器底部部分的白细胞的数量，和
输出装置，用以输出由检测装置所得到的检测结果，
其中的检测装置包括一个图像-捕获部分，该部分具有一个用以捕获由透镜部分所反射的白细胞汇集容器底部部分图像的图像-捕获表面，一个识别位于图像-捕获表面上的白细胞汇集容器底部部分图像中白细胞的图像分析处理器和一个用于白细胞计数的计数器，和
白细胞汇集容器底部部分的大小能使整个底部部分的图像在检测装置中的图像-捕获表面上成为一幅图像。
14．根据权利要求13中所说的白细胞计数装置，其特征在于图像-捕获部分包括CCD图像-处理装置。
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